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ANALISIS DE COCAINA ANALISIS DE COCAINA Y Y
SUS METABOLITOSSUS METABOLITOS
INDICEINDICE
1. INTRODUCCIÓN 1.1-Características y sus efectos en el cuerpo humano. 1.2-Caracterización del analito. 1.3-Metabolismo de la cocaína.
2. ANALISIS DE COCAINA 2.1-Características generales de las técnicas de extracción. 2.2-Otras técnicas. 2.3-Aplicación de las técnicas en función de la matriz 2.4-Tabla resumen.
3. BIBLIOGRAFÍA
1. INTRODUCCIÓN1. INTRODUCCIÓN
Características y sus efectos en cuerpo humanoCaracterísticas y sus efectos en cuerpo humano
La coca es una especie de singular importancia cuyas plantas fueroncultivadas por los indios de América del Sur; masticaban sus hojas como estimulante para resistir diferentes inclemencias e incluso en ceremonias religiosas. Actualmente se cultiva en varias partes del continente americano, en la isla de Java y en la India, principalmentepara la producción de cocaína.
Básicamente hay dos formas químicas: -las sales: la forma más común del polvo de cocaína, se disuelve en agua; forma intravenosa o intranasal. -los cristales de cocaína (como base libre): no ha sido neutralizado por ácido para producir la sal correspondiente; se puede fumar, ya que no se descompone como sí lo hace el clorhidrato.
La cocaína es un estimulante adictivo que funciona en el sistema nervioso central, principalmente al sistema dopaminérgico mediante la modulación de la dopamina, un neurotransmisor que se encuentra en ciertas zonas y neuronas del cerebro.
EFECTOS
USO MEDICINAL: Las hojas de la coca se han usado durante milesde años como hierba medicinal y para la elaboración de infusiones debido a su carácter anestésico local, por lo que se usa en ciertostipos de cirugías de los ojos, oídos y garganta.
-elevación de la autoestima y la confianza en uno mismo, -una gran locuacidad, excitación (pudiendo llegarse a la extrema irritabilidad). -dura relativamente poco tiempo (unos 30-60 minutos) -ansiedad por recibir otra dosis
Caracterización del analitoCaracterización del analito
COCAINA:
(1R,2R,3S,5S)-3-(benzoiloxi)-8-metil-8-azabiciclo[3.2.1] octano-2-carboxilato de metilo. C17H21O4N Es un alcaloide perteneciente al grupo de los alcaloides tropánicos; es una base nitrogenada capaz de formar sales en acidos organicos e inorganicos.
Propiedades físicas: -son prismas monoclínicos, incoloros, con un punto de fusión de 98ºC. -es muy soluble en cloroformo (CHCl3), soluble en etanol, eter dietílico, CS2, benceno, muy poco soluble en agua fria. -la soluciones de cocaína son levógiras y tiene una [a]D 20= -15,83º en cloroformo. -sublima con descomposición a temperaturas que estén por encima de su punto de fusión. -sabor amargo e insensibiliza transitoriamente los nervios linguales.
Núcleo fundamental: tropano
Función de puente
Del tropano deriva la ecgoninaque presenta un radical hidroxilo (OH) en el carbono 3 y un grupo carboxílico (COOH) en posición 2; siendo por tanto el 3-hidroxi-2-carboxi-tropano.
303272198
182
82
122
10594
N-desalquilacion
Hidrólisis de ester
N-desalquilacionHidrólisis de ester
Hidrólisis de ester
N-desalquilacion
Trans-esterificacion
Metabolismo de la cocaína:Metabolismo de la cocaína:
-Reacciones metabólicas de fase I:
-Reacciones metabólicas de fase II: formación de glucoconjugados.
La biotransformación de la cocaína se realiza en el hígado y en el plasma sanguíneo a través de las colinesterasas que dan lugar a productos hidrosolubles.
2. ANALISIS DE COCAÍNA2. ANALISIS DE COCAÍNA
CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LAS TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN.
Extracción líquido – líquido (LLE)
No tóxicos, transparentes, no emulsiones, más densos que el
agua
Extracción en fase sólida (SPE).
1. Acondicionamiento del cartucho
2. Paso lento de la muestra
3. Fase lavado
4. Desorción con disolvente apropiado.
ParámetroParámetro LLELLE SPESPE
EspecificidadEspecificidad Baja Alta
Tiempo de Tiempo de análisisanálisis
Largo Corto
Concentración Concentración El analito se diluye
Se obtiene extracto concentrado
RecuperaciónRecuperación Baja Alta
SalubridadSalubridad Solventes tóxicos
Menos cantidades
CostosCostos Consumo de solventes y t
Consumo de solventes y t
Comparación entre técnicas:
Microextracción en fase sólida (SPME): “Extracción Extracción de los analitos de la matriz de la muestra mediante una de los analitos de la matriz de la muestra mediante una fibra de sílice fundida que está recubierta de un fibra de sílice fundida que está recubierta de un sorbente, seguida de una desorción de los mismos, sorbente, seguida de una desorción de los mismos, térmica o mediante el empleo de un solvente orgánicotérmica o mediante el empleo de un solvente orgánico”.
• “Ausencia” disolventes y bajo coste.
• Elevada sensibilidad y puede automatizarse
• Pequeños volúmenes muestra
• Fácil transporte y versatilidad matrices (aliento, sol. Liq.)
• Problemas de reproducibilidad, gran número de variables implicadas (limitación análisis cuantitativo) Patrón interno
• A veces LD altos (SPME-LC)
Modo SPME Propiedades del analito
Matrices
Inmersión Directa Espacio de cabeza Membrana protectora
De media a baja volatilidad De alta a mediana volatilidad Baja volatilidad
Muestras gaseosas, liquidas. Liquidas, sólidas Muestras complejas
“Practical Tips on Preparing Plasma Samples for Drugs analysis Using SPME”. (www.lcgeurope.com)
““Practical Tips on Preparing Plasma Samples for Drugs analysis Using SPME”. Practical Tips on Preparing Plasma Samples for Drugs analysis Using SPME”. (www.lcgeurope.com)(www.lcgeurope.com)
Extracción HS en Nurka390 termostatizador
Termómetro a 60ºC.1 hora con cronom. Time:
01:00:00
Inyección directa
10’
45º
C
10ºC/min
180ºC
5ºC/min.
290ºC
25ºC
300 ºC
-Molecularly Imprinted Solid Phase Extraction (MISPE)
-Microextracción Líquido-Liquido (LLME)
-Extracción Sólido-Líquido:
-Asistido por ultrasonidos-Asistido microondas-Agitación directa
-Análisis in-vivo con sondas de microdiálisis
Otras técnicas empleadas en la extracción de Otras técnicas empleadas en la extracción de cocaínacocaína
MISPE
-soporta condiciones de alta temperatura, presión, pH extremos y disolventes orgánicos
-bajo coste y alta capacidad
-reproducibilidad en la fabricación
-reconocimiento a medida
Empleado para BE en muestrasacuosas a niveles clínicos μg/mL
Relleno de columnas de HPLC
LLME
LLME en dos o tres fases
-Tres fases:
ASample ↔ AAqueous acceptor ↔ AOrganic acceptor
-Dos fases
La fase aceptora es igual que la orgánica
Cocaína en saliva y orina
Cloroformo como fase orgánica y aceptora (dos fases)
TIPOS DE MUESTRA(Uñas, billetes, polvos “ilícitos”, hojas de coca, tejidos post-mortem, saliva, pelo, orina, sangre)
UñasSe busca COC, NCOC y BE
ProcedimientoExtracción S-L con 3ml MeOH 16h 40ºCSPE
Activación: 2ml MeOH y 2ml tampón fosfato pH=6Lavado: 6ml H2O, 3ml HCl 0,1 M y 9ml MeOHElución: 2ml methylene chloride–2-propanol–amoniumhydroxide (80:20:2, v/v/v).
Evaporación derivatización 25μl Etilacetato
2μl GC/MS
Billetes($,$can,Fr suizos, €, GBP)
Procedimiento
-Agitación en Vórtex 5 min 15 ml MeOH-Evaporación-O,5 ml MeOH GC/MS
SALIVA
Correlación con plasmaCocaína está presente en saliva de consumidoresBúsqueda de EME, BE, COC (69, 54 y 31 ppb, resp.
17h después de dosis)
Recolección de muestra:-sin estímulo-con estímulo: caramelos cítricos, chicle, etc
Procedimiento:1ml saliva pH=9-Extracción L-L con 3ml de organoclorados-Evaporación-GC/MS
SPME: Selección de la fibra Polydimethylsiloxane (PDMS) Analito en líquido Inmersión directa Analito en matriz sólida Espacio de cabeza (HS) Factores que pueden optimizar el proceso:
Fuerza iónica Adición de sales (NaCl) pH matriz Drogas ácidas y/o neutras drogas neutras en
fibra Tiempo de extracción Tiempo requerido para establecer
equilibrio (15-30 min) Aditivos orgánicos (MeOH) Pueden eliminar proteínas de la
matriz. Temperatura Establecer un equilibrio de temperatura Derivatización Agitación Influencia de las proteínas en la fibra
SANGRE
SPMECentrifugación10 min a 4000rpm
Adición de patrón interno deuterado disuelto en ACN
Centrifugación 5 min a 12000 rpm
400 µL plasma+
200 µL Borax buffer (pH = 9)
Mejorar la SPME: Adición 50 mg NaCl y agitar
SPME directa (25 min): PDMS (100 µm polydimethylsiloxane)
GC-MS (5min)
PELO-Cocaína como compuesto mayoritario y, BEG y EME en bajas concentraciones (deg.)-1er analisis: 1981, mediante RIAGC/MS.-Se puede detectar meses después de su administración.
LAVADO 5-10mg + 1mL MeOH 15min, 37ºC + 3x(fosfato pH6 30min, 37ºC ).
DIGESTION Alcalina: 1h en 1N NaOH a 100ºC. Eliminación de proteínas. Degradación de cocaína.
Acida: 50mg pulv. + 0.1M HCl 45ºC, noche +100μL 1M NaOH +2mL pH 7.4.
(sin pulv) 1mL 0.1M HCl durante 18h a 37ºC .
Enzimática: 10mg + 2.6mL buffer + 0.4mL 0.4M dithiothreitol durante2h a 40ºC. +50μL de proteinase K, a 40ºC por la noche.
buffer:1 mL 1 M Tris HCI buffer, 20 mL 10% SDS + 79 mL agua destilada.
EXTRACCIÓN Liquido-líquido:
SPE: C18, 6mL MeOH 3mL H2O 10min secado 3x 500μL 3mL H2O 3mL acético 15min 4500rpm
acetona:diclorometano 3mL H2O 3:1
también: Bond Elut fase reversa + intercambio iónico.GC/MS (derivatización) y LC/MS.
ORINA-Compuestos mayoritarios: BEG y EME, y en baja concentración COC libre.-En control de dopaje solo se monitoriza BEG y EME.
EXTRACCIÓN líquido-líquido: 100μL pH 11 + 5mL TBME, agitar, centrifugar y separar fases.
SPE: C18, centrifugar. 500μL MeOH 1mL H2O 200μL AcN:MeOH (70:30) 500μL H2O
Bond Elut, 1mL+ 2mL buffer pH9, vortex 10s.
3mL MeOH 3mLH2O 2mL CH2Cl:isoprop (8:2) 3mL H2O 2% ammonio
SECAR FASES EN CASO DE DERIVATIZAR.
DERIVATIZACIÓN residuo+50μL MSTFA:dith:NH4I a 65ºC 30min. residuo+10μL CD3I a 100ºC 5min.
HPLC/MS
GC/MS
HIDROLISIS 2mL + 100μL pH7 + 25 μL β-glucoronidasa a 55ºC durante 1h.
Tipo de Tipo de muestramuestra TratamientoTratamiento DetecciónDetección
Uñas SLE, SPE GC-MS
Billetes SLE GC-MS
T.Post-mortem SPE GC-MS
Hojas de coca SPME, MW GC-MS
Saliva LLE, MLLE GC-MS
Sangre SPME, SPE GC-MS
Pelo SPE GC-MS, LC-MS
OrinaLLE, MLLE, SPE,
MISPEGC-MS, LC-MS
3. BIBLIOGRAFÍA3. BIBLIOGRAFÍA
“Analysis of Hair for Cocaine”, Gary L. Henderson, Martha R. Harkey, and Reese T. Jones.“Hair Testing for Drugs of Abuse: International Research on Standards and Technology”, 1995, p. 91-120. NIH Publication No. 95-3727.“Rapid assay of cocaine, opiates and metabolites by gas chromatography-mass spectrometry”. E.J.Cone, W.D.Darwin. J.Chr. Biomed Appli. 580 (1991) 43-61.“Determination of cocaine and benzoylecgonine by derivatization with Iodomethane-D3 or PFPA/HFIP in human blood and urine using GC/MS (EI or PCI mode)” R.E.Aderjan, G.Schmitt, M.Wu, Ch.Meyer. J. Anal. Toxic, vol.17 (1993). “A method for the simultaneous determination of cocaine, benzoylecgonine and ecgonine methyl ester in blood and urine using GC/EIMS with derivatization to produce high mass molecular ions”. D.S.Isenschmid, B. S. Levine, Y.H.Caplan. J. Anal. Toxic, vol.12 (1988). “Practical Tips on Preparing Plasma Samples for Drugs analysis Using SPME”. (www.lcgeurope.com) “Determination of cocaine and cocaethylene in plasma by solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry”. I. Álvarez et al. / J.Chromatogr.B 845 (2007) 90-94“Validated, non-destructive and environmentally friendly determination of cocaine in euro bank notes”, Francesc A. et al, /Journal of Chromatography A, 1065 (2005) 321–325“Bioanalysis of drugs by liquid-phase microextraction coupled to separation techniques”, Stig Pedersen-Bjergaard∗, Knut Einar Rasmussen, /Journal of Chromatography B, 817 (2005) 3–12“Simple microbore high-performance liquid chromatographic method for the determination of dopamine and cocaine from a single in vivo brain microdialysis sample”,Loren H, /Journal of Chromatography B, 709 (1998) 35–45“Molecularly imprinted solid-phase extraction of cocaine metabolites from aqueous samples”, A. Zurutuza, /Analytica Chimica Acta 542 (2005) 14–19“Review: Pharmacokinetics of illicit drugs in oral fluid”, Olaf H. Drummer, /Forensic Science International 150 (2005) 133–142“Validation of a method to detect cocaine and its metabolites in nails by gas chromatography–mass Spectrometry”, Simone Valente-Campos, /Forensic Science International 159 (2006) 218–222
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