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Desarrollo de las inteligencias

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B I O T E C N O L O G Í A

Ingeniería genética

Desarrollo de las inteligencias

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BIOTECNOLOGÍA

• Visión general:

• En la práctica:

Utilización de los seres vivos para beneficio humano

La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten

manipular el genoma de un ser vivo.

• Producción de alimentos y bebidas• Obtención de medicamentos

• Clonación, mapas genéticos,• Organismos transgénicos, terapia génica

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INGENIERÍA GENÉTICA

a) Tecnología de ADN recombinante

b) Clonación y expresión de genes

c) Aplicaciones

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PROCESO…(ADN recombinante)

1. Fragmentar y aislar el ADN2. Unión a vectores.3. Introducción en las células.4. Clonación5. Búsqueda del clon idóneo.6. Análisis del ADN clonado: transferencia Southern,7. Secuenciación.8. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

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FRAGMENTACIÓN DEL ADN

• Por endonucleasas de restricción

• Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.

• Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).

• Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio. Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.

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ACCIÓN DE ENDONUCLEASAS

• Generan extremos cohesivos.• Si se actúa sobre dos ADNs diferentes con la misma endonucleasa,

al juntarlos se unirían espontáneamente.

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IMÁGENES DE ACCIÓN

ADN

ENDONUCLEASAS

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EN DETALLE…

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MAPA DE RESTRICCIÓN

Mapa físico de un segmento de ADN que muestra los lugares de corte de endonucleasas específicas y la distancia entre pares de bases.

Indica puntos de corte

Se reflejan determinadas secuencias de nucleótidos.

Permite comparar ADNs y ver su similitud (detección de mutaciones)

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EJERCICIO 1

• Un fragmento lineal de ADN de 7Kb se corta por separado con dos endonucleasas de restricción y luego con una mezcla de ambas obteniéndose los fragmentos indicados a continuación :

Endonucleasa de restricción Tamaño de los fragmentos (Kb)

EcoRI 3.0 y 4.0

HaeIII 2.0 y 5.0

EcoRI + HaeIII 2.0 , 1.0 y 4.0

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EJERCICIO 1 - Solución

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APLICACIÓN MAPA RESTRICCIÓN

• Permite diferencias ADNs de individuos de diferentes especies.

• POLIMORFISMO DE LONGITUD DE FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN (RFLP) (cada individuo tiene diferente colección de fragmentos para la acción de una misma colección de endonucleasas)

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2. UNIÓN A VECTORES

• Los vectores deben ser tratados con las mismas endonucleasas de restricción.

• Luego se produce la unión del vector con el fragmento de ADN a introducir.

Los vectores son estructuras que permiten introducir material genético en el interior de otra célula.

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PLÁSMIDOS

• Son moléculas de ADN circular e bacterias.

• Tienen replicación independiente.

• Además, otros genes• Facilidad para la

manipulación.• Porta marcadores

específicos: permiten diferenciación posteror.

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IMAGEN DE UNIÓN PLÁSMIDO

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FAGOS

• Virus que infectan bacterias (bacteriófagos)

• Transducción: incorporan material genético del huesped.

• Al infectar otra célula (bacteria) introduce el material del antiguo huesped.

• Ej. Bacteriofágo o fago .

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FAGO LAMBDA

• Un vector ampliamente usado para crear DNA recombinante.

• 48,502 pares de bases de longitud.

• Usualmente un DNA recombinante de lambda tiene 80% DNA del vector y 20% del DNA insertado.

CICLO DE UN VIRUS

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CÓSMIDOS

• Fragmentos de ADN que llevan un ADN no propio y el sitio COS. (similares a plásmidos)

• Sitio COS: provoca el empaquetamiento del ADN.

• Conclusión: permite transportar grandes cantidades de ADN.

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OTROS

• Cromosomas artificiales de levadura: YACs• Retrovirus• Cromosomas humanos artificiales: HACs

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RESUMEN VECTORES

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4. CLONACIÓN

• Sacar copias del ADN que se ha unido al vector.• Se utiliza un huesped:

– Capacidad de crecimiento rápido.– No ser dañino o patógeno– Ser capaz de aceptar el ADN exógeno y que éste

permanezca estable.– El huésped debe tener enzimas para la replicación

del vector.

• Bacterias: E. coli y B. subtillis.

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Escherichia coli como vector

• Potencialmente patógeno• Producción de

endotoxinas.

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CLONACIÓN EN EUCARIOTAS

• EL más utilizado Saccharomyces cerevisiae.– Es capaz de recibir plásmidos.– También YACs (cromosomas artificiales de levadura)

• Cultivos celulares de mamíferos:– Manejo parecidos a huéspedes bacterianos.– Ventaja: tienen proceso maduración del ARNm y así

ya es directamente funcional.

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UTILIZACIÓN DE YACs

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5. BÚSQUEDA DEL CLON IDÓNEO

• Hay muchos tipos de bacterias transformadas.

• ¿Cuál tiene el fragmento de ADN exógeno que nos interesa?

• Se saca réplica en membrana.

• Se desnaturaliza ADN con NaOH.

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5. BÚSQUEDA DEL CLON IDÓNEO

• Se desnaturaliza el ADN con NaOH.

• Se añade sonda radioactiva: complementaria al gen que se quiere buscar.

• Se lava el ADN monohebra (sólo queda el híbrido)

• Se pone placa fotográfica.

Biblioteca genómica

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APLICACIÓN MÉDICA OBTENCIÓN DE LA INSULINA

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6. IDENTIFICACIÓN DE GENES - Southern

• Es un mecanismo mediante el cual se pueden identificar genes que se encuentren en fragmentos de restricción.

• Aplicación:– Diagnóstico de enfermedades– Huella genética

• Concepto previo: electroforesis

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ELECTROFORESIS EN GEL

• Gel de Agarosa (polímero de galactosa)

• Se ponen en “pozitos” en un extremos los fragmentos de ADN

• Se somete a un campo eléctrico (grupos fosfato son arrastrados al polo +)

• Fragmentos más grandes emigran menos. Los pequeños más.

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MÉTODO SOUTHERN

1. Electroforesis en gel (separación de fragmentos por tamaño)

2. Desnaturalización (a ADN de cadena sencilla)

3. Transferencia a filtro de nitrocelulosa (los papeles secantes absorben el tampón y los ADN monohebra se pegan al filtro)

4. Hibridación con sondas marcadas P32.

5. Eliminación de sondas no unidas.

6. Exposición a la película fotográfica y revelado

7. Identificación de fragmentos

V E RV E R 2

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AMPLIFICACIÓN PCR

• Objetivo: obtener millones de copias en poco tiempo de fragmentos de ADN.

• Se basa en el enzima: , obtenida de Thermobacillus.

• Sólo se necesita conocer la secuencia de los extremos para fabricar cebadores.

• Tras varios ciclos se forman millones de copias.

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AMPLIFICACIÓN POR PCR

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POLIMERASA CHAIN REACTION

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CADENA DE REACCIÓN DE LA POLIMERASA - 1

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PCR 2

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CICLO DE UN VIRUS

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SOUTHERN

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Método southern

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• Producción de alimentos y bebidas• Obtención de medicamentos