View
235
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
Animals modificats genèticament:ratolins transgènics i mutants
definició, obtenció i aplicacionsen biologia, biomedicina i biotecnologia
Lluís MontoliuCSICCentro Nacional de Biotecnología, Madrid
Octubre de 2006
1 de 36
Fenotip(aspecte)
Genotip(gen)
Genotip
Fenotip
Afegir unafunció
Transgènics
Suprimir unafunció
genoanul·lats / mutants
Genètica clàssica Genètica inversa
2 de 36
Fases inicials del desenvolupamentd’un embrió de mamífer (ratolí)
Oòcitsfecundats
Embrió2 cèl·lules
Embrió8 cèl·lules(mòrula)
Blastocist
TOTIPOTÈNCIA
PLURIPOTÈNCIA
3 de 36
Blastocists de ratolí (dia 3-4)
De la fase de preimplantacióa l’embrió en gestació
I.C.M. (ES cells)(Epiblast)Ectodermprimitiu
Trofectoderm(Trofoblasts)
Zonapel·lúcida
Blastocel Endoderm primitiu
Embrió de ratolí en gestació (dia 12)4 de 36
Obtenció de cèl·lules troncals embrionàries(cèl·lules mare pluripotents, ES cells)
I.C.M. (ES cells)(Epiblast)Ectodermprimitiu
5 de 36
Afegir una nova funció: Animals transgènics (Microinjecció)
6 de 36
Control de l’expressió del transgèn:
- En l’espai (promotor, regions reguladores)- En el temps (sistema induïble)
Un sistema induïble ha de garantir:
Capacitat de reacció i rang ampli de respostaNo- interacció amb els sistemes endògens
No- toxicitatReversibilitat
Proporcional a la dosi de l'efector(més dosi, més resposta)
Inducció ràpida
7 de 36
EFECTOR
Els transgens induïbles són binaris
LacZ pA
Promotor induïble
pA
+
TRANSACTIVADOR
INACTIU ACTIU
Promotor específic de cervell
Com es pot controlar l’expressió d’un transgèn?
Ratolins transgènics amb expressió induïble8 de 36
EFECTOR
TRE
TtAVP16
TRE
TtAVP16
TRE
rTtAVP16
TRE
rTtAVP16
-Dox +Dox
-Dox +Dox
TET-OFF
TET-ON
Gossen & Bujard 1992
Kistner et al., 1996
El sistema induïble mitjançant tetraciclina/doxiciclina
EFECTOR
TET-ON TET-OFF
9 de 36
Los EP pueden provocar expresión
ectópica osilenciamiento
+?
CH3 CH3 CH3CH3 CH3
CH3 CH3
EFECTES DE POSICIÓ
Expressió normal del transgèn
Problema: efectes de posició en animals transgènics, variabilitat
10 de 36
Domini d’expressió
INSULATOR
S/MAR
ENHANCER
SILENCER
REPRESSOR
L.C.R.
Expressió del transgèn
+
-
+
+/-
+/-
+++++ OK
EXPLICACIÓ DELS RESULTATS VARIABLES:No-inclusió de tots els elements reguladors propis del domini d’expressió
11 de 36
Com es millora l’expressió d’un transgèn?
Promotor minigen / cDNA poliA
SOLUCIÓ: Us de transgens genómics, amb fragments grans de DNA que garanteixin la inclusió de tots els elements
reguladors que són propis del domini d’expressió
12 de 36
Exemple: correcció de l’albinisme en ratolins transgènicsEl gen de la tirosinasa
Ratolí albí Ratolí salvatge (agouti )
TRANSGÈNESI
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
ptrTYR4(5 kb promoter)
ptrTYR5(280 bp promoter)minigens
YACs12345 YRT2 (250 kb)
13 de 36
Inactivació gènica en ratolins transgénicsTransgènics antisentit (antisense)
Transgènics amb RNA d’interferènciasiRNA/shRNA (small interfering RNA/short hairpin RNA)
gen A a l’inreves poliA
Transgènics antisenseRNA Pol IIpromotor
Gen A
Pot funcionarResultats imprevisiblesDesactivació no completa
Transgènics siRNA / shRNA
polyARNA Pol IIIpromotor
Molt específicsResultats previsiblesDesactivació variable
Gene A A
Ratolins genominvats (knock-down)
14 de 36
Generació de ratolins transgènics
Eficiència en la generació de ratolins transgènics:
100 óvuls fecundats microinjectats10-30 % poden implantar-se i gestar-se correctament
10-30 cries nascudes10-30 % de las cries són transgènics
1-9 ratolins transgènics
Eficiència global: 1-9 % (habitualment 2-5%)
15 de 36
Cèl·lules ESsobre fibroblastes
embrionaris de ratolí
Desactivació específica de gens mitjançant recombinació homòloga en cèl·lules ES
Generació de ratolins genoanul·lats / mutants (knock-out)
16 de 36
Obtenció de quimeras mitjançant la microinjecció de cèl·lules ES en blastocists
17 de 36
Obtenció de quimeras mitjançant l’agregació de mòrules i cèl·lules ES
Cèl·lules ES
Mòrula
Quimera
18 de 36
Estratègia general per lageneració d’un ratolí mutan-genoanul·lat (knock-out)
mitjançant recombinació homòloga en cèl·lules ES
gen A
x x Inicialment les cèl·lules ES són
sensibles a G418resistents a Ganciclovir
NeoRTKTargeting construct
gen A
gen ASTOP
RECOMBINACIÓ HOMÒLOGA Les cèl·lules ES són
resistents a G418resistents a Ganciclovir
genA A
INTEGRACIÓ A L’ATZAR Les cèl·lules ES són
resistents a G418sensibles a Ganciclovir
19 de36
Generació de ratolins genoanul·lats / mutants
Eficiència de recombinació homòloga en cèl·lules ES:
0-25 % clons de cèl·lules ES recombinants són positius (habitualment 2-10%)
80-90% mòrules agreguen amb cèl·lules ES40-60% blastocists inyectats/agregats amb cèl·lules ES arriben a terme
Contribució del genotip ES a la línia germinal
Quimeres amb > 50 % tendeixen a transmetreQuimeres < 50 % contribució tendeixen a no transmetre
SíNo20 de 36
Obtenció de ratolins mutants / genoanul·lats a partir de quimeres
X+
X
Primera generació F1
Segona generació F2
Quimera Salvatge
Heterozigot Heterozigot
Heterozigot SalvatgeMutant
Ratolí mutant (<= 25% de la F2)
21 de 36
gen A
gen A
gen A
gen A
gen A*
neo
neoEGFP
neoGen B
Al·lel originalGen A actiu
Al·lel genoanul·lat (knock-out) Gen A inactiu
Al·lel genomodificat (knock-in) Gen indicador sota el control de AGen A inactivat
Al·lel genomodificat (knock-in) Gen B sota el control de AGen A inactivat
Al·lel genomodificat (knock-in) Gen A “modificat” actiu
neo
*
ESTRATÈGIES DIFERENTS PER A LA GENERACIÓ D’ANIMALS MUTANTS
22 de 36
PROBLEMA: Com avaluem la funció d’aquests gens en individus adults?
PROBLEMA: Les mutacions poden ser letals
en gens que afectin el desenvolupament de l’organisme
FGF4FGF2R
XPD
Postimplantació
BRCA1Hoxa-10
Otx-2
Organogènesi
FibronectinaHNF-3βN-myc
Desenvolupament fetal
WT-1NF1
RXRα
Supervivència perinatal
CREBGR
GDNF
DE
SE
NV
OL
UP
AM
EN
T
Preimplantació
23 de 36
Solució: generar mutants condicionals
El sistema CRE-loxP
de recombinació específica de lloc
(bacteriòfag P1)
+
+
CRERecombinasa
específica
loxP loxP
loxP
escissió integració
24 de 36
El sistema CRE-loxP i la generació de ratolins KO mutants condicionals(específics de teixit)
RecombinacióHomòloga en cèl·lules ES
CRE
Microinjecció(transgénic)
CRE
CRE
X
CRE
RATOLÍ AMB LA MUTACIÓ PRESENT NOMÉS EN UN TEIXIT
Ratolí 1
Ratolí 2
Ratolí 1 Ratolí 2
25 de 36
gen A
gen Aneo
Al·lel originalGen A actiu
Al·lel “floxed”Gen A actiu
ESTRATÈGIES DIFERENTS PER LA GENERACIÓ D’ANIMALS MUTANTS CONDICIONALS
gen AAl·lel “floxed”Gen A actiu
gen AAl·lel genoanul·latGen A inactiu
gen A*Al·lel genomodificat "floxed”Gen A “modificat” actiu
*
+ CRE
+ CRE
+ CRE
Floxed = “Flanked by LoxP sites”
LoxP
26 de 36
Fusió de la proteïna CRE amb dominis d’unió a ligand (LBD)de receptors hormonals mutats.
CRE ER-LBD*
CRE GR-LBD*
CRE PR-LBD*
S’activa per 4-OH-tamoxiféNo s’activa per β-estradiol
S’activa per dexametasonaNo s’activa per cortisol
S’activa per RU486No s’activa per progesterona
Schewnk et al. (1998)
Brocard et al. (1998)
Kellendonk et al. (1996)
hsp90
CRE inactiva CRE activa
Fonament científic
Ligand
Control de la mutació en el temps i en l’espaiGeneració de ratolins amb mutacions
específiques de teixit en un moment determinat
27 de 36
Aplicacions dels animals transgènics / mutants (genoanul·lats)
Identificació de gens per complementació de mutacions
Mutagènesi per inserció
Anàlisi de la funció d’un gen al llarg del desenvolupament
Estudi d’unitats de transcripció complexes
Identificació de dominis d’expressió i reguladors llunyans
Diseny d’estratègies de teràpia gènica
Models animals de malalties humanes
Transgens induïbles, indicadors
Producció de proteïnes recombinants d’interès
Xenotransplantaments28 de 36
Aplicacions dels animals transgènics i mutants
Biologia coneixement
Biomedicina salut humana i animal
Biotecnologia producció
29 de 36
Number of Medline Citations Listed by General Phenotype in Transgenic or Knockout Mice
GrupDiabetesObesitatCàncerCàncer de pitAlèrgiaCardiovascularsAterosclerosiHipertensióDesenvolupament embrionàriFertilitatReproduccióOrganogènesiAnomalies craniofacials
MUTANTS131607444813924419181
2521107
130337763
TRANSGÈNICS57311726661981043472251924994
9971853156
Anna Anagnostopoulos (The Jackson Lab., 2000)
MODELS ANIMALS TRANSGÈNICS O MUTANTS EN L’ESTUDI DE MALALTIES HUMANES
30 de 36
Number of Medline CitationsListed by Behavioral Phenotype
TIPUS
AnsietatAprenentatgeEpilepsiaPorEstrésPsicosiAgresióDolorCapacitats motoresInstint maternalAlcoholismeMemòriaAlimentació
TRANSGÈNICS
221634717282
22631375
724331119
MUTANTS
421895324
23513764
23318
15119030
Anna Anagnostopoulos (The Jackson Lab., 2000)
… I TAMBÉ PER MALALTIES O DESORDRES DE TIPUS NERVIÓS O DE LA CONDUCTA
31 de 36
Animals transgènics en biotecnologia
Augment de producció (quantitat)
Augment de producció (qualitat)
Bioreactors
Xenotransplantaments
32 de 36
DollyIan Wilmut (1945- )
i la ovella Dolly (1996-2003)
TRANSFERÈNCIANUCLEAR EN
MAMÍFERS(1997)
33 de 36
ANIMALS “CLONATS” (2006)
34 de 36
Espècie animal Any del clonatge
Ovella 1997
Vaca 1998
Ratolí 1998
Cabra 1999
Porc 2000
Gat 2002
Conill 2002
Peix zebra 2002
Mula 2003
Caball 2003
Rata 2003
Gos 2005
Fura 2006
ÒVULENUCLEACIÓ
TRANSFERÈNCIANUCLEAR
BIÒPSIACÈL·LULA
SOMÀTICA
CULTIU IN VITRO
CÈL·LULES ESEN CULTIU
MODIFICACIÓGENÈTICA
DIFERENCIACIÓIN VITRO A UN
TIPUS CEL·LULAR NOU
TRANSPLANTAMENT
USO DE CÉLULAS MADRE (STEM CELLS)EN TERAPIA HUMANA
Reprogramacióin vivo
BLASTOCIST
TERÀPIA CEL·LULAR
35 de 36
http://www.cnb.csic.es/~transimp/
Pàgines web:Transgénesis en Mamíferos
Células troncales - embriones - clonación
transgenicos@cnb.uam.es
http://www.cnb.csic.es/~montoliu/
montoliu@cnb.csic.es
Lluís MontoliuCSICCentro Nacional de Biotecnología, Madrid
36 de 36
Recommended