13-Las enzimas como herramientas analíticas

Las enzimas como herramientas analíticasanalíticas

Dr. José Luis Cárdenas López

Las enzimas como herramientas analíticas

• Enzimas endógenas

• Enzimas exógenas• Enzimas exógenas

• Desarrollo de biosensores

Enzimas endógenasCambios postmortem, manejo y procesamiento (especialmente congelación, descongelación)

daño celular

rompimiento de organelosrompimiento de organelos(mitocondrias, lisosomas)

liberación de enzimas al fluido

celular

incremento o decremento de la actividadESTIMACIÓN

(productos)

Enzimas endógenas usadas como índices de calidad de pescado

Enzima Medicion Referencia

Ca+2

ATPasa Calidad de pescado congelado (Nambudiri and Gopakumar,

1990)

Ca+2

ATPasa Calidad del surimi (Katoh et al., 1979)

Lactato dehidrogenasa Calidad de pescado enhielado o

congelado

(Nambudiri and Gopakumar,

1990)

Mg+2

ATPasa sarcoplasmica Frescura durante el enhielado (Yamanaka and Mackie, 1971)

Transglutaminasa Fuerza del gel de surimi (An et al., 1996)

Varias enzimas lisosomales y

mitocondriales

Historia de congelacion-

descongelación de pescado y

moluscos bivalvos

(Chhatbar and Velankar, 1977)

Ensayo de ATPasa• 1 g de músculo en 80 mL de agua destilada a 0°C,

licuar a 20,000 rpm, centrifugar 20 min a 0°C, sobrenadante

• Ensayo:

• 2 mL de muestra

• 1 mL de histidina pH 6.9, 0.1 mL de cloruro de • 1 mL de histidina pH 6.9, 0.1 mL de cloruro de magnesio 0.15 M, 0.5 mL de ATP 3mM pH 7.5, 0.4 mL de agua

• Incubar a 25°C, 2,4,6,8, etc. min, parar la rx con TCA 5% y centrifugar. El sobrenadante se mide en un espectrofotómetro (fosfato inorgánico)

Cambios en actividad ATPasa durante el almacenamiento en refrigeración

0.002 Hasta 14 días

Durante la congelación…

Ojo con el pH, las [sal] y crioprotectores

Gradual hasta 180 días

ATPasa como índice de calidad de surimi

• Investigadores han relacionado altas actividades de ATPasa con alta calidad de surimi (medido como fuerza de gel)

• Por lo que pudiera usarse como otro índice de • Por lo que pudiera usarse como otro índice de calidad del surimi

Lactado deshidrogenasa (LDH)

• Enzima clave en el camino glucolítico, se encuentra ampliamente distribuída en el reino animal

• Actúa tanto en lactato como en piruvato en presencia de NADHpresencia de NADH

• Muchas especies de pescado tienen altas actividades de LDH, por lo que acumulan mas ácido láctico y su formación es una medida de la actividad

• Por lo que puede ser usada para estimar la frescura

Isoformas de LDH

• Existe en muchas isoformas (4 ó 5 en el caso de atún y lenguado)

• Diferentes tejidos (cardiaco, esquelético) diferente isoforma diferente isoforma

• En Tilapia (O.mossambicus) enhielada, el ac. láctico se dobló 50 h después de la muerte y fue atribuíble a alta actividad de LDH

Actividades críticas de LDH en varias especies marinas

Actividad LDH menos de estos valores, indican límite de utilización como alimento

Act LDH desaparece a los 15 días enhielado

¿Porqué?

Lipólisis

Acumulación de AGL

Agregación de proteínas

Pérdida de actividad de la

enzima por desnaturalización

Actividades ATPasa y LDH en especies en congelación

Alta correlación con otros índicesde calidad como TMA, AGL, IP y con evaluaciones sensoriales

OJO: actividad ATPasa y LDH especie específicas

Enzimas lisosomales y mitocondriales

• Congelación y decongelación rápida resultan en el daño irreparable de mitocondrias y lisosomas, y la salida de enzimas al sarcoplasmasarcoplasma

• La presencia de estas enzimas puede diferenciar entre producto que ha sido congelado/descongelado y aquel no congelado

¿Cuáles?

• Son enzimas involucradas en el daño muscular

• Alfa glucosidasas (EC 3.2.1.20)

• Beta-N-glucosaminidasa (EC 3.2.1.30)

• Fosfatasa ácida (EC 3.1.3.2)• Fosfatasa ácida (EC 3.1.3.2)

• Malato deshidrogenasa (EC 1.1.1.37)

• Citocromo oxidasa (EC 1.9.3.1)

• Y otras…

Efecto de la congelación y descongelación

Las lisosomales…

• Los ensayos para enzimas lisosomales (catepsinas) son laboriosos y con sustratos caros (fluorogénicos la mayoría) por lo que dificilmente pueden ser rutinarios a nivel de dificilmente pueden ser rutinarios a nivel de planta

• Sin embargo, pueden ser importantes para explicar daño celular y su mecanismo

Digestibilidad In vivo

Pros y cons

• El insumo más importante en la acuacultura es el alimento

• ¿Qué capacidad tiene el animal de convertir ese alimento en tejido vivo (músculo, $$)?

• Digestibilidad aparente y verdadera de los • Digestibilidad aparente y verdadera de los alimentos

• Ensayo caro y de mucho tiempo, con muchas mediciones, pesar los organismos, las heces, los alimentos, etc.

• La mejor medición de la viabilidad del alimento en la nutrición acuícola

biodisponibilidad

• la medición de la digestibilidad proporciona una buena indicación de la biodisponibilidad de nutrientes, que de esta manera brinda una base racional con la cual se pueden formular base racional con la cual se pueden formular las dietas para cubrir las normas específicas de niveles de nutrientes disponibles

Digestibilidad In vitro

Simulación del proceso en el laboratorio

La técnica de las 4 enzimas

• Saterlee (1977) usó 3 enzimas (coctel de tripsina, quimiotripsina y proteasa bacterial) después de digerir por 10 min, midió el pH y generó una ecuación de predicción de la generó una ecuación de predicción de la digestibilidad de la proteinas de la muestra (23 muestras) con una r de 0.90

• Otros autores han incorporado una peptidasa y cambios de pH para simular condiciones en el estómago e intestino, mejorando los valores de r entre digestibilidad In vivo e In vitro

Mejorando la técnica de 4 enzimas

• Enzimas comerciales vs enzimas específicas de los organismos

• Dimes y Haard (90´s) en salmónidos

• pH stat y OPA• pH stat y OPA

• Sin embargo, todavía no se ha validado este método con diferentes ingredientes de proteínas de origen animal

Necesidad de un método In Vitro

• Necesidad de fuentes alternativas de proteina.

• La respuestas de salmónidos a los reemplazos de harinas de reemplazos de harinas de pescado pueden ser complejas.

• La determinación In vivo

toma tiempo, es cara y requiere habilidad técnica.

Correlación entre DA y % de GH medido con pH-Stat

Animal Ingred. P=planta A=animal

4-Enz r2

E pescado

r2

Referencia

Trucha 10 (P&A)

0.64 0.82 Dimes & Haard, 1994

7 (A) 0.71 0.86 Dong et al., 1993 7 (A) 0.71 0.86 6 (A) 0.91 0.81 Barrows et al., 1997

6 (A) - 0.87 Dimes et al., 1994

4 (P&A) - 0.88 Haard, 1991

12 (P&A)

0.71 0.86 Weerasinghe & Haard, 1998

Camarón 7 (P&A) 0.71 0.77 Ezquerra et al., 1997

Chinook 8 (A*) 0.36 0.28 Clancey et al., 1995

* Hidrolizados

Ejercicio 4 del set de problemas 3

2 H+ removibles

S+EH2 EH2S EH2+P

- H+

Posible diagrama de equilibrio

S+EH- EH- S EH- +P

S+E-2 E-2 S E-2 +P

- H+

- H+

Primero ver catálisis

Vmax

ESH-

¿Cómo?Hacer un experimento a [S]>>>Km, la velocidad es igual a Vmax

ES-2ESH2

pH

Vmax

Luego ver la unión

Vmax/Km

EH-

Igual hacer un experimento con [S]<<<Km, la velocidad es igual a Vmax/Km

E-2EH2

pH

Vmax/Km

Regla: Una ionización tiene que ver o con catálisis o con unión, no con ambas

Resultado

S+EH2 EH2S EH2+P

- H+

S+EH- EH- S EH- +P

S+E-2 E-2 S E-2 +P

- H+

- H+

Ionizaciones de la enzima

1) Estos son los que se ionizan a pH neutro

• Grupo pKa ∆H ionización (Kj)

• Cys 8.33 6.5-7.0

• Asp 3.86• Asp 3.86

• Glu 4.25

• Lys 10.53

• Arg 12.48 12-13

• His 6.0 6.9-7.5

• α-carboxilo 2.1-2.3 0

• α-amino 9.1-10.8 10-13

a) Las ionizaciones tanto de los pH 4.2 (protonación) como 6.8 (desprotonación) son responsables en la NO formación del complejo ES (solamente la especie EH- se une a S, y el complejo en si (EH-S) se puede protonar o desprotonar dando 3 especies de complejo pudiendo las 3 especies de complejo ir a producto en la parte de catálisis

b) A 4.2 pueden ser Asp, Glu o el mismo C terminalA 6.8 puede ser His y Cys en menor medida