Prof. Responsable: Dra. Ana Anzulovich Prof. Colaborador: Dra. Fanny Zirulnik Responsable de los...

Prof. Responsable: Dra. Ana Anzulovich

Prof. Colaborador: Dra. Fanny Zirulnik

Responsable de los Trabajos Prácticos: Dra. Alicia Molina

Jefes de TP: Dra. Mariela Coria y Dra. Lorena Navigatore

EQUIPO DOCENTE

QUIMICA BIOLOGICA

Objetivos:I. Comprender las transformaciones

energéticas celularesII. Establecer los principios de la

bioenergéticaIII. Describir las rutas metabólicas de

biosíntesis

Moléculas Biológicas - Estructura químicaInteracciones entre moléculasDegradación y síntesis celular de las moléculas

Conservación y utilización de la energía en las células

Mecanismos regulatorios

En particular, los OBJETIVOS de este curso para las carreras de Licenciatura y Profesorado en Ciencias Biológicas, son:

- Estudiar las enzimas como herramientas de regulación, transformación y generación de energía celular.

- Analizar los procesos de degradación y biosíntesis de los compuestos biológicos, teniendo en cuenta su interrelación y mecanismos de regulación.

- Integrar las distintas vías metabólicas y su relación con los mecanismos de producción y utilización de energía por parte de los seres vivos.

ENZIMAS: Naturaleza Química. Propiedades Generales.

Nomenclatura y Clasificación. Coenzimas y Grupos

Prostéticos. Actividad Enzimática: Unidad de enzima-

Actividad específica- Actividad molecular. Conceptos de

afinidad y cooperatividad enzimática. Factores que

afectan la actividad enzimatica: pH, T, [S], [Enzima].

Inhibidores naturales de la actividad enzimática.

Mecanismo de regulación metabólica: Inhibición y

activación por sustrato, niveles enzimáticos, modulación de la

actividad de enzimas. Regulación Enzimática: Enzimas

alostéricas (propiedades y cinética). Modulación Covalente.

Zimógenos. Isoenzimas: Propiedades e importancia.

BOLILLA 1

1850, Louis Pasteur ‘fermentos’ de las levaduras.

1897, Edward Buchner (los fermentos se pueden aislar de las levaduras). Fredrick W. Kühne (llamó a esos fermentos ‘enzimas”).

1926, James Sumner (ureasa, estructura proteica).

1930, John Northrop y Moses Kunitz- (pepsina,tripsina y quimotripsina).

Ultimos 50 años (estructura y función). 1963- 1º Secuencia de aminoácidos

ribonucleasa pancreática bovina A. 1965, 1º estructura Rx- lisozima de la clara de

huevo de gallina. 1983.Sidney Altman y colaboradores. El ARN de

la ribonucleasa P tiene actividad catalítica.

UN POCO DE HISTORIA…

Energía de activación de una reacción

Energia libre (G)

Progreso de la reaccion

Estado deactivacion

Energia de Activacion (Ea)

ΔG (-) de reaccion

G1 de Reactivos A+B

G2 de Productos C+D

A + B C + D

Ea de la reaccioncatalizada

Catalizador

La velocidad a la cual se produce el intermediario de transición depende de:1- la Ea,2- la frecuencia de choques entre las moléculas.3- orientación adecuada de las moléculas.

Catalizador: agente capaz de acelerar una reacción química, sin formar parte de los productos formados, ni desgastarse en el proceso.

Las ENZIMAS son macromoléculas que funcionan como catalizadores biológicos, ya que disminuyen la Ea y favorecen la orientación de las moléculas reaccionantes.

Ningún organismo puede vivir sin ENZIMAS

La mayoría de las reacciones deben ser catalizadas para que ocurran en el tiempo y el momento que la célula lo requiere.

Las enzimas en general son proteínas que deben ser sintetizadas correctamente, con la estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria, si la tuvieran, de toda proteína.

Cualquier alteración de la síntesis de estas proteínas puede llevar a una patología

Transformación de moléculas de nutrientes simples en moléculas mas complejas, y viceversa.

Extracción de energía desde combustibles o compuestos degradables por oxidación.

Polimerización de subunidades para formar macromoléculas, etc.

FUNCION DE LAS ENZIMAS

Transformación de moléculas complejas en moléculas simples y viceversa

Ejemplos de transformaciones mediadas por enzimas

PAN

PAPAS

ARROZ

ALMIDON

GLUCOGENO (GLUCOSA)n

n (GLUCOSA)

ENZIMAS

ENZIMAS

PANCETA

CHIZITOS

CHORIZOS

GRASAS(TG)

TRIGLICERIDOS

MONOGLICERIDOS

ENZIMAS

ENZIMAS

GLICEROL+3 AC.GRASOS

ENZIMAS

Oxido-reducción

Rotura y formación de enlaces C-C

Reorganizaciones internas

Transferencia de grupos

Reacciones de condensación

Tipos de reacciones catalizadas por enzimas

Al nombre del sustrato o del producto, se le agrega la terminación ASA. Por ejemplo:

sacarasa, ureasa, amilasa, etc. O a la reaccion que catalizan, por ej.:

oxidoreductasa, deshidrogenasa, descarboxilasa, etc.

Otras tienen nombres arbitrarios, como: ptialina salival, pepsina del jugo gástrico,

tripsina, etc. Cada enzima tiene un nombre y un numero

asignado por la Comisión Internacional de Enzimas. Por ej.: Lactato deshidrogenasa (EC 1.1.1.27)

DENOMINACION DE LAS ENZIMAS

Clase - subclase - subsubclase - nº de orden

1 1 1 27

Cómo se clasifican las enzimas???

1-OXIDORREDUCTASAS

2. TRANSFERASAS

Alcohol deshidrogenasa (EC 1.1.1.1)

Hexoquinasa

(EC 2.7.1.2)

Clase - subclase - subsubclase - nº de orden

Lactato 1 1 1 27 deshidrogenasa

4. LIASAS

5. ISOMERASAS

6. LIGASAS

Piruvato descarboxilasa

(EC 4.1.1.1)

Fumarasa ó malato isomerasa

(EC 5.2.1.1)

Piruvato carboxilasa

(EC 6.4.1.1)

3. HIDROLASAS

Carboxipeptidasa A

(EC 3.4.17.1)

NATURALEZA Y COMPORTAMIENTO DE LAS ENZIMAS

La mayoría de las ENZIMAS (E) son PROTEINAS (excepción: la ribozima)

Las ENZIMAS tienen la capacidad de AUMENTAR LA VELOCIDAD de las reacciones, por ello se denominan CATALIZADORES BIOLOGICOS

La sustancia sobre las cuales actúan se denominan SUSTRATO (S)

ESTRUCTURA TERCIARIA Y CUATERNARIA

SITIO DE UNION AL SUSTRATO (Sitio Activo) Uniones no Covalentes: Puente de hidrógeno

Hidrofóbicas Electrostáticas

NECESITAN DE FACTORES NO ENZIMATICOS: inorgánicos (metales) y orgánicos (Coenzimas)

ESPECIFICIDAD DE SUSTRATO. Estereoespecificidad y especificidad geométrica.

SON REGULABLES: la síntesis de la proteína-enzima, su actividad y degradación.

CARACTERISTICAS DE LAS ENZIMAS

REACCION ENZIMATICA

Enzima ProductoSustratoEnzima

E + S E + P

Complejo ES

ES

Diagrama de coordenadas de una reacción enzimática catalizada y sin catalizar

P

Ea de la reacción NO catalizada

S

Energía Libre (G) Estado de transición

Progreso de la reacción

Ea de la reacción cat.

Enz-S Enz-P

ALTA ESPECIFICIDAD

Único sustrato

Glucoquinasa Glucosa

ESPECIFICIDAD RELATIVA Grupo de sustratos

Hexoquinasas HEXOSAS

glucosa, manosa y fructosa

ESPECIFICIDAD DE LAS ENZIMAS

D-Glucosa

Glucoquinasa

GLUCOSA GLUCOSA-6P

ATP ADP

- P

ENZIMA TOTAL

PROTEÍNA(termolábil)

NO PROTEICA(termoestable)

HOLOENZIMA APOENZIMA COENZIMA= +

COENZIMAS

Transportadores de grupos funcionales

Transportadores de electrones

VITAMINAS-COENZIMAS

Niacina NAD, NADP

Ion Hidruro (:H -)

PDH GAD

Riboflavina (Vit.B2)

FAD, FMN

Electrones

SDH

Tiamina (Vit. B1)

PP-tiamina

Aldehídos

PDH, TC

Acido fólico

TH4

Grupos monocarbonados

Ser-Tre Deshidra

t.

Acido lipoico

Lipoamida

Electrones y grupos acilos.

PDH

Piridoxina (B6)

P-piridoxal

Transferencia grupos aminos

Transaminasas

Acido pantoténico

Coenzima A

Grupos acilo

Tiolasa

Enzimas que requieren iones metálicos como cofactores

Citocromo oxidasa

Catalasa

Peroxidasa

Fe++ ó Fe+++

Anhidrasa carbónica Zn++

Piruvato quinasa K+

Hexoquinasa

Glucosa-6-fosfatasa

Piruvato quinasaMg++

COMPARTIMENTALIZACION: Diferente localización dentro de la célula.

SISTEMAS MULTIENZIMATICOS: Enzimas relacionadas agrupadas formando verdaderos complejos macromoleculares.

ENZIMAS MULTIFUNCIONALES: Una enzima que presenta distintos sitios catalíticos

DISTRIBUCION DE LAS ENZIMAS

Unidades Internacionales (UI) (medida de velocidad)

Actividad Específica Actividad enzimática (UI) por miligramo de

proteína presente en la muestra

Actividad Molar ó Numero de Recambio Moléculas de S convertidas en P por unidad de tiempo y por molécula de enzima

ACTIVIDAD ENZIMATICA

UI =moles de S transformados

min

AE =

UI

mg de proteína

Actividad molar = mol de enzima

mmol de S transformados/min

ACTIVIDAD ESPECIFICA

+ +Prot.Tot: ∑ + +Prot.Tot: ∑ +

AB

+Prot.Tot: ∑

Prot.Tot: ∑

D

Actividad específica

U.I.E.

mgr de proteína= =

Activ. Enzimática

Prot. totales

Factores que afectan la actividad enzimática

pH

Temperatura

Concentración de Enzima

Concentración de Sustrato

Influencia del pH sobre la actividad enzimática

Actividad enzimática

pHpH óptimo

Ejemplos de enzimas con diferentes pH óptimos

Influencia de la Temperatura sobre la actividad enzimática

T(ºC)

Actividad enzimática

T. óptima

act

ivid

ad p

or

d

e la

te

mp

erat

ura

de temperatura

provoca

desnaturalización

Efecto de la concentración de enzima sobre la actividad

[E]

Act. Enz. o Vo

Concentración saturante de sustrato, y a pH yT constantes

Vo

[S]

Leonor Michaelis y Maud Menten

Vo

[S]

VARIACION DE LA VELOCIDAD DE REACCION CON LA CONCENTRACION DE SUSTRATO

GRÁFICA DOBLE RECÍPROCA O DE LINEWEAVER-BURK

Pendiente= Km/Vmáx

Intersección c/eje x = - 1/Km

Ordenada al origen = 1/Vmáx.

INHIBICION ENZIMATICA

INHIBICION IRREVERSIBLE

POR ENLACE COVALENTE

INHIBIDOR SUICIDA

DIFP Quimotripsina

Alopurinol Xantina oxidasa

Penicilina Transpeptidasa

INHIBICION REVERSIBLE

COMPETITIVA

NO COMPETITIVA

ACOMPETITIVA

INHIBICION IRREVERSIBLE

- Acetilcolinesterasa

- QuimotripsinaEnzima inactivada

Por unión covalente del inhibidor

Diisopropilfluorfosfato (DIPF)

Inhibidor suicida

INHIBICION IRREVERSIBLE

Se une al sitio activo de la enzima y ésta cataliza la modificación

del inhibidor a otro compuesto que permanece unido a la enzima.

El ALOPURINOL es un inhibidor suicida que actúa sobre la enzima xantina oxidasa (degradación de purinas).

Se forma el oxopurinol el cual queda unido a la enzima.

Inhibidor competitivo

COO-

(CH2)2

COO-

COO-

CH2

COO-

Succinato + FAD+ Fumarato + FADH2

Succinato deshidrogenasa

Malonato

Inhibidor no competitivo

Inhibidor acompetitivo

acompetitivo

REGULACION DE LAS REACCIONES CATALIZADAS POR ENZIMAS

REGULACION DE LA ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS

REGULACION DE LA SINTESIS

DE LAS ENZIMASENZIMAS INDUCIBLES

REGULACION ALOSTERICA REGULACION COVALENTE

REGULACION POR PROTEINAS

REGULACION POR PROTEOLISIS

ENZIMAS ALOSTERICASENZIMA ALOSTERICA

MODULADORES POSITIVOS MODULADORES NEGATIVOS

Enzima Enzima Enzima Enzima

1 2 3 4

PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS ALOSTERICAS

Poseen un sitio de unión a un metabolito regulador (sitio alostérico)

La unión del metabolito a la enzima es de carácter reversible y no covalente.

Son homotrópicas o heterotrópicas.

En general poseen dos o mas sitios reguladores.

La mayoría posee dos o mas cadenas polipeptídicas o subunidades.

En general tienen un comportamiento cinético sigmoideo

CINETICA DE UNA ENZIMA ALOSTERICACurva Sigmoidea

Regulación de la actividad de la Aspartato transcarbamilasa

(ATCasa)

vi

v

Aspartato (mM)

Hexoquinasa, Fosfofructoquinasa y Piruvato Quinasa

Vía glicolítica

AcetilCoA carboxilasa Biosíntesis de lípidos

Aspartato Transcarbamilasa Biosíntesis de nucleó- tidos pirimidínicos Glutamato Deshidrogenasa Degradación de aminoácidos Citrato sintasa, isocitrato y a-cetoglutarato

deshidrogenasas Ciclo de Krebs

EJEMPLOS DE ENZIMAS ALOSTERICAS

COOPERATIVIDAD

COOPERATIVIDAD

POSITIVA

NEGATIVA

HOMOTROPICA

HETEROTROPICA

REGULACION POR MODIFICACION COVALENTE

Fosforilacion

ADP-Ribosilación

Enzima

Fosfoadenilacion

Enzima

• POR UNION COVALENTE DE GRUPOS (FOSFATOS , ADENILATOS, ETC.)

• INTERVIENEN ENZIMAS: QUINASAS, FOSFATASAS

• LA UNION DEL GRUPO PUEDE ACTIVAR O INHIBIR LA ENZIMA POR UN CAMBIO CONFORMACIONAL

Ejemplo de regulación covalente

Fosforilasa fosfatasa

2 Pi

2 H2O

Fosforilasaquinasa

ATP

ADP

Fosforilasa b

P -O-CH2 CH2- O- P

Fosforilasa a

(menos activa)

(Cadena lateral de Ser)

CH2- HOHO-CH2

Por eliminación de una cadena peptídica, enzimas inactivas se convierten en enzimas activas y viceversa.

Las enzimas digestivas: pepsinógeno y quimotripsinógeno se convierten en las enzimas activas pepsina y tripsina.

Suele ocurrir una activación secuencial produciéndose una cascada de activaciones. Ej. Coagulación sanguínea.

REGULACION POR PROTEOLISIS

ZIMOGENOS

Modifican la actividad de enzimas involucradas en el metabolismo celular. Por ej. Indirectamente activando o inhibiendo la actividad de la glutamina sintetasa.

RNA polimerasa: Asn, Gln, Glu, Lys y Arg forman enlaces hidrógenos con las bases del DNA

REGULACION POR PROTEINAS

ISOENZIMAS

Diferentes formas moleculares de una

misma enzima.

Catalizan la misma reacción, actuando sobre

el mismo sustrato para dar el mismo producto

Son sintetizadas por genes diferentes

Tienen diferente composición aminoacídica

por lo que pueden separarse por electroforesis.

Son utilizadas en clínica para determinar

el origen del tejido dañado

Se encuentran ubicadas en diferentes

compartimentos de la célula ó en diferentes

tejidos.

Dos isoenzimas presentan en general

diferentes valores de Km y Vmáx.

Ejemplo de isoenzimas: Glucoquinasa y hexoquinasa

Hexoquinasa

Glucoquinasa

Actividadenzimática

Km. hexq Km. glucq [glucosa mmol/l

Lactato deshidrogenasa (LDH)

Presenta 5 isoenzimas con distinta composición en cuanto a sus subunidades y c/u es específica de un tejido.

H4 H3M H2M2 HM3 M4

M > Músculo

H > Corazón