1 PCR: Aplicaciones en Infectología Laboratorio de Biología Molecular Facultad de Medicina UASLP...

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PCR:Aplicaciones en Infectología

Laboratorio de Biología MolecularFacultad de Medicina UASLP

CA Garcia Sepúlveda MD PhD

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Tan solo en los EEUUA, cada año se reportan entre 5 y 7 millones de enfermedades asociadas a infecciones.

Se estima que un número mucho superior de enfermedades infecciosas no son reportadas cada año.

Gran morbi-mortalidad de enfermedades infecciosas a nivel mundial.

Las bacterias y virus continuan siendo una amenaza para la raza humana (2do riesgo despues de Homo sapiens).

La intervención temprana (y apropiada) ante dichas patologías requiere de la identificación rápida del patógeno implicado, sobretodo en UCI, UCEN o SE en donde la vida del paciente pudiera estar en riesgo.

Introducción

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El desenlace clínico ante enfermedades infecciosas se encuentra directamente relacionado con el tiempo transcurrido para identificar al patógeno:

Mayor tiempo = Peor pronóstico.

Acercamiento diagnóstico actual (en la era posgenómica) sigue basandose en métodos tradicionales, engorrosos, lentos y poco sensibles.

- Poco útiles ante escenarios de emergencia/críticos

- Poca información resultante (Streptococcus spp)

- Seguimiento con otros ensayos lentos de caracterización

- Poco utiles en pacientes que reciben antibióticos

Introducción

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Consecuencias:

Lleva a la adopción de estrategias clínicas empíricas y conservadoras.

Lleva al abuso en la prescripción de antiobióticos.

Incrementa el costo de la atención médica (incuso extrahospitalaria).

Incrementa la tasa de hospitalizaciones innecesarias (hay un control?)

Presiona a los patógenos a evolucionar más rápidamente o a escapar de escenarios de riesgo (resistencias, recombinantes nosocomiales, etc).

Introducción

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Reacción en Cadena de la Polimerasa

Método enzimático para amplificar pequeñas regiones de DNA in vitro.

Una sola bacteria no se puede estudiar, por lo que se hace uso de técnicas de cultivo para incrementar sus números de tal modo en que se puedan realizar estudios bioquímicos.

¿Que es la PCR?

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Invención

Kary Banks Mullis, Ph.D. (Dic 28, 1944)

Bioquímico norteamericano.

Laureado Nobel (1993).

Criado en Carolina del Norte EEUUAA en una granja.

Trabajo en cardiología pediátrica, farmacéutica, sintesis proteica.

Escribio ciencia ficcion por un tiempo y trabajo (como PhD) en una panaderia.

Trabajo para Cetus donde divisó el mecanismo general subyacente de la PCR.

Niega que el SIDA sea causado por HIV y niega el calentamiento global.

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Molécula que contiene información que define la manera en que un organismo debe:

- armarse,

- funcionar y

- degradarse (morir).

DNA

3.4 nm (34 Å)

0.34 nm (3.4 Å)

2 nm (20 Å)

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DNA

Molécula de DNA es:

- Bicatenaria

- Complementaria

- Antiparalela

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DNA

A

T

G

C

A

G

C

A

T

G

C

T

A

C

G

T

A

C

G

T

A

C

G

T

Molécula de DNA es:

- Bicatenaria

- Complementaria

- Antiparalela

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DNA

5' 3'

3' 5'

Molécula de DNA es:

- Bicatenaria

- Complementaria

- Antiparalela

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Desnaturalización Reversible

¿Como se descontamina una superficie de DNA?

- Detergentes o jabones- NaOCl - Calor- Acidos- Bases - Luz ultravioleta- Radiación actínica - DNAsas

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Desnaturalización Reversible

¿Como se descontamina una superficie de DNA?

- Detergentes o jabones ✗- NaOCl ✗- Calor ✗- Acidos ✗- Bases ✗- Luz Ultravioleta ✓- Radiación actínica ✓- DNAsas ✓

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Desnaturalización Reversible

CONTEXTO:

Una célula humana promedio contiene entre 6 y 9 picogramos de DNA.

46 cromosomas.

100,000 genes a 22,000 genes

3 mil millones de bases

El cambio de tan solo 1 base es suficiente para alterar al organismo.

PROBLEMA:

Como detectar un cambio de 1 base entre 3 mil millones de bases?

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Desnaturalización Reversible

SOLUCION:

PCR

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Componentes

• Componentes• Condiciones

Agua

Buffer

MgCl2dNTPs (A,C, T, G)

Oligoucleotidos

DNA Polimerasa

DNA

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Componentes

• Componentes• Condiciones

Agua

Buffer

MgCl2dNTPs (A,C, T, G)

Oligoucleotidos

DNA Polimerasa

DNA

Estabiliza a la DNA polimerasaAmortigua pHAportando iones necesarios (KCl)Puede contener aceleradores (Tween)Promotores de la reacción:

• FBS• DMSO• Gelatina

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Componentes

• Componentes• Condiciones

Agua

Buffer

MgCl2dNTPs (A,C, T, G)

Oligoucleotidos

DNA Polimerasa

DNA

Necesario para el correcto funcionamiento de la DNA polimerasa

Su concentración modifica el éxito (nivel de amplificación) de la reacción.

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Componentes

• Componentes• Condiciones

Agua

Buffer

MgCl2dNTPs (A,C, T, G)

Oligoucleotidos

DNA Polimerasa

DNA

Monomeros que será polimerizados durante la reacción.

Desoxyadenosin trifosfato (A)Desoxyguanosin trifosfato (G)Desoxycitidin trifosfato (C)Desoxytimidin trifosfato (T)

No se puede crear DNA de la nada.

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Componentes

• Componentes• Condiciones

Agua

Buffer

MgCl2dNTPs (A,C, T, G)

Oligoucleotidos

DNA Polimerasa

DNA

Pequeños fragmentos de DNA (18-30 bp)

Dirigen la polimerización de regiones específicas.

DICTAN LA ESPECIFICIDAD DE LA REACCION!

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Componentes

• Componentes• Condiciones

Agua

Buffer

MgCl2dNTPs (A,C, T, G)

Oligoucleotidos

DNA Polimerasa

DNA

Es la responsable de polimerizar los monómeros (dNTPs) para formar copias de DNA.

5´-3´ Polimerasa3´-5´ Exonucleasa

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Componentes

• Componentes• Condiciones

Agua

Buffer

MgCl2dNTPs (A,C, T, G)

Oligoucleotidos

DNA Polimerasa

DNA

Sirve de referencia o molde para la síntesis de nuevo DNA.

Le indica el orden con el cual deben agregarse dNTPs a la DNA polimerasa.

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Componentes

• Componentes• Condiciones

Component l

Sterile Water 38.0 10X PCR Buffer 5.0 MgCl2 (50mM) 2.5 dNTP’s (10mM each) 1.0 PrimerFWD (25 pmol/l) 1.0 PrimerREV 1.0 DNA Polymerase 0.5 DNA Template 1.0

Total Volume 50.0

Component l

Sterile Water 38.0 10X PCR Buffer 5.0 MgCl2 (50mM) 2.5 dNTP’s (10mM each) 1.0 PrimerFWD (25 pmol/l) 1.0 PrimerREV 1.0 DNA Polymerase 0.5 DNA Template 1.0

Total Volume 50.0

Volumen de PCR común:

Hace 10 años = 500 y 1000 µLHace 5 años = 25 y 50 µLHoy = 10 a 12.5 µL

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Condiciones

• Componentes• Condiciones

Desnaturalizar

Hibridizar

Extender

AcidosBasesSalesDetergentesTemperatura

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Condiciones

• Componentes• Condiciones

Desnaturalizar

Hibridizar

Extender Ciclos de temperatura(Termociclaje)

AcidosBasesSalesDetergentesTemperatura

Incompatibles con DNA pol

Thermophilus aquaticus = Taq

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Termociclador

• Componentes• Condiciones

Desnaturalizar

Hibridizar

Extender

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Condiciones

• Componentes• Condiciones

Desnaturalizar

Hibridizar

Extender

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Condiciones

• Componentes• Condiciones

Desnaturalizar

Hibridizar

Extender

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Cinetica de la reacción

• Componentes• Condiciones

95ºC

55ºC

72ºC

Desnaturalización Hibiridización

20 – 40 X

Hibrido= DNA + OligonucleotidoDepende de contenido GC%Dicta la especificidad de union del oligo al DNA

Extensión

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Cinetica de la reacción

• Componentes• Condiciones

95ºC

55ºC

72ºC

Desnaturalización Hibiridización

20 – 40 X

Polimerasa Velocidad Exonuc Tasa Error %Prod -MutTaq 2 Kb/min No 8.0x10-6 16Pfu 0.5 Kb/ min Si 1.3x10-6 2.6Pwo 1 Kb/min Si 0.4x10-6 0.7

Extensión

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Cinetica de la reacción

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Cinetica de la reacción

• Componentes• Condiciones

nº ciclos

DN

A p

rod

uct

o

pri

mer

s

La eficiencia neta del proceso es tán elevada que permite amplificar una copia de DNA original a mil millones de copias en tan solo 30 ciclos (2 hrs)!

La especificidad está dictada por el diseño de oligos y optimización de la técnica.

La sensibilidad del proceso es alta gracias a su elevada eficiencia.

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Proceso logarítmico (de tan solo 15 pasos):

1-2-4-8-16-32-64-128-256-512-1024-2048-4096-8192-16,384-32,768

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Proceso logarítmico (de tan solo 15 pasos):

1-2-4-8-16-32-64-128-256-512-1024-2048-4096-8192-16,384-32,768

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30 ciclos

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Electroforesis

• Fosfatos y carga negativa del DNA responsable de migración electroforética.

(-)

(-)

(-) (-)

(-)(-)

(-)

(-)

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Electroforesis

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Aplicaciones en Infectologia

• Facilita procesamiento de muestras• DNA es muy estable (meses a años).• Pequeño volumen de procesamiento y almacenamiento.• Archivable.• No requiere de red fria para transporte.

• Posee mayor sensibilidad que métodos tradicionales (serologicos)• Teóricamente capaz de detectar una sola molécula de DNA.• Muestras no viables pueden ser analizadas.

• Posee mayor especificidad.• Reacciones cruzadas mínimas (calidad de diseño del oligo).• Capaz de distinguir diferencias de tan solo UNA sola base nucleotídica.

• Permite identificar organismos dificiles o lentos de cultivar (Mycobact)

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Aplicaciones actuales

•Multiplex PCR

Detección simultánea de más de un patógeno en la misma reacción.

Incorpora mayor número de oligonucleótidos.

½ del costo (obvio).

Incrementa rapidez tamizaje.

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Aplicaciones actuales

Nested-PCR

Anidada.

Realizar una PCR sobre el producto de otra PCR.

Detección de especies de DNA raras (en número) en muestras diluidas o con bajos títulos.

Al menos cuatro oligos diferentes.

Supra-sensible (detección).

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Aplicaciones actuales

Random-PCR

Aleatoria.

PCR poco específica que permite amplificar a muchas entidades (especies, bacterias, etc) en una sola reacción.

Oligos dirigidos contra secuencias conservadas de bacterias (16S rRNA).

Permiten ampificar a cualquier bacteria (bacteremias, meningitis, etc).

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Aplicaciones actuales

RT-PCR

Reverse Transcriptase.

PCR realizada sobre RNA.

Expresión de genes (mRNA).

Genomas virales RNA (HIV, Flu).

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Aplicaciones actuales

Q-PCR

Quantitative.

Permite cuantificar el nivelde los productos de PCR.

Util para medir expresión de genes (mRNA).

Utilisima para medir niveles de replicación viral(carga viral).

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Aplicaciones clínicas

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Aplicaciones clínicas

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Conclusiones

El diagnóstico molecular ha demostrado ser revolucionario para la práctica clínica del infectólogo (hospitalario o epidemiologo).

Utilidad incomparable en escenarios críticos como UMQx, UCI y UCEN en donde es preciso contar con herramientas rápidas, sensibles y robustas para la toma de decisiones clínicas.

La PCR sigue siendo la mejor técnica molecular que se haya desarollado y aunpromete mucho respecto a aplicaciones, optimización (costo y tiempo) y derivaciones (RT, QT, etc).

Utilidad demonstrada para detección de patógenos, seguimiento clínico, vigilancia de patógenos emergentes, detección de amenzasa biológicas y detección de patógenos resistentes a fármacos.

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Laboratorio de Biología Molecular

Gracias

Felicidades al personal del Laboratorio Estatal de Salud Pública en su décimo aniversario.