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UNIVERSIDAD SAN PABLO CEU
FACULTAD DE FARMACIA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
SECCIÓN DE QUÍMICA ORGÁNICA Y FARMACÉUTICA
ADRENOMEDULINA y PAMP
Nuevas dianas terapéuticas para el diseño de
agentes antiproliferativos y/o antiangiogénicos
TESIS DOCTORAL
VIRGINIA ROLDÓS SERRANO
Madrid, 2008
Dra. Dña. Beatriz de Pascual-Teresa y Dra. Dña. Ana Ramos González,
Profesoras Agregadas de Química Orgánica y Farmacéutica ambas
pertenecientes a la Facultad de Farmacia de la Universidad San Pablo CEU,
CERTIFICAN:
Que la presente Memoria, titulada ADRENOMEDULINA Y PAMP, NUEVAS
DIANAS TERAPÉUTICAS PARA EL DISEÑO DE AGENTES
ANTIPROLIFERATIVOS Y/O ANTIANGIOGÉNICOS ha sido realizada bajo su
dirección en la Sección de Química Orgánica y Farmacéutica del Departamento de
Química de la Universidad San Pablo CEU, por la licenciada en Farmacia Dña.
Virginia Roldós Serrano, y autorizan su presentación para ser calificada como
Tesis Doctoral.
Montepríncipe, 24 de Junio de 2008
Fdo. Dra. Dña. Beatriz de Pascual-Teresa Fernández
Fdo. Dra. Dña. Ana Ramos González
VºBº Directora del Departamento
Beatriz de Pascual-Teresa Fernández
AGRADECIMIENTOS
Gracias a mis directoras de tesis Dra. Beatriz de Pascual-Teresa y Dra.
Ana Ramos González. Cada una, a su modo, ha sabido enseñarme su gran
profesionalidad y trasmitirme su vasta experiencia con atenta dedicación, valiosas
enseñanzas que espero poder aplicar en el futuro con su misma pericia. Gracias
por su calidez humana, su paciencia infinita frente a mi tozudez, su comprensión y
su amistad. Gracias por su sentido del humor y sus constantes palabras de aliento
cuando parecía que los astros confabulaban en nuestra contra.
Gracias a la Dra. Sonsoles Martín Santamaría por su apoyo, consejos y
estímulo permanente, por su incondicional ayuda y su amistad.
Gracias al Dr. Miguel Julián Viñals por tantísimas horas de labor
compartida y solidaria, por sus enseñanzas, su optimismo y su amistad.
Gracias al Dr. Alfredo Martínez Ramírez por permitirme realizar una
estancia en su laboratorio del Departamento de Neuroanatomía y Biología Celular
del Instituto Cajal de Ciencias Neurobiológicas. Gracias por su apoyo permanente
y su vivo interés en nuestro trabajo. Gracias también a los Dres. José Rodrigo,
Ricardo Martínez Murillo, Patricia Fernández y Julia Serrano por su simpatía y
afectuosa acogida.
Gracias a la Dra. Sonia de Pascual-Teresa por permitirme realizar ensayos
de proliferación celular en su laboratorio del Instituto del Frío (CSIC) y por su
asesoramiento. Gracias a María Hidalgo por su desinteresada ayuda.
Gracias a los directores de la sección de Biología Vegetal y Ecología, de la
Sección de Parasitología y de la sección de Bioquímica por permitirme utilizar su
equipamiento para las pruebas biológicas.
Gracias al Dr. Antonio Pineda-Lucena del Centro de Investigación Príncipe
Felipe y sus colaboradores Dr. Rodrigo Carbajo y Dra. Anne Schott por la
realización de los experimentos de RMN.
Gracias a las Dras. Danièle Altschuh y Laurence Choulier de École
Supérieure de Biotechnologie (CNRS) por la realización de los experimentos SPR.
Gracias al Sr. Decano, Dr. Agustín Probanza Lobo, por su permanente
disposición y comprensión, por su apoyo sincero de siempre y su valiosa ayuda.
Gracias a los compañeros de departamento que me han acompañado en
estos años: Gema, Javier, Alberto, Álvaros, Marta, Amalia, Cristina, Teresa,
Mónica, Edu, Ana, Pilar, Susana y muy especialmente a mis compañeros de grupo
José María, José Juan y Mario, con quienes he compartido más estrechamente
nuestras horas de cacharreo. Gracias a Berta por su apoyo, su cariño, su simpatía
y generosidad. Gracias a Ángel por tantas horas de risas cómplices, por su
generosidad y su nobleza. Gracias a Irene por su preciosa amistad, por
perdonarme cientos de despistes y llegadas tarde, por su honestidad y su gran
corazón.
Gracias a la Universidad San Pablo CEU por la concesión de una beca
predoctoral y diversas ayudas para estancias y asistencias a congresos, así como
la utilización de sus instalaciones y medios.
Gracias a la Sociedad Española de Química Terapéutica por la concesión
del premio Ramón Madroñero.
Gracias a mi familia, especialmente a mi madre y mi hermana por apoyar sin
condiciones mis determinaciones, por estar siempre presentes y saber tender
infinitos puentes a través del océano. Gracias por su amor y entrega. Gracias por
hacerme ser mejor ser humano cada día.
Gracias a Mariano por sus palabras y sus silencios, su amor y su luz.
Gracias por compartir conmigo la infinita ilusión de nuestro hijo, nuestro sueño
mayor.
Finalmente gracias a Madrid. Nunca sospeché que podría querer otra
ciudad que no fuera mi Montevideo. Menos podía pensar en esta posibilidad
cuando no hay mar en este horizonte, están tan lejos los abrazos de los míos y el
sol de Castilla se empeña en resecar la tierra y mi piel. Por fortuna estaba
equivocada. Al principio tímidamente y después en alud, esta ciudad me mostró
seres humanos excepcionales y aunque ha habido de los otros, no hay
mezquindad capaz de empañar el brillo de esta villa.
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
ACTH Corticotropina
AM Adrenomedulina
AMPc Adenosín monofosfato cíclico
ARNm Ácido ribonucleico mensajero
Boc terc-butoxicarbonilo
BSA Albúmina sérica bovina
CGRP Péptidos relacionados con el gen de la calcitonina
CoMFA Análisis comparativo de campos moleculares
CRLR Receptor del tipo del receptor de la calcitonina
CV Validación cruzada
DCM Diclorometano
DMF N,N-Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfóxido
DMSO-d6 Dimetilsulfóxido hexadeuterado
EM Espectro de masas
FEP Perturbación de energía libre
FMM Método multipolar rápido
GA Algoritmo genético
GB/SA Modelo generalizado de Born / Área superficial
GPCRs Receptores acoplados a proteínas G
GRIND Descriptores independientes de alineamiento
HTS Cribado de alto rendimiento
IBMX 3-Isobutil-1-metilxantina
IE Impacto electrónico
IR Infrarrojo
LBDD Diseño de fármacos basado en el ligando
LGA Algoritmo genético lamarkiano
LICA N-isopropil-N-ciclohexilamiduro de litio
MD Dinámica molecular
MEP Potencial electrostático molecular
MIF Campo de interacción molecular
MIP Potencial de interacción molecular
MM Mecánica molecular
MM-GBSA Mecánica molecular-área de superficie generalizada de Born
MMP-2 Metaloproteasa 2 de la matriz
MM-PBSA Mecánica molecular-Área de superficie Poisson-Boltzmann
MTT Bromuro de 3-(4,5-dimetilltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio
NCI Instituto Nacional del Cáncer
p.f. Punto de fusión
PAMP Péptido 20-N-terminal de la proadrenomedulina
PB Poisson-Boltzmann
PBC Condiciones de límite periódico
PBS Tampón fosfato salino
PC Componente principal
PCA Análisis de componentes principales
PDB Base de datos de proteínas
PKA Proteína cinasa dependiente de AMPc
PLS Mínimos cuadrados parciales
PMA Ácido fosfomolíbdico
PME Particle Mesh Ewald
QM Mecánica Cuántica
QSAR Relación estructura-actividad cuantitativa
QSAR-3D Relación estructura-actividad cuantitativa tridimensional
RAMP Proteína modificadora de la actividad del receptor
RMDS Desviación cuadrática media
RMN Resonancia magnética nuclear
SA Superficie accesible al disolvente
SAR Relación estructura actividad
SBDD Diseño de fármacos basado en la estructura
SDS Dodecilsulfato-d25 de sodio
SNC Sistema nervioso central
SPR Resonancia de plasma en superficie
TA Temperatura ambiente
TCA Ácido tricloroacético
TFE Trifluoroetanol
THF Tetrahidrofurano
TMS Tetrametilsilano
VEGF Factor de crecimiento endotelial vascular
VS Cribado Virtual
Índice
Introducción 1
Antecedentes 1. Estructura
2. Biosíntesis, liberación y metabolismo
3. Receptores
4. Funciones
5. AM y PAMP: perspectivas de su aplicación terapéutica
6. Moduladores de la acción de AM
7. Diseño de fármacos
7. 1. Diseño indirecto
7. 2. Diseño directo
7. 2. 1. Cribado virtual o virtual screening
7. 2. 2. Dinámica Molecular
5
5
9
12
15
23
27
32
33
39
44
45
Capitulo I. Diseño, síntesis y evaluación biológica de moduladores negativos de Adrenomedulina como agentes antitumorales
I. 1. Objetivos y Plan de Trabajo 61
I. 2. Discusión de Resultados I. 2. 1. Síntesis
I. 2. 2. Actividad Biológica
65
65
71
I. 3. Conclusiones 89
I. 4. Parte Experimental I. 4. 1. Materiales y Métodos
I. 4. 2. Síntesis
I. 4. 2. 1. Cloruros de 4-[carboxi(fenil)metil]-4-hidroxipiperidinio
I. 4. 2. 2. 4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil)piperidin-1-carboxilato de
terc-butilo (21)
91
91
96
96
106
I. 4. 2. 3. Cloruro de 4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil)piperidinio (22)
I. 4. 2. 4. Método general de la preparación de 2-(1-alquil-4-hidroxipiperidin-
4-il)-2-metilpropanoato de metilo (23-34)
I. 4. 2. 5. 2-(1-etil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (35)
I. 4. 2. 6. 2-(1-benzoil-4-hidroxi-piperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (36)
I. 4. 2. 7. 2-(4-etil-1-hidroxiciclohexil)-2-metilpropionato de metilo (38)
I. 2. 4. 8. Ácido 2-(1-etil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropanoico (37)
I. 2. 4. 9. Ácido 2-(4-etil-1-hidroxiciclohexil)-2-metilpropanoico (39)
I. 2. 4. 10. (1-etil-4-hidroxipiperidin-4-il)(fenil)acetato de metilo (17)
107
107
115
116
116
117
117
118
I. 4. 3. Determinación de la afinidad I. 4. 3. 1. Ensayo de competición
I. 4. 3. 2. Determinación de la afinidad por SPR
I. 4. 4. Ensayos Biológicos
I. 4. 4. 1. Análisis de la producción de AMPc
I. 4. 4. 2. Pruebas antiproliferativas
I. 4. 5. Estudios QSAR- 3D
119
119
119
120
120
122
123
Capitulo II. Cribado virtual de pequeñas moléculas con posible actividad como moduladores negativos del PAMP
II. 1. Objetivos y Plan de Trabajo 127
II. 2. Discusión de Resultados II. 2. 1. Cribado Virtual
II. 2. 2. Ensayo de competición
II. 2. 3. Determinación de la afinidad por SPR
129
129
140
142
II. 2. 4. Dinámica Molecular
II. 2. 5. Evaluación de la actividad antiangiogénica
II. 2. 6. Pruebas Antiproliferativas
II. 2. 7. Resonancia Magnética Nuclear
145
167
168
171
II. 3. Conclusiones 175
II. 4. Parte Experimental
II. 4. 1. Cribado Virtual
II. 4. 2. Ensayo de competición
II. 4. 3. Determinación de la afinidad por SPR
II. 4. 4. Dinámica Molecular
II. 4. 5. Angiogénesis: Ensayo de anillos de arcos aórticos de pollo II. 4. 6. Pruebas antiproliferativas
II. 4. 7. Resonancia Magnética Nuclear
177
177
182
183
184
186
187
188
Bibliografía 189
Introducción
Introducción
1
Introducción
La Adrenomedulina (AM) y el péptido 20-N-terminal de la
proadrenomedulina (PAMP) son dos péptidos biológicamente activos relacionados
entre sí y que desarrollan papeles muy importantes en la regulación de diversas
funciones biológicas.
La AM es un factor vital para la supervivencia de las células tumorales ya
que, además de comportarse como un factor de crecimiento, reduce la apoptosis,
su producción aumenta en situaciones de hipoxia y muestra una acusada actividad
proangiogénica en modelos ex vivo e in vivo.
El PAMP es aún más potente como factor angiogénico y su inhibición
provoca la reducción del crecimiento tumoral.
En el presente trabajo nos hemos planteado la búsqueda de pequeñas
moléculas que, a través de su unión a estos péptidos, puedan modular su
actividad. Especial interés poseen los moduladores negativos, por su potencial
utilidad como agentes antitumorales y/o antiangiogénicos.
Para este estudio se han aplicado dos estrategias diferentes de diseño de
fármacos. En el caso de la AM, al no disponer de la estructura tridimensional, se
ha llevado a cabo un diseño basado en el ligando. Por el contrario, la
disponibilidad de la estructura 3D del PAMP, ha permitido iniciar el estudio
mediante un cribado virtual para detectar moléculas que se unan al péptido.
En el capítulo I de esta memoria nos hemos centrado en la AM. En un
estudio de cribado farmacológico puesto a punto en el Instituto Nacional del
Cáncer de EEUU (NCI), se detectaron varios moduladores positivos y negativos de
AM con una interesante actividad hipotensora y antiproliferativa, respectivamente.
Introducción
2
En primer lugar se puso a punto un método de síntesis para obtener una
serie de compuestos estructuralmente relacionados con un cabeza de serie
previamente seleccionado mediante el citado cribado farmacológico llevado a cabo
en el NCI.
A continuación, se evaluó cualitativamente la afinidad por la AM de los
compuestos sintetizados mediante un estudio de competición con su anticuerpo
monoclonal. También se estudió de forma cuantitativa, con la técnica de
Resonancia de Plasma en Superficie (Surface Plasmon Resonance, SPR), la
capacidad de unión de los compuestos a la AM.
Los datos se utilizaron para establecer un modelo QSAR-3D que nos
permitió identificar ciertas características estructurales fundamentales para la
unión a la AM: la presencia de un grupo dador de enlace de hidrógeno y un anillo
aromático. Además, el modelo posee una alta capacidad predictiva y está siendo
utilizado para el diseño de nuevos moduladores más activos.
En la siguiente etapa se determinó la producción de AMPc mediante un
radioinmunoensayo, lo que nos permitió comprobar que los compuestos con un
ácido carboxílico libre se comportan como moduladores negativos de la AM.
Por lo tanto, todos los ácidos sintetizados se sometieron a ensayos de
actividad antiproliferativa en diferentes líneas celulares. El compuesto 16, que es
el que posee mayor afinidad por la AM, mostró una interesante actividad
antiproliferativa frente a la línea celular de cáncer de colon HCT116, por lo que ha
sido seleccionado para llevar a cabo ensayos in vivo en colaboración con el
Centro Integral Oncológico Clara Campal (CIOCC), Hospital de Madrid.
En el capítulo II de esta memoria, nos propusimos buscar pequeñas
moléculas capaces de modular la acción del PAMP. En primer lugar, se llevó a
cabo un cribado virtual, utilizando el programa AutoDock, de la colección de
compuestos del NCI (NCI diversity set), constituida por 1800 compuestos, junto
con 60 compuestos pertenecientes a nuestra quimioteca. Este cribado nos
permitió seleccionar los 50 compuestos con mayor afinidad de acuerdo a criterios
energéticos.
Introducción
3
A continuación se puso a punto un método para determinar
experimentalmente la afinidad de los ligandos por el PAMP, basado en la
competencia con un anticuerpo monoclonal antiPAMP. De esta forma se
seleccionaron los 20 compuestos más afines para realizar otros ensayos
biológicos y de afinidad.
Con la finalidad de profundizar en el conocimiento de las interacciones que
se establecen entre el péptido y un ligando que mostró afinidad por el PAMP
mediante SPR, se llevaron a cabo simulaciones de Dinámica Molecular (DM) del
complejo correspondiente y del péptido libre.
La simulación puso de manifiesto que las interacciones que más
contribuyen a la estabilidad del complejo son las interacciones de tipo catión-π
entre argininas del péptido y anillos aromáticos del ligando y de apilamiento
(stacking) entre anillos aromáticos de ambas especies.
Aplicando los métodos MM-PBSA (Molecular Mechanics Poisson
Boltzmann Surface Area) y MM-GBSA (Molecular Mechanics Generalized Born
Surface Area) y el módulo NMODE de AMBER, se determinó la energía teórica de
unión del complejo PAMP-USP1K (∆Gbind) y se comparó con la energía de unión
calculada para el complejo entre el PAMP y un compuesto que experimentalmente
se ha demostrado que no se une al péptido (PAMP-USP1N). Por otro lado, para el
complejo PAMP-USP1K se calculó la contribución media de la entalpía de unión
de cada uno de los residuos del péptido, confirmando la importancia de las
interacciones detectadas en la simulación de dinámica molecular.
Recientemente, se ha comenzado a estudiar la interacción de nuestros
compuestos con PAMP utilizando técnicas de RMN. Esta técnica permite, no solo
confirmar la formación de los complejos, sino también obtener información
experimental sobre los residuos del péptido implicados en la unión, que podrían
confirmar los datos obtenidos en nuestro estudio teórico.
Finalmente, todos los compuestos que dieron positivo el ensayo de
competición con el anticuerpo monoclonal antiPAMP fueron evaluados en un
Introducción
4
ensayo de anillos aórticos de pollo, para determinar su actividad antiangiogénica,
pero desafortunadamente ninguno de ellos resultó activo.
Sin embargo, tres de ellos han mostrado una interesante actividad
antiproliferativa frente a la línea celular de cáncer de colon Caco-2.
Antecedentes
Antecedentes
5
La AM es un péptido biológicamente activo, que fue aislado por primera
vez en 1993 a partir de extractos de una línea celular de feocromocitoma humano,
un cáncer derivado de la médula adrenal, por un grupo de científicos japoneses
que buscaban péptidos capaces de estimular la producción de adenosín
monofosfato cíclico (AMPc) en plaquetas.1
El PAMP es una molécula peptídica multifuncional que posee varias
funciones biológicas entre las que se encuentra su papel proangiogénico que
favorece el crecimiento tumoral y su efecto inhibitorio de la secreción de
catecolaminas mediado por los receptores nicotínicos.
El papel de estos péptidos en la regulación de diferentes procesos
biológicos y, más específicamente, en enfermedades como el cáncer, los convierte
en atractivas dianas para el diseño de nuevos agentes antitumorales.
1. Estructura
La AM humana es un péptido de 52 aminoácidos con un puente disulfuro
entre los residuos 16 y 21 y con una tirosina amidada en su extremo carboxilo
terminal (Figura 1).1 El puente disulfuro genera un anillo de 6 aminoácidos, con
dos cadenas de diferente longitud que salen del mismo.
Antecedentes
6
Debido a sus características estructurales, la AM, el CGRP (calcinotin
gene-related peptide), la amilina y la calcitonina propiamente dicha están incluidos
dentro de la familia de los péptidos relacionados con el gen de la calcitonina. La
secuencia de la AM no presenta una homología alta con el CGRP (27%), sin
embargo, los péptidos AM, calcitonina, CGRP y amilina tienen características
estructurales comunes, tales como el ciclo de 6 ó 7 aminoácidos, generado por un
puente disulfuro intramolecular y la tirosina amidada en su extremo carboxilo
terminal.2, 3 Estas dos características estructurales son imprescindibles para la
actividad biológica de estos péptidos.4 Entre ellos existe un solapamiento de
acciones biológicas que puede ser debido en parte a la promiscuidad de sus
receptores.5
En el momento de iniciar este trabajo no existía ningún dato sobre la
estructura tridimensional de la AM y su resolución podría suministrar claves para la
determinación del mecanismo involucrado en la modulación de su actividad.
Los esfuerzos realizados en nuestro grupo de investigación para proponer
un modelo basado en la homología por el momento no han dado resultados
positivos, ya que no se conoce la estructura tridimensional de ninguna proteína
suficientemente homóloga.
Figura 1: Representación de la AM donde se muestra el puente disulfuro que da lugar al ciclo
entre los aminoácidos 16 y 21.
Antecedentes
7
Tampoco los modelos que obtuvimos por threading fueron de calidad
suficiente y no fue posible llegar a un consenso entre los distintos servidores
utilizados.6
En cuanto a los intentos de resolver su estructura mediante la técnica de
difracción de rayos X, no condujeron a ningún resultado positivo debido a que
sufre agregación y no fue posible conseguir cristales adecuados para su estudio.
Finalmente, y en el momento de imprimir esta tesis, ha sido posible obtener un
espectro de RMN con calidad suficiente para resolver la estructura tridimensional
de la AM. Este trabajo fue realizado por el Dr. Javier Pérez Castells (USP-CEU) y
el Dr. Jesús Jiménez Barbero del CIB (Centro de Investigaciones Biológicas).
El PAMP fue aislado por primera vez en 1993 al mismo tiempo que la AM.7
Posee una secuencia de 20 aminoácidos en la que su extremo carboxilo terminal
se encuentra amidado (PAMP-[1-20]; ARLDVASEFRKKWNKWALSR-amida).
La estructura tridimensional del PAMP y su conformación más estable fue
determinada en 2005 usando espectroscopia de RMN bidimensional de 1H y 13C y
modelado molecular.8 Evaluando las diferencias entre conformaciones obtenidas
del PAMP en dos disolventes, los autores de este trabajo determinaron que la
estructura consiste en una α-hélice desde la ARG2 hasta la ARG20 en
trifluoroetanol/agua (TFE/H2O) y desde ARG2 hasta ALA17 en dodecilsulfato-d25 de
sodio (SDS) (Figura 2). Este último se utiliza mucho en investigación estructural
puesto que, a través de la formación de micelas, genera un ambiente hidrófobo
que emula las membranas biológicas o el interior de las proteínas.9
Antecedentes
8
Figura 2: Estructura tridimensional del PAMP (Código PDB = 2FLY).
El hecho de que los residuos de 18 a 20 no adopten la conformación de α-
hélice en SDS sugiere que podrían tener un papel esencial en el reconocimiento y
unión del PAMP a su receptor. Esto coincide con los estudios de Mahata y cols.10
que demuestran la importancia de los residuos del extremo C-terminal en la
actividad fisiológica. Este grupo observó que la eliminación de la amida del
carboxilo terminal disminuye levemente la actividad y que la eliminación de los tres
aminoácidos de este extremo anulaba completamente la acción del PAMP en sus
receptores nicotínicos.
Pero no sólo el extremo C-terminal es necesario para la actividad. Belloni y
cols. determinaron que el fragmento peptídico PAMP-[12-20], no inhibe la
secreción de catecolaminas pero actúa como un antagonista débil de la actividad
del PAMP.11 El hecho de que el PAMP-[12-20] sea capaz de unirse a los
receptores nicotínicos aunque no produzca los mismos efectos que el PAMP
sugiere que los dos extremos N y C-terminal son fundamentales para la inhibición
de secreción de catecolaminas desde estos receptores.
Por otra parte, Martínez y cols.12 investigaron el potencial angiogénico del
PAMP en ensayos in vitro e in vivo. Observaron que el PAMP induce el
crecimiento de los vasos sanguíneos (respuesta dosis dependiente) y que el
fragmento peptídico PAMP-[12-20] produce una acción antagónica del PAMP,
inhibiendo su acción angiogénica. Estos resultados indican que los extremos C y
Antecedentes
9
N-terminal son fundamentales tanto para la actividad angiogénica como para su
acción inhibitoria de la secreción de catecolaminas.
2. Biosíntesis, liberación y metabolismo
Tanto la AM como el PAMP provienen del mismo gen y éste se ha
secuenciado en distintas especies (rata, cerdo, vaca, ratón y hombre).13-15
El gen humano contiene cuatro exones y tres intrones. La pérdida de los
tres intrones del ARNm recién transcrito da lugar al ARNm maduro denominado
Forma A (Figura 3). Después de la translación de la misma se produce una
prehormona de 185 aminoácidos llamada preproadrenomedulina. Ésta debe sufrir
distintas modificaciones post-transduccionales antes de producir la
proadrenomedulina y dar lugar a dos péptidos amidados: AM y PAMP (Figura 3).16
El PAMP es liberado de la proadrenomedulina por proteolisis en el primer grupo de
aminoácidos básicos (GLY42LIS43ARG44), después de lo cual tiene lugar la
amidación post-translacional del C-terminal del PAMP, en respuesta a la señal de
la GLY por la enzima monooxigenasa α-amidante de peptidilglicinas.
La AM secretada, también llamada AM inmadura, posee un aminoácido
más (GLY) y es convertida en AM madura por amidación enzimática. La enzima
amidante, monooxigenasa α-amidante de peptidilglicinas, es coexpresada con la
AM en diferentes tejidos y contiene dos dominios que catalizan dos reacciones
consecutivas: monooxigenasa hidroxilante de peptidilglicinas y lipasa α-amidante
de peptidilhidroxiglicinas.17, 18
Por otra parte, si el intrón 3 se conserva, se produce un ARNm más largo
(Forma B), que posee un codon prematuro. Este codon evita la transcripción de la
AM, dando lugar sólo a la producción de una prohormona más pequeña que solo
contiene PAMP.16
Esto explicaría que la relación PAMP/AM en las células y tejidos donde se
expresa el gen sea diferente dependiendo del tejido y la especie a la que
Antecedentes
10
pertenezca, e incluso el hecho de que solo uno de los péptidos esté presente
exclusivamente en determinados tipos de células.16
Figura 3: Representación esquemática de los pasos intermedios en la biosíntesis de la AM y el
PAMP. El gen de la AM humana tiene cuatro exones y tres intrones. El ARN maduro puede estar
presente en dos formas: A y B. La forma A se traduce en una proteína precursora, la
preproadrenomedulina, de un tamaño de 185 aminoácidos y da lugar a dos péptidos activos, la
AM y el PAMP. La forma B da lugar únicamente al PAMP.
La secreción de AM se ha estudiado en cultivos de células endoteliales,
células del músculo liso vascular y cardiomiocitos. Factores como el estrés
oxidativo, citoquinas proinflamatorias, angiotensina II, hipoxia e hiperglicemia
estimulan la producción de AM.19 En la médula adrenal, la AM es secretada junto
con las catecolaminas en respuesta a la estimulación colinérgica. A diferencia de
otros péptidos, la AM no se almacena en gránulos (excepto en las células
endocrinas pancreáticas), sino que se libera inmediatamente después de su
síntesis.
3’
Exón 1 Exón 2 Exón 3 Exón 4
Preproadrenomedulina
PAMP AM
Forma A
5’
Forma BStop
ARNm ARNm
PAMP
Pre ARNm
Antecedentes
11
En plasma, la AM se une específicamente al factor H del complemento.20
Con esta unión aumentan los efectos mediados por receptor, pero se suprimen los
efectos independientes de él, como la actividad antimicrobiana. Por otra parte, la
AM mejora la actividad del factor H, que es un inhibidor de la ruta alternativa de
activación del sistema del complemento. La AM unida al factor H no se puede
detectar en la mayoría de los ensayos que se hacen en el plasma, por lo tanto los
niveles de AM probablemente son más altos que los publicados en la mayoría de
los estudios. Pero además, los niveles altos de AM que se han detectado en
algunos estados clínicos, especialmente en el shock séptico, podrían estar
sobrestimados en estudios tempranos puesto que en esas circunstancias se
registra una disminución de la concentración de factor H en plasma.19
La AM circulante es rápidamente metabolizada con un tiempo de vida
media de aproximadamente 20 minutos. Los niveles de AM en aorta son más
bajos que en la arteria pulmonar, lo que sugiere que los pulmones podrían ser el
principal lugar de eliminación del péptido.19
Se ha observado la expresión del gen de la proadrenomedulina en la
mayoría de los órganos y tejidos, incluyendo el sistema nervioso central, glándulas
y sistema cardiovascular entre otros.21
Martínez y cols. estudiaron las secuencias de este gen a lo largo de la
evolución de diferentes especies vertebradas y observaron que mientras la
secuencia correspondiente a la AM no sufre grandes cambios, la correspondiente
al PAMP experimenta grandes variaciones.22 Entre ellas se encuentra la función
amida del C-terminal del PAMP que no está presente en peces y aves pero sí se
encuentra en todos los mamíferos estudiados. Las secuencias de este gen en
ratas, cerdos y humanos son idénticas en un 80% y los 12 residuos del extremo C-
terminal están conservados completamente en las tres especies.10
El PAMP se encuentra en plasma y orina, y en muchos tejidos humanos
como la médula adrenal, pulmones, hígado, bazo, páncreas, corazón
(especialmente en la aurícula derecha en una concentración considerable),
corteza cerebral y riñón, entre otros.23 Eto y cols. identificaron la presencia de
PAMP en diferentes tejidos humanos.23 Estos datos se recogen en la tabla 1.
Antecedentes
12
Los niveles de PAMP en plasma aumentan con varias enfermedades tales
como la hipertensión,24 insuficiencia renal crónica,25 insuficiencia cardiaca26 y
glomerulonefritis crónica.27
región ir-PAMPa
Médula adrenal 13.8 ± 7.93 Feocromocitoma 12.3 ± 9.82 Corazón aurícula derecha 5.72 ± 1.11 aurícula izquierda 1.11 ± 0.62 ventrículo derecho 0.10 ± 0.06 ventrículo izquierdo 0.06 ± 0.02 Pulmón 0.02 ± 0.01 Hígado 0.03 ± 0.01 Bazo 0.03 ± 0.02 Páncreas 0.09 ± 0.02 Riñón 0.06 ± 0.03 Intestino delgado 0.05 ± 0.02 Corteza cerebral 0.02 ± 0.01
a ir-PAMP: inmunoreactividad-PAMP (fmol/mg de tejido húmedo)
Tabla 1: Distribución de ir-PAMP en tejidos humanos
3. Receptores Se han clonado y secuenciado varios de los receptores potenciales para la
AM y han presentado diferente afinidad respecto a ella. Algunos de ellos son
capaces de reconocer, además de a la AM, a otros péptidos de la misma familia
como el CGRP. Todos estos receptores pertenecen a la superfamilia de
receptores con siete dominios transmembrana, capaces de activar la proteína G y
formaron parte en su momento del creciente grupo de receptores huérfanos, es
decir, carentes de ligando conocido.
Además de los siete dominios transmembrana, consta de una unidad
conocida como CRLR (calcitonin receptor like receptor ó receptor del tipo del
Antecedentes
13
G
activación[AMPc]
Señal
AC
GPCR
AM
Espacio extracelular
Espacio intracelular
receptor de calcitonina)28, 29 y una proteína modificadora de la actividad del
receptor (receptor-activity-modifying proteins, RAMP). Las RAMP parecen ser
necesarias para transportar el CRLR a la membrana plasmática y para determinar
su patrón de glicosidación. Por otro lado, deben estar presentes para reconocer al
ligando determinando la especificidad del receptor.30, 31 Existen tres tipos de
RAMPs y la asociación del CRLR con cada una de ellas da lugar a un tipo de
receptor específico diferente. La asociación con la denominada RAMP1 da lugar a
un receptor específico de CGRP, mientras que la asociación con RAMP2 se
traduce en un receptor específico de AM. Cuando la AM se une al receptor, la
proteína CRLR interacciona con la proteína G que activa la adenilatociclasa,
dando lugar a una elevación de los niveles de AMPc, que es el responsable final
de su actividad biológica (Figura 4).30
Figura 4: La AM se une al receptor, la proteína CRLR interacciona con la proteína G que
activa la adenilatociclasa y se elevan los niveles de AMPc.
Todo esto ha sido confirmado por varios trabajos, entre ellos, Kamitani y
cols. demostraron la expresión del complejo RAMP2/CRLR como un receptor
funcional de la AM en las células endoteliales y en las células de músculo liso
vascular humano.32
Se ha aislado otro posible receptor para la AM que se expresa
predominantemente en células hematopoyéticas.33 Su secuencia presenta una alta
Antecedentes
14
homología con la del receptor L1 de rata, pero cuando se expresó en células COS-
7 ni éste ni el receptor L1 resultaron funcionales.34
Además de estos receptores, el factor H afecta a algunas de las funciones
descritas para la AM in vitro y podría considerarse un receptor soluble. Pío y
cols.35 aislaron y caracterizaron esta proteína humana y observaron un aumento
en la producción de AMPc inducido por AM, cuando se incubó la línea celular Rat-
2 con AM en presencia de factor H. Se ha observado también que el factor H
produce un aumento en el crecimiento celular en la línea celular T-47D de cáncer
de mama y que aumenta la inhibición de la secreción de insulina mediada por
AM.36 Además, como se mencionó antes, el factor H bloquea el efecto
antimicrobiano de la AM con una respuesta dosis dependiente. Recíprocamente,
la AM influye sobre la función reguladora del factor H sobre el complemento.20
Por otra parte, en varios artículos se han publicado acciones de la AM a
través de mecanismos independientes de AMPc.37, 38
La AM también puede aumentar39, 40 o disminuir41 los niveles intracelulares
de Ca+2 independientemente del AMPc y estimular la óxido nítrico sintasa (NOS)
en células endoteliales.42 Tampoco en el caso de la activación de los canales de
K+ sensibles a ATP en células vasculares del músculo liso, la señalización es
dependiente de AMPc.43
Los sitios de unión del PAMP se distinguen muy bien de los receptores de
la AM aunque aún no se encuentran bien caracterizados.
Recientemente se han publicado datos que sugieren que el receptor
humano de corticostatina MrgX2, un receptor acoplado a proteína G, podría actuar
también como receptor del PAMP.44, 45 También existen publicaciones que
proponen receptores colinérgicos10, 46, 47 o mecanismos alternativos que involucran
varios receptores acoplados a proteínas G44, 48 como el receptor del péptido
liberador de gastrina (GRP-R),49 pero en todos los casos la afinidad del PAMP por
ellos es muy baja.
Antecedentes
15
4. Funciones
Cuando se aisló la AM, la elevación de AMPc intracelular fue el primer
camino de señalización observado. Esta capacidad de aumentar los niveles de
AMPc ha sido confirmada en distintos tipos celulares, tales como las células
endoteliales de vena umbilical humana,50 células mesangiales de rata,51 células
del músculo esquelético de rata,52 miocitos cardíacos durante el período
neonatal,53 células tumorales54 y fibroblastos de rata,55 entre otros.
El aumento en AMPc, como ya se ha mencionado, se produce por la
activación de la adenilatociclasa, que a su vez induce la actividad de la proteína
cinasa dependiente de AMPc (PKA).55
La importancia de la AM ha abierto un amplio campo de investigación que
se manifiesta en la creciente cantidad de artículos publicados en los últimos años
sobre sus interesantes funciones fisiológicas. Se han identificado muchas
funciones en las cuales la AM juega un papel fundamental. Entre otras, cabe
destacar su función vasodilatadora y broncodilatadora, la inhibición de la secreción
de numerosas hormonas, la regulación de la función renal y de la proliferación
celular. El libro editado por Martínez y Cuttitta56 contiene una revisión exhaustiva
sobre éstas y otras funciones de la AM. Se ha estudiado también la relación de
estas funciones de la AM con diversas enfermedades, como el cáncer, la
hipertensión y la diabetes.
En lo que respecta al PAMP, sus actividades biológicas han sido
confirmadas tanto en modelos humanos como animales. El PAMP se encuentra
elevado en una variedad de estados patológicos tales como la hipertensión,24 la
insuficiencia cardiaca,26 la insuficiencia renal crónica57 y el cáncer de próstata.58
La distribución intracelular de AM y PAMP en órganos endocrinos sigue el
patrón esperado para péptidos que actúan como hormonas, acumulándose en
gránulos secretores, como se observa en páncreas,59, 60 la pituitaria anterior,61 y
células del sistema endocrino difuso en el intestino,62 entre otros. En contraste,
algunos estudios ultraestructurales llevados a cabo en órganos no endocrinos, han
Antecedentes
16
mostrado una distribución diferente, que indica que estas moléculas también
poseen funciones a nivel intracelular. Recientemente, se ha publicado que tanto
AM como PAMP se unen a los microtúbulos y pueden regular las funciones del
citoesqueleto.63
4.1. Sistema cardiovascular
La administración sistémica de AM disminuye la tensión sanguínea debido
al descenso de la resistencia periférica vascular.64 Como consecuencia de ello,
aumenta el ritmo y flujo sanguíneo cardíaco.
Se ha observado aumento de los niveles de AM en plasma en situaciones
de hipertensión,65 fallo cardíaco,66 e infarto agudo de miocardio.67 En todos los
casos los niveles de AM en plasma descienden después de la recuperación.
El PAMP puede inducir vasodilatación por una variedad de mecanismos
que dependen tanto del sitio como de la especie: inhibición de la liberación de
norepinefrina de las terminaciones adrenérgicas en el lecho mesentérico
vascular,68 o vasodilatación directa o tono dependiente en ratas,69 o actividad
vasodilatadora mediada por AMPc en gatos.70 Se ha observado que en bovinos el
PAMP inhibe la síntesis y secreción de catecolaminas inducida por agonistas
nicotínicos.46, 71 Sin embargo, el mecanismo exacto o el sitio de acción del PAMP
aún se encuentra en estudio.
4. 2. Sistema nervioso central (SNC)
La AM y sus receptores se expresan abundantemente en el cerebro y los
niveles más altos se encuentran en tálamo, hipotálamo, adeno y neurohipófisis.72, 73
Los niveles de expresión no sólo se deben a la producción local, sino también al
hecho de que la AM puede atravesar la barrera hematoencefálica.74 Por lo tanto,
algunos de los efectos que se observan con la administración periférica de AM
podrían tener lugar vía SNC. Un ejemplo de ello son la inhibición de la ingesta de
Antecedentes
17
agua75 o de sal76 con la administración intracerebroventricular de AM. La
inactivación de la AM por anticuerpos específicos produce acciones opuestas.77
Contrariamente al efecto periférico hipotensor, la administración de AM a
nivel central aumenta la tensión sanguínea y el ritmo cardíaco por estimulación del
sistema nervioso simpático.78
4. 3. Aparato respiratorio
La AM causa vasodilatación y aumento del flujo sanguíneo en los
pulmones79 y también es capaz de producir broncodilatación.80 Recientemente se
ha demostrado con ensayos in vivo el papel fundamental de la AM en la regulación
de la hipertensión pulmonar. La hipertensión arterial pulmonar es la principal
complicación cardiovascular de las enfermedades respiratorias crónicas, y su
desarrollo constituye uno de los indicadores más importantes de mal pronóstico de
la enfermedad. El bajo tono vascular y la respuesta vasoconstrictora frente a la
hipoxia son característicos de la circulación pulmonar. En ellas tiene un papel
esencial el endotelio pulmonar. Las alteraciones estructurales de las arterias
pulmonares en la hipertensión arterial pulmonar afectan preferentemente a la capa
íntima y pueden lesionar las células endoteliales. Qi y cols.81 han demostrado que
la administración crónica de AM reduce la presión arterial pulmonar y desacelera
los cambios ultraestructurales de las arterias pulmonares en ratas hipóxicas, sin
hipotensión sistémica.
Además, como se mencionó antes, los pulmones tienen un importante
papel en el metabolismo de la AM.
El PAMP puede producir broncodilatación. Kanazawa y cols.82 llevaron a
cabo un estudio in vivo con cerdos de guinea anestesiados. Demostraron que
tanto la AM como el PAMP inhiben significativamente la broncoconstricción
inducida por acetilcolina e histamina en concentraciones de 10-7 M, aunque la
acción del PAMP es menos duradera y el efecto broncodilatador de la AM es casi
Antecedentes
18
100 veces mayor. Estos hallazgos sugieren que estos péptidos juegan un papel
importante en las funciones aéreas.
4. 4. El riñón y el balance electrolítico
La infusión intravenosa o intrarrenal de la AM aumenta la producción de
orina y la excreción de sodio. El efecto está asociado principalmente a la
vasodilatación, el aumento del flujo sanguíneo y la velocidad de filtración
glomerular. Sin embargo, la AM también inhibe la reabsorción tubular de sodio.
Además, dosis bajas del péptido aumentan la natriuresis sin afectar a la velocidad
de filtración glomerular, lo que sugiere un efecto predominantemente tubular.83
En las células mesangiales aumenta la concentración de AMPc y con ello
el coeficiente de filtración y la velocidad de filtración glomerular.84 Además, la AM
inhibe la migración y proliferación inducida por angiotensina II de estas células, así
como la producción de especies reactivas de oxígeno.85 Estos efectos tal vez
atenúan la progresión de nefropatías crónicas.
4. 5. Regulación hormonal
El papel primario de la AM en el cerebro parece ser la regulación del eje
hipotalámico-pituitario-adrenal. La AM regula la secreción de arginina-vasopresina
y oxitocina desde neuronas hipotalámicas y aumenta moderadamente la secreción
de hormona de crecimiento en humanos y somatotrofos de rata.86 Además, inhibe
la secreción de corticotropina (ACTH).87
Los efectos de la AM en la médula adrenal están principalmente
relacionados con la regulación de la zona glomerulosa en la corteza y en las
células cromafinas de la médula.88
Se ha demostrado en ensayos in vitro e in vivo que, a nivel del páncreas,
la AM inhibe la secreción de insulina.89
Antecedentes
19
El PAMP, al igual que otros péptidos que se encuentran en la médula
adrenal, afecta a la actividad secretoria de la corteza suprarrenal. Se ha
demostrado la presencia abundante de sitios de unión de [125I]PAMP en las
glándulas suprarrenales y que al igual que la AM, el PAMP inhibe la producción de
la aldosterona estimulada por la angiotensina-II y el K+, tanto en células de la zona
glomerulosa de ratas90 como de humanos.47, 91
Respecto a la glándula pituitaria, se ha observado que el PAMP se
encuentra en humanos, cerdos, ratas y ratones entre otros61, 92-94 y que es capaz
de inhibir la secreción basal de ACTH en cultivos celulares de pituitaria de rata.95
4. 6. Fisiología reproductiva
La AM posee una alta expresión en el aparato reproductor femenino y los
niveles del péptido varían a lo largo del ciclo menstrual. Los efectos de la AM en el
útero incluyen vasodilatación de vasos locales, relajación del músculo liso uterino,
angiogénesis, acciones antiapoptóticas y actividad antimicrobiana.96, 97
También en el aparato masculino la acción de la AM es importante, como
han puesto de manifiesto los estudios de su implicación en la erección.98
4. 7. Proliferación celular
La AM es capaz de inhibir o estimular la proliferación celular según el tipo
de células del que se trate. Estimula la proliferación de las células de la zona
glomerulosa de la corteza adrenal,99-101 en osteoblastos,102-104 células C6 de
glioma,105 además de muchas células de líneas tumorales.54, 106 Por el contrario, la
AM inhibe la proliferación de fibroblastos cardíacos de rata,107, 108 de células
mesangiales,109-111 de las células del músculo liso vascular107, 112, 113 y cultivos de
cardiomiocitos.114
La AM también puede actuar como un factor antiapoptótico de
supervivencia a través de una variedad de mecanismos.115-117
Antecedentes
20
Martínez y cols. han demostrado que células que sobreexpresan AM
muestran niveles más bajos de factores proapotóticos tales como Bax, Bid y
caspasa 8, junto con una mayor resistencia a la apoptosis respecto a células que
no han sido transfectadas.118
4. 8. Actividad Antimicrobiana
La AM está presente en una gran variedad de tejidos protectores (piel,
vías aéreas, tracto gentitourinario, tubo digestivo, córnea) y secreciones (saliva,
leche y sudor) implicadas en la defensa de la colonización microbiana. El papel
protector de la AM ha sido demostrado tanto para bacterias Gram-positivas como
Gram-negativas.119, 120
La unión de la AM al factor H del sistema del complemento provoca una
reducción de su actividad antimicrobiana.20
El PAMP humano posee actividad antimicrobiana contra Escherichia
coli.121 Sólo el PAMP de los primates es capaz de inhibir el crecimiento bacteriano,
indicando que esta actividad ha aparecido recientemente en el árbol filogenético.22
Incluso se ven diferencias de comportamiento al comparar tres formas del péptido
que difieren ligeramente en su estructura. Mientras que la forma del PAMP con el
ácido carboxílico libre (no amidado) es más eficiente que el péptido maduro, el
péptido inmaduro que aún posee una glicina terminal no es activo.22 La habilidad
del PAMP para inhibir el crecimiento bacteriano parece estar relacionada con su
capacidad para insertarse en la membrana exterior, generando poros que afectan
a la integridad de la bacteria.22 Se han demostrado mecanismos similares para
otros péptidos antimicrobianos122 y el análisis por RMN del PAMP8 sugiere que su
estructura es compatible con un mecanismo de esta naturaleza.
Antecedentes
21
4. 9. Regulación de la absorción intestinal
La AM posee una gran potencialidad como agente antiinflamatorio e
inmunomodulador. A dosis muy bajas, del orden de nanomolar, favorece la
recuperación del tejido intestinal inflamado desencadenando un reequilibrio en la
expresión de las citocinas implicadas en el proceso patológico.123, 124
Por otra parte, debido a la presencia del PAMP en el tracto
gastrointestinal, se ha estudiado su posible participación en la absorción de azúcar
a nivel intestinal.125 Se ha demostrado que el PAMP aumenta la captación de
azúcar de concentraciones en torno a 10-12 a 10-7, y que esta acción se debe a la
alteración del transporte de α-glucósido de metilo con la implicación del AMPc.125
Estos estudios se han realizado en yeyuno de ratas y de ellos se deduce que el
PAMP podría tener un papel importante en la absorción de azúcares actuando
directamente sobre los enterocitos.
4. 10. Actividad angiogénica.
La implicación de la AM como agente angiogénico ha despertado gran
interés, pues se ha demostrado mediante el ensayo de membrana corioalantoidea
de pollo que la AM actúa como un potente factor angiogénico.126 Posteriormente
diversos estudios han confirmado la implicación de la AM en el proceso de
angiogénesis en distintos modelos celulares como endometrio humano,127
uterino,128 tumor endometrial129 y células de cáncer de mama.118
El PAMP también puede actuar como un potente factor angiogénico.12 Sus
receptores se encuentran en las células del endotelio microvascular humano y es
capaz de inducir neovascularización en modelos animales a concentraciones seis
órdenes de magnitud inferiores a otros factores proangiogénicos como el VEGF y
la AM.12 Se ha demostrado que las células endoteliales microvasculares humanas
responden al PAMP con aumento de la migración y de la formación de tubos en
los ensayos de Matrigel. Martínez y cols. demostraron que el potencial migratorio
Antecedentes
22
de las células endoteliales aumenta hasta cuatro veces al tratarlas con PAMP a
una concentración de 10-11 M. Además, la presencia de PAMP induce la expresión
de otros factores angiogénicos que incluyen AM, VEGF, factor de crecimiento de
fibroblastos básico (basic fibroblast growth factor, bFGF) y factor de crecimiento
derivado de plaquetas tipo C (PDGF-C).12 Estas observaciones sugieren que el
PAMP posee un efecto dual sobre las células endoteliales: por un lado una
estimulación directa a través de la unión a receptores específicos y por otro la
estimulación indirecta de la angiogénesis mediante la inducción de otros factores.
El PAMP es un agente angiogénico mucho más potente que la AM o el
VEGF cuando se aplica in vivo, por lo que podría tratarse de una de las moléculas
con mayor potencial angiogénico que se conoce.12
Se ha observado que, en presencia de un péptido capaz de inhibir
específicamente los efectos inducidos por el PAMP, se inhibe la angiogénesis
inducida en células tumorales y se retrasa el crecimiento del tumor en modelos de
xenotransplante.12
Por lo tanto, aquellas moléculas que actúen como moduladores negativos
de la acción del PAMP podrían actuar como antiangiogénicas y de esta forma
como antitumorales.
Antecedentes
23
5. AM y PAMP: perspectivas de su aplicación terapéutica
5. 1. Enfermedades cardiovasculares
Como se ha mencionado antes, la concentración de AM en plasma
sanguíneo se eleva en diversas situaciones de estrés que incluyen ejercicio físico
severo,130 fallo cardíaco,66 infarto de miocardio67 e hipertensión.65, 131, 132 En todos
estos casos, el aumento de AM va acompañado de una disminución de la presión
sanguínea y del flujo ventricular izquierdo. Normalmente también se observa una
clara correlación entre la concentración de AM circulante y la de los péptidos
natriuréticos atrial (ANP) y cerebral (BNP) que también poseen propiedades
hipotensoras.66 Estas elevaciones de AM en sangre vuelven a su nivel basal
después de la recuperación de la enfermedad correspondiente, necesitándose, en
el caso del fallo cardíaco, al menos tres semanas para la total normalización de
estos niveles.67
Estas observaciones, recogidas en pacientes aquejados de diversas
enfermedades, se corresponden fielmente con los experimentos realizados en
animales de laboratorio y en voluntarios sanos. Por ejemplo, se ha comprobado
que dosis tan bajas como 0.1 nmol/Kg de AM inyectada en una sola vez pueden
rebajar significativamente la presión arterial en ratas normales. Esta hipotensión
aparece relacionada con una reducción en la resistencia periférica total.133
Además, se ha observado que la AM produce un aumento en la tensión
desarrollada en el corazón, indicando un efecto ionotrópico positivo de esta
molécula.40 Estas observaciones se han corroborado por experimentos en los que
se sobreexpresó el ARNm de la AM mediante transferencia genética134 o en
ratones transgénicos.135
Se han hecho también estudios en voluntarios sanos y se ha comprobado
que a ciertas dosis (8 ng/Kg min. durante 90 min) se observa una marcada
reducción de la presión arterial, pero sin cambios en otros fenómenos afectados
por la AM, tales como la secreción de catecolaminas, renina, hormonas adrenales
Antecedentes
24
o péptidos natriuréticos, indicando que estos últimos efectos necesitan
concentraciones más altas o son regulados de forma paracrina o autocrina, más
que endocrina.136 Todos estos datos sugieren que la AM podría ser secretada en
el torrente circulatorio para contrarrestar los efectos de desviaciones patológicas
que afectan a la presión arterial, y que podría ser usada como un modulador
farmacológico en casos de hipertensión.137
Durante el infarto agudo de miocardio se observa un contínuo y lento
aumento de los niveles de AM en plasma,138 siendo especialmente altos los
niveles de AM en la circulación coronaria en la angina de pecho.139
Los niveles plasmáticos de AM se encuentran elevados también en la
insuficiencia cardiaca, en proporción con la severidad tanto sintomática como
hemodinámica de la patología y en correlación con otros péptidos natriuréticos.140,
141 Por todo ello existen indicios de que la AM podría ser beneficiosa en el
tratamiento de la insuficiencia cardiaca.142
5. 2. Diabetes
La acción inhibitoria de la secreción de insulina por parte de la AM se ha
estudiado profundamente en varias líneas celulares productoras de insulina tales
como RINm, N289, TR4, CRL 2057, CRL 1777 y CRL 2055.60
Cuando se agrega AM a células aisladas de los islotes pancreáticos se
produce una disminución dosis dependiente de la secreción de insulina. Si
además se agrega un anticuerpo monoclonal de AM, se induce un aumento de
cinco veces en la cantidad de insulina secretada.60 Un efecto similar se observa en
ratas.60, 143
En humanos, los niveles de AM en sangre están claramente elevados en
pacientes con diabetes tipo 2, si se comparan con los niveles en pacientes
normales.144, 145 Hayashi y cols. han propuesto que la hiperglicemia se estimula por
la expresión de AM vascular a través de un mecanismo proteína cinasa C
dependiente.146 Sin embargo, se ha demostrado que, cuando se excluyen de los
Antecedentes
25
estudios a los pacientes con nefropatías, los niveles de plasma no son
significativamente distintos de los que presentan los diabéticos o pacientes
sanos.147 Esto es particularmente evidente en pacientes con diabetes de tipo 1 e
insuficiencia renal, cuyos niveles de AM en plasma son mucho más elevados que
los correspondientes a diabéticos con otras complicaciones.148
También se ha sugerido que el aumento de los niveles de AM está
relacionado con un intento por proteger los órganos del daño oxidativo149 y que
esto podría explicar las diferencias en la producción de AM en pacientes
diabéticos de tipo 1 y 2.147, 150
En cualquier caso, puesto que la hiperglicemia es responsable de todos
los desórdenes asociados con la diabetes, un control de los niveles de glucosa en
sangre a través de la regulación de los niveles de AM podría ofrecer un
tratamiento alternativo a las terapias ya existentes para el tratamiento de esta
enfermedad. Especialmente si se tiene en cuenta que ratones knockout
heterócigos para AM que llegan a ser adultos, desarrollan en su edad madura
resistencia periférica a la insulina.151
5. 3. Cáncer
Se ha estudiado que la progresión del cáncer puede acelerarse en muchos
casos debido a ciertos péptidos fisiológicos capaces de inducir crecimiento tumoral
vía mecanismos autocrinos y paracrinos. La AM está profundamente implicada en
la carcinogénesis y la progresión de tumores.126, 152 La primera vez que se
identificó la AM se encontró en un tumor humano (feocromocitoma),1 pero pronto
fue localizada en una variedad de diferentes tipos de cáncer.
En las células cancerosas la AM se puede considerar como un factor de
supervivencia del tumor. Funciona como un péptido regulatorio multifuncional y su
acción consiste en regular varios aspectos de la fisiología de la célula maligna que
promueven su crecimiento. La AM es un factor de crecimiento para las células
tumorales, reduce la apoptosis, aumenta la movilidad de las células y constituye
Antecedentes
26
un agente angiogénico, promoviendo la neovascularización en un medio
hipóxico.118
Se ha observado la sobreexpresión de AM en tumores cerebrales,153 en el
epitelio de las vías aéreas y cáncer de pulmón154 y se ha demostrado su
participación por un mecanismo autocrino/paracrino que podría dirigir la
proliferación neoplásica.54 Se ha publicado otras pruebas de la capacidad de la AM
para estimular el crecimiento de las células tumorales.126, 155, 156 La actividad
proliferativa de la AM ha sido demostrada in vitro.157-160 Cuando un anticuerpo
monoclonal de AM se agrega a un cultivo de una línea celular de cáncer de mama,
se observa una reducción marcada de la proliferación y este efecto se puede
revertir agregando AM exógena.54
Un comportamiento acorde se ha observado in vivo. Las líneas celulares
de glioblastoma humano, el más maligno y común de los tumores cerebrales,
expresan altos niveles de ARNm de AM y esa AM inmunoreactiva es liberada al
medio de cultivo.161 Martínez y cols. caracterizaron el efecto de la sobreexpresión
de AM en tumores mamarios.118 Se transfectaron dos líneas celulares de cáncer
de mama (T47D y MCF-7) con un vector de expresión conteniendo la secuencia
genética que codifica la AM humana. Las células transfectadas expresaron niveles
altos de ARNm de AM, en comparación con las transfectadas con el vector vacío.
En un experimento preliminar in vivo, tres de cada diez ratones inyectados con las
células T47D transfectadas desarrollaron tumores, mientras que ninguno de los
inyectados con las células del vector vacío desarrolló la enfermedad.118
También se han publicado algunos casos en los que la AM inhibe la
proliferación de líneas celulares de cáncer de próstata.162
La implicación de la AM como agente angiogénico también ha despertado
gran interés, pues se ha demostrado, mediante el ensayo de membrana
corioalantoidea de pollo, que la AM actúa como un potente factor angiogénico.126, 163
Posteriormente, diversos estudios han confirmado la implicación de la AM en el
proceso de angiogénesis en distintos modelos celulares.118, 129, 164-167
La hipótesis de que pueda detenerse la progresión de un tumor a través
del bloqueo de la angiogénesis inducida por la AM ha sido demostrada en
Antecedentes
27
experimentos in vivo.161, 168 Estas experiencias muestran el potencial de la AM
como nueva diana para el desarrollo de fármacos antitumorales que actúen
disminuyendo los niveles de AM.
Finalmente, existen publicaciones que describen a la AM como un factor
inmunosupresor, que ayuda a las células tumorales a evadir las acciones del
sistema inmune.20, 169
El papel de la AM como regulador multifuncional de la carcinogénesis y
progresión del tumor está extensamente demostrado y la AM ha sido identificada
como una prometedora nueva diana en la búsqueda de terapias anticancerosas
eficientes.106, 157
6. Moduladores de la acción de AM
La actividad de la AM puede ser modulada de forma indirecta o directa. La
modulación indirecta implica la expresión génica,170-173 transcripción174-176 y
translación tanto de la AM como de sus receptores.
La modulación directa ocurre cuando los moduladores son capaces de
unirse a la AM madura. Hasta ahora se han descrito algunos moduladores
peptídicos y no peptídicos. Pío y cols.20 demostraron que el factor de complemento
H es capaz de unirse a la AM y que esta unión modula la bioactividad, tanto del
factor H como de la AM.
Se ha demostrado que algunas proteínas tienen un papel fundamental en
el metabolismo de la AM. Martínez y cols. han determinado que la AM se
fragmenta in vitro por la acción de la metaloproteasa 2 de la matriz (MMP-2).177 El
enzima MMP-2 produce fragmentos peptídicos a partir de la AM, algunos de los
cuales ejercen el mismo efecto que la AM sobre la tensión sanguínea, otros
ningún efecto y otros un efecto vasoconstrictor. Es importante mencionar que el
factor H previene dicha fragmentación.
También se ha demostrado que los fragmentos AM (22-52), AM (16-31) y
proAM (153-185) actúan como inhibidores de la unión de la AM con su receptor.178
Antecedentes
28
Sin embargo, el inhibidor fisiológico que ha resultado ser más eficaz hasta la fecha
es el anticuerpo monoclonal desarrollado en el laboratorio de los Drs. F. Cuttitta y
A. Martínez en Bethesda (Maryland, USA).179
Ninguno de estos compuestos es útil para su aplicación clínica ya que los
péptidos tienen normalmente una vida media corta, como resultado de la acción
de enzimas proteolíticos. Por otro lado, los anticuerpos pueden producir una
respuesta inmune del organismo, que reduce considerablemente su aplicabilidad.
Por ello es interesante la búsqueda de moléculas pequeñas, capaces de modular
la unión de la AM a sus receptores y proteínas de unión. Para detectar estos
compuestos, el método más adecuado es la realización de una búsqueda y
evaluación de actividad biológica (screening) dentro de una colección de
compuestos.
En el Instituto Nacional del Cáncer (NCI) de USA, integrantes de nuestro
grupo de investigación llevaron a cabo un estudio dirigido a la identificación de
moduladores positivos y negativos de AM, mediante la búsqueda en una colección
combinatoria de moléculas. Esta colección está constituida por alrededor de
250.000 compuestos, que forman parte del Programa de Desarrollo Terapéutico
de los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos y que se encuentra a
disposición de los investigadores de este centro (http://dtp.nci.nih.gov/). El método
consistió en la puesta a punto de un cribado farmacológico (High Throughput
Screening, HTS) para detectar de forma rápida y eficaz la presencia de
compuestos que interaccionan con la AM. Una vez puesto a punto el método, se
realizó el cribado de unos 2000 compuestos y los candidatos obtenidos fueron
sometidos, en una segunda fase, a pruebas que permitieron comprobar los efectos
moduladores de dichas moléculas. Para ello se analizó la influencia de estos
compuestos en la elevación de AMPc inducida por AM en la línea celular Rat2,
que contiene receptores específicos para esta hormona peptídida. Este
experimento permitió clasificar los compuestos en moduladores negativos y
moduladores positivos de la AM. A continuación los moduladores negativos se
sometieron a evaluación biológica en distintas líneas celulares (H1299, T47D y
Antecedentes
29
MCF7), mientras que los moduladores positivos se sometieron a ensayos de
determinación de su efecto sobre la tensión arterial.179
Hasta el momento se han identificado por este procedimiento los
compuestos que se muestran en la figura 5 y que han sido clasificados como
moduladores negativos.
N
OHO
HO
N
OHHO
O
OH
OHO OHO
N
N
OS
O
O
N
N
N
NH2N
S
HO O
OOH
O
O
NHN
N
O OH
HO
O
NN
S
O
O
OH
NHO
O
1
H
Figura 5: Moduladores negativos de AM
Se trata de los primeros moduladores negativos de la AM de naturaleza no
peptídica, con potencial aplicación terapéutica, especialmente en el tratamiento del
cáncer. Suponen además una herramienta muy útil para el estudio del mecanismo
de acción de la AM y para el establecimiento de relaciones estructura-actividad.106
También se han identificado una serie de moduladores positivos, cuyas
estructuras se recogen en la figura 6. Ensayos in vivo han demostrado que estos
compuestos disminuyen la presión arterial en ratas, tal y como cabía esperar,
dado el efecto vasodilatador de la adrenomedulina.179
Antecedentes
30
Figura 6: Moduladores positivos de AM
Uno de los moduladores positivos que demostró un comportamiento
prometedor en los pasos de cribado antes mencionados, fue el bistriazol (color
azul, figura 6). En nuestro grupo de investigación se ha llevado a cabo la síntesis
de una serie de compuestos químicamente relacionados y se ha evaluado su
capacidad de competición por la AM.180 Los resultados se muestran en la tabla 2.
Con estos datos se llevó a cabo un estudio QSAR-3D usando técnicas
computacionales, con el fin de determinar los requerimientos estructurales para
una interacción eficiente con la AM. En casos como éste, en los cuales la
estructura del receptor aún no se conoce, los estudios de relación estructura-
actividad ayudan a menudo a elucidar los requerimientos esenciales de un
potencial ligando para interaccionar favorablemente con su diana, e
indirectamente suministran pistas acerca de las características del sitio de unión.
Con los resultados de la tabla 2 se ha derivado un modelo QSAR-3D con
una alta capacidad predictiva y que ha puesto de manifiesto dos características
relevantes para la unión a la AM: la presencia de un NH libre y de un grupo
aromático capaz de establecer interacciones hidrofóbicas a una determinada
distancia.
O
N
NN
NH
O
N
N N
N H
N
N
N
H
H H
H
OO
OH
O
HO
OHHN
N
N
N
N
OH
N
N N
N
N
OH
H
H O
H
HN
N
NN
O
OH
O
HO
Antecedentes
31
NN
N (CH2)nO
NN
NO
R' R'
RR
Serie 1
n R R’ % Competición 8 Ph NH-Ph 81
8 p-Cl-Ph NH2 19
8 2,4-diclorofenil NH2 48 8 2(1’-hidroxinaftil) NH2 42 8 1(2’-hidroxinaftil) NH2 46 8 p-Cl-Ph NH-Ph 51 8 2,4-diclorofenil NH-Ph 68 8 2(1’-hidroxinaftil) NH-Ph 83 8 1(2’-hidroxinaftil) NH-Ph 24 4 Ph CH2Ph 19 5 Ph CH2Ph 14 6 Ph CH2Ph 3 7 Ph CH2Ph 20
8 Ph CH2Ph 4
O O
HN
HN
(CH2)nPhO
O O
HNN
HOPh
Serie 2
NN
O (CH2)nPhO
NN
OOPh
Serie 3 n % Competición n % Competición 4 1 4 18 5 16 5 4 6 20 6 10 7 7 7 6 8 25 8 5
Tabla 2: Resultados del ensayo de competición para moduladores positivos de la AM.
Antecedentes
32
En el trabajo recogido en esta memoria se plantea un estudio similar con
moduladores negativos. El interés es aún mayor porque los compuestos que de él
se deriven tienen potencial utilidad como antitumorales y/o antiangiogénicos. No
existe ningún antecedente de moléculas pequeñas que actúen como moduladores
negativos de la AM, por lo tanto este trabajo representa una aproximación
novedosa al diseño de agentes antitumorales.
7. Diseño de fármacos La estrategia actual de búsqueda de nuevos y mejores medicamentos es
un proceso complejo e interdisciplinar que suele llevar entre 10 y 12 años de
investigación y desarrollo, con un gasto de 800 millones de euros, tras lo cual tan
solo entre 5-10% de las moléculas llegan a la fase de ensayo clínico y menos aún
son comercializadas. El uso de ordenadores ha facilitado y abaratado los costes
de cada etapa de investigación y desarrollo de un nuevo medicamento. En
particular, parte de nuestro trabajo se centra en el uso de técnicas
computacionales para el diseño de nuevos ligandos o lo que se denomina diseño
asistido por ordenador.
Actualmente, existen dos estrategias principales para abordar el diseño de
fármacos por técnicas computacionales: el diseño directo o basado en la
estructura y el diseño indirecto o basado en el ligando. Se habla de diseño de
ligandos (o de fármacos) basado en la estructura (structure based drug design,
SBDD) cuando se dispone de la estructura tridimensional del receptor o diana
terapéutica. Cuando se desconoce, o no se desea tener en cuenta la estructura
del receptor que constituye la diana farmacológica, el análisis de un conjunto de
ligandos que se unan a esa diana puede suministrar información muy útil para
diseñar moléculas más afines a dicho receptor. Ésta es la metodología que se
denomina diseño indirecto o diseño de fármacos basado en el ligando (ligand
based drug design, LBDD).
Antecedentes
33
En este trabajo se han abordado las dos estrategias. Como la estructura
tridimensional de la AM no se conoce, la búsqueda de moléculas capaces de
unirse a ella se realizó mediante diseño indirecto. En el caso del PAMP, para el
que se conoce la estructura 3D, nos planteamos un diseño de fármaco basado en
la estructura.
7. 1. Diseño indirecto La manipulación de una estructura cabeza de serie para obtener diversos
compuestos análogos y la evaluación cuantitativa de la actividad biológica de
éstos puede proporcionar información muy útil incluso cuando no se encuentre
ningún análogo de mayor actividad. El análisis de los resultados obtenidos puede
llevar al establecimiento de relaciones estructura-actividad o QSAR (Quantitative
Structure-Activity Relationships).
El concepto de QSAR se basa en el hecho de que las propiedades
biológicas de un compuesto están en función de parámetros fisicoquímicos, tales
como solubilidad, lipofilia, efectos electrónicos, ionización, estereoquímica, etc.181
Con el establecimiento de relaciones estructura-actividad se logran dos
objetivos: en primer lugar, el establecimiento del grupo farmacóforo, es decir, de la
estructura mínima responsable de la acción de las moléculas consideradas, que
debe ser común a todos los compuestos que ejerzan su acción farmacológica a
través de una misma interacción molecular con el receptor. En segundo lugar, el
establecimiento de cuáles son los sustituyentes que, situados sobre dicho
farmacóforo, conducen a un compuesto con propiedades terapéuticas óptimas (no
sólo en cuanto a actividad biológica, sino que se pueden relacionar con
selectividad de acción, distribución, toxicidad, etc.), es decir, optimización del
cabeza de serie.
Cuando las relaciones QSAR hacen uso de descriptores fisicoquímicos que
dependen de la estructura tridimensional de la molécula, entonces se habla de
QSAR-3D.182 Actualmente, su uso está muy extendido, no solo para predecir
Antecedentes
34
actividades, sino también para estimar otras propiedades (toxicidad,
biodisponibilidad, etc.).
Para llevar a cabo un estudio QSAR-3D se deben calcular los descriptores
químicos tridimensionales y correlacionarlos con actividades a través de análisis
estadístico multivariante.
Para determinar los descriptores interesa describir propiedades
fisicoquímicas de una molécula que tenga que ver con su posible modo de unión.
Estas propiedades estarán relacionadas con las fuerzas de interacción molecular.
Debido a que las interacciones ligando-receptor son óptimas a una determinada
distancia r, es útil construir una malla alrededor de cada ligando y calcular en
cada punto de esa malla o grid, su potencial de interacción molecular (molecular
interaction potential, MIP) con determinados grupos químicos, llamados sondas.
En el caso de que el cálculo del MIP considere una sonda protón y dicho cálculo
considere la función de onda de la molécula, entonces, se habla de potencial
electrostático molecular (molecular electrostatic potential, MEP). A la distribución
de valores de MIP alrededor de una molécula se le denomina campo de
interacción molecular (molecular interaction field, MIF). Existe una gran variedad
de descriptores para simular diferentes átomos o grupos funcionales. Por
ejemplo, existen desde descriptores para simular oxígenos carbonílicos a otros
que simulan grupos carboxílicos alifáticos. Se han desarrollado otros descriptores
denominados descriptores independientes de alineamiento (GRid INdependent
Descriptors, GRIND)183 que permiten obtener modelos QSAR-3D sin necesidad
de superponer los compuestos.
Una vez calculados los MIFs de una serie de moléculas, podemos
construir una matriz que correlacione cada valor de actividad con los valores del
MIF. Esta matriz tendrá tantas filas como moléculas (n) y tantas columnas como
puntos tenga el MIF, más el valor de actividad (x+1). La resolución de este
sistema se obtiene con la aplicación de métodos de análisis multivariante: análisis
de componentes principales (principal components analysis, PCA) y mínimos
cuadrados parciales (partial least square, PLS).
Antecedentes
35
El análisis de componentes principales (PCA) es un método de reducción
de variables. Normalmente, en estudios QSAR-3D, la matriz contiene menos de
100 objetos (que son los ligandos) y varios miles de variables x. Mirando
directamente estos números, nadie podría descubrir patrones, tendencias, pautas,
clusters (agrupamientos o conglomerados), etc. en los objetos. El PCA es una
técnica extremadamente útil para resumir toda la información contenida en la
matriz-X y ponerla en una forma inteligible.
En el análisis de componentes principales, las p variables originales (x)
son reemplazadas por un número menor de m nuevas variables (t) llamadas
componentes principales, de forma que la pérdida de información sea mínima. Ello
se consigue expresando cada nueva variable ti como un vector combinación lineal
de las p variables originales.
t1 = c11χ1 + c12χ2 + … + c1pχp
t2 = c21χ1 + c22χ2 + … + c2pχp
tm = cm1χ1 + cm2χ2 + … + cmpχp
Los componentes principales deben ser ortogonales, es decir, no estar
correlacionados entre sí. Cada nueva variable ti acumula, de forma decreciente
(desde 1 hasta m) el máximo de información original. En teoría se pueden obtener
tantos componentes principales como variables originales, si bien con un número
reducido m << p se retiene una cantidad suficiente de la información (varianza) de
las variables originales.
La información no contenida en las variables pi queda como varianza-X no
explicada, en una matriz residual (E), la cual tiene exactamente la misma
dimensionalidad que la matriz-X original.
Al reducir un espacio de cientos o miles de descriptores, que pueden
contener información redundante, a unas pocas variables (de 2 a 5, normalmente,
y totalmente independientes entre sí), la técnica del PCA permite disponer de las
descripciones multivariantes de una forma intuitiva, manejable y sobre todo
Antecedentes
36
interpretable.184 La distribución que adoptan los objetos (moléculas) en el espacio
de descriptores y su agrupamiento en conglomerados (clusters), se puede
visualizar a través de la representación gráfica de la matriz de puntuación (T)
(scoring). También se puede determinar cómo contribuyen las variables originales
a esta distribución, estudiando la relación entre variables originales y componentes
principales a través de la representación gráfica de la matriz de loadings (P’).
Una variante del PCA aplicada a los estudios de regresión es el método de
mínimos cuadrados parciales (PLS). Mientras que el PCA trabaja únicamente con
variables X, el análisis PLS es una técnica de regresión cuya finalidad consiste en
explicar una o más variables dependientes (Y) en términos de variables X.
Y = f(X) + E
Es posible crear múltiples modelos que satisfagan la ecuación. Entre ellos
el mejor es aquel que permita el cálculo de la variable y que corresponda
correctamente con el valor experimental, incluso para moléculas no incluidas en el
set de construcción del modelo. Estos son los modelo predictivos y pueden ser
utilizados para realizar estimaciones de confianza de los valores Y para nuevas
moléculas, antes de ser sintetizadas.
Los mejores modelos PLS que se puedan obtener están sujetos a la
misma limitación que cualquier otro modelo de regresión, es decir, un modelo de
regresión nunca puede ser mejor que la serie de datos a partir del cual se ha
obtenido. No es posible, por tanto, obtener información sobre áreas en las que no
haya suficiente variabilidad.
Una vez que ha finalizado este proceso es necesario hacer una validación
interna del modelo quimiométrico generado. Para ello, el método más empleado
es la validación cruzada (cross-validation, CV), que permite eliminar el riesgo de
correlaciones casuales. Funciona construyendo modelos reducidos (modelos para
los cuales se han excluido algunos objetos) y que se utilizan para predecir las
variables Y (normalmente actividad) de los objetos excluidos. Entonces, la Y
predicha se compara con la Y experimental, calculándose, entre otros índices, el
Antecedentes
37
q2 (coeficiente de correlación predictivo), que nos indica la calidad predictiva del
modelo.
⎥⎥⎦
⎤
⎢⎢⎣
⎡
−
−−=
∑∑
2
22
)(`)(
1YYYY
q
A veces será necesario ajustar ligeramente el alineamiento del compuesto
o compuestos peor predichos y repetir los pasos anteriores hasta que se
encuentre un alineamiento mutuo que produzca un modelo QSAR-3D con alto
valor predictivo (alto valor de q2).
Es importante darse cuenta de que las variables Y, como cualquier otra
variable experimental, contienen errores. Los modelos tratarán de ajustar la Y
tanto como sea posible y, si se intenta mejorar demasiado el ajuste (fitting), el
modelo explicará también el ruido. Este fenómeno, denominado “sobreajuste”
(overfitting), es muy peligroso porque los modelos sobreajustados parecen muy
buenos modelos, pero no son capaces de predecir los valores de Y de objetos no
incluidos en el conjunto de entrenamiento.185
La capacidad de predicción de un modelo se atribuye a la existencia de
una relación verdadera entre los valores de las propiedades X (normalmente las
energías de los campos de interacción) y los valores de la propiedad Y
(normalmente la actividad de un fármaco). Incluso si los modelos QSAR-3D no son
capaces de explicar completamente los valores de la actividad, son muy valiosos
para identificar las áreas alrededor de las moléculas que más contribuyen a la
actividad. Estas regiones pueden ser consideradas como regiones importantes en
la interacción ligando-receptor, y pueden proporcionar pistas sobre cómo
interaccionan y por tanto ayudar al diseño de nuevos compuestos.
El análisis QSAR-3D tiene tres dificultades principales que superar. En
primer lugar, la identificación de las conformaciones bioactivas de los compuestos
flexibles que forman el conjunto de entrenamiento (training set). La conformación
bioactiva no se corresponde necesariamente con la estructura obtenida del
Antecedentes
38
análisis de la estructura cristalina o con la conformación en solución obtenida por
RMN. En la interpretación más sencilla, sobre todo para la actividad in vitro, la
conformación activa de un ligando se supone que es aquella que corresponde a la
conformación unida al receptor. En segundo lugar, la especificación de los criterios
para comparar las moléculas a la hora de construir un modelo QSAR-3D, lo que se
denomina alineamiento o superposición molecular. Por último, cada molécula del
conjunto de entrenamiento debe ser particionada respecto a las interacciones
intermoleculares (con el receptor). Es decir, se puede esperar que diferentes
partes de cada molécula tengan diferentes tipos de interacción con sitios de un
receptor común y/o en un medio común. Esta forma particionada de la molécula se
denomina farmacóforo de interacción.
Los métodos QSAR-3D más utilizados son el método CoMFA
(Comparative Molecular Field Análisis)186 y el método GRID/GOLPE.187 La
principal diferencia entre estos métodos es el tipo de descriptores que usan: el
método CoMFA calcula dos tipos de campos de interacción molecular: estérico (un
potencial de Lennard Jones 12-6) y electrostático (potencial culómbico); el método
GRID/GOLPE permite calcular un campo para cada sonda química implementada
en el programa GRID,188 que utiliza aproximaciones de la mecánica molecular.
Antecedentes
39
7. 2. Diseño directo
La investigación sobre fármacos que se realiza en la actualidad, a diferencia
de la llevada a cabo hasta hace dos o tres décadas, tiene su punto de mira en los
receptores moleculares. El avance en muchas disciplinas ha hecho posible la
identificación de numerosas macromoléculas diana: fundamentalmente ácidos
nucleicos y proteínas. Entre los avances más importantes realizados en el campo
de la biología molecular se encuentra la posibilidad de producir cantidades
suficientes de proteínas purificadas o del aislamiento desde su fuente natural.
Esto, añadido al avance en las técnicas de determinación estructural, hace que
puedan ser utilizadas como dianas para el diseño de fármacos. Los modelos de
receptores generados por ordenador (métodos teóricos) también nos pueden
servir para el diseño directo, aunque estos modelos deben ser de buena calidad.
El análisis detallado de los complejos ligando-receptor muestra que los
ligandos suelen adaptarse a la forma del sitio de unión, haciendo uso extenso de
su contribución hidrofóbica para la unión e interaccionando mediante enlaces de
hidrógeno. Todas estas observaciones han conducido a un enriquecimiento del
conocimiento del modo de unión desde el punto de vista fisicoquímico.
Los sistemas biológicos se rigen por la asociación no covalente, pero
altamente específica de moléculas. La acción de las hormonas, el reconocimiento
de antígenos por el sistema inmune o el control de la transcripción de ADN son
claros ejemplos.
Debido a que los ligandos que utilizamos como fármacos son moléculas
orgánicas pequeñas y que éstos tienen modos de interacción con sus receptores
muy específicos, el conocimiento del proceso de reconocimiento molecular es de
vital importancia para poder abordar el diseño de nuevos fármacos. El empleo de
técnicas computacionales que nos permitan, no sólo reproducir los procesos de
reconocimiento molecular, sino entenderlos y estudiarlos para, posteriormente,
predecir el comportamiento de determinados ligandos en el seno de los sitios
activos de distintas proteínas, ha permitido un avance muy significativo en el
Antecedentes
40
campo del diseño molecular basado en la estructura, que en general representa
uno de los mayores retos de la química farmacéutica actual.
El diseño basado en la estructura se basa en el análisis de la
complementariedad de los ligandos con una macromolécula en términos de forma,
volumen y otras propiedades fisicoquímicas. El éxito de este análisis puede
proporcionar información sobre nuevas entidades químicas que sean capaces de
interaccionar con distintos receptores terapéuticos o nuevos usos para ligandos ya
conocidos para otros receptores. La primera consecuencia de un diseño basado
en la estructura asistido por ordenador es la reducción drástica del número y de la
magnitud de las pruebas biológicas. En su lugar sólo es necesario probar aquellos
compuestos más prometedores.
El Protein Data Bank (PDB)189 es una base de datos de estructura 3D de
proteínas y ácidos nucleicos que es de dominio público y puede ser usada
libremente (figura 7).
85,1
14,3
0,40,2
Rayos-X RMN Microscopía Electrónica Otros
Figura 7: Aproximadamente el 85% de las estructuras disponibles en el PDB han sido
determinadas por cristalografía de rayos X, 14% por RMN, alrededor del 0.4% por
microscopía electrónica y sólo el 0.2% se determinaron con otros métodos.
Estos datos son enviados por científicos de todo el mundo. Los métodos
experimentales principales de resolución de la estructura de macromoléculas y de
complejos ligando-receptor son la cristalografía de rayos X y RMN. Otros métodos
Antecedentes
41
experimentales menos utilizados incluyen la microscopía electrónica, la difracción
electrónica, la transferencia de fluorescencia y la tomografía electrónica.
Además, cuando no se dispone de la estructura experimental de la
macromolécula problema, aún se pueden utilizar métodos directos de diseño de
fármacos acudiendo a técnicas de modelado molecular. Con éstas se pretende
obtener un modelo teórico de la estructura de la macromolécula, que si bien en
ningún caso será una representación exacta, nos puede permitir explorar las
zonas de interés con una cierta confianza.190 Las técnicas de modelado de
proteínas abarcan: Métodos ab initio, de reconocimiento de plegamiento (fold
recognition)191 y modelado por homología, entre otros.
Dependiendo del tipo de información experimental de que se disponga, la
predicción del modo de unión de un nuevo ligando a su receptor se puede abordar
de diferentes maneras. Es posible que la estructura del receptor objeto de estudio
haya sido resuelta formando complejos con más de un ligando, lo que sería la
situación ideal para el estudio del modo de unión. En ese caso es posible procesar
la información sobre el modo de unión de cada uno de los compuestos para
alinear nuevos ligandos y así conocer su posición de acoplamiento en la proteína.
En los casos en los que únicamente se dispone de uno de estos complejos
resueltos, la información puede ser suficiente para conocer el sitio de unión de
nuevos ligandos. Si se dispone de datos experimentales suplementarios, como
pueden ser estudios de mutagénesis dirigida, es posible un acoplamiento manual
del ligando, con la ayuda de programas de modelado molecular.
Si otros datos experimentales adicionales no están disponibles, es posible
utilizar métodos automáticos para explorar los posibles modos de unión de nuevos
ligandos al receptor problema. Estos son los programas de docking (anglicismo
que se podría traducir por acoplamiento), los cuales realizan una exploración
exhaustiva de posiciones relativas ligando-receptor, evaluando las interacciones
intermoleculares en cada posición explorada. Como resultado de esta exploración
se obtiene una colección de posibles posiciones de acoplamiento ligando-proteína,
que el programa ordena según la puntuación que su función de evaluación le ha
dado a cada solución (scoring). Estos dos pasos consecutivos (exploración y
Antecedentes
42
evaluación) se han resuelto de muy diversas formas en los programas de docking
disponibles.
El programa AutoDock192 es un conjunto de herramientas de docking o
acoplamiento automático. Realmente consiste en dos programas principales:
AutoDock, que lleva a cabo el acoplamiento del ligando en un conjunto de mallas
tridimensionales o grids que describen la macromolécula y AutoGrid, que pre-
calcula dichos grids.
AutoDock hace uso de una técnica de simulación tipo Monte Carlo para
explorar el espacio conformacional y de un sistema de evaluación rápida de la
energía, usando potenciales de afinidad molecular basados en mallas
tridimensionales. Esto permite realizar con eficacia el estudio de un problema de
acoplar un sustrato flexible en el sitio de unión de un receptor rígido. De este
modo, partiendo de la especificación de la estructura tridimensional del receptor,
de la información acerca de la libertad de rotación de los enlaces del ligando y de
una conformación arbitraria de partida, el procedimiento permite realizar un
acoplamiento que puede considerarse altamente efectivo.
La malla tridimensional o grid consiste en un enrejado tridimensional de
puntos regularmente espaciados, envolviendo, completa o parcialmente, a la
macromolécula objeto de estudio (figura 8). Ésta puede ser una proteína, una
enzima, un anticuerpo, el ADN, el ARN, o incluso un polímero o un cristal iónico.
Normalmente, el espaciado de los puntos de la malla varía desde 0,2 Å a 1,0 Å.
Cada punto dentro del mapa de grid almacena la energía potencial experimentada
por un átomo “sonda” o grupo funcional, situado en el interior de cada celda de la
rejilla. Esta energía potencial se debe a la interacción con todos los demás átomos
de la macromolécula. A partir de estos supuestos se debe especificar un nivel de
número de puntos de enrejado en cada dimensión, nx, ny y nz. La energía de la
sonda en cada punto del enrejado se determina mediante el conjunto de
parámetros necesarios para este particular tipo de átomo y la suma de todos los
átomos de la macromolécula, dentro de un radio de no enlace y de todas las
interacciones recíprocas existentes.
Antecedentes
43
Figura 8: representación de una malla tridimensional o grid, los vértices de esta malla
están representados en color verde y está constituida por un conjunto de puntos (puntos
de grid) que se encuentran a una distancia regular los unos de los otros (espaciado o
grid spacing) (color violeta). En cada uno de estos puntos se coloca un átomo-sonda
(probe atom) (color azul).
Los mapas de grid se necesitan para aquellos tipos de átomos presentes en
el ligando que está siendo acoplado. Por ejemplo, si el ligando acoplado es un
hidrocarburo, entonces sólo se requieren mapas de grid de carbono e hidrógeno.
En la práctica, sin embargo, los hidrógenos no polares no se tienen en cuenta de
forma explícita, de tal modo que sólo sería necesario el mapa de enrejado del
carbono, para los átomos de carbono unidos entre sí. Esto ahorra tiempo de
cálculo y espacio en disco.
Las últimas versiones de AutoDock utilizan algoritmos genéticos que han
permitido afrontar, por un lado, el funcionamiento correcto con un sistema que
tenga más de ocho enlaces con libertad de rotación y, por otro, estimar si el
ligando se une con una constante de afinidad milimolar, micromolar o nanomolar.
La versión 3.0 de AutoDock192 ofrece varios algoritmos de búsqueda para
explorar un problema de docking dado: Monte Carlo Simulated Annealing (SA),
Algoritmo Genético (GA) y un algoritmo híbrido entre algoritmo genético y
búsqueda local, conocido como Algoritmo Genético Lamarckiano (LGA). En
general, el método LGA proporciona mejores resultados en la búsqueda de la
energía más baja del sistema. Además, AutoDock incluye un campo de fuerzas de
Antecedentes
44
energía libre de enlace evaluado empíricamente, que permite la predicción de
energías libres de enlace y, en consecuencia, de constantes de asociación para
los ligandos acoplados.
7. 2. 1. Cribado virtual o virtual screening
El descubrimiento de compuestos activos para una diana terapéutica
representa un paso limitante en el proceso de descubrimiento de fármacos. Los
avances en la automatización y el desarrollo de los métodos bioanalíticos han
permitido la aplicación de técnicas HTS, que implica poder realizar ensayos
farmacológicos a millones de compuestos. Un ejemplo que ilustra claramente la
importancia de esta metodología es el hallazgo de oxadiazoles para el tratamiento
de la esquistosomiasis, recientemente publicado en Nature.193
A pesar de que el número de compuestos que pueden ser evaluados
mediante HTS es muy elevado, este número es muy pequeño en comparación con
el astronómico número de estructuras moleculares que podrían tener interés
biológico. Conforme el coste computacional ha disminuido, los investigadores han
dirigido sus esfuerzos a desarrollar métodos computacionales que realicen
cribados virtuales (virtual screenings o cribados in silico) de los compuestos con
potencial interés farmacológico.
Los métodos de cribado virtual deben desarrollarse basándose en un
algoritmo lo suficientemente rápido como para evaluar millones de compuestos
potenciales, pero manteniendo la suficiente precisión como para identificar
satisfactoriamente un subconjunto de compuestos entre los cuales se espera que
haya algún cabeza de serie. De acuerdo con estos requisitos, los métodos de
cribado basados en la estructura utilizan una representación muy simplificada de
las propiedades del receptor: un enrejado (grid) y una función de puntuación
empírica o semiempírica para estimar la fuerza de unión. La función de puntuación
(scoring function) puede variar mucho de unos programas a otros y es difícil
establecer la efectividad real de cada una de ellas.
Antecedentes
45
Para el cribado virtual se pueden utilizar bases de datos de compuestos
(quimiotecas) de dominio público, entre las que se encuentran la base de datos
ACD (Available Chemicals Directory)194, ZINC195, NCI (base de datos del NCI)196,
CSD (Cambridge Structural Database)197 y por supuesto quimiotecas disponibles
previo pago o colecciones privadas de compuestos.
Como el coste de realizar cribados virtuales es mucho menor y más rápido
que los métodos de HTS, pueden proporcionar la clave para limitar el número de
compuestos que hay que evaluar mediante HTS aumentando la eficacia del
proceso de descubrimiento de moléculas con interés farmacológico.
7. 2. 2. Dinámica Molecular
La dinámica molecular constituye una de las principales herramientas en el
estudio de la estructura, dinámica y termodinámica de macromoléculas biológicas.
Prueba de ello son los numerosos artículos científicos publicados hasta el año
2007 que hacen referencia a esta técnica (más de 60.000, algunos de ellos citados
más de 2.000 veces). Esta herramienta computacional calcula el comportamiento
de un sistema molecular a lo largo del tiempo. En este tiempo, es posible que
sucedan desde vibraciones de enlace o cambios conformacionales hasta
movimientos alostéricos, dependiendo del tiempo de integración que se utilice. En
todo caso, la dinámica molecular proporciona cambios en las posiciones de los
átomos de una manera dinámica.
La dinámica molecular se basa en la segunda ley de Newton del
movimiento. Integrando las ecuaciones de movimiento para cada átomo, se puede
obtener la trayectoria que viene definida por las posiciones, las velocidades y las
aceleraciones de los átomos a lo largo del tiempo de simulación.
La dinámica molecular es por tanto un método determinista, lo cual significa
que, una vez conocidas las posiciones y las velocidades de los átomos, es posible
predecir el estado del sistema en cada momento del futuro o del pasado. Las
Antecedentes
46
posiciones iniciales pueden ser obtenidas de la resolución de estructuras mediante
métodos experimentales, como se vio anteriormente.
Al conjunto de estados accesibles a una molécula se le denomina espacio
de fase. Se trata de un espacio 6N-dimensional, ya que el estado de un sistema
de N átomos queda definido al especificar las 3N coordenadas atómicas y los 3N
momentos.
Según la ecuación de la segunda ley de Newton:
iii amF =
donde Fi es la fuerza ejercida sobre el átomo i, y mi y ai son la masa y la
aceleración de ese átomo.
La fuerza sobre un átomo puede ser calculada a partir del cambio en la
energía potencial entre la posición actual y una posición cercana. Esto se conoce
como el gradiente de energía potencial U:
UF ii −∇=
Las energías potenciales pueden ser calculadas mediante el empleo de
métodos de mecánica molecular (MM) o mediante mecánica cuántica (QM). La
MM sólo se puede aplicar en aquellos casos en los que no se produzcan cambios
drásticos en la estructura electrónica, como puede ser la ruptura de un enlace. La
QM, sin embargo, sí puede ser utilizada en esas circunstancias.
Es posible predecir la posición de cada átomo a lo largo del tiempo
mediante el conocimiento de la fuerza y de la masa de cada uno de los átomos.
Para ello es necesario realizar la evaluación de las variables en intervalos muy
pequeños de tiempo (del orden de femtosegundos). El resultado de unir todos
estos pequeños intervalos de tiempo se llama trayectoria. En la práctica, las
trayectorias no se obtienen directamente de la ecuación de movimiento ya que
carece de solución analítica. En primer lugar se calculan las aceleraciones
mediante la resolución de la siguiente ecuación:
Antecedentes
47
2
2
dtrdm
drdU i
ii
=−
en el caso más sencillo donde la aceleración es constante:
dtdva i
i =
a partir de la integración de la ecuación, se calculan las velocidades:
0vtav ii +=
y así
dtdrv i
i =
las posiciones se pueden obtener de la integración de la ecuación anterior:
0rtvr ii +=
Combinando esta ecuación con la expresión de velocidad, se obtiene la
siguiente ecuación que relaciona la posición r a un tiempo t en función de la
aceleración a, la posición inicial r0 y la velocidad inicial v0:
002 rtvatr ++=
Por lo tanto, para calcular la trayectoria de un sistema molecular sólo se
necesitan las posiciones iniciales de los átomos, la distribución inicial de las
velocidades y la aceleración que se determina mediante el gradiente de la función
de energía potencial. Estos datos se obtienen de diferentes formas:
- La topología inicial del sistema se obtiene a partir de datos experimentales o
modelos teóricos.
- La distribución inicial de velocidades se suele obtener al azar mediante la
aplicación de una distribución de Maxwell-Boltzmann a la temperatura del
estudio.
- La energía cinética (K) se define en términos de momento de los átomos (p)
Antecedentes
48
∑=N
i
i
mppK
1
2
21)(
- La energía total del sistema (Hamiltoniano) es la suma de la energía
potencial y la cinética,
)()(),( rUpKprH +=
Se pueden calcular propiedades termodinámicas a partir de una simulación
de dinámica molecular. El valor instantáneo de temperatura se relaciona con la
energía cinética por medio del momento de los átomos según la siguiente
ecuación:
)3(221
2
NTkm
pK BN
i
i == ∑=
donde N es el número de átomos del sistema. Para un sistema aislado, el
momento de traslación total y el momento angular total están conservados y se les
puede asignar un valor cero mediante la elección de velocidades iniciales
apropiadas.
La energía potencial es función de la posición de todos los átomos (3N) del
sistema. Debido a la complejidad de este sistema, no existe una solución analítica
a la ecuación de movimiento y debe ser resuelta numéricamente.
Entre los algoritmos que resuelven numéricamente la ecuación de
movimiento se encuentran el de Verlet,198 leap-frog,199 un derivado de Verlet
conocido como Velocity-Verlet200 y el algoritmo de Beeman.201
Antecedentes
49
7. 2. 2. 1 Condiciones especiales de la dinámica molecular202
Utilización de restricciones
Los movimientos experimentados por una molécula flexible se pueden
distinguir por su frecuencia. Así, podemos hablar de movimientos que tienen lugar
con muy alta frecuencia, como las vibraciones de enlace y de movimientos que
tienen lugar con baja frecuencia, como pueden ser los cambios conformacionales
importantes. Como se ha descrito anteriormente, la evaluación de la posición de
los átomos no se realiza de forma continua, sino que se realiza a determinados
intervalos de tiempo.
Estos intervalos de tiempo pueden ser mayores o menores y no existe un
intervalo ideal ya que depende bastante del tipo de información que deseemos
obtener. Si el intervalo de tiempo es muy pequeño, la trayectoria no recogerá
información de la mayoría del espacio multidimensional aunque nos proporcionará
gran información sobre las vibraciones de enlace. Si el intervalo de tiempo es muy
grande, existe la posibilidad de que surjan errores al integrar el algoritmo, ya que
durante el tiempo entre una integración y la siguiente podrían haberse producido
movimientos de los átomos que violen la ecuación de movimiento, lo que se
reflejaría en un error matemático que detendría la simulación. Normalmente, en el
caso de los sistemas moleculares, se suele escoger como tiempo de integración la
décima parte del tiempo que tarda en realizarse el movimiento más rápido. El
movimiento más frecuente es el del alejamiento-acercamiento del enlace,
especialmente aquél que implica un hidrógeno cuyo período de vibración es de 10
fs, por lo que se suele escoger un intervalo de tiempo de 1 fs.
El coste computacional es mayor cuanto menor sea el intervalo de tiempo
de integración. En el caso de que no sea crucial el conocimiento de los
movimientos de vibración de los enlaces, es posible constreñir éstos a un valor de
equilibrio sin afectar al resto de grados de libertad del sistema, lo cual permite
Antecedentes
50
aumentar el intervalo de tiempo de integración y por tanto reducir el coste
computacional.
Una constricción o restricción es un requerimiento que el sistema debe
cumplir. Es posible constreñir enlaces, ángulos, etc., de tal manera que se fuerza
al sistema a adoptar los valores específicos de esa constricción a lo largo de la
simulación.
Se han desarrollado algoritmos que permiten constreñir movimientos, lo
cual aumenta la velocidad de la simulación. El más conocido es SHAKE,203 que se
aplica al final de cada paso y que se encarga de poner todos los enlaces en sus
respectivos valores de equilibrio permitiendo utilizar intervalos de tiempo de
integración superiores (en torno a 2 fs). SHAKE puede ser utilizado para constreñir
distancias de enlace, ángulos de enlace y diedros, aunque esto puede llevar a
disminuir los posibles cambios conformacionales.
Control de la presión y de la temperatura
Las dinámicas moleculares a temperatura constante introducen un término
λ para ajustar las velocidades y mantener el sistema a la temperatura deseada. El
sistema está acoplado a un baño externo que es el encargado de mantener
constante la temperatura, proporcionando calor o extrayendo calor del sistema.204
21
1)(
1 ⎥⎦
⎤⎢⎣
⎡⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛−+=
tTTt o
τδλ
Los métodos para ajustar la presión a un valor constante funcionan de
manera similar. En este caso se acopla un baño de presión que es análogo al
baño de temperatura y se escala el volumen de la caja de simulación por el factor
λ, que en este caso corresponderá a:
))((1 0PtPt
p
−−=τδλ
Antecedentes
51
Condiciones de límite periódico (Periodic Boundary Conditions, PBC)
Las condiciones de límite periódico surgen como solución al problema de
las fuerzas que experimentan los átomos alojados en los extremos terminales de
la caja de simulación (normalmente una caja de disolvente), ya que estos átomos,
al estar en el límite de la caja, no experimentan las mismas fuerzas que el resto de
los átomos que sí están rodeados de otros átomos en todas las direcciones.
Las condiciones de límite periódico hacen que un sistema se comporte
como si estuviera replicado N veces en el espacio en idénticas celdas formando
una red periódica, en la que cada una de estas celdas es un sistema periódico
simple. Las coordenadas de las partículas que se encuentran en las celdas
replicadas se relacionan directamente con las partículas de la celda original
mediante simple translación. Las fuerzas que experimentan las partículas de la
celda original son calculadas con las partículas de esa misma celda y lo mismo
pasa con las celdas imagen. Si una partícula sale de una celda durante la
simulación se reemplaza por una partícula de una imagen que entra en la celda
por el lado opuesto.
El empleo de las condiciones de límite periódico proporciona una manera
efectiva y rápida de solucionar el problema de los extremos de la caja de
simulación, aunque entran en juego nuevos problemas, como el cálculo de las
fuerzas de largo alcance, que pueden traspasar el límite de la caja y hacer
necesario tener en cuenta las celdas replicadas. Las fuerzas de largo alcance sólo
pueden ser correctamente calculadas mediante la suma de las réplicas del
sistema original. Sin embargo, esto supone un esfuerzo computacional muy
importante por lo que se han desarrollado algunos métodos para poder resolver
este problema, como el del sumatorio de Ewald205 o el fast multipole method
(FMM).206
Antecedentes
52
Distancia de corte (Cut-off)
La cantidad de información que se debe procesar en el cálculo de una
trayectoria de dinámica molecular puede llegar a ser abrumadora. Por ello se
utilizan distancias de corte (cut-off) que permiten reducir el espacio de cálculo
definiendo la distancia máxima a la cual se tienen en cuenta las interacciones
entre átomos. Más allá de esta distancia, las interacciones se desprecian. Esta
aproximación es particularmente interesante en cuanto al cálculo de las
interacciones no enlazantes se refiere, ya que están consideradas como la parte
más costosa desde el punto de vista computacional.
La utilización de un cut-off para las interacciones no enlazantes está
generalmente aceptado para las interacciones de tipo van der Waals, ya que éstas
tienden rápidamente a cero a medida que la distancia entre átomos es mayor. Sin
embargo, en el caso de las interacciones iónicas de átomos cargados, la
dependencia respecto de la distancia es mucho menor que en el caso anterior, por
lo que el empleo de la distancia de corte no es completamente correcto.
El método de Particle Mesh Ewald (PME)205, 207 corrige este problema
relacionado con las interacciones electrostáticas. PME transforma el cálculo de
sumatoria de todas las interacciones electrostáticas posibles en otros dos términos
de convergencia mucho más rápida:
0EEeEeE recdirele ++=
donde Eedir se refiere al espacio directo, Eerec se refiere al espacio recíproco y E0 es
una constante.
Cuando se utiliza este método, las interacciones de rango corto o de
espacio directo son calculadas mediante un potencial culómbico modificado,
mientras que el resto de las interacciones o de espacio recíproco son calculadas a
través del sumatorio de vectores. En el cálculo del espacio directo se utilizan
distribuciones gaussianas para representar las cargas originales, que hacen
converger el término más rápidamente que en su forma original. Dichas
Antecedentes
53
distribuciones son posteriormente contrarrestadas mediante distribuciones
gaussianas de carga inversa en el cálculo del espacio recíproco. En el método
PME se optimiza el cálculo del espacio recíproco a través de la transformación
mediante interpolación de las cargas puntuales a mallas tridimensionales. Dichas
mallas son posteriormente tratadas mediante transformadas de Fourier, las cuales
reducen notablemente el coste computacional.
Tratamiento del disolvente. El agua como disolvente
El agua influye profundamente en la mayor parte de los fenómenos
bioquímicos y la unión de los ligandos a sus receptores no es una excepción. El
disolvente acuoso juega un papel clave en la determinación de la preferencia
conformacional de los ligandos y sus receptores, a la vez que modula las fuerzas
de unión que experimentan entre sí. El efecto hidrofóbico que gobierna muchas de
las interacciones fármaco-receptor es una consecuencia directa de interacciones
desfavorables de solutos no polares en medio acuoso, por este motivo es esencial
tener en cuenta los efectos de solvatación para poder predecir cuantitativamente
las afinidades de unión.
Se han desarrollado numerosos métodos para modelar los efectos del
disolvente, tanto para pequeñas moléculas como para macromoléculas, utilizando
desde modelos de solvente continuo, pasando por la inclusión de moléculas de
disolvente hasta la utilización de métodos híbridos.208, 209 Estas técnicas han sido
desarrolladas tanto para estudios de mecánica molecular como para mecánica
cuántica.
La energía de solvatación se define como la diferencia entre el coste
energético necesario para crear una cavidad en el disolvente y la energía que se
libera debido a las interacciones atractivas de dispersión y electrostáticas que se
producen entre el disolvente y el soluto. Las fuerzas electrostáticas se refuerzan
debido a la polarización tanto en el soluto como en el disolvente. La entropía
también juega un papel importante en cuanto a que el disolvente alrededor del
Antecedentes
54
soluto puede estar más ordenado que si se trata el disolvente en bruto. El
disolvente también reduce la interacción intramolecular de las cargas del soluto y
por lo tanto, puede alterar la preferencia conformacional del soluto.
Debido al coste computacional, las simulaciones con solvente explícito se
llevan a cabo normalmente empleando métodos de mecánica molecular. Los
efectos de la polarización debidos al disolvente se pueden mimetizar mediante el
uso de modelos de solvatación continuos por inclusión de un campo de reacción.
Estos modelos se utilizan tanto en MM como en QM. Los métodos híbridos
consisten en que la primera esfera de solvatación está modelada mediante
moléculas de disolvente explícito, mientras que el resto del disolvente se trata
como modelo continuo. Los métodos que mimetizan adecuadamente la
polarización del soluto pueden ser estudiados únicamente mediante QM.
Disolvente explícito
La inclusión de solvente de forma explícita, de manera que se trata a nivel
atómico, es una de las formas más exactas, pero también más costosas
computacionalmente. En la mayor parte de los casos, se tratan en condiciones
periódicas de contorno (PBC): la molécula de soluto se sitúa en el centro de la
celda y el espacio vacío en ella se rellena con moléculas de solvente. En este
caso, AMBER210 realiza el tratamiento de las interacciones de largo alcance con el
método de sumas de Ewald.
Otra forma de solvatar explícitamente consiste en rodear la molécula con
una capa (cap) de moléculas de solvente y sin tratamiento de condiciones
periódicas de contorno. En este caso, el número de moléculas de agua requeridas
es menor que en PBC, por lo que resulta más asequible computacionalmente que
la solvatación explícita periódica. Para prevenir la evaporación de las aguas en el
límite solvente-vacío, se aplican stochastic boundary conditions mediante la
restricción de un potencial harmónico.
Antecedentes
55
En la versión de AMBER 8210 se ha implementado un modelo alternativo
de solvatación para el tratamiento de esta capa de aguas respecto a versiones
anteriores de AMBER. Así, se incluye una corrección para el campo de reacción
de las aguas que están situadas tras la capa (cap), calculado mediante el método
de diferencias finitas de Poisson-Boltzmann. No se trata de un modelo de
solvatación implícito, como los que se presentan posteriormente, ya que no trata la
generalidad del sistema mediante este modelo.
Las regiones interiores al radio de la capa de aguas (soluto + solvente
explícito) se detallan a nivel atómico y el resto se trata como un medio continuo.
Se destaca que en versiones anteriores de AMBER, se permitía la inclusión de
una cap de aguas que solvatase parcialmente el sistema (normalmente la región
activa). En AMBER 8,210 la esfera de aguas ha de englobar a todo el soluto ya que
modela como un continuo todo aquello más allá del radio de la capa.
Disolvente implícito
La descripción exacta del entorno acuoso puede resultar
computacionalmente cara: la solvatación explícita de una proteína de tamaño
medio requiere miles de moléculas de agua.
Actualmente, la alternativa de reemplazar estas aguas discretas por un
sistema “virtual” de aguas está cobrando gran popularidad. Consiste en modelar
un medio infinito continuo con las propiedades dieléctricas e hidrofóbicas del agua.
Esto es lo que hacen los modelos de solvente implícito, basados en la teoría
clásica de Poisson-Boltzmann (PB). En ellos, el soluto se detalla a nivel atómico,
mientras que las moléculas de solvente y posibles electrolitos se tratan como un
continuo sin estructura, caracterizado por una constante dieléctrica del solvente
(εs). En el interior de la cavidad del soluto, la constante dieléctrica toma valores
característicos de proteínas (εint=2-8) o 1.
Aparte del coste computacional más reducido, estos modelos implícitos
presentan una serie de ventajas frente a la representación explícita del agua,
Antecedentes
56
como evitar el equilibrado del sistema (temperatura y presión); el soluto puede
explorar más rápidamente el espacio de fases debido a la ausencia de viscosidad
asociada a los modelos explícitos; se modela la solvatación en un volumen infinito,
evitándose artefactos del sistema periódico y se facilita la estimación de energías
de estructuras solvatadas. Sin embargo, se pierde también la posibilidad de
analizar interacciones estructurales soluto-solvente, como la formación de enlaces
de hidrógeno.
7. 2. 2. 2. Cálculo de la afinidad de unión Molecular Mechanics-Generalized Born Surface Area (MM-GBSA) Molecular Mechanics-Poisson Boltzman Surface Area (MM-PBSA)
MM-PBSA y MM-GBSA son métodos para evaluar energías libres de unión
o para calcular energías libres absolutas de moléculas en solución.
Las energías son evaluadas de acuerdo a una estrategia desarrollada por
Srinivassan, Kollman y Massova.211, 212 Están basadas en mecánica estadística y
contiene los distintos términos fisicoquímicos que intervienen en el proceso de
unión de un ligando a una proteína, fenómeno esquematizado en la Figura 9.
+
Figura 9: Esquema de unión de un ligando y proteína, con el desordenamiento de
aguas que produce el efecto hidrofóbico.
Inicialmente, la proteína y el ligando se hayan solvatados por moléculas de
agua. Tras la unión, las interacciones intermoleculares no enlazantes (suponiendo
que no hay unión covalente), estabilizan el complejo. El cambio entrópico asociado
al proceso es debido a la reducción de libertad conformacional del ligando (supone
∆G
Antecedentes
57
una reducción de entropía) y por el denominado efecto hidrofóbico producido por
el desordenamiento de las moléculas de agua, inicialmente ordenadas en torno al
ligando y receptor, contribuyendo positivamente al cambio entrópico.
Termodinámicamente, corresponde a la siguiente ecuación donde las
interacciones intermoleculares establecen la variación entálpica.
∆Gbind = GC – (GR + GL)
donde C, R y L son complejo, receptor y ligando.
El objetivo fundamental del método MM-PBSA/GBSA es calcular la
diferencia de energía entre dos estados:
R (aq) + L (aq) C (aq)
R (vac) + L (vac) C (vac)
∆GRsolv ∆GL
solv ∆GCsolv
∆Gbind,vac
∆Gbind,solv
El método combina mecánica molecular, el modelo Poisson-Bolzmann
para las interacciones electrostáticas en el caso de PBSA y la ecuación
generalizada de Born en GBSA, cálculos de área de la superficie accesible al
disolvente y análisis de modo normal para la entropía. La energía libre de unión es
expresada como:
∆Gbind, solv = ∆Gunión, vacío + ∆GC solv – (∆GL
solv + ∆GR solv)
donde ∆Gbind, solv es la energía libre de unión, ∆Gbind, vacío es la energía libre de
asociación entre proteína y ligando en fase gaseosa y ∆GC solv, ∆GL
solv y ∆GR solv
Antecedentes
58
corresponden a las energías libres de solvatación de complejo, ligando y receptor,
respectivamente. Además:
∆Gbind, vacío = ∆GMM - T∆S
donde ∆GMM es la diferencia de energías de enlace, ángulo, ángulo diedro,
electrostática y de van der Waals entre productos (complejo) y reactivos (ligando y
receptor) calculadas con el campo de fuerzas de AMBER. La energía libre de
solvatación está compuesta por dos términos, uno electrostático y otro no polar:
∆GMM = ∆GvdW + ∆Gelec + ∆GINT
∆G solv = ∆Gsolv pol + ∆G np
El término electrostático supone la contribución más importante, debido a
la fuerza de las interacciones soluto-solvente. Este término no sólo incluye estas
interacciones, sino también el trabajo necesario para generar el campo de
reacción del solvente inducido por la distribución de cargas del soluto. ∆Gsolv pol
equivale a la mitad de la energía de interacción soluto-solvente. Esta contribución
electrostática se evalúa a partir de modelos continuos del solvente: bien a partir de
la resolución de la ecuación de Poisson-Boltzmann mediante el método de
diferencias finitas (el método se denomina MM-PBSA)213 o mediante un modelo
Generalizado de Born (MM-GBSA).214 En teoría, los resultados obtenidos por MM-
GBSA ó MM-PBSA son similares, aunque el modelo generalizado de Born es más
rápido.
El término de interacciones no-polares es proporcional al área de la
superficie accesible al disolvente (solvent accesible surface area, SA),215 que
describe el área sobre la cual se produce contacto ligando–proteína, según la
ecuación:
∆Gsolv np = γSASA + β
Antecedentes
59
donde la tensión superficial γ y el término independiente β se fijaron en 0.005 kcal
mol –1 Å-2 y 0.00 kcal mol-1 respectivamente para el cálculo con PB y 0.0072 kcal
mol–1 Å-2 y 0.00 kcal mol-1 respectivamente para el cálculo con GB. La superficie
accesible se determina a partir de la posición del centro de una sonda esférica
(que representa una molécula de solvente, de radio 1.4 Å) que rueda sobre la
superficie de van der Waals de la proteína. Incrementando el valor de los radios de
van der Waals por el radio de la sonda, se obtienen los radios denominados
expandidos (expanded atom radii).
Capítulo I Diseño, síntesis y evaluación biológica de moduladores negativos de Adrenomedulina como agentes antitumorales
I. 1. Objetivos y Plan de Trabajo
Objetivos y Plan de Trabajo
61
I. 1. Objetivos y Plan de Trabajo
Desde el descubrimiento inicial de la AM por Kitamura y cols.1 se han
publicado un gran número de trabajos describiendo su mecanismo de acción y su
gran potencial como diana terapéutica. Los datos de que se dispone hasta el
momento parecen indicar que el control de los niveles de AM con moduladores
negativos podría tener importantes efectos en el tratamiento de diversas
enfermedades.
De especial interés para nosotros es su relación con el cáncer. Se ha
demostrado que la AM estimula el crecimiento celular, es un agente angiogénico
(estimula la vascularización en tejidos tumorales) y un inhibidor de la apoptosis.
El objetivo de este trabajo es la búsqueda de compuestos de bajo peso
molecular, capaces de ejercer un control negativo sobre los niveles de AM y que,
como consecuencia, puedan presentar actividad antiangiogénica y/o antitumoral.
El estudio es totalmente original y novedoso, ya que hasta el momento los únicos
compuestos no peptídicos con conocida afinidad por la AM y capaces de regular
sus funciones son los detectados en el cribado realizado en el NCI, que
constituyen el punto de partida de la investigación que se lleva a cabo en nuestro
grupo de trabajo en esta área.
De entre los diez compuestos que han demostrado interaccionar con la
AM actuando como moduladores negativos (figura 5), para este trabajo hemos
Objetivos y Plan de Trabajo
62
elegido el ácido 1, como cabeza de serie para llevar a cabo la síntesis y
evaluación biológica de una serie de moduladores negativos de la AM. Ello nos
permitirá establecer la relación estructura actividad de este tipo de compuestos y
proponer nuevas estructuras con mayor afinidad y actividad biológica.
Concretamente, nos hemos propuesto la síntesis y evaluación biológica de
dos series de compuestos. Una de ellas consiste en derivados de piperazinas de
tipo A donde R es un grupo etilo o bencilo. La otra serie de compuestos
relacionados son las piperazinas de tipo B, donde se ha eliminado el centro
estereogénico y se ha aumentado la variedad estructural del radical R (figura 10).
HO
N
OCH3
O
RN
HOOH
OAr
R
Tipo A Tipo B
H
+Cl-N
HOOH
OPh
1
H
+Cl-
Figura 10: Compuesto 1 y estructuras químicas de los derivados de
piperazinas de tipo A y B
I. 1. 1. Síntesis
En primer lugar nos planteamos poner a punto rutas de síntesis que
permitieran acceder a los derivados propuestos, utilizando métodos
convencionales. Una vez optimizados los procedimientos, se pretende diseñar
quimiotecas de tamaño pequeño utilizando técnicas combinatorias de síntesis en
paralelo. Con ello se pretendía obtener de forma rápida compuestos con una gran
variedad estructural y establecer la relación estructura-actividad para cada una de
las series.
Objetivos y Plan de Trabajo
63
I. 1. 2. Ensayo de competición
La determinación de la actividad biológica se ha estructurado en varias
etapas. En primer lugar, la evaluación de la habilidad de los compuestos
sintetizados para competir por la unión a la AM con su anticuerpo monoclonal. El
ensayo de competición con su anticuerpo ha sido desarrollado por miembros de
nuestro grupo de investigación179 y permite evaluar simultáneamente y de forma
sencilla un gran número de compuestos, entre ellos las colecciones de
compuestos que se obtengan utilizando técnicas de síntesis combinatoria.
I. 1. 3. Resonancia de Plasma en Superficie y QSAR-3D
Otro de los objetivos de este trabajo es el estudio de la capacidad de los
compuestos para unirse a la AM utilizando la técnica de Resonancia de Plasma en
Superficie (SPR) y con los datos obtenidos llevar a cabo un estudio QSAR-3D.
I. 1. 4. Producción de segundos mensajeros
Con el fin de comprobar que los compuestos sintetizados se comportan
como moduladores negativos de AM, nos hemos propuesto determinar la
producción de segundos mensajeros, mediante un radioinmunoensayo que
permite detectar los niveles intracelulares de AMPc. Cuando la AM se une a su
receptor se produce una elevación de los niveles de AMPc intracelulares, el cual
actúa como segundo mensajero. Para asegurar que los nuevos compuestos son
moduladores negativos de la acción de la AM, se expone la línea celular Rat2 (que
contiene los receptores específicos de la AM) a una mezcla formada por 100 nM
de AM (como agonista) más uno de los compuestos. La disminución de los niveles
de AMPc se analiza mediante un radioinmunoensayo comercial.179
Objetivos y Plan de Trabajo
64
I. 1. 5. Ensayos de proliferación celular
Finalmente nos proponemos evaluar la actividad antiproliferativa en
células tumorales de los compuestos que, con las técnicas anteriores, se muestren
como potenciales moduladores negativos. Las células tumorales serán
suministradas por el grupo de investigación del Dr. Alfredo Martínez (Consejo
Superior de Investigaciones Científicas, Instituto Cajal) y se mantendrán en cultivo
en su laboratorio. Para evaluar la capacidad antiproliferativa de los compuestos,
las células se sembrarán en placas de 96 pocillos y se expondrán a los
compuestos. Al final del experimento el número de células se evaluará mediante
las técnicas de MTT o tiñéndolas con sulforrodamina. Por otra parte, el grupo de
investigación del Dr. Manuel Hidalgo del Centro Integral Oncológico Clara Campal
(CIOCC), Hospital de Madrid, se hará cargo de evaluar la actividad antiproliferativa
en otras líneas celulares.
I. 2. Discusión de Resultados
65
I. 2. Discusión de Resultados
I. 2. 1. Síntesis
En este apartado se describe síntesis de una serie de compuestos
derivados del compuesto 1. Como ya se mencionó anteriormente, este compuesto
constituye el cabeza de serie elegido para, mediante modificaciones estructurales,
conseguir pequeñas quimiotecas de una variedad estructural tal que permitan
establecer relaciones estructura-actividad.
La síntesis de los derivados de piperazina de tipo A se recoge en el
esquema 1. En esta serie se ha sustituido el anillo bencénico por otros sistemas
con grupos atrayentes y donadores de electrones en distintas posiciones.
Asimismo se ha sustituido el anillo bencénico por tiofeno y naftaleno.
N
HOOH
OPh
1
H
+Cl-
66
También, aprovechando la disponibilidad de otra piperidona comercial, se
han preparado análogos de los compuestos anteriores con piperidonas N-bencil
sustituidas. Para la síntesis de todos estos compuestos se ha utilizado el método
descrito por Blicke y Zinnes216 para la síntesis de 1, en la que se hace reaccionar
el ácido fenilacético con N-etil-4-piperidona o N-bencil-4-piperidona en presencia
de iPrMgCl como base.
ArOH
O N
O
RCl
-NR
HOAr
COOH
H+
(a)
1- 24
+
1: Ar = Ph; R = CH3CH22: Ar = Ph; R = PhCH23: Ar = p-Br-Ph; R = CH3CH24: Ar = m-CH3-Ph; R = CH3CH25: Ar = m-HO-Ph; R = CH3CH26: Ar = m-Br-Ph; R = CH3CH27: Ar = p-Br-Ph; R = PhCH28: Ar = m-Br-Ph; R = PhCH2
9: Ar = p-CH3-Ph; R = CH3CH210: Ar = p-CH3-Ph; R = PhCH211: Ar = m-CH3-Ph; R = PhCH212: Ar = m-HO-Ph; R = PhCH213: Ar = 2-tienil; R' = CH3CH214: Ar = 2-tienil; R' = PhCH215: Ar = 1-naftil; R' = CH3CH216: Ar = 1-naftil; R' = PhCH2
Esquema 1. Reactivos (a) iPrMgCl, tolueno
La reacción se completó con rendimientos moderados para todos los
derivados propuestos. Sin embargo, la dificultad del procedimiento se centró en la
purificación de los productos obtenidos, ya que se trata de sales muy polares que
no fue posible someter a cromatografía en columna sobre gel de sílice o alúmina.
La purificación se basó en efectuar extracciones sucesivas en caliente con
nitrometano, a fin de separar las impurezas insolubles de los productos solubles
en este disolvente en caliente. Este método fue adecuado para aislar los
67
compuestos 1-5 y 13-16 con una pureza suficiente para obtener microanálisis
correctos.
En otros casos (compuestos 6-12) resultó útil tratar la sal inicialmente
formada con óxido de propileno en etanol a reflujo para liberar el grupo amino y
volver a formar el hidrocloruro tratando el residuo con HCl/AcOEt.217 Sin embargo,
aunque el procedimiento conduce a compuestos aparentemente puros por RMN 1H y 13C, en algunos casos no se obtienen con suficiente pureza como para
conseguir microanálisis correctos. También se intentaron, sin éxito, otros métodos
de purificación como recristalización, resinas de intercambio iónico y cromatografía
en columna.
Para solucionar este problema se intentó poner a punto un método que
permitiese obtener los ácidos puros por hidrólisis de los ésteres correspondientes.
Éstos deberían ser fáciles de obtener en una reacción de Reformatsky a partir del
α-bromo éster y la piperidona correspondientes. Sin embargo, al llevar a cabo la
reacción de Reformatsky partiendo de bromofenilacetato de metilo y N-etil-4-
piperidona no se obtuvo el α-hidroxiéster 17, sino que se recuperaron los
compuestos de partida inalterados.
N
HOOCH3
O
17
NR
HOOCH3
O
18 : R=COCH319 : R=Boc
NBoc
HOAr
COOH
20
Una alternativa a la reacción de Reformatsky consiste en la formación del
enolato del éster con una base fuerte218 (LICA suele ser la base de elección en
68
estos casos), y posterior adición de la cetona. De esta forma se consiguió obtener
el éster (17) con un 12% de rendimiento.
Desafortunadamente, cuando la reacción se intentó extender a otros
ésteres arilsustituídos o a la N-acetil-4-piperidona (para la síntesis de 18) o N-Boc-
4-piperidona (para la síntesis de 19), no se consiguió aislar los productos
deseados, por lo que esta vía no fue útil para ampliar la sustitución de nuestros
sistemas en estas posiciones.
La N-Boc-4-piperidona es un compuesto comercial y su utilización en este
tipo de reacciones tiene la ventaja de que, por eliminación posterior del grupo terc-
butoxicarbonilo, seguido de alquilación o acilación de la amina formada, se podría
acceder a una gran variedad de compuestos diferentemente sustituidos en el
átomo de nitrógeno. Puesto que la reacción con LICA no tuvo éxito, se intentó
obtener el ácido 20 por reacción del ácido fenilacético con N-Boc-4-piperidona en
las condiciones habituales. Sin embargo tampoco en este caso la reacción tuvo
éxito.
Para la síntesis de los derivados de tipo B decidimos partir de isobutirato
de metilo, para el cual están descritas varias reacciones de condensación con
distintas cicloalcanonas en presencia de LICA y que transcurren con rendimientos
excelentes.218
El isobutirato de metilo se hizo reaccionar con N-Boc-4-piperidona y la
reacción transcurrió con un alto rendimiento (87%) obteniéndose el N-Boc-
derivado 21 (esquema 2). En este caso se trata de un compuesto neutro fácil de
aislar y purificar. La posterior desprotección del grupo amino se realizó
burbujeando HCl (g) a través de una solución en AcOEt enfriada a 0 ºC. Esta
reacción transcurrió con un 75% de rendimiento y resultó mucho más eficaz que la
desprotección con ácido trifluoroacético (33%) que se había ensayado
previamente. El cloruro de 4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil)piperidinio
(22) obtenido es un intermedio clave para la obtención de una serie de ésteres con
una amplia variedad de sustituyentes en el átomo de N. Así, el compuesto 22 pudo
alquilarse de manera sencilla y con buenos rendimientos utilizando el bromuro de
69
alquilo correspondiente y K2CO3, en periodos que van desde las 6 a 24 horas
(esquema 2).
El compuesto dibencilado 34 se obtuvo aplicando el mismo procedimiento
a partir de 22 y bromuro de bencilo, pero utilizando 2 equivalentes del haluro y
empleando un tiempo de reacción mucho mayor que para la formación de 24.
OCH3
O
NBoc
HOOCH3
O
NH2
HOOCH3
O
+
NR
HOOCH3
O
Cl-
(c)
21 22
(a)
(d)
23-33
23: R = CH2=CH-CH224: R = PhCH225: R = p-NO2PhCH226: R = (CH2)2CHCH227: R = p-Cl PhCH228: R = p-CF3PhCH229: R = HOCH2CH230: R = (CH3CH2)2NCH2CH231: R = p-CH3OPhCH232: R = CH3OCH2CH2
(b)
33: R = HC C CH2
Esquema 2. Reactivos (a) LICA, THF, -78 ºC; (b) N-Boc-4-piperidona THF, -78 ºC; (c)
HCl (g), AcOEt, 0 ºC; (d) R-Br, K2CO3, DMF, TA.
La evaluación biológica de esta nueva serie de ésteres nos puede dar una
idea de la implicación del grupo carboxilo en la unión a la AM. Por otro lado, nos
puede dar información sobre la influencia de la sustitución en el átomo de
nitrógeno sobre la actividad biológica, que puede estudiarse a través de los
70
propios ésteres si éstos resultan activos, o a través de los ácidos que pueden
obtenerse por hidrólisis de los mismos.
Otra ventaja que presentan estos nuevos sistemas es que se ha eliminado
el centro estereogénico presente en la serie de compuestos 1-17, que puede
complicar la evaluación biológica, ya que en caso de que la actividad antitumoral
sea interesante, será necesario resolver la mezcla racémica y evaluar cada uno de
los enantiómeros por separado.
Los derivados 35 y 36 se sintetizaron por reacción directa del isobutirato
de metilo con N-etil-4-piperidona y N-benzoil-4-piperidona, respectivamente, ya
que estos reactivos son comerciales.
N
HOOH
O
34
Ph
Ph
NR
HOOCH3
O
35: R = CH2CH336: R = PhCO
N
HOOH
O
37
Para conseguir un compuesto de la serie con la función ácido carboxílico
libre se realizó la hidrólisis de 35 en medio básico (NaOH 0.5 M) y THF como
disolvente para dar el ácido 37.
También se ha preparado el 2-(4-etil-1-hidroxiciclohexil)-2-metilpropionato
de metilo (38), análogo al compuesto 35, en el que se ha sustituido el anillo de
piperidina por un ciclohexano y el ácido 39 procedente de su hidrólisis (Esquema
3). Estos compuestos, junto con la amida 36, pueden aportar datos sobre la
importancia de la presencia de un nitrógeno básico sobre la actividad biológica.
71
OCH3
O HOOCH3
O
38
(a)
(b)
(c) HOOH
O
39
(d)
Esquema 3. Reactivos (a) LICA, THF, -78 ºC; (b) 4-etilciclohexanona, THF, -78 ºC; (c)
NaOH, THF, ∆; (d) HCl 10%.
I. 2. 2. Actividad Biológica I. 2. 2. 1. Evaluación del porcentaje de competición
El primer ensayo que se llevó a cabo fue un experimento de competición
con el anticuerpo monoclonal de la AM. A través de este ensayo se evaluó
cualitativamente la afinidad de los diferentes compuestos sintetizados, estimando
la habilidad de los mismos para interferir en la unión entre la AM y su anticuerpo
monoclonal, siguiendo la misma metodología descrita por Martínez y cols.179, 219
Un anticuerpo monoclonal neutralizante es capaz de unirse a un epítopo
del péptido, crítico para reconocimiento del receptor. Aquellas moléculas capaces
de interrumpir la unión péptido-anticuerpo podrían ser buenos candidatos como
moduladores de la acción biológica del péptido.
El fundamento del mismo se representa en la figura 11. En una placa de
96 pocillos en la que se ha adsorbido AM se añaden los compuestos a ensayar.
Después de 1 hora se agrega el anticuerpo monoclonal de AM (AcαAM) marcado
con peroxidada, manteniendo el sistema a temperatura ambiente durante una hora
más. El anticuerpo marcado se unirá a la AM en las posiciones en las que consiga
desplazar a los compuestos. Después de lavar, se agrega el sustrato de la
peroxidasa (dihidrocloruro de o-fenilendiamina), de forma que la reacción
72
AcαAM marcado
Sustrato
color
AM AM AM AM AM Base del pocillo
color
colorimétrica que tiene lugar es directamente proporcional a la unión del
anticuerpo marcado con la AM, e inversamente proporcional a la unión del
compuesto a la AM. Un compuesto de alta afinidad bloqueará la unión del
anticuerpo con la AM de modo que no habrá generación de color y la absorbancia
registrada será baja. Por el contrario, compuestos que posean poca afinidad por la
AM producirán un registro de absorbancia mayor.
Figura 11: Fundamento del método empleado en la evaluación del porcentaje de
competición con el anticuerpo monoclonal de AM.
Las placas se organizan de manera que haya lugares concretos para los
controles internos de inhibición negativos (0% de afinidad, no se adicionan
antagonistas potenciales), controles internos de inhibición positivos (100% de
afinidad, se adiciona anticuerpo no marcado) y también pocillos sin AM que se
utilizan para determinar uniones no específicas.
Los compuestos se colocan en cada placa por duplicado y a su vez cada
placa se realiza por duplicado. Los controles internos positivos (que a su vez son
negativos de inhibición) son útiles para definir el máximo de absorbancia. Y los
controles internos positivos de inhibición son útiles para verificar que el ensayo ha
transcurrido normalmente, puesto que una inhibición positiva se traduce en una
disminución de color.
73
Los valores de absorbancia nos permiten calcular valores del porcentaje
de competición, que resultan útiles para evaluar de forma cualitativa el
comportamiento de cada compuesto frente a la AM.
A pesar de que el compuesto 1 pertenecía a los 121 compuestos capaces
de interferir significativamente en la unión de la AM y el anticuerpo según los datos
publicados,179 en nuestras manos mostró una muy modesta reducción de la
absorbancia. Sin embargo, las modificaciones estructurales sobre el compuesto
han conducido a un aumento de la afinidad en once casos (compuestos 5, 13, 16,
21, 22, 24, 25, 30, 33, 34 y 35) como puede observarse en las tablas 3, 4 y 5.
Debe tenerse en cuenta que las variaciones estructurales propuestas no
son tan drásticas como para esperar grandes variaciones en los registros de
absorbancia. Sin embargo, los resultados parecen indicar que la presencia del
grupo carboxilo no es imprescindible para la unión con la AM, como se observa
para los compuestos de tipo B. Tampoco la eliminación del centro estereogénico
parece afectar a la afinidad.
comp Ar R % A±SD[a] Respuesta (RU)±SD[b] % AMPc±SD[c]
1 Ph CH3CH2 99.2 ± 5.6 3.1 ± 1.5 73.1 ± 6.9 (***)
3 p-Br-Ph CH3CH2 106.4 ± 0.0 n.u.
5 m-HO-Ph CH3CH2 85.4 ± 17.8 8.3 ± 1.3 78.1 ± 2.4 (**)
13 2-tienil CH3CH2 94.1 ± 5.0 92.1 agr. 93.2 ± 8.9 (ns)
14 2-tienil PhCH2 102.3 ± 1.8 19.0 79.9 ± 3.8 (**)
15 1-naftil CH3CH2 105.4± 7.8 2.8 ± 0.3 97.0 ± 6.4 (ns)
16 1-naftil PhCH2 92.1 ± 0.0 14.4 ± 2.4 84.3 ± 6.4 (*)
Tabla 3: Estructura química y datos biológicos de piperazinas de tipo A. [a] % Absorbancia en
ensayo de competición; [b] Respuesta SPR (RU) ajustada al peso molecular con compuestos
en solución 200 µM; n.u., no existe unión; agr., probablemente agregado; [c] % de la
producción de AMPc evaluado con AMPc [125I] Biotrack Assay System; ns, diferencia no
significativa; *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001.
74
comp R % A±SD[a] Respuesta (RU)±SD[b] % cAMP±SD[c]
21 Boc 93.0 ± 1.5 n. u.
22 H 92.5 ± 4.6 2.4
23 alil 103.9 ± 4.9 1.5 ± 0.7
24 PhCH2 91.1 ± 8.5 4.9 ± 2.3 122.4 ± 3.2 (*)
25 p-NO2-PhCH2 88.1 ± 11.9 6.6 ± 1.4
28 p-CF3-PhCH2 100.7 ± 2.1 3.5 ± 1.7 118.2 ± 5.2 (*)
29 HOCH2CH2 106.8 ± 2.8 n. u.
30 (CH3CH2)2NCH2CH2 96.4 ± 4.9 1.1 ± 0.1 89.9 ± 5.1 (*)
31 p- CH3O-PhCH2 105.5 ± 9.0 7.6 ± 1.4 104.2 ± 0.6 (ns)
33 propargil 99.1 ± 7.6 2.2
35 CH3CH2 94.4 ± 1.7 n.u. 92.5 ± 5.1 (ns)
36 PhCO 109.4 ± 5.3 n.u.
Tabla 4: Estructura química y datos biológicos de piperazinas de tipo B. [a] % Absorbancia
en ensayo de competición; [b] Respuesta SPR (RU) ajustada al peso molecular con
compuestos en solución 200 µM; n.u., no existe unión; [c] % de la producción de AMPc
evaluado con cAMP [125I] Biotrack Assay System; ns, diferencia no significativa; *, P<0.05;
**, P<0.01; ***, P<0.001.
75
comp estructura % A ±SD[a] Respuesta (RU)±SD[b]
% AMPc±SD[c]
34 N
HOCOOCH3
Ph Ph
Cl-+
97.6 ± 7.7 11.4 112.4 ± 4.1 (*)
39
HOCOOH
111.5 ± 8.2 n.u.
Tabla 5: Estructura química y datos biológicos de 34 y 39. [a] % Absorbancia en ensayo de
competición; [b] Respuesta SPR (RU) ajustada al peso molecular con compuestos en
solución 200 µM; n.u., no existe unión; [c] % de la producción de AMPc evaluado con cAMP
[125I] Biotrack Assay System; ns, diferencia no significativa; *, P<0.05; **, P<0.01; ***,
P<0.001.
Los resultados obtenidos en este ensayo preliminar sugieren la necesidad
de aplicar una técnica más sensible como la Resonancia de Plasma en Superficie
(SPR), que permite realizar una evaluación cuantitativa de la unión de nuestros
compuestos con la AM.
I. 2. 2. 2. Resonancia de Plasma en Superficie
Para establecer inequívocamente la caracterización de la unión entre AM y
los compuestos sintetizados se llevó a cabo un estudio utilizando la técnica de
SPR con la tecnología Biacore. La AM se inmovilizó covalentemente sobre la
superficie de un sensor sCM5 cubierto por una matriz de dextrano. Los distintos
compuestos o analitos se inyectaron sobre la superficie con un flujo continuo. El
cambio en el índice de refracción, que está relacionado con la acumulación de
masa en la superficie del sensor, se registra en función del tiempo. Las curvas de
interacción resultantes se denominan sensorgramas y su análisis matemático
76
permite caracterizar cuantitativamente las interacciones moleculares: parámetros
cinéticos y de afinidad, constantes de unión, estequiometría, concentración activa,
etc. La unión de las pequeñas moléculas fue medida en unidades de respuesta
relativa (RU) que dependen de la masa del compuesto unido a la AM inmovilizada.
En la figura 12 se recogen las curvas SPR para dos compuestos que no se unen a
la AM (3, 39), un compuesto con una respuesta moderada (15) y uno de los
compuestos con mayor afinidad (16). El efecto en los dos últimos casos es dosis
dependiente.
Las tablas 3, 4 y 5 resumen la respuesta en equilibrio a una concentración
200 µM para todos los compuestos, normalizadas ajustándolas respecto al peso
molecular (RU*100/PM). El valor RU (3.1 ± 1.5) para el compuesto 1 indica que
posee una afinidad moderada por la AM. Este resultado está de acuerdo con la
baja afinidad observada en el experimento de competición por el anticuerpo
monoclonal mencionado anteriormente, pero no concuerda con la afinidad
previamente descrita para este compuesto (Ka = 1.30 x 108 ± 1.57 x 107).179 Sin
embargo, lo más interesante de este estudio es que las modificaciones
estructurales realizadas sobre el compuesto cabeza de serie nos han permitido
obtener compuestos con mayor afinidad por la AM, tales como los compuestos 5,
14, 16, 31 y 34 que muestran valores de RU entre dos y tres veces más altos que
el compuesto 1.
En este punto es importante resaltar que los compuestos capaces de
interferir en la unión entre la AM y su anticuerpo monoclonal deben unirse en una
región específica del péptido que es crítica para el reconocimiento del receptor.
Por ello, un resultado negativo en este ensayo no tiene por qué dar lugar a
resultados negativos en experimentos de SPR, puesto que el ligando podría unirse
a una región diferente del péptido. Este podría ser el caso del compuesto 31 que,
de acuerdo con el ensayo de competencia preliminar, no se une a la AM, mientras
que la respuesta en SPR indica que sí existe unión.
77
Figura 12: Curvas SPR, correspondientes a inyecciones de 60 s
para los compuestos 39 (a), 3 (b), 15 (c) y 16 (d) a diferentes
concentraciones (0, 50, 100 y 200 µM) sobre AM.
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150
Tim e s
RU
Res
pons
e
a.
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 tiempo (s)
5 4 3 2 1 0
-1 -2 -3 -4 -5
Res
pues
ta (R
U)
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150
Tim e s
RU
Res
pons
e
b.
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130
5 4 3 2 1 0
-1 -2 -3 -4 -5
Res
pues
ta (R
U)
tiempo (s)
Res
pues
ta (R
U)
-5
-3
-1
1
3
5
7
9
11
13
15
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150
Tim e s
RU
Res
pons
e
c. 15
13 11 9 7 5 3 1
-1 -3 -5
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150
Tim e s
RU
Res
pons
e
-50 -10 10 30 50 70 90 110 130 15tiempo (s)
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 15tiempo (s)
15 13 11 9 7 5 3 1
-1 -3 -5
Res
pues
ta (R
U)
d.
78
Las medidas de SPR fueron realizadas por la Dra. Danièle Altschuh, la
Dra. Laurence Choulier y la Dra. Sonsoles Martín-Santamaría en el Laboratorio de
Biotecnología de Interacciones Moleculares, Escuela Superior de Biotecnología de
Estrasburgo (Francia).
I. 2. 2. 3. Estudios QSAR- 3D
Con el objetivo de racionalizar los resultados obtenidos en SPR se llevó a
cabo un estudio QSAR-3D. Esta metodología nos permitió estudiar cuáles son las
características estructurales que los compuestos deben poseer para ser capaces
de unirse a la AM. Los resultados obtenidos son útiles para el diseño de análogos
más afines.
El modelo QSAR-3D se derivó empleando el programa Almond 3.3.0220
utilizando descriptores independientes de alineamiento (GRIND).221 Para este
estudio se eligieron 4 sondas GRID:188 DRY (representa interacciones
hidrofóbicas), O (oxígeno de carbonilo sp2 como aceptor de enlaces de H), N1 (NH
de tipo amida, como donador de enlace de H) y la sonda TIP (como descriptor de
la forma molecular). Usando estas cuatro sondas se obtuvo una matriz de 500
variables con 13 objetos y 10 correlogramas de 50 variables cada uno. Para
reducir el número de variables se llevó a cabo un diseño factorial fraccional (FFD)
implementado por Almond. Se usaron los valores que por defecto sugiere el
programa. El análisis de mínimos cuadrados parciales (PLS) dio lugar a un modelo
con tres variables latentes con un r2 = 0.93. La validación cruzada del modelo para
3 PCs se llevó a cabo usando el método leave-one-out (LOO), grupos aleatorios y
el método leave-two-out generando valores de q2 de 0.82, 0.79 y 0.76,
respectivamente.
La calidad del modelo obtenido se evaluó con la predicción de la unión del
compuesto 28, que no estaba incluido en el conjunto de entrenamiento. El valor
79
que predijo el modelo fue similar al valor obtenido experimentalmente. En la figura
13 se muestra el gráfico representando los valores experimentales frente a los
valores calculados para la unión con la AM.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Respuesta Experimental (RU)
Pred
icci
ón d
e la
Res
pues
ta (R
U)
1
315
2233
3023
15
25
34 16
14
24
28
Figura 13: Representación gráfica de la respuesta experimental (RU) en SPR frente a los
valores obtenidos con el modelo predictivo. El compuesto 28 se representa en color rojo.
La inspección de los correlogramas DRY-DRY y DRY-O mostró
claramente que la intensidad de la interacción se correlaciona con la unión (figura
14). Las variables representan pares de nodos a aquellas distancias a las que las
sondas DRY y O presentan interacciones favorables. Las interacciones más
fuertes (colores rojo y magenta en la figura 14) corresponden a los compuestos 14
y 16, que pertenecen a la serie de tipo A (R = PhCH2) y poseen un anillo
aromático en el Cα. Este residuo probablemente interaccione con un bolsillo
hidrofóbico en el receptor, hecho que concuerda con las interacciones favorables
80
con la sonda DRY. Por otra parte, estos compuestos poseen un grupo hidroxilo
que podría estar actuando como un donador de enlaces de hidrógeno en su
interacción con el receptor, característica que concuerda con las interacciones
favorables que poseen estos compuestos con la sonda O. Es importante indicar
que estos mismos rasgos habían sido identificados como relevantes para la unión
con la AM en el modelo QSAR-3D derivado para los moduladores positivos.180
Figura 14: Superposición de correlogramas DRY-DRY y DRY-O (representan las
interacciones con las regiones hidrofóbicas de los ligandos (DRY-DRY)).
En cuanto a los derivados de tipo B, ninguno de ellos mostró una fuerte
afinidad por la AM (todos los valores de RU son inferiores a 10), sugiriendo que la
presencia del anillo aromático en el Cα es favorable para la unión con el péptido.
DRY-DRY DRY-O
Prod
ucto
de
ener
gías
de
inte
racc
ión
DRY-DRY DRY-O
Prod
ucto
de
ener
gías
de
inte
racc
ión
81
Sin embargo, el éster 34, con un patrón de sustitución similar en el Cα pero con un
segundo grupo bencilo unido al N de la piperazina, mostró un valor de RU de 11.4.
El grupo bencilo adicional podría compensar la ausencia del anillo aromático en el
Cα, aunque la presencia de la carga positiva sobre el átomo de nitrógeno podría
contribuir también a aumentar su afinidad.
La figura 15 muestra las relaciones geométricas entre algunas regiones de
interacción favorable con la sonda DRY (amarillo) y algunas regiones de
interacción favorable con la sonda O (rojo), identificando posibles bolsillos donde
las interacciones hidrofóbicas y enlaces de hidrógeno son favorables para la
unión.
Es importante mencionar que la inclusión de las variables de los
correlogramas TIP mejora considerablemente la calidad del modelo, hecho que
confirma la importancia de la descripción de la forma en los modelos QSAR-3D.
Figura 15: Interacciones presentes en el compuesto 16. Las superficies representan las
interacciones con la sonda DRY (amarillo) y la sonda O (rojo).
82
En el futuro se diseñarán compuestos con grupos complementarios
dirigidos a los posibles bolsillos capaces de mejorar las interacciones favorables.
Por ejemplo, cuando el compuesto 40, se introduce en el modelo QSAR-3D, éste
predice para dicha molécula un RU = 14.11. Su síntesis es sencilla siguiendo el
método que hemos usado hasta ahora, es decir la condensación del ácido 2-
(benzo[b]tiofen-3-il) acético con N-bencil piperidona. El ácido 2-(benzo[b]tiofen-3-il)
acético se puede obtener por hidrólisis del nitrilo correspondiente que es
comercial.
N
HOOH
O
S
40
I. 2. 2. 4. Análisis de segundos mensajeros
El hecho de que algunas moléculas pequeñas sean capaces de unirse a la
AM no significa que sean capaces de modular su acción. Esta característica puede
ser evaluada a través de la determinación de la producción de AMPc, un segundo
mensajero intracelular, en células Rat2. La línea celular Rat2 contiene receptores
específicos para la AM y reacciona frente a ella elevando su contenido de AMPc
intracelular.55 Esta línea celular fue proporcionada por el American Tissue Culture
Collection (Manassas, VA).
El estudio se llevó a cabo con un grupo de compuestos seleccionados y
consta de dos etapas. En la primera etapa se prepararon dos placas de 24 pocillos
83
con células confluentes Rat2 y a continuación se añadieron bacitracina y 3-
isobutil-1-metilxantina (IBMX). La bacitracina actúa como un inhibidor de proteasas
y el IBMX es un inhibidor de la fosfodiesterasa que, por tanto, evita la degradación
del AMPc. Se incubaron las células durante 15 minutos a 37 ºC en esta solución. A
continuación, se añadieron los compuestos a caracterizar a una concentración tal
que la concentración final fue 100 nM. Como control positivo se utilizó forskolina,
que es un potente activador de proteínas G. Se dejó actuar a los compuestos
durante 5 minutos a 37 ºC y a continuación se detuvo la reacción colocando la
placa en hielo. Se añadió etanol absoluto frío y se extrajo la suspensión de células
de cada pocillo. Cada una de ellas constituye una muestra a evaluar en el
radioinmunoensayo.
El radioinmunoensayo para el AMPc se realizó siguiendo el protocolo del
kit RPA 509 de Biotrack (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ).20 El sistema
utiliza como trazador AMPc marcado con 125I, junto con un antisuero altamente
específico y sensible. El ensayo se basa en la competición entre el AMPc no
marcado y una cantidad fija de AMPc marcado con 125I por un número limitado de
sitios en el anticuerpo específico. Si las cantidades de anticuerpo y ligando
radioactivo están fijas, la cantidad de ligando radioactivo unido al anticuerpo será
inversamente proporcional a la concentración de AMPc presente en las muestras
analizadas.
libre
[125I ] AMPc
AMPc
+ Anticuerpo
unido
[125I ] AMPc - Anticuerpo
AMPc - Anticuerpo
El anticuerpo unido al AMPc se hizo reaccionar después con un anticuerpo
secundario que está unido a partículas de polímeros magnetizables (Amerlex-M).
La separación de la fracción unida al anticuerpo se efectuó por centrifugación de la
84
suspensión del Amerlex-M. Esta es la fracción que se midió en el contador de
radioactividad.
Los resultados se resumen en las tablas 3, 4 y 5. Todos los ácidos
carboxílicos (compuestos de tipo A y 39), reducen los niveles de AMPc, en
concordancia con la función de moduladores negativos esperada. En ausencia de
AM ninguno de los compuestos mostró respuesta alguna.
Sorprendentemente, todos los ésteres sometidos a este ensayo
produjeron un aumento de los niveles de AMPc, comportándose como
moduladores positivos. Estos hechos sugieren que la presencia del ácido
carboxílico es esencial para la acción como modulador negativo. Sin embargo,
existen otros rasgos estructurales, como la ausencia del grupo arilo en el Cα, que
también podrían tener influencia en este cambio de comportamiento. Para
descartar esta posibilidad se sintetizó y analizó el éster metílico del compuesto 1.
Se observó que aunque el éster 17 mantiene su afinidad por la AM en el ensayo
de competición con el anticuerpo monoclonal (%A = 78.1 ± 3.7), se comporta
como un modulador positivo aumentando los niveles de AMPc hasta 116.8 ± 1.3.
Una conclusión similar puede obtenerse por comparación del éster 35 y el ácido
correspondiente 37 cuyos registros de AMPc son 92.5 ± 5.1 (ns) y 71.35 ± 4.4
(***) respectivamente.
I. 2. 2. 5. Pruebas antiproliferativas
Como parte de la evaluación biológica del compuesto 16, también se
realizó el ensayo de proliferación en una variedad de líneas celulares (T47D,
CT2A, A549 y H1299). La línea T47D se compone de células de cáncer de mama
que expresan bajos niveles basales de AM. Esto permite saturar los sitios activos
del péptido trabajando a muy bajas concentraciones de las moléculas a estudiar.
Con el fin de complementar y ampliar los resultados con esta línea celular, se
trabajó con las otras tres líneas celulares tumorales que se encontraban
disponibles en el laboratorio. Con este ensayo pretendíamos observar si los
85
compuestos sintetizados alteraban la proliferación celular, esto es, si inhibían el
crecimiento celular.
El ensayo consistió en la incubación de un número determinado de células
por pocillo junto con el compuesto a ensayar a una concentración de 1 µM. Se
utilizaron para ello placas de 96 pocillos. Al cabo de 5 días de incubación,
aplicando una técnica de tinción que utiliza sulforrodamina B, se midió el grado de
proliferación alcanzado.
También como método colorimétrico para determinar el número de células
viables en el ensayo de proliferación se utilizó el kit comercial CellTiter 96® AQueous
One Soluction Cell Proliferation Assay.
La medida se realizó por octuplicado y en todos los casos se utilizó
doxiciclina como control positivo, ya que se trata de un potente inhibidor de la
proliferación celular. Además, se incluyeron en cada placa una columna sin células
(blanco) y una columna con células, pero sin compuesto de prueba (control
negativo).
Con ninguna de estas cuatro líneas celulares se observaron resultados
prometedores. Por otra parte, en el Centro Integral Oncológico Clara Campal del
Hospital de Madrid, se probó 16 en otras cuatro líneas celulares: L3.6-pl
(células de tumor de páncreas humano),222 Panc-1 (células de tumor de
páncreas humano),223 HCT-116 (células de cáncer de colon humano)224 y HT29
(células de cáncer de colon humano).225 Solamente en el caso de las líneas
celulares HCT-116 y HT29 se obtuvieron resultados interesantes. El
compuesto 16 se probó en un rango de concentración 0.1 a 10 µM y los
resultados se resumen en la figura 16 .
En éstas dos líneas celulares, 16 fue capaz de inhibir la proliferación
celular y de forma dosis dependiente. En el caso de la línea celular HCT-116 la
inhibición es mucho más acusada que la que realiza el control, mientras que
para la línea celular HT29, aunque la inhibición de la proliferación celular es
modesta, el resultado es interesante puesto que se trata de una línea celular
86
muy resistente. Es por ello que el compuesto 16 ha sido seleccionado para ser
sometido a ensayos de actividad in vivo, que se llevarán a cabo en el Hospital
de Madrid.
HCT-116
0
20
40
60
80
100
120
5FU VR24
Prol
ifera
ción
(%)
0.1 uL 1.0 uL 10.0 uL
HT29
0
20
40
60
80
100
120
5FU VR24
Prol
ifera
ción
(%)
0.1 uL 1.0 uL 10.0 uL
Figura 16: Porcentaje de proliferación celular en presencia del compuesto 16 comparado con 5-fluorouracilo en
las líneas celulares de cáncer de colon HCT-116 y HT29 a las concentraciones of 0.1, 1 y 10 µM.
87
I. 3. Conclusiones
Conclusiones
89
I. 3. Conclusiones
Se sintetizó una serie de compuestos estructuralmente relacionados con el
cloruro de 4-[carboxi(fenil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (1), compuesto que fue
detectado como modulador negativo de AM en el cribado farmacológico previo de
una parte de la colección de moléculas del NCI.
Se evaluó la afinidad por AM de los compuestos sintetizados utilizando el
ensayo de competición en la unión de la AM con su anticuerpo monoclonal. Si bien
el compuesto 1 mostró una muy modesta reducción de la absorbancia, muchos de
los compuestos sintetizados mejoraron este comportamiento.
Se llevó a cabo un estudio más profundo evaluando cuantitativamente la
capacidad de los compuestos para unirse a la AM con técnicas de Resonancia de
Plasma en Superficie. Los datos obtenidos mostraron que los compuestos 5, 14,
16, 31 y 34 poseen una mayor afinidad por la AM que el compuesto 1.
Un estudio QSAR-3D permitió la identificación de ciertos rasgos
estructurales que podrían ser claves para la unión de las moléculas a la AM, como
son la presencia de un dador de enlaces de H y un anillo aromático. El modelo
obtenido resulta valioso para el diseño de nuevos derivados con mayor afinidad.
Se evaluó la habilidad de los compuestos para modificar los niveles
intracelulares de AMPc en células Rat2, a través de su unión a la AM. Esta última
Conclusiones
90
determinación mostró que la presencia de un grupo ácido carboxílico libre es
esencial para obtener moduladores negativos de la AM como potenciales agentes
antiangiogénicos y antitumorales.
Finalmente, el compuesto con mayor afinidad por la AM (16), de acuerdo a
los datos proporcionados por SPR, fue seleccionado para estudiar su actividad
antiproliferativa en varias líneas celulares. Este compuesto mostró una interesante
actividad antiproliferativa en dos líneas celulares de cáncer de colon (HCT-116 y
HT29) muy resistentes a otros agentes como el 5-fluorouracilo, por lo que ha sido
elegido para llevar a cabo estudios in vivo.
I. 4. Parte Experimental
Parte Experimental
91
I. 4. Parte Experimental
I. 4. 1. Materiales y Métodos
I. 4. 1. 1. Métodos generales de síntesis
Las reacciones sensibles al aire se realizaron bajo atmósfera de argon.
Los reactivos líquidos se transfirieron utilizando jeringas y cánulas, a través de
septos.
La purificación de los crudos de reacción se llevó a cabo por cromatografía
en columna, utilizando gel de sílice Merck 230-240 mesh con el eluyente indicado
en cada caso. El análisis de los productos de reacción se realizó por cromatografía
en capa fina (Kiesegel 60F-254). Para el revelado de las mismas se utilizó luz UV
(λ = 254 nm), yodo y/o ácido fosfomolíbdico.
Los espectros de RMN 1H, y 13C fueron registrados en un espectrómetro
Brucker-AC-300. La multiplicidad de las señales en el RMN 1H se da como sigue: s
= singlete, sa = singlete ancho, t = triplete, m = multiplete, d = doblete, c =
cuadruplete, dd = doblete de doblete, td = triplete de dobletes, da = doblete ancho,
etc. Los valores de las constantes de acoplamiento (J) se expresan en Hz. Los
valores de los desplazamientos químicos (δ) se dan en partes por millón (ppm),
utilizando TMS como referencia interna. En los espectros de RMN 13C se utilizó
Parte Experimental
92
como referencia el CDCl3, DMSO-d6, o CD3OD en su señal central (77.0, 39.7, 49.0
ppm, respectivamente).
Los espectros de IR se realizaron en un espectrofotómetro Perkin- Elmer
1330 y se dan en cm-1. Los puntos de fusión se determinaron en un tubo capilar
abierto en un aparato Stuart Scientific SMP3.
Los espectros de masas (EM) de impacto electrónico (IE) se registraron en
el Servicio de Espectrometría de Masas de la Universidad San Pablo-CEU, en un
espectrómetro ESQUIRE 3000 de Brucker Daltonics, provisto de fuente de
ionización APCI/ESI, dependiendo de las características del compuesto, y trampa
iónica.
Los análisis elementales (C, H, N) se llevaron a cabo en el servicio de
Microanálisis de la Universidad Complutense de Madrid con un analizador
elemental LECO CHNS-932.
I.4. 1. 2. Actividad biológica
Se propuso un protocolo de ensayo que permitió evaluar cómo influyen los
compuestos sintetizados, posibles moduladores negativos, en la interacción de la
AM con sus receptores.
Se realizaron cuatro tipos de experimentos: a) estudio de competición con
el fin de determinar cualitativamente el grado de interacción que existe entre las
moléculas de la serie y la AM; b) Resonancia de Plasma en Superficie; c) estudio
de la producción de segundos mensajeros; d) ensayos de proliferación celular.
Para la primera fase, se recubrió con AM el fondo de una placa de 96
pocillos y a continuación se agregaron los compuestos. Al añadir un anticuerpo
monoclonal marcado, éste compite con los compuestos y se une a la AM. La
cantidad de anticuerpo que se une a la AM puede ser cuantificada por un método
colorimétrico después de eliminar el anticuerpo no unido mediante lavados de la
placa.
Parte Experimental
93
En el segundo experimento se determina la habilidad de los compuestos
sintetizados para unirse a la AM a través de la Resonancia de Plasma en
Superficie (SPR).
El tercer experimento consiste en la evaluación de las moléculas
sintetizadas como moduladores negativos o positivos de la AM. Para ello se
realiza un ensayo de segundos mensajeros, como el AMPc, cuyo nivel intracelular
se determina mediante técnicas de radioinmunoensayo.
Finalmente, los compuestos con mayor actividad se sometieron a ensayos
de proliferación celular.
Equipos
Para las medidas de absorbancia en los ensayos de proliferación se utilizó
un espectrofotómetro Titertek Multiskan PLUS.
En el radioinmunoensayo para las medidas de radioactividad se utilizó un
contador Gamma 1470 WizardTM.
Los estudios de SPR se llevaron a cabo en un aparato Biacore T100 (GE
Healthcare Biacore, Uppsala, Sweden).
Líneas celulares
Para los ensayos biológicos de los compuestos se utilizaron varias líneas
celulares:
Rat2: • Características: Fibroblastos de rata, con receptores específicos para la AM.55
• Procedencia: Instituto Cajal (CSIC)
Parte Experimental
94
T47D118 • Características: Células de cáncer de mama, que expresan bajos niveles basales
de AM y que han sido utilizadas en ensayos de apoptosis y proliferación.
• Procedencia: Instituto Cajal (CSIC)
CT2A226 • Características: células de astrocitoma de ratón
• Procedencia: Instituto Cajal (CSIC)
A549227 y H1299228 • Características: células no pequeñas de carcinoma de pulmón
• Procedencia: Instituto Cajal (CSIC)
L3.6-pl222
• Características: células de tumor de páncreas humano
• Procedencia: CIOCC, Hospital de Madrid
Panc-1223
• Características: células de tumor de páncreas humano
• Procedencia: CIOCC, Hospital de Madrid
HCT-116224 • Características: células de cáncer de colon humano
• Procedencia: CIOCC, Hospital de Madrid HT29225 • Características: células de cáncer de colon humano
• Procedencia: CIOCC, Hospital de Madrid
Parte Experimental
95
Reactivos químicos e inmunológicos
Se utilizó AM humana sintética procedente de los laboratorios Bachem.
El anticuerpo monoclonal MoAbG6 fue proporcionado por los doctores
Alfredo Martínez y Frank Cuttitta, de la Cell and Cancer Biology Branch, NCI
(Bethesda, MD).
Parte Experimental
96
I. 4. 2. Síntesis
I. 4. 2. 1. Síntesis de cloruros de 4-[carboxi(fenil)metil]-4-hidroxipiperidinio
Método general
A una disolución de cloruro de isopropilmagnesio (2M, 3 equivalentes) en
Et2O se adiciona bajo atmósfera de argon, una disolución del correspondiente
ácido (1.5 equivalentes) en tolueno anhidro. La mezcla de reacción resultante se
calienta a reflujo durante 24 h. A continuación, se añade una disolución de la
correspondiente piperidona (1 equivalente) en benceno anhidro vía cánula. La
suspensión resultante se calienta a reflujo hasta que se observa la total
desaparición de los compuestos de partida por cromatografía en capa fina. Una
vez enfriado, el crudo de reacción se vierte sobre una mezcla hielo/HCl
concentrado. Se reserva la fase acuosa y la fase orgánica se extrae tres veces
con una disolución acuosa de HCl al 10 %. Las fases acuosas combinadas se
lavan con Et2O y se elimina el agua a presión reducida. El sólido obtenido se
suspende en nitrometano y se refluye durante 30 minutos. Una vez filtrada la
disolución en caliente se repite el procedimiento (3 veces) refluyendo el residuo
con nitrometano. Finalmente se elimina el disolvente bajo presión reducida
obteniéndose los ácidos correspondientes en forma de hidrocloruros.
Parte Experimental
97
Método general de purificación de hidrocloruros.
A una disolución de cada uno de los hidrocloruros (1 equivalente) en EtOH
absoluto, se adiciona óxido de propileno en exceso. La mezcla de reacción se
agita a temperatura ambiente durante 24 h y el sólido obtenido se filtra a vacío y
se lava con EtOH absoluto. Al ácido libre en AcOEt se adiciona una disolución de AcOEt saturada con
HCl (g). La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 24 h, y el
sólido obtenido se filtra a vacío y se lava con AcOEt.
Parte Experimental
98
Síntesis de cloruro de 4-[carboxi(fenil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (1)
A partir de ácido fenilacético (2.00 g, 15 mmol) en tolueno (20
mL), N-etil-4-piperidona (1.27 g, 10 mmol) en tolueno (20 mL)
y cloruro de isopropilmagnesio (15 mL, 30 mmol) se obtuvo 1
(2.42 g, 81%) como un sólido marrón claro; p.f. 80-85 ºC; IR:
νmax = 1690, 3400; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.31 (t, J =
7.3 Hz, 3 H, CH3), 1.84-2.16 (m, 4 H, 2CH2), 3.09-3.43 (m, 6
H, 2NCH2 y CH2CH3), 3.72 (s, 1 H, CH), 7.30-7.37 (m, 3 H,
ArH), 7.43-7.46 (m, 2 H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 9.7, 32.6, 34.0,
53.1, 61.4, 69.5, 128.9, 129.4, 131.0, 135.8, 175.6; análisis elemental calc (%)
para C15H22ClNO3: C 60.10, H 7.40, N 4.67; encontrado C 60.32, H 7.25, N 4.33.
Síntesis de cloruro de 1-bencil-4-[carboxi(fenil)metil]-4-hidroxipiperidinio (2)
A partir de ácido fenilacético (2.00 g, 15 mmol) en tolueno
(20 mL), N-bencil-4-piperidona (1.89 g, 10 mmol) en tolueno
(20 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (15 mL, 30 mmol)
se obtuvo 2 (0.89 g, 25%) como un aceite marrón; IR: νmax
= 1690, 3350; EM (IE): m/z 326 [M]+; RMN 1H (300 MHz;
DMSO-d6): δ = 1.65-1.99 (m, 4 H, 2CH2), 3.13 (sa, 4 H,
2NCH2), 3.65 (s, 1 H, CH), 3.65 (d, J = 4.9 Hz, 2 H,
CH2Ph), 7.31-7.53 (m, 8 H, ArH), 7.63 (sa, 2 H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-d6): δ = 21.2, 47.3, 58.9, 68.2, 70.0, 127.5, 128.2, 128.8,
129.8, 129.9, 131.0, 131.5, 135.0, 173.1; análisis elemental calc (%) para
C20H24ClNO3: C 64.84, H 6.81, N 3.78; encontrado: C 64.79, H 6.83, N 3.75.
N
HO
OH
O
HCl
N
HO
OH
O
HCl
Parte Experimental
99
Síntesis de cloruro de 4-[carboxi(p-bromofenil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (3)
A partir de ácido (4-bromofenil)acético (1.00 g, 5 mmol) en
tolueno (11 mL), N-etil-4-piperidona (0.38 g, 3 mmol) en tolueno
(4 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (5 mL, 10 mmol) se obtuvo
3 (0.75 g, 66%) como un sólido amarillento; p.f. 80-82 ºC; IR: νmax
= 1720, 3400; EM (IE): m/z 344 [M+2]+, 342 [M]+; RMN 1H (300
MHz; DMSO-d6): δ = 1.30 (t, J = 7.3 Hz, 3 H, CH3), 1.81-2.13 (m,
4 H, 2CH2), 3.13 (c, J = 7.3 Hz, 2 H, CH2CH3), 3.19-3.43 (m, 4 H,
2NCH2), 3.71 (s, 1 H, CH), 7.38 (d, J = 8.5 Hz, 2 H, ArH), 7.51 (d, J = 8.5 Hz, 2 H,
ArH); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-d6): δ = 9.0, 31.0, 31.5, 47.0, 50.8, 60.0, 120.8,
130.9, 132.1, 134.5, 172.7; análisis elemental calc (%) para C15H21BrClNO3: C
45.41, H 5.84, N 3.53; encontrado: C 45.72, H 5.56, N 3.50.
Síntesis de cloruro de 4-[carboxi(m-metilfenil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (4)
A partir de ácido (3-metilfenil)acético (1.00 g, 7 mmol) en
benceno (7 mL), N-etil-4-piperidona (0.56 g, 5 mmol) en tolueno
(7 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (6.7 mL, 13 mmol) se
obtuvo 4 (0.80 g, 58%) como un sólido marrón; p.f. 82-85 ºC; IR:
νmax = 1750, 3500; EM (IE): m/z 278 [M]+; RMN 1H (300 MHz;
CD3OD): δ = 1.30 (t, J = 7.3 Hz, 3 H, CH3), 1.79-2.11 (m, 4 H,
2CH2), 2.34 (s, 3 H, CH3), 3.09-3.42 (m, 6 H, 2NCH2 y CH2CH3),
3.68 (s, 1 H, CH), 7.14-7.15 (m, 1 H, ArH), 7.21-7.26 (m, 3 H, ArH); RMN 13C (75.4
MHz; DMSO-d6): δ = 9.0, 21.1, 30.8, 31.8, 47.0, 50.8, 60.7, 127.0, 127.9, 128.0,
130.5, 134.9, 137.0, 173.2.
N
HO
OH
O
HCl
N
HO
OH
O
HCl
Br
Parte Experimental
100
Síntesis de cloruro de 4-[carboxi(m-hidroxifenil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (5)
A partir de ácido (3-hidroxifenil)acético (1.50 g, 10 mmol) en
benceno (7 mL), N-etil-4-piperidona (0.84 g, 7 mmol) en
benceno (8 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (11 mL, 22
mmol) se obtuvo 5 (0.44 g, 25%) como un aceite amarillo; IR
νmax = 1750, 3500; EM (IE): m/z 280 [M]+; RMN 1H (300 MHz;
CD3OD): δ = 1.30 (t, J = 7.3 Hz, 3 H, CH3), 1.87-2.07 (m, 4 H,
2CH2), 3.12 (c, J = 7.3 Hz, 2 H, CH2CH3), 3.29-3.31 (m, 4 H, 2NCH2), 3.64 (s, 1 H,
CH), 6.72-6.75 (d, J = 8.5 Hz, 1 H, ArH), 6.85-6.91 (m, 2 H, ArH), 7.15 (t, J = 7.9
Hz, 1 H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-d6): δ = 9.1, 31.0, 47.1, 50.9, 56.0,
60.8, 114.4, 116.7, 120.7, 128.9, 136.2, 157.0, 173.2; análisis elemental calc (%)
para C15H22ClNO4: C 57.05, H 7.02, N 4.44; encontrado: C 57.17, H 7.00, N 4.37.
Síntesis de cloruro de 4-[carboxi(m-bromofenil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (6)
A partir de ácido (3-bromofenil)acético (1.00 g, 5 mmol) en
benceno (8 mL), N-etil-4-piperidona (0.38 g, 3 mmol) en
benceno (7 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (5 mL, 10 mmol)
y después de purificar por el método general descrito en 1.4.2.1,
se obtuvo 6 (0.44 g, 40%) como un aceite marrón; IR: νmax =
1720, 3320; EM (IE): m/z 344 [M+2]+, 342 [M]+; RMN 1H (300
MHz; DMSO-d6): δ = 1.19 (m, 3 H, CH3), 1.70-2.04 (m, 4 H,
2CH2), 3.00-3.04 (m, 4 H, 2NCH2), 3.25-3.32 (m, 2 H, CH2CH3), 3.70 (s, 1 H, CH),
7.31 (t, J = 7.9 Hz, 1 H, Ar H), 7.43 (d, J = 7.3 Hz, 1H, Ar H), 7.51 (d, J = 7.9 Hz, 1
H, ArH), 7.66 (s, 1 H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-d6): δ = 9.1, 30.8, 31.1,
56.1, 60.1, 68.2, 121.3, 129.2, 130.2, 130.3, 132.5, 137.8, 172.6.
N
HO
OH
O
HCl
Br
N
HO
OH
O
HCl
OH
Parte Experimental
101
Síntesis de cloruro de 1-bencil-4-[carboxi(p-bromofenil)metil]-4-hidroxipiperidinio (7)
A partir de ácido (4-bromofenil)acético (1.00 g, 5 mmol) en
benceno (6 mL), N-bencil-4-piperidona (0.57 g, 3 mmol) en
benceno (6 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (5 mL, 10 mmol),
después de purificar por el método general descrito en 1.4.2.1, se obtuvo 7 (0.14 g, 13%) como un sólido blanco; p.f. > 160 ºC
dec; IR: νmax = 1720, 3340; EM (IE): m/z 406 [M+2]+, 404 [M]+;
RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6): δ = 1.64-2.02 (m, 4 H, 2CH2),
3.11 (sa, 4 H, 2NCH2), 3.65 (s, 1 H, CH), 4.25 (s, 2 H, 2CH2Ph),
7.35-7.44 (m, 5 H, ArH), 7.52-7.55 (m, 4 H, ArH); RMN 13C (75.4
MHz; DMSO-d6): δ = 30.5, 47.2, 58.6, 60.1, 68.1, 120.8, 128.8, 129.5, 130.9,
131.4, 132.1, 134.5, 140.8, 172.7.
Síntesis de cloruro de 1-bencil-4-[carboxi(m-bromofenil)metil]-4-hidroxipiperidinio (8)
A partir de ácido (3-bromofenil)acético (0.50 g, 2.3 mmol) en
benceno (3 mL), N-bencil-4-piperidona (0.29 g, 1.5 mmol) en
benceno (2 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (2 mL, 4.6 mmol)
y después de purificar por el método general descrito en 1.4.2.1,
se obtuvo 8 (0.60 g, 91%) como un aceite marrón; IR (neat): νmax
= 1730, 3340; EM (IE): m/z 406 [M+2]+, 404 [M]+; RMN 1H (300
MHz; DMSO-d6): δ =1.82 (sa, 4 H, 2CH2), 3.08 (sa, 4 H, 2NCH2),
3.67 (s, 1 H, CH), 4.24 (s, 2 H, CH2Ph), 4.40 (sa, 1 H, OH), 7.30
(dd, J = 7.3, 7.9 Hz, 1 H, ArH), 7.40-7.44 (m, 4 H, ArH), 7.49-7.54 (m, 3 H, ArH),
7.65 (s, 1H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-d6): δ = 30.8, 47.9, 58.4, 60.4, 68.7,
120.8, 127.9, 128.8, 129.5, 130.9, 131.4, 132.1, 134.5, 137.6, 140.8, 172.9.
N
HO
OH
O
HCl
Br
N
HO
OH
O
HCl
Br
Parte Experimental
102
Síntesis de cloruro de 4-[carboxi(p-metilfenil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (9)
A partir de ácido (4-metilfenil)acético (1.00 g, 6.7 mmol) en
benceno (7 mL), N-etil-4-piperidona (0.57 g, 4.5 mmol) en
benceno (6 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (6.7 mL, 13.4
mmol) y después de purificar por el método general descrito en
1.4.2.1, se obtuvo 9 (0.14 g, 11%) como un aceite marrón; IR:
νmax = 1720, 3320; RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6): δ = 1.34-1.44
(m, 3 H, CH3), 1.86-2.23 (m, 4 H, 2CH2), 2.50 (s, 3 H, CH3), 3.22-
3.26 (m, 4 H, 2NCH2), 3.47-3.51 (m, 2 H, CH2CH3), 3.85 (s, 1 H,
CH), 5.31 (s, 1 H, OH), 7.37 (d, J = 7.3 Hz, 2 H, ArH), 7.51 (d, J = 7.3 Hz, 2 H,
ArH), 9.37 (sa, 1 H, NH); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-d6): δ = 9.1, 20.6, 31.6,
47.1, 50.9, 60.5, 68.2, 128.7, 129.7 132.0, 136.6, 173.3.
Síntesis de cloruro de 1-bencil-4-[carboxi(p-metilfenil)metil]-4-hidroxipiperidinio (10)
A partir de ácido (4-metilfenil)acético (1.00 g, 6.7 mmol) en
benceno (7 mL), N-bencil-4-piperidona (0.84 g, 4.5 mmol) en
benceno (6 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (6.7 mL, 13.4
mmol), después de purificar por el método general descrito en
1.4.2.1, se obtuvo 10 (0.50 g, 29%) como un sólido blanco; p.f. >
180 ºC dec; IR: νmax = 1760, 3500; EM (IE): m/z 340 [M]+; RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6): δ = 1.66-1.88 (m, 4 H, 2CH2), 2.27 (s, 3
H, CH3), 3.12 (sa, 4 H, 2NCH2) 3.61 (s, 1 H, CH), 4.24 (s, 2 H,
CH2Ph) 5.10 (sa, 1 H, OH), 7.14 (d, J = 7.3 Hz, 2 H, ArH), 7.26 (d,
J = 7.3 Hz, 2 H, ArH), 7.45-7.47 (m, 5 H, ArH), 9.39 (sa, 1 H, NH); RMN 13C (75.4
MHz; DMSO-d6): δ = 30.1, 31.5, 47.3, 58.9, 60.6, 68.2, 128.7, 128.8, 129.5, 129.6,
129.8, 131.5, 131.9, 136.5, 173.2; análisis elemental calc (%) para C21H26ClNO3: C
67.10, H 6.97, N 3.73; encontrado: C 64.03, H 6.82, N 3.75.
N
HO
OH
O
HCl
CH3
N
HO
OH
O
HCl
CH3
Parte Experimental
103
Síntesis de cloruro de 1-bencil-4-[carboxi(m-metilfenil)metil]-4-hidroxipiperidinio (11)
A partir de ácido (3-metilfenil)acético (1.00 g, 6.7 mmol) en
benceno (7 mL), N-bencil-4-piperidona (0.84 g, 4.5 mmol) en
benceno (6 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (6.7 mL, 13.4
mmol), después de purificar por el método general descrito en
1.4.2.1, se obtuvo 11 (0.24 g, 29%) como un aceite marrón;
IR: νmax = 1750, 3500; EM (IE): m/z 340 [M]+; RMN 1H (300
MHz; DMSO-d6): δ = 1.53-1.82 (m, 4 H, 2CH2), 2.18 (s, 3 H,
CH3), 3.01 (sa, 4 H, 2NCH2), 3.50 (s, 1 H, CH), 4.13 (sa, 2 H,
CH2Ph), 5.02 (sa, 1 H, OH) 6.99-7.11 (m, 4 H, ArH), 7.34-7.39 (m, 5H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-d6): δ = 21.1, 31.3, 47.3, 58.5, 60.9, 68.2, 126.9, 128.0,
128.7, 128.8, 129.5, 129.7, 130.4, 131.4, 134.9, 137.1, 173.1. Síntesis de cloruro de 1-bencil-4-[carboxi(m-hidroxifenil)metil]-4-hidroxipiperidinio (12)
A partir de ácido (3-hidroxifenil)acético (1.50 g, 9.8 mmol) en
benceno (18 mL), N-bencil-4-piperidona (1.24 g, 6.6 mmol) en
benceno (10 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (15 mL, 30.0
mmol), después de purificar por el método general descrito en
1.4.2.1, se obtuvo 12 (0.69 g, 29%) como un sólido amarillo;
p.f. > 105 ºC desc; IR: νmax = 1760, 3500; EM (IE): m/z 342
[M]+; RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6): δ = 1.62-1.99 (m, 4 H,
2CH2), 3.05-3.13 (m, 4 H, 2NCH2), 3.54 (s, 1 H, CH), 4.25 (sa, 2
H, CH2Ph), 5.09 (sa, 1 H, OH), 6.69 (d, J = 7.9 Hz, 1 H, ArH), 6.76 (d, J = 7.3 Hz, 1
H, ArH), 6.84 (s, 1 H, ArH), 7.10 (dd, J = 7.3, 7.9 Hz, 1 H, ArH) 7.45-7.61 (m, 5 H,
ArH), 9.45 (sa, 1 H, NH); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-d6): δ = 30.1, 47.5, 59.0,
61.0, 68.3, 114.5, 116.7, 120.8, 128.9, 129.1, 129.6, 129.8, 131.5, 136.2, 157.1,
173.2 .
N
HO
OH
O
HCl
CH3
N
HO
OH
O
HCl
OH
Parte Experimental
104
Síntesis de cloruro de 4-[carboxi-(2-tienil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (13)
A partir de ácido 2-tienilacético (2.00 g, 14 mmol) en benceno
(10 mL), N-etil-4-piperidona (1.20 g, 9 mmol) en benceno (10
mL) y cloruro de isopropilmagnesio (14.1 mL, 28 mmol) se
obtuvo 13 (3.23 g, 92%) como un sólido marrón; p.f.>106ºC
descompone (AcOEt); IR: νmax = 1720, 3400; EM (IE): m/z 270
[M]+; RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6): δ = 1.19 (t, J = 7.3 Hz, 3 H,
CH3), 1.70-2.10 (m, 4 H, 2CH2), 3.01 (sa, 4 H, 2NCH2), 3.37 (sa, 2 H, CH2CH3),
3.99 (s, 1 H, CH), 5.25 (sa, 1 H, OH), 7.00 (m, 1 H, tiofeno-H), 7.06 (d, J = 3.1 Hz,
1 H, tiofeno -H), 7.46 (d , J = 4.9 Hz, 1 H, tiofeno -H); RMN 13C (75.4 MHz; DMSO-
d6): δ = 9.0, 30.9, 31.3, 47.0, 50.8, 56.9, 126.2, 128.0, 136.1, 172.4; análisis
elemental calc (%) para: C13H20ClNO3S: C 51.06, H 6.59, N 4.58, S 10.49;
encontrado: C, 51.29, H 6.32, N 4.62, S 10.27.
Síntesis de cloruro de 1-bencil-4-[carboxi-(2-tienil)metil]-4-hidroxipiperidinio (14)
A partir de ácido 2-tienilacético (2.00 g, 14 mmol) en benceno
(10 mL), N-bencil-4-piperidona (1.80 g, 10 mmol) en benceno
(10 mL) y cloruro de isopropilmagnesio (14.1 mL, 28 mmol) se
obtuvo 14 (2.50 g, 71%) como un sólido marrón; p.f. >115 ºC
descompone (AcOEt); IR: νmax = 1720, 3400; EM (IE): m/z 332
[M]+; RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6): δ = 1.68-2.17 (m, 4 H,
2CH2), 3.13 (sa, 4 H, 2NCH2), 3.98 (s, 1 H, CH), 4.25 (sa, 2 H,
CH2Ph), 5.23 (sa, 1 H, OH), 6.97-7.04 (m, 2 H, tiofeno-H), 7.43-7.44 (m, 4 H,
tiofeno-H and ArH), 7.60-7.67 (m, 2 H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ =
30.7, 31.2, 47.1, 56.9, 58.7, 126.2, 126.6, 128.0, 128.7, 129.4, 129.9, 131.6,
136.1, 172.4; análisis elemental calc (%) para: C18H22ClNO3S: C 58.77, H 6.03, N
3.81, S 8.72; encontrado: C 58. 41, H 6.14, N 3. 77, S 8.89.
N
HO
OH
O
HCl
S
N
HO
OH
O
HCl
S
Parte Experimental
105
Síntesis de cloruro de 4-[carboxi(naftil)metil]-1-etil-4-hidroxipiperidinio (15)
A partir de ácido 1-naftilacético (2.0 g, 11 mmol) en benceno
(7 mL), N-etil-4-piperidona (0.89 g, 7 mmol) en benceno (8
mL) y cloruro de isopropilmagnesio (11 mL, 22 mmol) se
obtuvo 15 (1.25 g, 51%) como un sólido blanco; p.f. > 124 ºC
descompone (AcOEt); IR: νmax = 1710, 3400; EM (IE): m/z
350 [M]+; RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6): δ = 1.15 (t, J = 7.3
Hz, 3 H, CH3), 1.83-2.01 (m, 4 H, 2CH2), 2.96 (c, J = 7.9 Hz, 2 H, CH2CH3), 3.19-
3.26 (m, 2 H, NCH2), 3.38-3.44 (m, 2 H, NCH2), 4.69 (s, 1 H, CH), 7.48-7.59 (m, 3
H, ArH), 7.61-7.90 (m, 2 H, ArH), 8.6 (d, J = 8.6 Hz, 2 H, ArH); RMN 13C (75.4
MHz; CDCl3): δ = 9.0, 30.5, 32.3, 47.0, 50.8, 53.4, 69.0, 123.8, 125.2, 125.6,
126.5, 126.9, 128.0, 128.9, 131.4, 132.5, 133.7, 173.7; análisis elemental calc (%)
para: C19H24ClNO3 .1H2O: C 62.03, H 7.12, N 3.81; encontrado: C 62.39, H 6.84,
N 4.32. Síntesis de cloruro de 1-bencil-4-[carboxi(naftil)metil]-4-hidroxipiperidinio (16)
A partir de ácido 1-naftilacético (1.12 g, 6 mmol) en benceno
(7 mL), N-bencil-4-piperidona (0. 75 g, 4 mmol) en benceno (8
mL) y cloruro de isopropilmagnesio (11 mL, 12 mmol) se
obtuvo 16 (0.18 g, 11%) como un sólido blanco; p.f. > 204 ºC
descompone (AcOEt); IR: νmax = 1690, 3460; EM (IE): m/z
376 [M]+; RMN 1H (300 MHz; DMSO-d6): δ = 1.74-1.88 (m, 4
H, 2CH2), 3.18-3.31 (m, 4 H, 2NCH2), 4.25 (s, 2 H, CH2), 4.72
(s, 1 H, CH), 7.45-7.47 (m, 8 H, ArH), 7.79-7.90 (m, 2 H, ArH), 8.22 (d, J = 8.6 Hz,
2 H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 30.4, 32.5, 47.6, 49.2, 59.2, 68.7,
124.1, 125.4, 126.0, 126.9, 127.1, 128.4, 129.1, 129.2, 129.7, 129.9, 131.4, 131.7,
132.6, 134.0, 173.8; análisis elemental calc (%) para: C24H26ClNO3 . 2 H2O: C
64.35, H 6.75, N 3.13; encontrado: C 65.94, H 6.27, N 4.10.
N
HO
OH
O
HCl
N
HO
OH
O
HCl
Parte Experimental
106
1. 4. 2. 2. Síntesis de 4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil)piperidin-1-carboxilato de terc-butilo (21)
Sobre una solución de N,N-ciclohexilisopropilamina (4.1 mL,
25 mmol) en 20 mL de THF seco, enfriada a -78 ºC, con
agitación y bajo atmósfera de argon, se agrega, gota a gota
15.75 mL de nBuLi (1.6 M, 25 mmol) y se deja agitando
durante 30 minutos. A continuación se agrega lentamente
una solución de isobutirato de etilo (2.6 mL, 25 mmol) en THF seco (5 mL) y se
deja agitar a -78 ºC durante 30 minutos. Finalmente se añade una solución de N-
terc-butoxicarbonil-4-piperidona (3.3 g, 17 mmol) en THF seco. La mezcla de
reacción se deja agitando a -78 ºC durante 24 h y luego se diluye en AcOEt y se
lava tres veces con agua (20 mL). Las fases orgánicas se secan con Na2SO4
anhidro, se filtra el desecante y el disolvente se evapora a vacío. Se obtiene un
aceite que se purifica por cromatografía en columna en gel de sílice y AcOEt-
Hexano (1:1) como eluyente dando lugar a 26 (4.45 g, 87%) como un sólido
blanco; p.f. 80-81 ºC (AcOEt); IR: νmax = 1650, 1720, 3480; EM (IE): m/z 324
[M+Na]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.23 (s, 6 H, 2CH3), 1.46 (s, 9 H, 3CH3),
1.41-1.50 (m, 2 H, CH2), 1.62 (td, J = 12.6, 4.9 Hz, 2 H, CH2), 3.10 (td, J = 12.6,
2.7 Hz, 2 H, CH2), 3.72 (s, 3 H, OCH3), 3.92-3.97 (m, 2 H, CH2); RMN 13C (75.4
MHz; CDCl3): δ = 20.7, 28.7, 31.3, 39.0, 39.7, 49.6, 52.2, 72.6, 79.3, 154.8,
178.9; análisis elemental calc (%) para: C15H27NO5: C 59.78, H 9.03, N 4.65;
encontrado: C 59.40, H 8.79, N 4.68.
N
HO
O
O
O O
Parte Experimental
107
I. 4. 2. 3. Síntesis de cloruro de 4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil) piperidinio (22)
A través de una solución de 21 (4.46 g, 15 mmol) en AcOEt (40
mL) enfriada a 0 ºC se hace pasar una corriente de cloruro de
hidrógeno durante 15 minutos. A continuación la solución se
evapora a vacío. Se obtiene 22 (2.7 g, 75%) como un sólido
blanco; p.f. 176-177 ºC (AcOEt); IR: νmax = 1710, 2700, 3300; EM (IE): m/z 202
[M]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.24 (s, 6 H, 2CH3), 1.41-1.46 (m, 2 H, CH2),
1.65 (td, J = 12.6, 4.9 Hz, 2 H, CH2), 2.85-2.90 (m, 2 H, CH2), 3.03 (td, J = 12.9,
2.7 Hz, 2 H, CH2), 3.72 (s, 3 H, OCH3); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.8,
29.8, 41.4, 51.4, 52.5, 71.5; análisis elemental calc (%) para: C10H20ClNO3: C
50.52, H 8.58, Cl 14.91, N 5.89, O 20.19; encontrado: C 50.06, H 8.39, N 5.95.
I. 4. 2. 4. Método general de la preparación de 2-(1-alquil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropanoato de metilo (23-34) A una solución de cloruro de 4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil)piperidinio
(22) (1 equivalente) en DMF (2 mL aprox.) a temperatura ambiente se añade
K2CO3 (2 equivalentes) y a continuación el haluro de alquilo correspondiente (1
equivalente). La mezcla de reacción se agita a TA hasta que completa la reacción
(de 4 a 24 h). Se adiciona agua (10 mL) y la mezcla se extrae con AcOEt (3x15
mL). Los extractos orgánicos combinados se lavan con solución saturada de NaCl
y se secan sobre Na2SO4 anhidro. La solución se filtra y se evapora a vacío. Se
obtiene un residuo que se purifica por cromatografía en gel de sílice.
N
HO
O
O
HHCl
Parte Experimental
108
Síntesis de 2-(1-alil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (23)
A partir de 22 (0.10 g, 0.4 mmol) en DMF (2 mL), K2CO3 (0.14 g,
0.8 mmol) y bromuro de alilo (0.043 mL, 0.4 mmol), y después de
una cromatografía en columna del crudo con AcOEt como
eluyente, se obtuvo el compuesto 23 (0.042 g, 41 %) como un
aceite amarillo; IR: νmax = 1720, 3500; EM (IE): m/z 242 [M+H]+;
RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.24 (s, 6 H, 2CH3), 1.44-1.49 (m,
2 H, CH2), 1.79 (td, J = 12.6, 4.9 Hz, 2 H, CH2), 2.30 (td, J = 12.1, 2.2 Hz, 2 H,
CH2), 2.73-2.76 (m, 2 H, CH2), 3.02 (d, J = 6.6 Hz, 2 H, CH2), 3.42 (s, 1 H, OH),
3.71 (s, 3 H, OCH3), 5.13-5.22 (m, 2 H, C=CH2), 5.82-5.85 (m, 1 H, C=CH); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.8, 31.4, 48.9, 49.5, 52.0, 61.8, 72.3, 117.8, 135.2,
178.9 .
Síntesis de 2-(1-bencil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (24)
A partir de 22 (0.50 g, 2.1 mmol) en DMF (2 mL), K2CO3 (0.58
g, 4.2 mmol) y bromuro de bencilo (0.25 mL, 2.1 mmol), y
después de una cromatografía en columna del crudo con AcOEt
como eluyente, se obtuvo el compuesto 24 (0.23 g, 38%) como
un aceite amarillo; IR: νmax = 1700-1720, 3500; EM (IE): m/z 292
[M+H]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.22 (s, 6 H, 2CH3), 1.42 (da, J = 11.5 Hz,
2 H, CH2), 1.77 (ta, J = 13.2 Hz, 2 H, CH2), 2.37-2.44 (m, 2 H, CH2), 2.70-2.74 (m, 2
H, CH2), 3.36 (s, 1 H, OH), 3.51 (s, 2 H, CH2Ph), 3.67 (s, 3 H, OCH3), 7.27-7.33 (m,
5 H, ArH) ; RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.6, 31.3, 48.8, 49.4, 51.7, 62.9, 72.1,
126.6, 127.9, 128.9, 138.4, 178.5 .
N
HO
O
O
N
HO
O
O
Parte Experimental
109
Síntesis de 2-[4-hidroxi-1-(4-nitrobencil)piperidin-4-il]-2-metilpropionato de metilo (25)
A partir de 22 (0.10 g, 0.4 mmol) en DMF (2 mL), K2CO3
(0.12 g, 0.8 mmol) y bromuro de 4-nitrobencilo (0.09 g, 0.4
mmol), y después de una cromatografía en columna del
crudo con AcOEt como eluyente, se obtuvo el compuesto 25
(0.07 g, 48%) como un sólido amarillo; p.f. 77-78 ºC; IR: νmax
= 1700, 3460; EM (IE): m/z 337 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz;
CDCl3): δ = 1.25 (s, 6 H, 2CH3), 1.43-1.47 (m, 2 H, CH2), 1.80 (td, J = 12.6, 4.4 Hz,
2 H, CH2), 2.40-2.51 (m, 2 H, CH2), 2.63-2.67 (m, 2 H, CH2), 3.45 (s, 1 H, OH), 3.61
(s, 2 H, CH2Ph), 3.72 (s, 3 H, OCH3), 7.52 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, Ar-H), 8.17 (d, J =
8.8 Hz, 2 H, Ar-H) ; RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.8, 31.4, 41.2, 52.1, 53.0,
61.9, 72.0, 123.5, 123.7, 129.2, 129.7, 178.9; análisis elemental calc (%) para:
C17H24N2O5: C 60.70, H 7.19, N 8.33, encontrado: C 59.87, H 7.05, N 8.25.
Síntesis de 2-(1-ciclopropilmetil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (26)
A partir de 22 (0.20 g, 0.8 mmol) en DMF (2 mL), K2CO3 (0.23 g,
1.7 mmol) y bromuro de metilciclopropilo (0.11 g, 0.8 mmol), y
después de una cromatografía en columna del crudo con AcOEt-
MeOH (9:1) como eluyente, se obtuvo el compuesto 26 (0.12 g,
55%) como un aceite amarillo; IR: νmax = 1720, 3500; EM (IE): m/z 256 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 0.07-0.14 (m, 2 H, CH2), 0.47-0.55 (m, 2 H, CH2), 0.83-
0.93 (m, 1 H, CH), 1.25 (s, 6H, 2CH3), 1.48 (da, J = 11.6 Hz, 2 H, CH2), 1.85 (td, J =
13.2, 4.4 Hz, 2 H, CH2), 2.30 (d, J = 6.6 Hz, 2 H, CH2), 2.35-2.43 (m, 2 H, CH2),
2.90-2.93 (m, 2 H, CH2), 3.45 (s, 1 H, OH), 3.72 (s, 3 H, OCH3); RMN 13C (75.4
MHz; CDCl3): δ = 3.9, 8.1, 20.7, 31.2, 48.9, 49.5, 52.0, 63.6, 72.2, 77.2, 178.9.
N
HO
O
O
NO2
N
HO
O
O
Parte Experimental
110
Síntesis de 2-[1-(4-clorobencil)-4-hidroxipiperidin-4-il]-2-metilpropionato de metilo (27)
A partir de 22 (0.15 g, 0.6 mmol) en DMF (2 mL), K2CO3 (0.18
g, 1.3 mmol) y cloruro de p-clorobencilo (0.10 g, 0.6 mmol), y
después de una cromatografía en columna del crudo con
AcOEt-MeOH (1:1) como eluyente, se obtuvo el compuesto
27 (0.18 g, 85%) como un sólido blanco; p.f. 59-60 ºC; IR:
νmax = 1710, 3540; EM (IE): m/z 326 [M+H]+, 328
[M+H+2]+;RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ =1.23 (s, 6 H, 2CH3), 1.43 (da, J=11.0 Hz,
2 H, CH2), 1.77 (td, J = 12.6, 4.4 Hz, 2 H, CH2), 2.32-2.41 (m, 2 H, CH2), 2.63-2.67
(m, 2 H, CH2), 3.47 (s, 2 H, CH2Ph), 3.69 (s, 3 H, OCH3), 7.26 (sa, 4 H, Ar-H);
RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.8, 31.3, 48.9, 49.5, 52.1, 62.1, 72.3, 128.3,
130.5, 178.9 .
Síntesis de 2-[4-hidroxi-1-(4-trifluorometilbencil)piperidin-4-il]-2-metilpropionato de metilo (28)
A partir de 22 (0.15 g, 0.6 mmol) en DMF (2 mL), K2CO3
(0.18 g, 1.3 mmol) y bromuro de p-trifluorobencilo (0.15 g,
0.6 mmol), y después de una cromatografía en columna del
crudo con AcOEt como eluyente, se obtuvo el compuesto
28 (0.21 g, 94%) como un aceite amarillo; IR: νmax = 1340,
1700, 3500; EM (IE): m/z 360 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz;
CDCl3): δ = 1.24 (s, 6 H, 2CH3), 1.42-1.47 (m, 2 H, CH2), 1.79 (td, J = 13.2, 4.4
Hz, 2 H, CH2), 2.37-2.46 (m, 2 H, CH2), 2.65-2.68 (m, 2 H, CH2), 3.43 (s, 1 H, OH),
3.57 (s, 2 H, CH2Ph), 3.70 (s, 3 H, OCH3), 7.46 (d, J = 8.3 Hz, 2 H, Ar-H), 7.56 (d,
J = 8.3 Hz, 2 H, Ar-H); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.8, 31.4, 49.1, 49.6,
52.1, 62.4, 72.3, 122.4, 125.0, 125.1, 125.1, 125.2, 126.0, 129.2, 178.2; análisis
elemental calc (%) para: C18H24F3NO3: C 60.16, H 6.73, N 3.90; encontrado: C
59.77, H 6.69, N 3.94.
N
HO
O
O
Cl
N
HO
O
O
CF3
Parte Experimental
111
Síntesis de 2-[4-hidroxi-1-(2-hidroxietil)-piperidin-4-il]-2-metilpropionato de metilo (29)
A partir de 22 (0.20 g, 0.8 mmol) en DMF (2 mL), K2CO3 (0.23 g,
1.7 mmol) y 2-bromoetanol (0.11 g, 0.8 mmol), y después de una
cromatografía en columna del crudo con AcOEt-MeOH (9:1)
como eluyente, se obtuvo el compuesto 29 (0.07 g, 34%) como
un aceite amarillo; IR: νmax = 1720, 3400; EM (IE): m/z 246 [M+H]+; RMN 1H (300
MHz; CDCl3): δ = 1.23 (s, 3 H, CH3), 1.24 (s, 3 H, CH3), 1.43-1.48 (m, 2 H, CH2),
1.74-1.84 (m, 2 H, CH2), 2.38-2.45 (m, 2 H, CH2), 2.56-2.58 (m, 2 H, CH2), 2.71-
2.77 (m, 2 H, CH2), 3.45 (d, J = 6.6 Hz, 1 H, 1/2CH2), 3.65 (d, J = 6.6 Hz, 1 H,
1/2CH2), 3.72 (s, 3 H, OCH3); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.8, 31.5, 48.8,
49.5, 52.1, 57.8, 59.2, 72.2, 178.9.
Síntesis de 2-[1-(2-dietilaminoetil)-4-hidroxipiperidin-4-il]-2-metilpropionato de metilo (30)
A partir de 22 (0.20 g, 0.8 mmol) en DMF (2 mL), K2CO3 (0.23 g,
1.7 mmol) y 2-cloro-N,N-dietiletanamina (0.15 g, 0.8 mmol), y
después de una cromatografía en columna del crudo con
AcOEt-MeOH-NH3 (9:1:0.1) como eluyente, se obtuvo el
compuesto 30 (0.086 g, 34%) como un aceite amarillo; IR: νmax
= 1720, 3300; EM (IE): m/z 301 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.05 (t, J
= 7.2 Hz, 6 H, 2CH3), 1.24 (s, 6 H, 2CH3), 1.44-1.48 (m, 2 H, CH2), 1.85 (td, J =
13.2, 4.4 Hz, 2 H, CH2), 2.48 (ta, J = 11.0 Hz, 4 H, CH2), 2.60 (c, J = 14.3, 7.1 Hz,
4 H, 2CH2), 2.80-2.83 (m, 2 H, CH2), 3.48 (s, 1 H, OH), 3.71 (s, 3 H, OCH3); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 11.6, 20.8, 31.4, 47.4, 49.6, 50.2, 52.0, 56.5, 72.3,
178.9.
N
HO
O
O
OH
N
HO
O
O
N
Parte Experimental
112
Síntesis de 2-[4-hidroxi-1-(4-metoxibencil)piperidin-4-il]-2-metilpropionato de metilo (31)
A partir de 22 (0.20 g, 0.8 mmol) en DMF (2 mL), K2CO3
(0.23 g, 1.7 mmol) y bromuro de 4-metoxibencilo (0.17 g,
0.8 mmol), y después de una cromatografía en columna
del crudo con AcOEt-MeOH-NH3 (1:1:0.1) como eluyente, se obtuvo 31 (0.05 g, 20%) como un sólido blanco; p.f. 65-
67 ºC; IR: νmax = 1690, 1720, 3500; EM (IE): m/z 322
[M+H]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.23 (s, 6 H, 2CH3), 1.40-1.44 (m, 2 H,
CH2), 1.76 (td, J = 12.6, 4.4 Hz, 2 H, CH2), 2.29-2.38 (m, 2 H, CH2), 2.66-2.70 (m,
2 H, CH2), 3.34 (s, 1 H, OH), 3.46 (s, 2 H, CH2Ph), 3.70 (s, 3 H, OCH3), 3.79 (s, 3
H, OCH3), 6.85 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, Ar-H), 7.24 (d, J = 8.8 Hz, 2 H, Ar-H); RMN 13C
(75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.8, 31.4, 48.8, 49.6, 52.0, 55.2, 62.4, 72.4, 113.4, 130.3,
158.5, 178.9; análisis elemental calc (%) para: C18H27NO4: C 67.26, H 8.47, N
4.36; encontrado: C 66.74, H 8.31, N 4.46.
Síntesis de 2-[4-hidroxi-1-(2-metoxietil)piperidin-4-il]-2-metilpropionato de metilo (32)
A partir de 22 (0.20 g, 0.8 mmol) en DMF (2 mL), K2CO3 (0.23 g,
1.7 mmol) y 2-bromoetilmetiléter (0.12 g, 0.8 mmol), y después de
una cromatografía en columna del crudo con AcOEt como
eluyente, se obtuvo 32 (0.11 g, 49%) como un aceite amarillo; IR:
νmax = 1720, 3490; EM (IE): m/z 260 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.23
(s, 6 H, 2CH3), 1.45 (dd, J = 13.7, 2.2 Hz, 2 H, CH2), 1.85 (td, J = 13.2, 4.4 Hz, 2
H, CH2), 2.41 (ta, J = 11.6 Hz, 2 H, CH2), 2.61 (t, J = 6.1 Hz, 2 H, CH2), 2.77-2.81
(m, 2 H, CH2), 3.35 (s, 3 H, OCH3), 3.44 (s, 1 H, OH), 3.53 (t, J = 6.1 Hz, 2 H,
CH2), 3.71 (s, 3 H, OCH3); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.7, 31.2, 49.3, 49.5,
51.9, 57.8, 58.7, 69.9, 72.1, 178.8.
N
HO
O
O
OCH3
N
HO
O
O
O
Parte Experimental
113
Síntesis de 2-(4-hidroxi-1-prop-2-inilpiperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (33)
A partir de 22 (0.20 g, 0.8 mmol) en DMF (2 mL), K2CO3 (0.23 g,
1.7 mmol) y bromuro de propargilo (0.13 g, 0.8 mmol), y después
de una cromatografía en columna del crudo con AcOEt-MeOH-
NH3 (9:1:0.1) como eluyente, se obtuvo 33 (0.09 g, 45%) como un
sólido amarillo; p.f. 66-67 ºC; IR: νmax = 1730, 3260, 3490; EM (IE): m/z 240
[M+H]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.24 (s, 6 H, 2CH3), 1.50 (dd, J = 13.2,
2.2 Hz, 2 H, CH2), 1.82 (td, J = 12.6, 4.4 Hz, 2 H, CH2), 2.27 (t, J = 2.2 Hz, 1 H,
CH), 2.53-2.61 (m, 2 H, CH2), 2.75 (dt, J = 11.0, 2.2 Hz, 2 H, CH2), 3.28 (d, J = 2.8
Hz, 2 H, CH2), 3.44 (s, 1 H, OH), 3.72 (s, 3 H, OCH3); RMN 13C (75.4 MHz;
CDCl3): δ = 20.7, 31.4, 46.9, 48.1, 49.5, 52.0, 71.9, 72.9, 79.2, 178.8; análisis
elemental calc (%) para: C13H21NO3: C 65.25, H 8.84, N 5.85; encontrado C 64.71,
H 8.63, N 5.68.
N
HO
O
O
Parte Experimental
114
Síntesis de bromuro de 1,1-dibencil-4-hidroxi-4-(2-metoxi-1,1-dimetil-2-oxoetil) piperidinio (34)
A partir de 22 (0.50 g, 2 mmol) en DMF (10 mL), K2CO3
(0.58 g, 4 mmol) y bromuro de bencilo (0.50 mL, 4 mmol),
y después de una cromatografía en columna del crudo con
AcOEt-MeOH (9:1) como eluyente, se obtuvo 34 (0.53 g,
54%) como un sólido blanco; p.f. 87-88 ºC; IR: νmax = 1710,
3400; EM (IE): m/z 382.33 [M]+; RMN 1H (300 MHz;
CDCl3): δ = 1.29 (s, 6 H, CH3), 1.84-1.88 (d, 2 H, CH2), 2.36-2.45 (t, 2 H, CH2),
3.56-3.64 (t, 2 H, CH2), 3.72 (s, 3 H, OCH3), 3.72-3.81 (t, 2 H, CH2), 4.00 (s, 1 H,
OH), 4.77 (s, 2 H, CH2), 5.22 (s, 2 H, CH2), 7.28-7.24 (m, 8 H, Ar-H), 7.71-7.74 (d,
2 H, Ar-H); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.83, 27.80, 50.82, 52.65, 61.79,
67.68, 70.38, 79.49, 128.24, 128.71, 130.24, 130.67, 131.75, 132.00, 134.18,
134.88, 178.24; análisis elemental calc (%) para: C24H32BrNO3 . 1H2O: C 60.00, H
7.13, N 3.03; encontrado: C 59.77, H 6.92, N 2.92
N
HO
O
O
Br
Parte Experimental
115
I. 4. 2. 5. Síntesis de 2-(1-etil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (35)
Para la síntesis de 35 se aplicó el procedimiento descrito
anteriormente para 21. A partir de n-BuLi (1.6 M, 15.8 mL) en
hexano, isopropilciclohexilamina (4.1 mL) en THF anhidro (20
mL), isobutirato de etilo (2.6 mL, 25 mmol) en THF anhidro (5
mL) y N-etil-4-piperidona (2.29 mL, 17 mmol) en THF anhidro (5
mL), y después de una cromatografía en columna del crudo con
DCM-MeOH (9:1) como eluyente, se obtuvo 35 (3.59 g, 92%) como un aceite
amarillo; IR: νmax = 1720, 1740, 3500; EM (IE): m/z 230 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz;
CDCl3): δ = 1.09 (t, J = 7.1 Hz, 3 H, CH3), 1.24 (s, 6 H, 2CH3), 1.47 (dd, J = 13.7,
2.8 Hz, 2 H, CH2), 1.80 (td, J = 13.2, 4.4 Hz, 2 H, CH2), 2.26-2.35 (m, 2 H, CH2),
2.43 (c, J = 7.1 Hz, 2 H, CH2), 2.74-2.78 (m, 2 H, CH2), 3.42 (s, 1 H, OH), 3.72 (s,
3 H, OCH3); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 11.8, 20.6, 31.2, 48.4, 49.4, 51.8,
52.1, 72.2, 178.7.
N
HO
O
O
Parte Experimental
116
I. 4. 2. 6. Síntesis de 2-(1-benzoil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropionato de metilo (36)
Para la síntesis de 36 se aplicó el procedimiento descrito
anteriormente para 21. A partir de n-BuLi (1.6 M, 3.15 mL) en hexano,
isopropilciclohexilamina (0.83 mL, 5 mmol) en THF anhidro (10 mL),
isobutirato de etilo (0.57 mL, 5 mmol) en THF anhidro (2 mL) y N-
benzoil-4-piperidona (0.676 g, 3.3 mmol) en THF anhidro (5 mL), y
después de una cromatografía en columna del crudo con hexano-AcOEt (9:1) como
eluyente, se obtuvo 36 (0.39 g, 39%) como un sólido blanco; p.f. 88-89 ºC; IR: νmax =
1640, 1740, 3450; EM (IE): m/z 306 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 1.17 (s, 6
H, CH3), 1.31-1.68 (m, 4 H, 2CH2), 3.07-3.42 (m, 2 H, CH2), 3.65 (s, 3 H, OCH3), 7.32
(s, 5 H, Ar-H); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 20.7, 31.3, 32.2, 37.9, 43.5, 49.4, 52.2,
72.8, 126.8, 128.4, 129.5, 136.1, 170.2, 178.8; análisis elemental calc (%) para:
C17H23NO4 .1H2O: C 63.14, H 7.79, N 4.33; encontrado: C 62.98, H 7.56, N 4.45.
I. 4. 2. 7. Síntesis de 2-(4-etil-1-hidroxiciclohexil)-2-metilpropionato de metilo (38)
Para la síntesis de 38 se aplicó el procedimiento descrito
anteriormente para 21. A partir de n-BuLi (1.6 M, 14.9 mL) en hexano,
isopropilciclohexilamina (3.95 mL, 24 mmol) en THF anhidro (10 mL),
isobutirato de etilo (2.7 mL, 24 mmol) en THF anhidro (2 mL) y 4-
etilciclohexanona (2.00 g, 16 mmol) en THF anhidro (5 mL), y después de una
cromatografía en columna del crudo con hexano-AcOEt (9:1) como eluyente, se obtuvo
38 (4.54 g, 87%) como un aceite incoloro; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 0.87 (t, J =
7.1 Hz, 3 H, CH3), 0.95-1.10 (m, 2 H, CH2), 1.22 (s, 6 H, 2CH3), 1.24-1.57 (m, 9 H,
4CH2 y CH), 3.13 (sa, 1 H, OH), 3.70 (s, 3 H, OCH3); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ =
11.36, 20.76, 27.60, 29.46, 31.41, 38.84, 49.91, 51.71, 73.82, 178.91; análisis
elemental calc (%) para: C13H24O3: C 66.98, H 10.59; encontrado: C 67.31, H 10.23.
N
HO
O
O
O
HO
O
O
Parte Experimental
117
I. 4. 2. 8. Síntesis de ácido 2-(1-etil-4-hidroxipiperidin-4-il)-2-metilpropanoico (37)
Sobre una solución de 35 (0.20 g, 0.9 mmol) en THF (7.5 mL) se
agrega una solución acuosa de NaOH (5 mL, 0.5 M) y la mezcla
se refluye durante 2 días. A continuación se agrega lentamente
una solución acuosa de HCl 10% hasta la aparición de un sólido
blanco, que se filtra y lava con agua dando lugar al compuesto 37 (0.07 g, 37%);
p.f. 189 ºC (descompocición); EM (IE): m/z 217 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz;
CDCl3): δ = 1.24 (s, 3 H, CH3), 1.25 (s, 3 H, CH3), 1.36 (td, J = 7.2, 1.7 Hz, 3 H,
CH3), 1.94 (d, J = 14.9 Hz, 2 H, CH2), 2.14 (td, J = 13.2, 2.7 Hz, 2 H, CH2), 3.14-
3.47 (m, 6 H, 3CH2). 1.24 (s, 3 H, CH3), 1.25 (s, 3 H, CH3), 1.36 (td, J = 7.2, 1.7
Hz, 3 H, CH3), 1.94 (d, J = 14.9 Hz, 2 H, CH2), 2.14 (td, J = 13.2, 2.7 Hz, 2 H,
CH2), 3.14-3.47 (m, 6 H, 3CH2); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 22.03, 24.17,
30.95, 49.51, 49.37, 52.80, 71.83, 180.37. I. 4. 2. 9. Síntesis de ácido 2-(4-etil-1-hidroxiciclohexil)-2-metilpropanoico (39)
Sobre una solución de 38 (0.30 g, 1.3 mmol) en THF (9 mL) se
agrega una solución acuosa de NaOH (11 mL, 0.5 M) y la mezcla
se agita a TA durante 24 h. A continuación se agrega una
solución acuosa de HCl 10% y la mezcla se extrae con Et2O (3 x
20 mL). Los extractos se secan (Na2SO4), filtran y concentran a
sequedad. La purificación del residuo mediante cromatografía en columna usando
AcOEt como eluyente condujo a 39 (0.25 g, 88%) como un sólido blanco; p.f. 70-
71 ºC; EM (IE): m/z 237.05 [M+Na]+; RMN 1H (300 MHz; CDCl3): δ = 0.87 (t, J =
7.1 Hz, 3 H, CH3), 0.95-1.10 (m, 2 H, CH2), 1.22 (s, 6 H, 2CH3), 1.24-1.57 (m, 9 H,
4CH2 y CH), 3.13 (sa, 1 H, OH), 3.70 (s, 3 H, OCH3); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3):
δ = 11.43, 20.75, 27.54, 29.63, 31.22, 38.72, 50.11, 74.67, 183.23.
N
HO
OH
O
HO
OH
O
Parte Experimental
118
I. 4. 2. 10. Síntesis de (1-etil-4-hidroxipiperidin-4-il)(fenil)acetato de metilo (17)
Para la síntesis de 17 se aplicó el procedimiento descrito
anteriormente para 21. A partir de n-BuLi (1.6 M, 2.1 mL) en
hexano, isopropilciclohexilamina (0.55 mL) en THF anhidro (3
mL), fenilacetato de etilo (2.6 mL, 25 mmol) en THF anhidro (5
mL) y N-etil-4-piperidona (0.5 mL, 3 mmol) en THF anhidro (2
mL), y después de una cromatografía en columna del crudo con
CHCl3-MeOH (9:1) como eluyente, se obtuvo 17 (0.11 g, 12%) como un aceite
amarillo; EM (IE): m/z 278 [M+H]+; RMN 1H (300 MHz; CD3OD): δ = 1.09 (t, J =
7.3 Hz, 3 H, CH3), 1.59-1.70 (m, 4 H, 2CH2), 2.36-2.64 (m, 4 H, 2NCH2), 2.50 (c, J
= 7.3 Hz, 2 H, CH2CH3), 3.65 (s, 3 H, OCH3), 3.72 (s, 1 H, CH), 7.24-7.33 (m, 3 H,
ArH), 7.42-7.44 (m, 2 H, ArH); RMN 13C (75.4 MHz; CDCl3): δ = 11.7, 34.0, 36.8,
48.2, 48.4, 52.1, 52.2, 59.7, 70.2, 127.7, 128.4, 129.5, 134.1, 174.6.
N
HO
O
O
Parte Experimental
119
I. 4. 3. Determinación de la afinidad
I. 4. 3. 1. Ensayo de competición
Se adsorbe AM en placas de PVC de 96 pocillos (adsorción pasiva)
incubando 50 µL de AM (100 µg/µL) en cada pocillo durante 1 h.
Después de descartar la solución sobrenadante, se añaden 200 µL de
suero de albúmina bovina 1% (BSA) en tampón fosfato (PBS). Después de 1 h la
solución sobrenadante se vuelve a aspirar y se añaden 50 µL de una solución 1µM
de los compuestos a analizar.
Después de 1 h se añaden 50 µL de anticuerpo marcado con peroxidasa
(2.4 µg/mL) y la solución se deja reaccionar durante 1 h más. Tras lavar con BSA
1% en PBS, se estimula la actividad de la peroxidasa usando hidrocloruro de o-
feniletilendiamina como sustrato. El producto de reacción se cuantifica en un lector
de placas (Spectra Rainbow; Tecan, Raleigh, NC) a 450 nm. Cada placa contiene
varios controles internos, incluyendo pocillos sin AM para evaluar las uniones no
específicas; pocillos donde no se agrega ningún compuesto para obtener de ellos
el máximo registro de color; y pocillos donde se adiciona anticuerpo sin marcar
como control positivo de inhibición. Cada compuesto se ensaya por duplicado en
la misma placa. Los resultados son aceptados cuando son reproducibles en tres
placas independientes. La variación intraensayo fue del 6% y la variación
interensayo fue del 13%. La sensibilidad del ensayo se determinó con el
anticuerpo frío y fue 12 nM con un rango dinámico de 12 nM a 54 nM.
I. 4. 3. 2. Determinación de la afinidad por SPR
Usando un equipo Biacore T100 (GE Heathcare Biacore, Uppsala, Suecia)
se llevó a cabo un análisis de interacción molecular en tiempo real. Todos los
experimentos se llevaron a cabo a 25 ºC. En la célula de flujo 2 (Fc 2) de un chip
sensor sCM5 se inmovilizaron 1800 unidades de resonancia (RU) de AM usando
Parte Experimental
120
el método de acoplamiento de amina de acuerdo con las especificaciones del
fabricante (BIAapplications Handbook). Fc 1 fue tratada igual que Fc 2 pero sin la
inyección de AM y se utilizó como referencia. Los estudios se llevaron a cabo con
un flujo de 30 L/min con HBS-DMSO (10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3.4
mM EDTA, 5% DMSO) como tampón. Las muestras de los compuestos en
concentraciones de entre 10 y 200 µM en HBS-DMSO se inyectaron durante 1
min sobre las superficies de referencia y la de la AM, seguido de una post-
inyección durante 2 min. La regeneración se llevó a cabo con dos inyecciones de
30 s de NaCl 0.5 M, seguidas de 2 min. de estabilización. Típicamente, los 10
primeros ciclos consistieron en inyecciones de HBS-DMSO para asegurar que la
superficie se encontraba totalmente equilibrada. También se inyectó HBS-DMSO
antes de cada nuevo compuesto. Los datos del biosensor fueron analizados
usando el software Biacore T100 Evaluation versión 1.1.1 (GE Healthcare). Como
el DMSO a menudo genera cambios en el índice de refracción mayores a las
señales esperadas de los compuestos, los datos fueron corregidos teniendo en
cuenta las posibles diferencias en el índice de refracción generadas por el DMSO
entre las células de flujo.229
I. 4. 4. Ensayos biológicos I. 4. 4. 1. Análisis de la producción de AMPc
Este ensayo se realizó siguiendo protocolos anteriormente publicados.20
Se prepara una placa de 24 pocillos con células confluentes añadiendo 500 µL de
una suspensión de células Rat2 en medio R10 (1x105 células por pocillo) y
dejando incubar una noche. A continuación se lava dos veces con TIS. El medio
TIS consiste en medio RPMI 1640 (Invitrogen) al que se añaden 10 µg/mL de
transferrina, 10 µg/mL de insulina y una concentración 50 nM de selenito sódico.
La transferrina transporta hierro al interior de la célula. La insulina actúa como
factor de crecimiento, evitando que las células entren en apoptosis. El selenito
sódico, por su parte, actúa como antioxidante.
Parte Experimental
121
Se añaden luego 250 µL de TIS con 1% BSA, 1 mg/mL de bacitracina y
100 µM de IBMX. Se incuban las células durante 15 min. a 37 ºC en esta solución.
A continuación, se añaden los compuestos que se desea analizar a una
concentración tal que la concentración final sea 100 nM. Como control positivo se
utiliza forskolina (50 µM) que es un potente activador de proteínas G. Se deja
actuar a los compuestos durante 5 minutos a 37 ºC y a continuación se detiene la
reacción colocando la placa en hielo. Se añaden 250 µL de etanol absoluto frío,
que extrae completamente los contenidos celulares. Las células pegadas al fondo
se homogenizan raspando con la punta de una pipeta y la suspensión se transfiere
a tubos. Las muestras se congelan a –80 ºC hasta que se realice el
radioinmunoensayo.
Radioinmunoensayo para AMPc
El radioinmunoensayo para el AMPc se realiza siguiendo el protocolo del
kit RPA 509 de Biotrack (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ).20
En primer lugar se equilibran todas las muestras y productos del kit a
temperatura ambiente. Después se rotulan tubos de polipropileno con 25 fmol, 50
fmol, 100 fmol, 200 fmol, 400 fmol, 800 fmol y 1600 fmol, y se agregan 500 µL de
buffer (kit) en todos los tubos. En el tubo 1600 fmol se agregan 500 µL de estándar
(32 pmol/mL) y se agita vigorosamente. A partir de esta solución se preparan las
siguientes diluyendo a la mitad sucesivamente con los tubos restantes. Alícuotas
de 100 µL de cada dilución proporcionarán siete niveles de AMPc estándar
diferentes entre 25 y 1600 fmol.
Por otra parte, se rotulan tubos de polipropileno por duplicado para
cuentas totales (TC), tubos de cero estándar (B0), estándares (7-20) y muestras
(21-68). Se agregan 100 µL de tampón en los tubos de cero estándar, 100 µL de
estándar en los tubos 7-20, y 100 µL de cada muestra a ensayar en los tubos
correspondientes.
Parte Experimental
122
Inmediatamente se adicionan 100 µL de antisuero a todos los tubos excepto los
correspondientes a TC. Todos los tubos se agitan vigorosamente en un vortex, se
cubren con un film de plástico y se incuban 3 horas entre 2-8 ºC.
Se agita la botella conteniendo el anticuerpo secundario Amerlex-M hasta
obtener una suspensión homogénea y se adicionan 500 µL a cada tubo excepto a
los TC. Se agita con vortex y se incuba 10 minutos a temperatura ambiente.
Después se separa la fracción unida al anticuerpo por centrifugación (10
minutos, a 1500 rpm) y se extrae el sobrenadante. Por último se mide la
radioactividad presente en cada sedimento. Después de restar el valor de unión no
específica, se construye la curva de calibrado y se interpolan en ella las medidas
de las muestras problema.
I. 4. 4. 2. Pruebas antiproliferativas
En el caso de las líneas celulares T47D, CT2A, A549 y H1299, en una
placa de 96 pocillos se siembran células de la línea elegida (1x104 células por
pocillo) en 50 µL de RPMI 1640 sin suero. Las placas se mantienen en un
incubador húmedo a 37 ºC. Un día después de la siembra se añaden los
compuestos y 5 días después se realizan las medidas. Para el revelado con la
solución comercial, CellTiter 96® AQueous One Soluction Cell Proliferation Assay, se
añaden 20 µL a cada pocillo de la placa. Inmediatamente se incuba la placa entre
1-4 h a 37 ºC en una atmósfera de 5% de CO2. Finalmente, se registra la
absorbancia a 492 nm.
Para las líneas celulares PANC-1, L36PL, HCT-116 y HT29, se
siembran en una placa de 96 pocillos 5 x 103 células por pocillo. Las placas se
mantienen en un incubador húmedo a 37 ºC. Un día después de la siembra se
añaden los compuestos en concentración creciente y también el control 5-
fluorouracilo (5-FU) para HCT116 y HT29, y gemcitabina para PANC-1 y
L36PL, en presencia de suero fetal bovino 0.5%. Después de 96 horas, se
agregan en cada pocillo, 0.02 mL de una solución de bromuro de 3-(4,5-
Parte Experimental
123
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (5 mg/mL en PBS; Sigma) y las placas se
incuban 3 h a 37 ºC. A continuación el medio se reemplaza por 0.1 mL de
DMSO por pocillo. Se agitan las placas y se mide la absorbancia a 570 nm
usando un lector de placas multipocillo (Modelo 550, Bio-Rad, Inc., Hercules,
CA). Cada experimento se realiza por triplicado para cada concentración y se
lleva a cabo por lo menos tres veces.
I. 4. 5. Estudios QSAR- 3D
La estructura 3D de los compuestos se construyó con el grupo carboxílico
protonado, es decir, en su forma neutra y el sustituyente voluminoso en el C4 de la
piperidina se colocó en posición ecuatorial.
Para todos los compuestos se consideró la misma configuración absoluta
del centro estereogénico. La geometría se optimizó a nivel AM1 usando los
programas ChemDraw Ultra 10.0 y Gaussian98.230
Los datos de SPR (tablas 3, 4 y 5) se usaron como variables y.
Las conformaciones obtenidas se analizaron utilizando la metodología
GRIND con el programa Almond 3.3.0.
Se eligieron las sondas DRY, O y N1 para representar las funciones
potencialmente importantes del sitio de unión. La sonda TIP fue también incluida
para considerar la forma de la molécula.
El espaciado de malla se fijó en 0.5 Å (smooth window = 0.8 unidades de
grid). El número de nodos filtrados se situó en 100, con un 50% de peso relativo
de los campos. Almond produjo diez grupos de variables: cuatro
autocorrelogramas y seis correlogramas cruzados. La línea base se eliminó para
hacer el escalado. La validación cruzada se realizó bien usando el método leave-
one-out (LOO) o por asignación de compuestos al azar en cinco grupos,
realizando la validación cruzada en estos grupos y luego repitiendo todo el poceso
20 veces. No se encontraron diferencias importantes entre ambos métodos de
validación.
Parte Experimental
124
Todas las operaciones se llevaron a cabo en un PC Intel Pentium 4
usando el sistema operativo Linux RedHat 9.
Capítulo II Cribado virtual de pequeñas moléculas con posible actividad como moduladores negativos del PAMP
II. 1. Objetivos y Plan de Trabajo
Objetivos y Plan de Trabajo
127
II. 1. Objetivos y Plan de Trabajo
De todas las acciones biológicas del PAMP nos ha interesado
particularmente su capacidad para actuar como un potente factor angiogénico. El
presente trabajo plantea la búsqueda de pequeñas moléculas que, a través de la
unión con el PAMP, puedan actuar como moduladores negativos de su acción, y
como consecuencia, puedan presentar interés como agentes antiangiogénicos.
Para ello nos planteamos llevar a cabo un cribado virtual basado en la
estructura del PAMP y utilizando la quimioteca de compuestos conocida como NCI
Diversity Set.231 Mediante el uso de este cribado virtual se pueden seleccionar
aquellos compuestos que tengan mayor afinidad por el PAMP, para someterlos en
una segunda etapa a ensayos de afinidad que confirmen experimentalmente la
predicción teórica.
Del mismo modo se pretende analizar una pequeña colección de
compuestos sintetizados en nuestro laboratorio, que proceden de otros trabajos
realizados en nuestro grupo de investigación.180, 232
Una vez ordenados los compuestos de acuerdo a su energía de unión al
péptido, se pretende profundizar en las interacciones ligando-péptido predichas
por el programa para los compuestos con energía de unión más favorable.
En una segunda etapa, es necesario poner a punto un método para
determinar experimentalmente la afinidad de los ligandos al PAMP, basado en la
competencia con un anticuerpo monoclonal del PAMP, que nos permita evaluar los
Objetivos y Plan de Trabajo
128
compuestos seleccionados y confirmar de manera preliminar las predicciones del
estudio de docking.
Los compuestos que muestren afinidad por el PAMP, se seleccionarán
para una evaluación cuantitativa con la técnica de SPR.
También se probará la actividad como agentes antiangiogénicos de los
compuestos seleccionados, mediante el ensayo de anillos de arcos aórticos de
embrión de pollo,118 así como su capacidad antiproliferativa en una línea celular de
cáncer de colon, Caco-2.
Las interacciones entre algunas de las pequeñas moléculas seleccionadas
y el PAMP se analizarán más profundamente mediante estudios de dinámica
molecular y cálculos teóricos de energías.
II. 2. Discusión de Resultados
Discusión de Resultados
129
II. 2. Discusión de resultados II. 2. 1. Cribado Virtual En los últimos años el cribado virtual (Virtual Screening: VS) se ha
transformado en una herramienta de gran utilidad para el descubrimiento de nuevos
fármacos. El VS supone un complemento del HTS y un criterio para la racionalización
de la síntesis. Los posibles hits determinados por HTS son reales pero, por sí solos,
no contribuyen a ampliar el conocimiento del modo de interacción con su diana
farmacológica. Sin embargo, el VS proporciona hits potenciales que aportan
información acerca del modo de interacción ligando-receptor. Además, esta técnica
es relativamente barata (ahorra la adquisición de reactivos y robotización), rápida y
permite considerar un número de compuestos in silico mucho mayor al que se
accede experimentalmente.
En este trabajo se ha seleccionado la colección de moléculas del NCI
conocida como NCI Diversity Set, ya que se trata de una base de datos de libre
acceso, preparada para AutoDock y nuestro grupo posee experiencia en la utilización
de la misma.233
Para iniciar la búsqueda de pequeñas moléculas capaces de unirse al
PAMP, en primer lugar se preparó la estructura del péptido con el formato y
características adecuadas para su utilización con el programa AutoDock. Se refinó la
lista del NCI, eliminando los compuestos de la denominada “problem list” que
contiene algunos archivos cuya calidad no está comprobada. También se eliminaron
aquellos que poseen átomos diferentes de C, H, N, O, S, P, F, Cl, Br, I. Del mismo
Discusión de Resultados
130
modo se construyeron los archivos correspondientes a los compuestos de nuestra
quimioteca.
A continuación se realizó el docking de forma automática para un total de
2436 estructuras, 1836 pertenecientes al NCI Diversity Set y 600 confórmeros
correspondientes a 60 compuestos pertenecientes a nuestra colección particular. Existen antecedentes que demuestran que la región activa del péptido se
encuentra en el extremo carboxilo terminal.12 Por este motivo, la compañía
Evogenix (Sydney, Australia), dentro de su proyecto de desarrollar un anticuerpo
monoclonal humanizado contra PAMP utilizable en clínica, desarrolló un
anticuerpo monoclonal αPAMP específicamente para este epítopo del péptido.234
Este anticuerpo es el que posteriormente se utilizó para los ensayos de afinidad.
Por lo tanto, en nuestro estudio de cribado virtual enfocamos el docking
solamente a esta región del péptido, tal y como se muestra en la figura 17.
Figura 17: Estructura 3D del PAMP y localización y dimensiones de la caja construida
para la realización del docking.
ARG20
62 Å
37 Å
45 Å ARG20
62 Å
37 Å
45 Å62 Å
37 Å
62 Å62 Å
37 Å
45 Å45 Å
Discusión de Resultados
131
Los resultados se ordenaron según la energía de unión al PAMP predicha
en el estudio de docking y, a continuación, se seleccionaron los 50 compuestos
que mostraron las energías de interacción más favorables para su posterior
evaluación en el ensayo de competición.
En la tabla 6 se muestran las estructuras químicas de los 50 compuestos
seleccionados junto con los valores de energía de unión obtenidos y los
aminoácidos que intervienen en las interacciones detectadas.
Se analizaron los complejos péptido-ligando uno a uno, a través de una
inspección visual (SYBYL 7.3), localizando los aminoácidos que podrían estar
implicados en la unión, según criterios de distancia (4 Å). Esta distancia es lo
suficientemente amplia para incluir interacciones de van der Waals, enlaces de
hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, etc.
Los primeros 14 compuestos presentan estructuras relacionadas y
pertenecen a nuestra quimioteca (código USP). Todas ellas se encuentran en un
rango de energía entre -14.17 y -11.56 kcal mol-1, que corresponde a una
diferencia de 2.61, valor cercano al que corresponde a la desviación estándar de
AutoDock (2.1 kcal mol-1)192 y por lo tanto se puede considerar que todas ellas
poseen una afinidad similar desde el punto de vista teórico.
Discusión de Resultados
132
Tabla 6: Compuestos identificados mediante el cribado virtual del PAMP.
Código Compuesto Eunión (kcal mol-1)
Unión al PAMP
% A SPR
USP1K O
NN
N
O NN
N-14.17
ARG20, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10
85.8 ± 5.5 positivo
USP3L O
NN
O
NN
OO
-13.89
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13,
ARG10
104.4 ± 5.8 -
USP1L NN
NO
N
NNO
-13.51
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, TRP13, ARG10,
PHE9
84.4 ± 2.7 dudoso
USP3N O
NN
OO
NN
O
-13.35 ARG20, SER19, ALA17, TRP16, LYS15, TRP13
84.8 ± 6.1 negativo
USP2M O O O
NHHN
OO O
HN
HN
-13.25
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10, PHE9
88.9 ± 4.7 negativo
USP1J ONN
N
O
NN
N
-13.07
ARG20, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10,
PHE9
97.3 ± 8.7 -
USP2J O O O
HNHN
O
O O
HNHN
-13.06
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, LYS15, ASN14, TRP13, ARG10,
2 enlaces H (TRP13)
99.5 ± 3.4 -
Discusión de Resultados
133
Código Compuesto Eunión (kcal mol-1)
Unión al PAMP
% A SPR
USP2L O
O O
NHHN
OO O
NHHN
-12.81
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, LYS15, ASN14, TRP13, LYS12
2 enlaces H (TRP16)
104.9 ± 2.9 -
USP2K O
O O
HN
HN OO O
NHHN
-12.31
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, LYS15, TRP13,
LYS12 1 enlace H (TRP13)
99.0 ± 7.6 -
USP3M
NN
ON
N
OO O -12.29
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, TRP13, ARG10,
PHE9
82.2 ± 11.9 insol.
USP2N O O O
HNHN O
O O
HNHN -12.18
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, LYS15, TRP13
129.4 ± 11.5 -
USP3J O
NN
O
NN
OO
-12.10
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10, PHE9
74.1 ± 6.5 positivo
USP1N ONN
N
O
NN
N
-11.85 ARG20, SER19, ALA17, TRP16,
TRP13
94.0 ± 3.2 -
USP1M ONN
N
O
NN
N
-11.56 ARG20, SER19, ALA17, TRP16, TRP13, ARG10
108.5 ± 6.3 -
Discusión de Resultados
134
Código Compuesto Eunión (kcal mol-1)
Unión al PAMP
% A SPR
371884
N
NN
NH2
NN
H2N
NHH
-10.22 ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13
103.9 ± 9.0 -
371876 N
H2NN N
N
NH2
-9.66 ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13
98.6 ± 5.8 -
371878
NH2
NN
NN
H2N
-9.46
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13,
ARG10
104.3 ± 6.5 -
3354 HOO O
-9.39 ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13
91.2 ± 2.1 -
611615
N
O
O
O PO
O
O
H
-9.29
ARG20, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10,
PHE9 1 enlace H (ARG10)
107.0 ± 14.8 -
26645 HO
O O -9.23
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13
98.4 ± 7.5 -
160391 OH
ON
O
NH
O CF3
CF3
F3C
F3CH
-9.24
LEU18, LYS15, ASN14, LYS12, LYS11, ARG10
3 enlaces H (LYS 15, 12, 11)
92.1 ± 2.6 -
64111 PP
H
H
-9.16 ARG20, ALA17, TRP16, TRP13
84.6 ± 7.2 agregac.
Discusión de Resultados
135
Código Compuesto Eunión (kcal mol-1)
Unión al PAMP
% A SPR
343227
Cl
NNN
N
Cl
NN
-8.95
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13,
ARG10 1 enlace H (ARG10)
88.0 ± 8.6 insol.
372046
NH2
N N
NN
NH2
-8.90
ARG20, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10
109.0 ± 7.8 -
00067 NN
N
N
NN
-8.90 ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13
96.5 ± 2.3 -
49487 NS
NNN
S
S
N
N
N N
S
H
H
H
H
-8.90
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13,
ARG10
88.0 ± 11.2 positivo
659162 CF3
NSSN
HNF3C H
N
-8.86
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13
2 enlaces H (TRP13,16)
109.0 ± 12.5 -
372294
O
O
N
ON
N
O2N
HH
H
-8.79 ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13
92.7 ± 2.4 -
128437
N O
N O
HO3S
H
H
-8.69
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13,
ARG10
101.1 ± 5.9 -
Discusión de Resultados
136
Código Compuesto Eunión (kcal mol-1)
Unión al PAMP
% A SPR
42384
NH2
N
NN
N
S
-8.67 ARG20, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10
91.4 ± 5.1 -
116654
OHO
NHHO3S
N
-8.65 ARG20, ALA17, TRP16, ASN14,
TRP13
96.7 ± 4.4 -
87877
OHN
NN
SO3H
HO3S
-8.63
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13,
ARG10 1 enlace H (ARG10)
86.4 ± 0.3 negativo
42258 NN
HN
NH
-8.63
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13,
ARG10
89.7 ± 2.3 agregac.
113491 N
ON
NNNN
N
ON
ON
N
O
-8.62
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13,
ARG10 1 enlace H (ARG10)
76.4 ± 2.3 insol.
282027 HN
NHNN
N
HN
N NN
NH
-8.61 ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13
95.3 ± 1.7 -
116702 O
NN
-8.60 ARG20, SER19, ALA17, TRP16,
TRP13
72.1 ± 9.3 dudoso
Discusión de Resultados
137
Código Compuesto Eunión (kcal mol-1)
Unión al PAMP
% A SPR
106221
O
N
NN
O
N
NN
ON
O
N
NO
H
H
H
-8.59
ARG20, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10
1 H enlace (ARG10)
95.1 ± 3.3 -
23922
NH2
-8.57 ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13
105.5 ± 2.1 -
26273 OHO
HO OH
NN
S
N N
-8.57
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13,
ARG10
109.2 ± 8.1 -
211736 NH2 H
N
NN
N
HP -8.57
ARG20, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10
76.0 ± 0.4 agregac.
23217 N
S
NHH
-9.09
ARG20, SER19, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13,
ARG10
80.8 ± 8.6 negativo
601364 HO S
O
O O N
NN N
O
SHO O
O
-8.54
ARG20, ALA17, TRP16, ASN14,
TRP13 1 enlace H (ARG20)
81.9 ± 7.9 negativo
299589
Cl
NN
NO
HNO
NH-8.51
ARG20, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10
1 enlace H (ARG10)
80.1 ± 21.3 agregac.
Discusión de Resultados
138
Código Compuesto Eunión (kcal mol-1)
Unión al PAMP
% A SPR
172614 NN
SN
NHO
HO ON N
NH2
NO2
-8.51 ARG20, ALA17, TRP16, ASN14,
TRP13
86.3 ± 4.6 dudoso
361814
O
NN
O
O
NS
O
N
S
-8.50
ARG20, ALA17, TRP16, ASN14,
TRP13 1 enlace H (TRP13)
92.5 ± 0.4 -
56452 S
N N
NH2
NN
-8.48
ARG20, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10
85.5 ± 8.8 dudoso
327705
ClS N
NN
O
O
-8.47
ARG20, ALA17, TRP16, ASN14, TRP13, ARG10
1 enlace H (ASN14)
88.4 ± 6.1 agregac.
632536 HN
NH
HN
-8.46 ARG20, SER19, ALA17, TRP16, LYS15, TRP13
96.2 ± 7.8 -
270718 OH
OClCl
Cl
ClCl
Cl
Cl
Cl
Cl
ClCl
ClS
HO O
O
-8.45
ALA17, TRP16, ASN14, TRP13,
ARG10 2 enlaces H
(ASN14, ARG10)
97.4 ± 1.2 -
126710 O
N
H2N
N
NH2
NO2
ClCl
-8.45
ARG2, VAL5, ALA6, PHE9,
ARG10, TRP13, 2 enlaces H (ARG2-NO2)
99.4 ± 1.9 -
Tabla 6: Compuestos identificados mediante el cribado virtual del PAMP.
Discusión de Resultados
139
En la figura 18 se muestra la frecuencia de interacción con aminoácidos en
los complejos PAMP-ligando de los 50 compuestos seleccionados.
Como se puede observar, los aminoácidos TRP13, ASN14, TRP16, ALA17 y
ARG20 están a menos de 4 Å de distancia del ligando en más del 80% de los
complejos predichos por AutoDock. Las moléculas que presentaron mejor energía
de interacción se unen precisamente a esta región del péptido y se observa que,
con mucha frecuencia, los anillos aromáticos presentes en los ligandos se apilan
con los anillos indólicos, predominantemente con el del TRP16. Sin embargo, estas
observaciones son incompletas debido a la rigidez del modelo utilizado. Para
estudiar con más profundidad las interacciones péptido-ligando se han propuesto
estudios de dinámica molecular para algunos de los ligandos mencionados.
Figura 18: Frecuencia de interacción con aminoácidos en los complejos PAMP-ligando
8
30
13
49
41
7
49 49
1
32
48
0
10
20
30
40
50
60
PHE9
ARG
10
LYS1
1
LYS1
2
TRP1
3
ASN
14
LYS1
5
TRP1
6
ALA1
7
LEU
18
SER
19
ARG
20
Discusión de Resultados
140
II. 2. 2. Ensayo de competición
Para poder llevar a cabo los ensayos biológicos, así como los estudios de
afinidad, se solicitaron al NCI los compuestos de la quimioteca seleccionados.
El ensayo de competencia con el anticuerpo monoclonal αPAMP se puso
a punto en nuestro laboratorio. Aunque el ensayo es similar al descrito para la AM,
fue necesario marcar el anticuerpo y determinar las condiciones de trabajo
idóneas, tales como las concentraciones de los anticuerpos, el tipo de placa a
utilizar y los tiempos de medida.
Los 50 compuestos seleccionados se sometieron al ensayo de
competición a una concentración 1 µM. Los registros de absorbancia (%A) para
cada uno de los compuestos ensayados se muestran en la figura 19 y en la tabla
6.
Como se puede observar, más de la mitad de los compuestos son
capaces de disminuir los registros de absorbancia confirmando experimentalmente
las predicciones de AutoDock.
Para posteriores ensayos se seleccionaron los 20 compuestos que
disminuyen la absorbancia más de un 10%. En la tabla 6 el código de estos
compuestos está indicado de color azul.
0
90
USP
1KU
SP3L
USP
1LU
SP3N
USP
2MU
SP1J
USP
2JU
SP2L
USP
2KU
SP3M
USP
2NU
SP3J
USP
1NU
SP1M
3718
8437
1876
3718
7833
5461
1615
2664
516
0391
6411
134
3227
3720
4660
0067
4948
765
9162
3722
9412
8437
4238
411
6654
8787
742
258
1134
9128
2027
1167
0210
6221
2392
226
273
2117
3623
217
6013
6429
9589
1726
1436
1814
5645
232
7705
6325
3627
0718
1267
10 Ac
Compuestos (1uM)
% A
Figura 19: Resultados del ensayo de competición. Registros de absorbancia a 450 nm (%A); los compuestos con código USP pertenecen a nuestra
quimioteca; los que sólo poseen código numérico pertenecen a la colección del NCI. Ac representa el anticuerpo sin marcar (control positivo de inhibición).
Discusión y Resultados
142
II. 2. 3. Determinación de la afinidad por SPR
Como se ha mencionado en el capítulo I de esta memoria, la SPR constituye
una técnica validada para la detección de interacciones ligando-receptor e incluso en
algunos casos permite cuantificar dicha interacción.
Por este motivo los 20 compuestos seleccionados mediante el ensayo de
competición fueron sometidos a experimentos de SPR en colaboración con la Dra.
Danièle Altschuh, del Laboratorio de Biotecnología de Interacciones Moleculares,
Escuela Superior de Biotecnología de Estrasburgo (Francia).
De los 20 compuestos seleccionados, tres de ellos (USP3M, 343227 y
113491) no fueron evaluados debido a que no se solubilizaron al 100% en DMSO.
Por otro lado, los compuestos 64111, 42258, 211736, 299589 y 327705 dieron respuestas superiores a la respuesta máxima calculada (Rmáx), lo que hace
suponer que existe agregación.
Entre los compuestos que pudieron ser evaluados, tres de ellos dieron una
respuesta positiva inequívoca (USP1K, USP3J y 49487). Los sensorgramas
correspondientes a los compuestos USP1K y 49487 se muestran en la figura 20.
Discusión y Resultados
143
Figura 20: Sensorgramas SPR, correspondientes a inyecciones de 60 s para los
compuestos USP1K (a) y 49487 (b) a diferentes concentraciones (0, 50, 100 y 200 µM).
Los compuestos 56452, USP1L, 116702 y 172614 dieron resultados
positivos, sin embargo, la respuesta no es dosis-depediente y la fiabilidad del
experimento es menor que en los casos anteriores. Un ejemplo se muestra en la
figura 21(a).
Los compuestos USP2M, USP1N, USP3N, 23217, 87877 y 601364 en este
experimento dieron resultados negativos (ejemplo en la figura 21 (b)).
-10
-5
0
5
10
15
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150T im e s
RU B la nk S u btra cted S en sorgram s
UR 15
10
5
0
-5
-10
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150 Tiempo (s)
a
-10
-5
0
5
10
15
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150T im e s
RU B la nk S u btra cted S en sorgram s
UR 15
10
5
0
-5
-10
-50 -30 -10 10 30 50 70 90 110 130 150 Tiempo (s)
a
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
-100 -50 0 50 100 150 200
Tim e s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted Sensorgrams
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
UR
60
50
40
30
20
10
0
-10
-20
-30
b
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
-100 -50 0 50 100 150 200
Tim e s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted Sensorgrams
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
UR
60
50
40
30
20
10
0
-10
-20
-30-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
-100 -50 0 50 100 150 200
Tim e s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted Sensorgrams
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
UR
60
50
40
30
20
10
0
-10
-20
-30-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
-100 -50 0 50 100 150 200
Tim e s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted Sensorgrams
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
-100 -50 0 50 100 150 200
Tim e s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted Sensorgrams
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
UR
60
50
40
30
20
10
0
-10
-20
-30
b
Discusión y Resultados
144
Figura 21: Sensorgramas SPR, correspondientes a inyecciones de 60 s para los
compuestos 56452 (a) y USP1N (b) a diferentes concentraciones (0, 50, 100 y 200 µM).
Estos resultados ponen de manifiesto que el protocolo utilizado en este
trabajo, que se basa en un cribado virtual seguido de un ensayo de competición
rápido y sencillo, permite detectar compuestos que se unen al PAMP.
a
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
-100 -50 0 50 100 150 200
Tim e s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted Sensorgrams
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
UR
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20
a
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
-100 -50 0 50 100 150 200
Tim e s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted Sensorgrams
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
UR
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20
a
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
-100 -50 0 50 100 150 200
Tim e s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted Sensorgrams
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
UR
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
-100 -50 0 50 100 150 200
Tim e s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted Sensorgrams
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
-100 -50 0 50 100 150 200
Tim e s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted Sensorgrams
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
UR
20
15
10
5
0
-5
-10
-15
-20
-10
-5
0
5
10
-100 -50 0 50 100 150 200
Time s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted SensorgramsUR
10
5
0
-5
-10
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
-10
-5
0
5
10
-100 -50 0 50 100 150 200
Time s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted SensorgramsUR
10
5
0
-5
-10
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
-10
-5
0
5
10
-100 -50 0 50 100 150 200
Time s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted SensorgramsUR
10
5
0
-5
-10-10
-5
0
5
10
-100 -50 0 50 100 150 200
Time s
RU
Res
pons
e
Blank Subtracted SensorgramsUR
10
5
0
-5
-10
-100 -50 0 50 100 150 200Tiempo (s)
Discusión y Resultados
145
II. 2. 4. Dinámica Molecular (DM) Los datos descritos anteriormente ponen de manifiesto que, compuestos
como USP1K y USP1N, que poseen estructuras muy similares y sólo se
diferencian en la longitud de la cadena metilénica, se comportan de forma muy
diferente en su interacción con PAMP.
Por un lado, en los experimentos de docking, los complejos poseen
energías muy similares (USP1K: -14.17 kcal mol-1 y USP1N: -11.85 kcal mol-1) y,
como se ha mencionado anteriormente, están próximos al margen de desviación
estándar del método. Sin embargo, tanto en el ensayo de competición como en
SPR, únicamente el compuesto USP1K mostró afinidad por el péptido, mientras
que el compuesto USP1N no presenta afinidad por el PAMP, como se muestra en
la figura 21.
Con la finalidad de profundizar en el modo de unión del compuesto USP1K a nivel atómico y considerar la flexibilidad tanto del ligando como del receptor, se
llevaron a cabo simulaciones de dinámica molecular, tanto para el péptido libre
como para el complejo entre el PAMP y el compuesto USP1K. Por otro lado, y con
el fin de obtener datos termodinámicos comparables, se aplicó el mismo protocolo
para el complejo PAMP-USP1N.
Como punto de partida para las simulaciones de DM se utilizó la primera
de las conformaciones depositadas de la estructura del péptido (código PDB =
2fly)8 y el complejo obtenido a partir de los estudios de docking. Tanto los dos
complejos como el péptido libre fueron neutralizados con cinco iones Cl- y
minimizados en vacío.
A continuación, con el módulo xleap de AMBER, se construyó una caja de
agua y, una vez inmersos en ella, los complejos se volvieron a minimizar. Los
parámetros para los compuestos USP1K y USP1N se derivaron por analogía de
trabajos previos realizados con compuestos de la misma serie.6 Se aplicaron
condiciones de límite periódico y las interacciones electrostáticas fueron tratadas
con el método Particle Mesh Ewald (PME)205, 207 con un espaciado de malla de 1
Discusión y Resultados
146
Å. La distancia de corte (cut off) para las interacciones entre los átomos fue de 8
Å. El algoritmo SHAKE203 fue aplicado a todos los enlaces con hidrógenos con un
intervalo de integración de 1.0 fs.
Tanto los complejos como el péptido libre se sometieron a un proceso de
equilibrado en varias etapas, que se detallan en la parte experimental y finalmente
a la dinámica de producción durante 9 ns a 300 K. Las simulaciones de dinámica molecular proporcionan coordenadas
respecto al tiempo, permitiendo un análisis detallado de la evolución
conformacional del sistema. La representación de la desviación cuadrática media
(RMSD) de las estructuras respecto a la inicial en función del tiempo da
información acerca de la estabilidad del complejo dinámico. Valores elevados de
RMSD indican un alto grado de desviación respecto de la estructura original. Este
valor fue monitorizado para los átomos principales del esqueleto de la proteína
(Cα, C, N) a lo largo del tiempo de simulación. En la figura 22 se recogen los
valores de RMSD para el complejo PAMP-USP1K y el péptido libre.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000 8500
Tiempo (ps)
RM
SD (A
)
Figura 22: RMSD (Å) del complejo PAMP-USP1K (verde) y del PAMP libre (rojo).
En los dos casos, la representación de los valores de RMSD muestra un
movimiento considerable del esqueleto del péptido, estabilizándose en los últimos
2.5 ns de la simulación. Los valores oscilan dentro de un rango que, en el caso del
Discusión y Resultados
147
complejo, no supera los 2 Å. Esta desviación de la conformación original, que se
evidencia en la gráfica, se debe a que tanto en la simulación del péptido libre,
como en la del complejo, la hélice del PAMP se pliega sobre sí misma a lo largo
del tiempo de la simulación. En la figura 23 se muestra cómo la hélice del péptido
en el complejo se pliega en forma de U a lo largo de la trayectoria, reforzando de
esa forma la interacción con el compuesto USP1K.
Discusión y Resultados
148
t=0 ns
t=2 ns
t=3 ns
t=4 ns
t=5 ns
t=6 ns
t=7 ns
t=8 ns
t=9 ns
Figura 23: Evolución de la estructura del complejo PAMP-USP1K a lo largo del
tiempo de simulación.
Discusión y Resultados
149
De acuerdo con estos resultados, podríamos considerar que, a partir de
los 6.5 ns de simulación, el sistema se encuentra próximo al equilibrio. Por lo
tanto, éste es el periodo donde hemos de realizar todos los análisis posteriores.
Una estructura media minimizada de los últimos 2.5 ns se muestra en la figura 24.
Figura 24: Estructura media minimizada de los últimos 2.5 ns de simulación del complejo
PAMP-USP1K.
En esta estructura se observa claramente el plegamiento y una posible
interacción entre los anillos aromáticos del ligando y las argininas de los extremos
del péptido (ARG2 y ARG20). Este tipo de interacción podría corresponder a
interacciones catión-π. También podrían existir interacciones de apilamiento entre
el TRP13 y uno de los anillos aromáticos de USP1K. Para analizar en detalle las
ARG2
ARG20
PHE9
TRP13
MT2
TL2
MT1TL1
TRP16
ARG2
ARG20
PHE9
TRP13
MT2
TL2
MT1TL1
TRP16
Discusión y Resultados
150
interacciones presentes entre el compuesto USP1K y el PAMP a lo largo de la
DM, es útil nombrar los diferentes fragmentos que forman parte de la estructura
(figura 25).
O
NN
N
O NN
N
MT1
TL1
MT2
TL2
TR1 TR2
CD5
Figura 25: Nombres asignados a cada uno de los fragmentos del compuesto USP1K.
Las interacciones catión-π están consideradas entre las más importantes
en sistemas biológicos para el reconocimiento molecular.235-237 Para la arginina, la
aproximación del grupo guanidinio a la nube de electrones π ha sido caracterizada
por dos ángulos α y β representados en la figura 26.238 Según este esquema, α es
el ángulo formado entre el plano del anillo y un vector que conecta su centroide
con el Cζ de la arginina, y β es el ángulo que forman el plano del grupo guanidinio
y el vector que une el Cζ con el centroide del anillo aromático. En estos sistemas
son posibles dos geometrías límites: una en donde el anillo aromático y el catión
plano se apilan colocándose paralelos, y otra en la que el guanidinio se coloca
perpendicular al anillo bencénico. Si bien los cálculos en fase gaseosa indican que
la geometría perpendicular es más favorable desde el punto de vista
termodinámico, esta preferencia se invierte completamente en simulaciones en
presencia explícita de disolvente. Esto podría deberse a que en posición paralela
la guanidina puede establecer enlaces de hidrógeno más fácilmente, por ejemplo
con el agua.
Discusión y Resultados
151
Por otro lado Gallivan y Dougherty encontraron que un 99% de las
interacciones significativas catión-π ocurren a distancias que no exceden los 6
Å.239 Estas distancias se representan en la figura 26.
CNH2
HN
H2N
R
β1
α1
d1
C
TL1
CNH2
HN
H2N
R
β2
α2
d2
C
MT2Figura 26: Estructura de las interacciones catión-π donde se indican las distancias y
ángulos que las definen.
Este tipo de interacción se observa desde el comienzo de la simulación
entre MT2 y la ARG20 y, más adelante, entre MT1 o TL1 y la ARG2. La figura 27 muestra una monitorización de las distancias d1 y d2 a lo largo
del tiempo de simulación. En ella se puede observar cómo se mantiene constante
la distancia d2 con valores entre los 3 y 6 Å. La inspección visual de la estructura a
lo largo de la simulación también revela el hecho de que el grupo guanidinio de la
ARG20 se coloca paralelo al anillo MT2.
Discusión y Resultados
152
0
5
10
15
20
25
30
35
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000 8500 9000
tiempo (ps)
dist
anci
a (A
)
Figura 27: Monitorización a lo largo del tiempo de simulación de las distancias d1 (ARG2-
MT1: verde; ARG2-TL1: azul) y d2 (ARG20-MT2: naranja) del complejo USP1K -PAMP.
Para confirmar estas observaciones se midió la evolución de los ángulos α
y β a lo largo de la trayectoria. En la figura 28 se puede observar que los ángulos
se mantienen alrededor de los 90º, permitiendo que los planos del grupo
guanidinio de la ARG20 y el anillo bencénico se mantengan prácticamente
paralelos y superpuestos todo el tiempo. Este comportamiento revela la estabilidad
de la interacción ARG20-MT2 que puede justificarse considerando que el anillo
MT2 está unido a un átomo de oxígeno electrodonador.
Discusión y Resultados
153
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
050
010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
0060
0065
0070
0075
0080
0085
00
tiempo (ps)
Áng
ulo
(º)
Figura 28: Monitorización de los valores de α (azul) y β (verde) en la interacción ARG20-
MT2 a lo largo del tiempo de simulación del complejo USP1K -PAMP.
Cuando el péptido se empieza a plegar y el complejo se estabiliza (últimos
2.5 ns), aparece una nueva interacción catión-π entre la ARG2 y los anillos TL1 y
MT1 de USP1K que se alternan durante la simulación. En la figura 27 se puede
observar claramente como los dos grupos se van acercando hasta lograr una
distancia compatible con este tipo de interacción. En el último tramo de la
dinámica puede observarse como las distancias se compensan, de modo que el
guanidinio puede interaccionar con MT1 y a continuación con TL1. También en
este caso se estudió la evolución de los ángulos en el tiempo. Los datos se
recogen en la figura 29.
Discusión y Resultados
154
(a)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000 8500 9000
tiempo (ps)
Ángu
lo (º
)
(b)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000 6500 7000 7500 8000 8500 9000
tiempo (ps)
Áng
ulo
(º)
Figura 29: Monitorización de los valores de α y β a lo largo del tiempo de simulación. (a) ángulo
α: ARG2-TL1 (azul) y ARG2-MT1 (rojo); (b) ángulo β: ARG2-TL1 (azul) y ARG2-MT1 y (rojo).
La medida de los ángulos fluctúa mucho más a lo largo de los últimos 2.5
ns y esto corrobora la alternancia entre la interacción del guanidinio con MT1 y
TL1 en la interacción catión-π. Este hecho se puede observar mucho más
claramente en una animación.
Discusión y Resultados
155
Otra de las interacciones que se puede observar es el enlace de hidrógeno
que se establece entre los nitrógenos pertenecientes a uno de los triazoles de
USP1K (aceptores) y el hidrógeno del guanidinio de la ARG20 (figura 30)
Figura 30: Detalle de la estructura media minimizada de los últimos 2.5 ns de simulación
del complejo PAMP-USP1K. La línea segmentada amarilla representa el enlace de H entre
N3 de la ARG 20 y los nitrógenos N1 y N2 del triazol (TR2) del ligando.
Jeffrey240 clasifica los enlaces de hidrógeno con distancias donador-
aceptor de 2.2 a 2.5 Å como “fuertes, predominantemente covalentes”, los de 2.5 a
3.2 Å como “moderados, principalmente electrostáticos” y los de 3.2 a 4.0 Å como
“débiles electrostáticos”. En este caso se evaluaron las distancias entre donador y
aceptor en nuestro complejo, considerando que tanto N1 como N2 en el triazol
podrían actuar como átomos aceptores mientras que N3 (en el grupo guanidinio)
actúa como donador, obteniéndose unos valores medios de 3.77 Å y 3.31 Å para
N1-N3 y N2-N3 respectivamente (figura 31). De acuerdo con la clasificación anterior,
Discusión y Resultados
156
se trataría de un enlace de H “débil electrostático” que involucra dos átomos
aceptores, enlaces que se denominan “tricéntricos”.
0
2
4
6
8
10
12
050
010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
0060
0065
0070
0075
0080
0085
0090
00
tiempo (ps)
dist
anci
a (A
)
Figura 31: Monitorización de las distancias aceptor-donador de enlaces de hidrógeno: N1-
N3 (rojo); N2-N3 (azul) a lo largo del tiempo de simulación.
También es importante el ángulo formado entre los tres átomos
implicados, donador-H-aceptor, y típicamente se encuentra entre 130º y 180º.240
Estos ángulos también fueron monitorizados obteniéndose un valor medio de 158º
para el ángulo N3-H-N1 y de 148º para el ángulo N3-H-N2, que coinciden con los se
encuentran típicamente para estas interacciones.
Como se mencionó antes, el enlace de hidrógeno favorece el hecho de
que el anillo MT2 y el guanidinio se orienten de forma paralela, ya que en esta
disposición no sólo se establece una interacción catión-π con el guanidinio, sino
que además éste es capaz de actuar como donador de enlace de H.
A lo largo de la simulación se observó un tercer tipo de interacción que,
como las anteriores, proporciona mayor estabilidad a la unión péptido-ligando. Se
Discusión y Resultados
157
trata de una interacción de apilamiento π-π entre residuos aromáticos, donde los
anillos tienden a apilarse como monedas. La interacción es consecuencia del
solapamiento de los orbitales en sistemas π conjugados y se fortalece cuanto
mayor sea el número de electrones π del sistema.
En el caso del complejo PAMP-USP1K, este comportamiento se observa
entre el anillo indólico del TRP13 y el anillo TL2 del ligando, y entre el fenilo de la
PHE9 y el anillo TL1 de USP1K. La figura 32 muestra la distancia entre los centros
de masa de los anillos aromáticos implicados a lo largo del tiempo de simulación.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
050
010
0015
0020
0025
0030
0035
0040
0045
0050
0055
0060
0065
0070
0075
0080
0085
0090
00
tiempo (ps)
dist
anci
a (A
)
Figura 32: Monitorización de las distancias entre los centros de masa de anillos aromáticos:
TL1-PHE9 (rojo); TL2-TRP13 (azul) a lo largo del tiempo de simulación.
Como se puede observar, en el último tramo de la simulación las
distancias se mantienen en rangos aceptables para el apilamiento paralelo, tanto
entre TL1 y PHE9, como entre TL2 y TRP13.
Discusión y Resultados
158
II. 2. 4. 1. Cálculo de la afinidad de unión (MM-GBSA y MM-PBSA)
Para estudiar de forma teórica las diferencias de afinidad al PAMP que
exhiben los compuestos USP1K y USP1N y estimar la entalpías de unión, se
aplicaron las técnicas MM-PBSA (Molecular Mechanics Poisson Boltzmann
Surface Area) y MM-GBSA (Molecular Mechanics Generalized Born Surface
Area).211, 241 Estos métodos proporcionan una combinación de modelos para poder
determinar la energía de unión (∆Gbind).
∆Gbind = ∆Hbind – T∆Sbind
∆Hbind = ∆GMM + ∆Gsolv
∆GMM = ∆GvdW + ∆Gelec + ∆GINT
∆Gsolv = ∆Gsolv pol + ∆Gsolv np
∆Gsolv np = γ SASA + β
La energía interna del complejo (∆GINT), los cambios en las interacciones
de van der Waals (∆GvdW) y electrostáticas (∆Gelec) se pueden evaluar mediante
métodos de mecánica molecular. La energía libre de solvatación (∆Gsolv) se calcula
sumando la contribución electrostática (∆Gsolv pol) a la contribución no polar (∆Gsolv
np). La energía libre electrostática de solvatación (∆Gsolv pol) se puede obtener por el
método Poisson-Boltzmann (PB) o por el método generalizado de Born (GB). La
energía libre hidrofóbica (∆Gsolv np) es una función lineal de la superficie accesible
al disolvente (SASA), donde γ es la tensión superficial y β el término
independiente.
También se puede estimar el cambio de la entropía durante la asociación
del péptido al ligando, T∆Sbind, mediante el módulo de AMBER NMODE.
La contribución entálpica proporciona una medida de la fuerza de las
interacciones entre el péptido y el ligando (enlaces de hidrógeno, interacciones de
van der Waals), en relación con aquellas con el disolvente. La contribución
entrópica, por otra parte, se relaciona con el cambio en la entropía del disolvente
Discusión y Resultados
159
que surge del repliegue de grupos hidrofóbicos a consecuencia de la unión y la
pérdida de libertad conformacional del soluto (traslacional, vibracional y
rotacional).242
Como cabría esperar para dos compuestos de estructura tan parecida, los
valores T∆Sbind para ambos complejos son muy similares y contribuyen a la
inestabilización del sistema (tabla 7). Sin embargo, la diferencia importante se
observa en los valores de ∆Hbind.
En las figuras 33, 34 y en la tabla 7, se representa la evolución de la
energía de unión y algunos de sus principales componentes a lo largo del tiempo
de simulación para los complejos PAMP-USP1K y PAMP-USP1N. Como puede
observarse en la figura para ambos complejos, los valores de energía calculados
por los dos métodos disponibles (PB y GB) son similares.
La contribución entálpica del complejo PAMP-USP1K calculada por ambos
métodos posee valores negativos, mientras que para el complejo PAMP-USP1N
se obtienen valores positivos. Estos resultados están de acuerdo con los datos
experimentales que demuestran que USP1K se une al PAMP y mientras que
USP1N no se une.
Además, es importante destacar que una de las principales diferencias en
la contribución energética se aprecia en la energía electrostática (∆Gelec). Estos
datos reflejan la importancia, en el caso del complejo PAMP-USP1K, de las
interacciones de tipo electrostático anteriormente descritas (catión-π, π-π y enlace
de hidrógeno) que no están presentes en el complejo PAMP-USP1N.
Discusión y Resultados
160
(b)
-60-50-40-30-20-10
0102030405060
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
tiempo (ps)
Ener
gía
(kca
l mol
-1)
Figura 33: Evolución de la energía libre de unión a lo largo del tiempo y sus principales
componentes, para el complejo PAMP-USP1K. (a) ∆Hbind PB, verde; T∆Sbind, rojo; ∆Gelec PB,
azul; ∆GvdW PB, fucsia. (b) ∆Hbind GB, verde; T∆Sbind, rojo; ∆Gelec GB, azul; ∆GvdW GB, fucsia.
(a)
-60-50-40-30-20-10
0102030405060
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
tiempo (ps)
Ener
gía
(kca
l mol
-1)
Discusión y Resultados
161
(a)
-100
-50
0
50
100150
200
250
300
350
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
tiempo (ps)
Ener
gía
(kca
l mol
-1)
(b)
-100-50
050
100150200250300350
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
tiempo (ps)
Ener
gía
(kca
l mol
-1)
Figura 34: Evolución de la energía libre de unión a lo largo del tiempo y sus principales
componentes, para el complejo PAMP-USP1N. (a) ∆Hbind PB, verde; T∆Sbind, rojo; ∆Gelec
PB, azul; ∆GvdW PB, fucsia. (b) ∆Hbind GB, verde; T∆Sbind, rojo; ∆Gelec GB, azul; ∆GvdW GB,
fucsia.
Discusión y Resultados
162
Energía (kcal mol-1) PAMP-USP1K PAMP-USP1N ∆Gelec -10.78 (6.89) 245.81 (6.72) ∆GvdW -36.32 (4.38) -21.53 (3.39) ∆GINT 1.84 (0.59) 7.26 (2.71) ∆GMM -45.26 (8.48) 231.55 (8.13)
∆Gsolv np (PB) -4.08 (0.33) -3.33 (0.29) ∆Gsolv pol (PB) 32.72 (6.01) 53.22 (5.55) ∆Gsolv (PB) 28.63 (5.92) 49.89 (5.55) ∆Hbind (PB) -16.63 (5.86) 281.44 (5.79) ∆Gsolv np (GB) -5.88 (0.48) -4.80 (0.42) ∆Gsolv pol (GB) 25.35 (5.63) 46.33 (5.25) ∆Gsolv (GB) 19.47 (5.61) 41.52 (5.31) ∆Hbind (GB) -25.79 (4.46) 273.07 (5.19)
T∆S -22.43 (2.28) -23.38 (3.09) Tabla 7: Energías promedio en kcal mol-1 con su correspondiente desviación estándar
entre paréntesis. ∆Gelec, energía electrostática calculada con el campo de fuerzas;
∆GvdW, energía de van der Waals calculada con el campo de fuerzas; ∆GINT, energía
interna (enlace, ángulos y diedro); ∆GMM, energía total en fase gaseosa; ∆Gsolv np, contribución no polar a la energía libre de solvatación; ∆Gsolv pol, contribución polar a la
energía libre de solvatación; ∆Gsolv, energía libre de solvatación; ∆Hbind, contribución
entálpica a la energía libre de unión y T∆S, contribución entrópica a la energía libre de
unión.
Si bien la pérdida de entropía es similar para ambos complejos, es
evidente que la magnitud relativa de su contribución a la energía total de unión
(∆Gbind) es diferente. En el caso del complejo PAMP-USP1N la contribución
entrópica desfavorable se ve reforzada por la entálpica, lo que conduce a un
resultado que indica una asociación desfavorable (∆GbindPB = 258.06 kcal mol-1 y
∆GbindGB = 249.69 kcal mol-1). Sin embargo, en el caso del complejo PAMP-
USP1K, la contribución entálpica favorable y el cambio de entropía desfavorable
se oponen. Según el método de cálculo aplicado en el cálculo de la entalpía,
∆Gbind es igual a 5.8 kcal mol-1 (PB) ó -3.36 kcal mol-1 (GB).
Discusión y Resultados
163
Aunque no es correcto pretender que los valores de las energías halladas
coincidan con valores determinados experimentalmente, a pesar de la diferencia
registrada entre los métodos y considerando los errores, sí se puede concluir que
la tendencia que indican las energías de binding se correlaciona con los hechos
experimentales.
Además de la energía total del sistema, los cálculos computacionales nos
permiten descomponer las energías libres en contribuciones individuales y
determinar cuál es la aportación que hacen los distintos residuos o constituyentes
del complejo a la energía final de unión. Nos interesó particularmente la
interacción catión-π que se establece entre los grupos guanidinios de las ARG 2 y
20 y los anillos aromáticos del compuesto USP1K.
En la tabla 8 se muestran los resultados de las energías medias, a lo largo
de toda la simulación, para las interacciones entre los guanidinios de las argininas
y los sistemas aromáticos de USP1K.
De acuerdo con estos resultados, estas interacciones realizan una
contribución entálpica a la energía libre de unión total favorable en todos los
casos. Es interesante destacar en este sentido, que ninguna de las interacciones
de los anillos aromáticos TL1 y MT1 con ARG2, realiza un aporte a la energía total
más favorable que la otra, lo cual concuerda con la alternancia de los anillos a lo
largo de la simulación. En cambio, sí puede decirse que la contribución de la
interacción de MT2 con ARG20 a la estabilidad del complejo es mucho más
importante en términos termodinámicos.
Discusión y Resultados
164
Energía (kcal mol-1) ARG2_MT1 ARG2_TL1 ARG20_MT2
∆Gelec 0.57 (0.16) -0.29 (0.10) -0.68 (0.96)
∆GvdW -0.02 (0.02) 0.00 (0.00) -0.33 (0.25)
∆GMM 0.55 (0.15) -0.29 (0.10) -1.02 (1.09)
∆Gsolv np (GB) 0.00 (0.00) 0.00 (0.00) -0.29 (0.24)
∆Gsolv pol (GB) -0.56 (0.16) 0.29 (0.10) 0.62 (0.68)
∆Gsolv (GB) -0.57 (0.16) 0.29 (0.10) 0.33 (0.70)
∆Hbind (GB) -0.01 (0.03) -0.01 (0.00) -0.69 (0.60) Tabla 8: Energías promedio en kcal mol-1 con su correspondiente desviación estándar
entre paréntesis. ∆Gelec, energía electrostática; ∆GvdW, energía de van der Waals; ∆GMM,
energía total en fase gaseosa; ∆Gsolv np, contribución no polar a la energía libre de
solvatación; ∆Gsolv pol, contribución polar a la energía libre de solvatación; ∆Gsolv, energía
libre de solvatación y ∆Hbind, contribución entálpica a la energía libre de unión.
También se estudió la contribución media que hacen cada uno de los
residuos a la entalpía de unión (∆Hbind) en los 2.5 ns finales de la simulación,
periodo donde se alcanza la estabilización del complejo. Los resultados se
muestran en la figura 35.
Discusión y Resultados
165
-4
-3
-2
-1
0
1
2
ALA1
ARG
2
LEU
3
ASP4
VAL5
ALA6
SER
7
GLU
8
PHE9
ARG
10
LYS1
1
LYS1
2
TRP1
3
ASN
14
LYS1
5
TRP1
6
ALA1
7
LEU
18
SER
19
ARG
20
Residuos
∆H
unió
n (kc
al m
ol -1
)
Figura 35: Contribución media a la entalpía de unión (∆Hbind) correspondiente a cada residuo en los
últimos 2.5 ns de simulación.
De acuerdo con los resultados obtenidos los residuos que realizan una
contribución favorable a la energía de unión y por lo tanto, a la estabilización del
complejo son ARG2, VAL5, ALA6, PHE9, TRP13, TRP16, ALA17 y ARG20.
Estos resultados confirman las interacciones que se mencionaron antes:
ARG2 y ARG20 implicados en interacciones catión-π, ARG20 formando un enlace
por puente de H y por tanto, contribuyendo en mayor medida a la estabilización del
sistema, y finalmente TRP13 y PHE9 en interacciones de apilamiento. Por otra
parte, se han puesto de manifiesto otras, de naturaleza hidrofóbica, entre la
cadena de 5 carbonos del compuesto USP1K (CD5) y los residuos VAL5, ALA6,
TRP16 y ALA17. Como era de esperar, la contribución de la ARG20 es muy superior a la de
ARG2 porque además de la interacción catión-π, existe un enlace por puente de
hidrógeno.
Para evaluar con más detalle esta contribución, se realizó una
descomposición en las diferentes fracciones de energía que corresponden a la
interacción de la ARG20 con el ligando USP1K, que se muestra en la tabla 9.
Discusión y Resultados
166
Residuo ∆Hbind (kcal mol-1) MT1 -0.05 TR1 -0.54 TL1 -0.07 CD5 -1.96 TL2 -0.17 TR2 -4.40 MT2 -0.65
Total -3.22 Tabla 9: Descomposición de la contribución entálpica a la energía libre de unión (∆Hbind)
de la interacción entre el aminoácido ARG20 y el ligando USP1K.
Esta nueva descomposición puso de manifiesto que en la interacción entre
la ARG20 y el ligando, la contribución fundamental se debe al enlace por puente de
hidrógeno, seguida de una interacción hidrofóbica con la cadena alifática y
finalmente por la interacción de tipo catión-π con el anillo aromático MT2.
En resumen, del estudio de dinámica molecular, se puede concluir que los
datos teóricos corroboran los datos experimentales y aportan información
estructural y energética interesante que puede ser utilizada para el diseño racional
de otros compuestos con mayor afinidad por el péptido.
Así, teniendo en cuenta que una de las interacciones más importante es la
establecida entre ARG20 y el anillo de triazol (TR2) junto con el anillo MT2, la
introducción de sustituyentes dadores de electrones en el anillo MT2 podría
contribuir a una estabilización del complejo.
También se ha observado que la longitud de la cadena alifática debe
mantenerse puesto que una distancia mayor impide que se establezcan las
interacciones anteriormente mencionadas.
Por otra parte, los experimentos SPR han puesto de manifiesto que el
compuesto USP3J también es capaz de unirse al PAMP. Es de suponer que esta
estructura interaccione con el péptido de manera similar a como lo hace USP1K.
Discusión y Resultados
167
Sin embargo, todas estas suposiciones deberán ser confirmadas cuando se
finalicen los experimentos de RMN que se mencionan más adelante.
II. 2. 5. Evaluación de la actividad antiangiogénica
El objetivo final de este trabajo es el diseño de compuestos con actividad
antiangiogénica a través de la modulación negativa de la actividad del PAMP.
Como ya se describió en la introducción de esta memoria, el PAMP ha
mostrado ser un potente agente antiangiogénico que supera incluso la actividad
del VEGF en modelos animales.12
Por ello, todos los compuestos que mostraron afinidad en el ensayo de
competición, se seleccionaron para evaluar su actividad antiangiogénica en el
ensayo de anillos aórticos de embrión de pollo. Este trabajo se llevó a cabo en el
Instituto Cajal (CSIC) y estuvo a cargo del Dr. Alfredo Martínez.
Desafortunadamente ninguno de ellos mostró actividad antiangiogénica
apreciable.
Una posible explicación, es que al unirse al PAMP se comporten como
moduladores positivos de su actividad, es decir que tengan un efecto
proangiogénico. Debido a que el ensayo anterior no es capaz de detectar
compuestos proangiogénicos, aquellos compuestos que se comporten como
moduladores positivos del PAMP no pueden ser identificados con este
experimento. Para explorar esta posibilidad, se proyecta realizar un ensayo de
angiogénesis in vivo, el ensayo in vivo dirigido de angiogénesis (directed in vivo
angiogenesis assay, DIVAA),12, 118 con el fin de establecer de qué manera modulan
la acción del PAMP compuestos como USP1K, USP3J y 49487.
En caso de actuar como moduladores positivos podrían tener diferentes
aplicaciones farmacológicas como potenciales vasodilatadores ó por su acción
proangiogénica. Por ejemplo, en cirugía plástica se han realizado distintos
experimentos con el VEGF, con el fin de mejorar la perfusión tisular.243, 244
Discusión y Resultados
168
Por otra parte, la hipoxia e isquemia crónicas estimulan la expresión de
importantes mediadores de la angiogénesis, por lo que actualmente, están en
evaluación en ensayos clínicos nuevas estrategias terapéuticas que involucran la
estimulación de la angiogénesis en el tejido isquémico.245, 246
II. 2. 6. Pruebas antiproliferativas
Como parte de la evaluación biológica de los compuestos también se
realizó el ensayo de proliferación en la línea celular de cáncer de colon Caco-2.
Con este ensayo se pretende evaluar si los compuestos con afinidad por el PAMP
también son capaces de alterar la proliferación celular inhibiendo su crecimiento.
Aunque la capacidad antiangiogénica y antiproliferativa son
independientes, el hecho de que compuestos potencialmente antiangiogénicos
sean capaces también de inhibir el crecimiento celular resulta muy interesante,
puesto que esta complementariedad de funciones aumenta sus posibilidades
como candidatos a fármacos antitumorales.
El ensayo consistió en la incubación de un número determinado de células
por pocillo junto con el compuesto de prueba a dos concentraciones (10 µM y 100
µM). Se sometieron a la prueba los 26 compuestos que presentaron un registro de
absorbancia inferior al 95% en el ensayo de competición con el anticuerpo
monoclonal.
En este ensayo se obtuvieron resultados interesantes para los siguientes
compuestos: 42258, 299589 y USP1K, tal y como se muestra en la figura 36. Para
estos tres compuestos se determinaron los IC50 y se obtuvieron los siguientes
valores: 26.3 µM, 85.5 µM y 101.7 µM para USP1K, 42258 y 299589
respectivamente.
Como se ha mencionado anteriormente, el compuesto USP1K es capaz
de unirse al PAMP. Sin embargo, para 42258 y 299589 los experimentos de SPR
no permitieron sacar conclusiones ya que se produce agregación.
Discusión y Resultados
169
Por este motivo, hemos recurrido a la RMN para evaluar la capacidad de
unión, técnica que además nos permite estudiar las interacciones existentes entre
el ligando y el péptido.
0
20
40
60
80
100
120
140
Contro
lUSP1K
USP1LUSP3NUSP2M
USP3M
USP3J
6411
134
3227
4948
7
8787
7
4225
811
3491
1167
0221
1736
2321
760
1364
2995
8917
2614
5645
232
7705
% d
e pr
olife
raci
ón
Figura 36: Porcentaje de crecimiento celular respecto del control (células no tratadas), en la línea de cáncer de colon Caco-2 a las concentraciones de
10 (azul) y 100µM (naranja).
Discusión y Resultados
171
II. 2. 7. Resonancia Magnética Nuclear
En la actualidad, una de las metodologías más empleadas para la
determinación de la estructura tridimensional de macromoléculas en disolución se
basa en la combinación de medidas de RMN y cálculos teóricos de mecánica y
dinámica molecular. Además, mediante esta estrategia no sólo se puede obtener
información estructural, sino también información dinámica, que no pueden aportar
fácilmente otras técnicas.
Para su estudio por RMN, inicialmente se seleccionaron los compuestos
USP1K, USP1N y 42258. De acuerdo con los experimentos de SPR, el compuesto
USP1K es capaz de unirse al PAMP, mientras que el compuesto USP1N no se
une. Por otro lado el compuesto 42258 ha sido seleccionado porque presenta una
interesante actividad antiproliferativa, aunque por SPR no se han obtenido
resultados concluyentes sobre su posible interacción con el PAMP.
Las pruebas fueron realizadas por el Dr. Antonio Pineda en el Centro de
Investigación Príncipe Felipe. Se llevaron a cabo principalmente experimentos
heteronucleares 2D HSQC 15N.
En primer lugar el PAMP marcado con 15N fue expresado con citocromo
b5 en Escherichia coli. El nivel de expresión fue aproximadamente de 10 mg/L de
proteína soluble por cultivo celular. A continuación, el péptido se purificó por
columna de intercambio iónico.
Las figuras 37 y 38 muestran la superposición de tres espectros: en color
negro el espectro del PAMP a 300 K en presencia de un 36% de TFE; en magenta
el espectro obtenido al añadir únicamente DMSO; y en rojo el que se obtiene al
añadir DMSO y los compuestos USP1K (figura 37) y 42258 (figura 38). En ambos
casos se puede observar que existen diferencias entre el desplazamiento
producido por los compuestos y el que se produce en presencia únicamente de
DMSO. Esta diferencia es mayor para el compuesto 42258, pero en ambos casos
los resultados permiten afirmar que existe interacción con el PAMP.
Discusión y Resultados
172
Cuando los experimentos se llevaron a cabo con el compuesto USP1N no
se observaron diferencias entre los espectros obtenidos, confirmándose el hecho
de que este compuesto no es capaz de formar un complejo estable con PAMP.
Estos resultados son especialmente interesantes, pues además de
confirmar tanto las predicciones teóricas, como corroborar los resultados de los
experimentos SPR, una vez que se resuelvan los espectros, dispondremos de
información concreta del modo de unión de los ligandos al PAMP, facilitando el
proceso de diseño de nuevos ligandos.
Este estudio se está ampliando al resto de los compuestos seleccionados,
especialmente para aquellos en los que mediante SPR no fue posible obtener
resultados concluyentes.
Discusión y Resultados
173
Figura 37: Espectro HSQC 15N de PAMP a 300 K con 36% de TFE (negro). Espectro HSQC 15N
de PAMP a 300 K con 36% de TFE y 24 µL de DMSO (magenta). Espectro HSQC 15N de PAMP-
USP1K (DMSO) a 300K con 36% de TFE (rojo).
Discusión y Resultados
174
Figura 38: Espectro HSQC 15N de PAMP a 300 K con 36% de TFE (negro). Espectro
HSQC 15N de PAMP a 300 K con 36% de TFE y 24 µL de DMSO (magenta). Espectro
HSQC 15N de PAMP- 42258 (DMSO) a 300K con 36% de TFE (rojo).
II. 3. Conclusiones
Conclusiones
175
II. 3. Conclusiones
Se ha llevado a cabo un cribado virtual de la colección de compuestos del
NCI (NCI Diversity Set) junto con una colección de 60 compuestos de nuestra
quimioteca (en un total de 600 conformaciones distintas).
Se ha puesto a punto un ensayo de competición con el anticuerpo
monoclonal del PAMP. Este ensayo nos ha permitido seleccionar 20 compuestos
de un total de 50, capaces de competir con el anticuerpo monoclonal en su unión
al PAMP, que por lo tanto podrían actuar como moduladores de su acción. De
acuerdo con este procedimiento, el 40% de las predicciones de AutoDock podrían
considerarse correctas.
Las medidas de afinidad determinadas inicialmente para los compuestos
de nuestra quimioteca con la técnica SPR, mostraron que los compuestos USP1K,
USP3J y 49487 son capaces de unirse al péptido.
Mientras que el compuesto USP1K es capaz de unirse al PAMP, el
compuesto de estructura similar USP1N no lo es. Por este motivo, los complejos
péptido-ligando de estos compuestos se sometieron a simulaciones de dinámica
molecular. Un análisis detallado de la simulación del complejo PAMP-USP1K nos
permitió poner de manifiesto algunas interacciones interesantes. Se trata de
interacciones catión-π, interacciones de apilamiento, enlaces por puente de
Conclusiones
176
hidrógeno e interacciones hidrofóbicas que estabilizan la estructura del complejo
formado.
Para los dos complejos objeto de estudio se realizaron cálculos de energía
utilizando los métodos MM/PBSA y MM/GBSA. Se determinaron las energías
teóricas de unión de los complejos, además de las contribuciones energéticas por
residuo, corroborándose por estos métodos los datos experimentales obtenidos.
Por otro lado, se llevaron a cabo pruebas antiproliferativas de los 20
compuestos seleccionados, en la línea celular Caco-2 de cáncer de colon. Aunque
la capacidad antiangiogénica y antiproliferativa son independientes, el hecho de
que compuestos potencialmente antiangiogénicos sean capaces también de inhibir
el crecimiento celular resulta muy interesante, puesto que esta complementariedad
de funciones aumenta sus posibilidades como candidatos a antitumorales. Se
observaron resultados interesantes para los compuestos USP1K, 42258 y 299589.
Hasta ahora, 14 de estos compuestos han sido evaluados como agentes
antiangiogénicos mediante el ensayo de anillos de arcos aórticos de pollo y
desafortunadamente ninguno de los compuestos ha resultado ser antiangiogénico.
Por último, a través de experimentos HSQC 15N, se estudió la interacción
entre dos compuestos y el PAMP. En este estudio, se pudo confirmar ambos
compuestos (42258 y USP1K) se unen al péptido formando complejos estables.
De acuerdo con las pruebas realizadas hasta el momento, se puede
concluir que estos dos compuestos, cuya capacidad para unirse al PAMP ha sido
demostrada experimentalmente con técnicas SPR y HSQC 15N y poseen
interesantes propiedades antiproliferativas, son muy buenos candidatos como
potenciales moduladores de la acción del péptido.
II. 4. Parte Experimental
Parte Experimental
177
II. 4. Parte Experimental II. 4. 1. Cribado Virtual II. 4. 1. 1. Preparación del péptido
Para este estudio se cuenta con una única estructura disponible
determinada usando espectroscopia de RMN bidimensional de 1H y 13C cuyo
código PDB es 2fly.8 De las veinte conformaciones depositadas en esta estructura
se seleccionó la primera por no haber diferencias significativas entre ellas.
En primer lugar, se eliminaron los hidrógenos no polares y se asignaron
cargas tipo Kollman UNI a todos los átomos utilizando SYBYL 7.3.
La malla 3D se centró en el residuo TRP16, aminoácido central de la región
elegida, en una caja de dimensiones 45 x 37 x 62 Å y 0.375 Å de espaciado para
los siguientes átomos: C, A (C aromático), N, S, H, F, Cl, Br, I, P y e
(electroestático) usando el programa AutoGrid v.3.
II. 4. 1. 2. NCI Diversity set
El NCI Diversity set es un conjunto reducido de 1990 compuestos
seleccionados de la base de datos 3D original del NCI y preparados para su
utilización con programas de docking en concreto para AutoDock. Se trata de una
lista de compuestos representativa de la diversidad química de una colección
mayor perteneciente al Programa de Desarrollo Terapéutico del Instituto Nacional
Parte Experimental
178
del Cáncer en Estados Unidos. En el esquema 4 se muestra el proceso de
selección que utiliza el NCI para los compuestos que pertenecerán al NCI Diversity
Set.
De los aproximadamente 140.000 compuestos que constituyen la
quimioteca del NCI, se seleccionan 71.756 compuestos que son aquellos de los
que se dispone de más de 1 g. A continuación se realiza la selección mediante el
programa Chem X, que define tres puntos farmacofóricos basados en aceptores ó
dadores de enlace de H, cargas positivas y negativas, sistemas aromáticos,
grupos hidrófobos, ácidos, bases e intervalos de distancia para crear un conjunto
finito de farmacóforos.
Esquema 4: Metodología que utiliza el NCI para seleccionar los integrantes del NCI
Diversity Set
Este proceso genera alrededor de 1.000.000 de farmacóforos para todas
las conformaciones aceptables de cada estructura. Finalmente el NCI Diversity Set
~140.000 compuestos
>1.0 g disponible
71.756 compuestos
3 puntos farmacofóricos(Chem X)
1990 compuestos
NCI Diversity Set
Parte Experimental
179
se construye por comparación de todos los farmacóforos para cada conformación
aceptable, incluyendo la estructura en el conjunto si posee cinco o más
farmacóforos nuevos y adicionalmente, cinco o menos enlaces rotables. Como el
proceso de selección depende del orden, las estructuras para este procedimiento
se consideran al azar.
Este protocolo conduce a 1990 compuestos de los que se construye un
archivo en el formato adecuado (pdbq), accesible en la red para su utilización
directa con el programa AutoDock.247 Esto implica agregar los hidrógenos polares,
asignar tipos de átomos, cargas puntuales tipo Gasteiger y los ángulos diedros
rotables.
Para nuestro estudio, de los 1990 compuestos, se eliminaron aquellos que
poseen en su estructura elementos distintos de C, N, S, H, F, Cl, Br, I y P para
simplificar la parametrización. Tampoco se incluyeron los pertenecientes a la
denominada “problem list” por el NCI, puesto que se conoce que dan problemas
con el programa AutoDock. El número total de compuestos pertenecientes al NCI
diversity set utilizados en este trabajo fue de 1836.
II. 4. 1. 3. Compuestos de nuestra colección
En este trabajo también se estudiaron una serie de compuestos
perteneciente a nuestra colección particular.
Los compuestos que poseen más de cinco enlaces rotables fueron
sometidos inicialmente a una búsqueda conformacional exhaustiva. Para ello se
construyeron las estructuras mediante el programa Macromodel248 y
posteriormente fueron sometidas a un refinamiento de la energía utilizando
mecánica molecular y el campo de fuerzas de AMBER.249
Después del refinamiento inicial, las estructuras se sometieron a una
búsqueda conformacional utilizando el programa Batchmin y el método Monte
Carlo,250 en el que los ángulos de la geometría inicial son relacionados y
modificados al azar. Una vez generada la nueva estructura, el propio método la
Parte Experimental
180
minimiza utilizando el campo de fuerzas seleccionado (en este caso AMBER) y
analiza el valor de su energía, de forma que si este valor es superior a la energía
del confórmero anterior en más de 50 kj (valor elegido) la estructura es rechazada,
si la energía es inferior a este margen, la nueva geometría es aceptada y
almacenada.
El programa continúa buscando hasta un máximo de 100 conformaciones
(valor seleccionado); las coloca en orden de menor a mayor energía y finaliza.
Todos los demás ligandos fueron inicialmente refinados mediante el
programa MOPAC.251
En los casos en que los compuestos contenían grupos ácidos o básicos se
determinó el estado de ionización a pH fisiológico haciendo uso del programa
Marvin.252
La asignación de cargas para todos los compuestos y confórmeros se
realizó mediante el programa SYBYL 7.3 y cargas tipo Gasteiger-Marsili.
Este procedimiento dio lugar a 600 confórmeros correspondientes a 60
estructuras diferentes. Estos 600 confórmeros fueron sometidos al mismo
procedimiento de cribado virtual que los 1836 pertenecientes al NCI Diversity Set.
II. 4. 1. 4. Cribado virtual
Para la realización del cribado virtual se utilizó la versión 3.0.5 del
programa AutoDock.192 La tabla 10 resume los parámetros utilizados para la
realización del docking de los distintos ligandos, para los que se buscaron en cada
caso 100 posibles soluciones. Este procedimiento consumió aproximadamente
media hora en un PC Xeon con sistema operativo Linux para cada una de las
moléculas objeto de estudio, excepto para las que pertenecían a nuestra
quimioteca, cuya exploración consumió aproximadamente cinco horas por
confórmero, debido a la elevada flexibilidad de los compuestos (ver tabla 6).
Parte Experimental
181
PARÁMETROS VALORES
Parámetros Algoritmo Genético (GA) y Algoritmo Genético Lamarckiano (LGA)
ga_pop_size Nº de individuos en la población 100
ga_num_evals Nº máximo de evaluaciones de energía 250000
ga_num_generations Nº del máximo de generaciones 27000
ga_elitism Nº individuos máximo que sobrevive a la siguiente
generación 1
ga_mutation_rate Porcentaje de mutación 0.02
ga_crossover_rate Porcentaje de entrecruzamiento 0.80
ga_window_size Nº de generaciones por escoger al peor individuo 10
ga_cauchy_alpha Distribución de Cauchy 0
ga_cauchy_beta Varianza de distribución de Cauchy 1
Parámetros Búsqueda local
sw_max_its Nº de iteraciones búsqueda local 300
sw_max_succ Nº de éxitos consecutivos antes del rho cambiante 4
sw_max_fail Nº de fracasos consecutivos antes del rho cambiante 4
sw_rho Tamaño de espacio de la búsqueda local para probar 1.0
sw_lb_rho Límite más bajo en rho 0.01
ls_search_freq Probabilidad de realizar búsqueda local en un individuo 0.06
Tabla 10: Parámetros utilizados en el estudio de docking
El programa busca hasta un máximo de 100 soluciones (valor
seleccionado), las coloca en orden de menor a mayor energía y finaliza. Para este
estudió se decidió seleccionar los primeros 50 complejos PAMP-ligando de
mínima energía. Estos complejos se analizaron visualmente mediante la utilización
del programa SYBYL 7.3.
Parte Experimental
182
II. 4. 2. Ensayo de competición
El anticuerpo monoclonal αPAMP fue producido por la compañía Evogenix
(Sydney, Australia).
El anticuerpo fue marcado con peroxidasa y purificado en nuestro
laboratorio utilizando los kits EZ-Link Plus Activated Peroxidase y Freezyme
Conjugate Purification (Cultek SL), respectivamente.
El PAMP que se utilizó es un péptido sintético adquirido en la compañía
Phoenix Pharmaceuticals (Belmont, CA).
Estudiando concentraciones, tiempos y condiciones óptimas para el
ensayo, se puso a punto el siguiente procedimiento basado en experimentos
similares publicados.179
En una placa de 96 pocillos de poliestireno (PS) se colocan 50 µL (2 ng/
µL) de PAMP en tampón fosfato (PBS) y se deja una hora para que el péptido se
adsorba en el fondo de los pocillos. Se dejan en la placa pocillos sin PAMP que
corresponden al blanco. Después de sucesivos lavados y del bloqueo de los
pocillos con albúmina sérica bovina (BSA (1%)-Tween 20 (0.1%) en PBS), se
añaden los compuestos a ensayar a una concentración de 1.0 µM y en los pocillos
de control positivo se añade anticuerpo sin marcar. Después de una hora de
incubación se agrega en todos los pocillos el anticuerpo monoclonal de PAMP
marcado con peroxidasa. Durante una hora el anticuerpo marcado competirá por
la unión al PAMP con los compuestos a ensayar.
Después se retira el excedente de solución mediante lavados adicionales.
La reacción colorimétrica que tiene lugar cuando se agrega el sustrato de la
peroxidasa (dihidrocloruro de o-fenilendiamina), es directamente proporcional a la
unión del anticuerpo marcado con el PAMP e inversamente proporcional a la unión
del compuesto al PAMP. El producto de reacción se cuantifica en un lector de
placas (Spectra Rainbow; Tecan, Raleigh, NC) a 450 nm.
Parte Experimental
183
II. 4. 3. Determinación de la afinidad por SPR
Las medidas de SPR fueron realizadas bajo la dirección de la Dra.
Laurence Choulier en el Laboratorio de Biotecnología de Interacciones
Moleculares en la Escuela Superior de Biotecnología de Estrasburgo (Francia).
Usando un equipo Biacore T100 (GE Heathcare Biacore, Uppsala, Suecia)
se llevó a cabo un análisis de interacción molecular en tiempo real. Todos los
experimentos se llevaron a cabo a 25 ºC. En la célula de flujo 2 (Fc 2) de un chip
sensor sCM5 se inmovilizaron 580 unidades de resonancia (RU) de PAMP usando
el método de acoplamiento de amina de acuerdo con las especificaciones del
fabricante (BIAapplications Handbook). Fc 1 fue tratada igual que Fc 2 pero sin la
inyección de PAMP y se utilizó como referencia. Los estudios se llevaron a cabo
con un flujo de 30 L/min con HBS-DMSO (10mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl,
3.4 mM EDTA, 5% DMSO) como tampón. Las muestras de los compuestos en
concentraciones de entre 10 y 200 µM en HBS-DMSO, se inyectaron durante 1
min. sobre las superficies de referencia y la de PAMP, seguido de una post-
inyección durante 2 min. La regeneración se llevó a cabo con dos inyecciones de
30 s de NaCl 0.5 M, seguidas de 2 min. de estabilización. Típicamente, los 10
primeros ciclos consistieron en inyecciones de HBS-DMSO para asegurar que la
superficie se encontraba totalmente equilibrada. También se inyectó HBS-DMSO
antes de cada nuevo compuesto. Los datos del biosensor fueron analizados
usando el software Biacore T100 Evaluation versión 1.1.1 (GE Healthcare). Como
el DMSO a menudo genera cambios en el índice de refracción mayores a las
señales esperadas de los compuestos, los datos fueron corregidos teniendo en
cuenta las posibles diferencias en el índice de refracción generadas por el DMSO
entre las células de flujo.229
Parte Experimental
184
II. 4. 4. Dinámica Molecular
II. 4. 4. 1. Preparación de los modelos
Para llevar a cabo las simulaciones de DM se eligió el mismo modelo del
PAMP que para el docking y los complejos de mínima energía obtenidos para
PAMP-USP1K y PAMP-USP1N.
Para calcular las cargas de los compuestos USP1K y USP1N y refinar su
geometría se utilizó Gaussian 98.230
Para neutralizar los sistemas se añadieron 5 iones de Cl-. Cada sistema
fue solvatado usando moléculas de agua tipo TIP3P253 en una caja cúbica de al
menos 10 Å de distancia de cualquier átomo del complejo, incluyéndose para este
modelo 7522, 7099 y 17690 moléculas de agua para PAMP, PAMP-USP1K y
PAMP-USP1N respectivamente.
II. 4. 4. 2. Simulaciones de DM
Se aplicaron condiciones de límite periódico y las interacciones
electrostáticas fueron tratadas con el método Particle Mesh Ewald (PME)205, 207 con
un espaciado de malla de 1 Å. La distancia de corte (cut off) para las interacciones
entre los átomos fue de 8 Å. El algoritmo SHAKE203 fue aplicado a todos los
enlaces con hidrógeno con un intervalo de integración de 1.0 fs.
Los complejos y el péptido libre se sometieron a un proceso de equilibrado
previo que consistió en las siguientes etapas: minimización a temperatura
constante (300 K); equilibrado durante 25 ps restringiendo el soluto con aumento
de la temperatura de 100 a 300 K; equilibrado durante 50 ps restringiendo el soluto
a temperatura constante (300 K); minimización a temperatura constante (300 K)
restringiendo el soluto; equilibrado durante 60 ps restringiendo el soluto con
aumento de la temperatura de 100 a 300 K. A continuación se llevaron a cabo 5
minimizaciones consecutivas a temperatura constante (300 K) liberando
paulatinamente las restricciones del soluto desde 25 kcal mol-1 Å-2 a 0 kcal mol-1
Parte Experimental
185
Å-2 seguido de un equilibrado durante 20 ps con aumento de la temperatura de 100
a 300 K sin restricciones del soluto y finalmente la dinámica de producción durante
9 ns a presión y temperatura constantes. Las coordenadas de las trayectorias se
guardaron cada 2 ps.
II. 4. 4. 3. Cálculos MM/PBSA y MM/GBSA
El primer paso de este método consistió en la generación múltiple de
instantáneas a partir de la trayectoria de DM, extrayendo las moléculas de agua y
contraiones. Las instantáneas espaciadas en intervalos de 20 ps se extrajeron de
la DM de producción dando lugar a 450 instantáneas para los 9 ns.
Para evaluar la energía electrostática de solvatación ∆Gsolv, se usó el
módulo PBSA de AMBER y el módulo GBSA de AMBER, con un espaciado de
malla de 2 Å y 1000 iteraciones en ambos casos. La energía de solvatación no
polar ∆Gsolv np se calculó con la superficie accesible al disolvente (SASA) usando el
programa MSMS,254 de acuerdo a la ecuación
∆Gsolv np = γSASA + β
donde la tensión superficial γ y el término independiente β se fijaron en 0.005 kcal
mol –1 Å-2 y 0.00 kcal mol-1, respectivamente para el cálculo con PB y 0.0072 kcal
mol –1 Å-2 y 0.00 kcal mol-1, respectivamente para el cálculo con GB.
Finalmente, para evaluar el cambio de entropía en el soluto durante la
asociación al ligando, -T∆S se utilizó el modo NMODE de AMBER.
Previamente a los cálculos de modo normal, el complejo, el receptor y el
ligando se sometieron a una minimización con una constante dieléctrica
dependiente de la distancia ε = 4r y un criterio de convergencia de 10-5 kcal mol-1
Å-1. Debido al alto coste computacional, el cálculo de entropía se realizó
seleccionando instantáneas espaciadas en intervalos de 200 ps de la DM dando
lugar a 45 datos a lo largo de los 9 ns.
Parte Experimental
186
La elección de la constante dieléctrica interna para la evaluación de las
energías de solvatación ha sido objeto de debate. Stoica y cols.255 encontraron
que las entalpías de unión calculadas utilizando una constante dieléctrica de valor
1.0, combinadas con la contribución entrópica, producían en general valores más
cercanos a los experimentales.
II. 4. 4. 4. Requerimientos computacionales
Las simulaciones de DM se llevaron a cabo usando el servicio del Cluster
de Modelización Científica (Universidad de Oviedo), a una velocidad de
aproximadamente 18 horas/ns. Los cálculos de energía libre se llevaron a cabo
utilizando recursos propios. Para una simulación MM/PBSA/GBSA con 450
instantáneas se requirió un tiempo aproximado de 10 horas en un PC Xeon. Los
cálculos de entropía usando el tratamiento NMODE requirieron aproximadamente
un tiempo similar.
II. 4. 5. Angiogénesis: Ensayo de anillos de arcos aórticos de pollo
Las pruebas de angiogénesis fueron realizadas bajo la dirección del Dr.
Alfredo Martínez en el Departamento de Neuroanatomía y Biología Celular del
Instituto Cajal de Ciencias Neurobiológicas, Consejo Superior de Investigaciones
Científicas (CSIC).
El ensayo de anillos de arcos aórticos de pollo es un ensayo de
angiogénesis ex vivo. Se preparan anillos aórticos de aproximadamente 0.8 mm
de longitud a partir de 5 arcos aórticos de embriones de pollo de 13 días. El tejido
conjuntivo de la capa adventicia se retira con pinzas cuidadosamente. Cada anillo
aórtico se coloca en el centro de un pocillo, en una placa de 48 pocillos y se cubre
con 10 µL de matrigel. Una vez que el matrigel ha solidificado, se añade a cada
pocillo una solución nutritiva que contiene un compuesto proangiogénico (10 nM
VEGF) y los compuestos a probar a una concentración conocida de 1 µM.
Parte Experimental
187
Las placas se incuban a 37 ºC en una atmósfera que contiene 5 % de CO2
de 24 a 36 horas. Los microvasos que brotan de los anillos aórticos se fotografían
con un microscopio invertido.
II. 4. 6. Pruebas antiproliferativas
Para este ensayos se utilizó la línea celular Caco-2:256 • Características: células de cáncer de colon humano
• Procedencia: Instituto del Frío (CSIC)
Para el cultivo de las Caco-2 se utilizó medio Dulbecco's Modified Eagle's
Medium (DMEM) enriquecido con suero fetal bovino al 10%, aminoácidos no
esenciales (1%) y una mezcla estreptomicina/penicilina (1%). Las células se
sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 5 x 104 células por pocillo.
Se mantuvieron en incubador humidificado a una temperatura de 37 °C con un
5% de CO2 hasta alcanzar el 80% de su confluencia, en torno a los 6 días.
A continuación, las células fueron tratadas durante 20 horas con los
compuestos a ensayar disueltos en DMSO. En todos los casos la cantidad de
DMSO no superó el 0,1% del volumen total de medio (1 mL) y se realizaron
controles a los que únicamente se les agregó un volumen igual de DMSO.
Transcurridas 20 horas de tratamiento, se midió la viabilidad celular
mediante el método de rojo neutro. Tras eliminar el medio se agregaron 0,5 mL de
medio fresco que contiene el rojo neutro y se incubó durante dos horas en
condiciones normales de cultivo. Posteriormente se eliminó el rojo neutro, se lavó
dos veces con PBS para eliminar restos y se extrajo el rojo neutro mediante
solución de extracción (EtOH:H2O:AcOH, 50:49:1). Transcurridos 15 minutos se
tomaron tres alícuotas por pocillo y se midió su absorbancia a 540 nm. Los
resultados se expresan como porcentaje frente a los controles.
Parte Experimental
188
II. 4. 7. Resonancia Magnética Nuclear
Los experimentos de RMN fueron realizados bajo la dirección del Dr.
Antonio Pineda en el Centro de Investigación Príncipe Felipe de Valencia.
Los espectros de RMN se adquirieron en un espectrómetro Bruker Avance
Ultrashield Plus 600, equipado con una criosonda TCI de 5 mm con gradientes en
el eje Z.
Todos los datos se procesaron con el programa Topspin 1.3 (Bruker
GmbH, Karlsruhe, Alemania). Los experimentos heteronucleares 2D 15N HSQC se
adquirieron con anchuras espectrales de 7.5 KHz (dimensión de 1H) y 1.6 KHz
(dimensión de 15N), con 24 acumulaciones y 128 puntos en la dimensión del 15N,
con una duración final de una 1 hora.
Las muestras se prepararon a una concentración aproximada de 50 µM en
10 mM Tris pH 7.5, 300 mM NaCl, 36% TFE y 10% D2O, en un volumen final de
500 µL. Las moléculas orgánicas se disolvieron en DMSO-d6 en concentraciones
desde 12.5 hasta 50 mM. La temperatura de medida fue de 300 K. Una vez
adquirido un experimento de referencia, se añadió en cada caso el volumen de
disolución correspondiente para tener una concentración final de molécula de 500
µM. Con el fin de eliminar el efecto en los desplazamientos químicos del DMSO, la
cantidad final del mismo se igualó en todos los casos.
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