AISLAMIENTO DE PLÁSMIDOS

AISLAMIENTO DEPLÁSMIDOS

ESTRUCTURA DEL ADNJames Watson y Francis Crick en 1953

demostraron que la estructura del ADN consiste en una doble hélice formada por dos cadenas.

El ADN es un ácido nucleico formado por nucleótidos.

Cada nucleótido consta de tres elementos:

• Un azúcar: desoxirribosa• Un grupo fosfato• Una base nitrogenada (adenina

(A), guanina (G), citosina (C) y timina (T))

Los extremos de cada una de las hebras del ADN son denominados 5’-P (fosfato) y 3’–OH (hidroxilo) en la desoxirribosa

Se replican independientemente del cromosoma del hospedero

Portan SOLO genes no esenciales Pueden ser circulares o lineales, de 1

kbp hasta de 1 Mbp Se encuentran superenrrollados,

que es la forma más compacta que existe de DNA

Se pueden encontrar desde 1 a 3 copias por célula o hasta 100.

Características de los plásmidos

Conformaciones de un plásmido Linealizado: Es decir cuando se ha cortado

ambas cadenas del DNA sólo una vez. Parcialmente linealizado: Cuando se ha

cortado el DNA en una de las cadenas DNA relajado circular. DNA que no se ha

empacado. Superenrrolado: Covalentemente cerrado y

muy empacado Superenrollado desnaturalizado. Parecido al

anterior pero un poco menos empacado

Superenrollamiento plásmido

Existen varias conformaciones de los plásmidos en el estado superenrollado.

Por lo que pueden migrar en un campo eléctrico de manera muy diferente cada uno a pesar de tener el mismo peso molecular

Hay distintos procedimientos para la purificación de DNA plasmídico, aunque todos incluyen los tres pasos siguientes:

1. Crecimiento de las bacterias en un medio selectivo de aquellas que llevan el plásmido.

2. Lisis de las bacterias para la liberación del plásmido 

3. Purificación del DNA plasmídico

DESNATURALIZACIÓN ALCALINA O METODO DE LISIS ALCALINA DE BIRNBOIM Y DOLY

Este método se basa en la diferente resistencia a valores de pH elevados del ADN plasmídico y cromosómico.

Explota las diferencias en las propiedades de desnaturalización y renaturalización entre el DNA plasmídico y el DNA cromosómico.

DesnaturalizaciónLa alcalinización con NaOH en presencia de

un SDS, provoca la lisis celular, la desnaturalización del DNA cromosómico y la liberación de los plásmidos también desnaturalizados.

Renaturalización

La neutralización del medio en presencia de una concentración alta de sal (acetato potásico), provoca:

A) que se cierre covalentemente el DNA plasmídico

B) y la precipitación del DNA cromosómico (por reasociaciones aleatorias intracatenarias).

Los agregados insolubles de DNA cromosómico se separan por centrifugación del DNA plasmídico que queda en el sobrenadante y conserva mayoritariamente su estructura nativa

El ADN plasmídico en el sobrenadante se concentra por precipitación con etanol.

Los tres pasos para obtener el DNA plasmídico

En la práctica:

1. Inocular 5mL de célulass transformantes en 5mL de medio LB+Kanamicina e incubar a 37◦C durante 12 h aprox.

2. Centrifugar el medio a 10000rpm por 1min a 4◦C y descartar el sobrenadante. El paquete celular queda en un microtubo.

3. Resuspender en 300µL de soln GTE fría, agitar en vortex e incubar a Tamb por 5min.

4. Adicionar 300µL de soln de lisis (que contiene?) , mezclar por inversión e incubar en hielo por 5min.

5. Adicionar 300µL de soln fría de acetato de potasio (3M,pH=4.8) y mezcla por inversión e incubar en hielo por 5min.

6. Centrifugar a 12000 rpm por 5min a 4◦C.7. Transferir sobrenadante a un tubo, adicionar

volumen igual de isopropanol frío e incubar por 20min a -20◦C.

8. Centrifugar a 12000 rpm por 5min a 4◦C.9. Eliminar sobrenadante y lavar con 1mL de etanol al

70%.10. Centrifugar a 12000 rpm por 5min a 4◦C11. Decantar sobrenadante y eliminar sobrante por

evaporación a Tamb.

12. Resuspender con 30µL de agua estéril y guardar a -20◦C.

13. Cuantificar concentración mediante absorbancia a 260nm (considerar unidad de absorbancia=50µg/mL).

BIBLIOGRAFIA

Cercenado Emilia, Procedimientos en Microbiología Clínica “ Métodos moleculares de tipificación epidemiológica en bacteriología”, SEIMC, http://www.clinicaelnazareno.org/biolab/sistema/archivos/18.%20metodos%20moleculares%20de%20tipificacion%20epidemiologica.pdf