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I
UNIVERSIDAD DE CANTABRIA
Facultad de Medicina
Dpto. de Biología Molecular
“ANÁLISIS DE LA CLONALIDAD DE LA RESPUESTA
INMUNITARIA EN LA PANCREATITIS AUTOINMUNE”
Tesis doctoral presentada por María Sánchez Castañón para optar al Grado de
Doctor por la Universidad de Cantabria.
Santander, Diciembre de 2010
II
III
Facultad de Medicina
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
D. MARCOS LÓPEZ HOYOS, Doctor en Medicina y Cirugía y Facultativo
Especialista de Área de Inmunología del Hospital Universitario Marqués de
Valdecilla
CERTIFICA QUE, el trabajo de investigación titulado “Análisis de la clonalidad
de la respuesta inmunitaria en la pancreatitis autoinmune” presentado por D.
MARÍA SÁNCHEZ CASTAÑÓN para optar al grado de Doctor en Biología, ha
sido realizado en el Departamento de Biología Molecular de la Universidad de
Cantabria y en el Servicio de Inmunología del Hospital Universitario Marqués
de Valdecilla bajo mi dirección.
Examinado el trabajo considero que está adecuadamente elaborado para su
lectura y defensa pública y ante la Comisión que ha de juzgar la Tesis Doctoral.
Y para que conste y surta los efectos oportunos, expido este certificado en
Santander a 1 de diciembre de 2010.
Hospital Universitario
Marqués de Valdecilla
IV
V
Jesús Merino Pérez, Catedrático de Inmunología de la Universidad
de Cantabria y Coordinador del grupo de investigación
“Inmunopatología”
EXPONE:
Que, desde abril de 2009, ha llevado a cabo las funciones de
TUTOR de la Licenciada en CC Biológicas y en Bioquímicas Maria
Sánchez Castañón durante el periodo de DOCTORADO en el
Programa Biología Molecular y Biomedicina. Durante este periodo
he desarrollado el proyecto de investigación titulado “Analisis de la
clonalidad de la respuesta inmunitaria en la pancreatitis
autoinmune” bajo la dirección científica del Dr Marcos López Hoyos,
Medico Adjunto de Inmunología del Hospital Universitario Marqués
de Valdecilla.
Lo que hace constar, a efectos de admisión de la Tesis Doctoral, en
Santander a 1 de diciembre de dos mil diez.
Fdo: Jesús Merino Pérez
VI
VII
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AA mmii hheerrmmaannoo llaa mmeejjoorr ppeerrssoonnaa qquuee ccoonnoozzccoo
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VIII
IX
QQuuee nnaaddiiee llee ddiiggaa lloo qquuee ttiieennee qquuee hhaacceerr aa aallgguuiieenn
qquuee yyaa hhaa ddeecciiddiiddoo ccuuááll ddeebbee sseerr ssuu ddeessttiinnoo
X
XI
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Marcos López Hoyos por confiar en mí desde el principio, por darme la
oportunidad de emprender este camino y por sus buenas ideas.
Al Dr. Gonzalo de las Heras del servicio de Digestivo por ser el primero en
preocuparse por unos pacientes con una enfermedad tan desconocida y
porque sin su inestimable ayuda y apoyo esta tesis no hubiera sido posible.
Al Dr. Andrés Insunza del servicio de Hematología porque ha sabido como
nadie trasmitirme sus conocimientos, que tanto me han servido en la
elaboración de esta tesis y que serán de gran utilidad en el futuro.
Al Dr. Javier Gómez Román y a Servando Lazuén del servicio de Anatomía
patológica por su colaboración en parte de este trabajo.
A todo el servicio de Inmunología que siempre ha estado ahí, en especial a
Carmen Gómez por su ayuda y apoyo en los malos momentos, a todos mis
compañeros de especialidad porque la unión hace la fuerza y a Carolina Santa
Cruz que siempre esta dispuesta a colaborar con su mejor sonrisa.
Al Dr. Francisco Leiva Cobian Jefe de Servicio y al Dr. Gonzalo Ocejo del
Servicio de Inmunología por los consejos que me dieron y no supe comprender.
A los Dr. Jesús y Ramón Merino por ayudarme y comprenderme en los
momentos difíciles y por aceptarme en su departamento como una más.
A los pacientes el verdadero motor de esta tesis, porque espero que toda
esta investigación les pueda ayudar en algo.
A mi hermano por sus excelentes diseños gráficos, como la portada de esta
tesis.
Por último, los más importantes en mi corazón, a toda mi familia y amigos
porque ellos nunca me fallarán.
XII
1
ÍNDICE
ÍÍÍÍÍÍÍÍNNNNNNNNDDDDDDDDIIIIIIIICCCCCCCCEEEEEEEE
2
3
ÍNDICE
ÍNDICE
Lista de tablas …………………………………………………………………….... 12
Lista de figuras ……………………………………………………………………... 15
Abreviaturas ……………………………………………………………………....... 20
1. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………... 24
1.1. Pancreatitis autoinmune. Antecedentes ……………………………….... 25
1.2. Definición y concepto ……………………………………………………… 26
1.3. Epidemiología ………………………………………………………………. 27
1.4. Patogénesis …...……………………………………………………………. 28
1.5. Pancreatitis autoinmune experimental en modelos animales ............... 34
1.6. Características clínicas ……………………………………………………. 37 1.7. Afectación extrapancreática en la ISD .................................................. 39
1.7.1. Afectación del tracto biliar ……………...………………………….. 39
1.7.2. Afectación hepática ..................................................................... 40
1.7.3. Afectación de la vesícula biliar ……………………………………. 41
1.7.4. Afectación del tracto gastrointestinal ……………………………... 42
1.7.5. Afectación del glándulas salivares y lacrimales ….……………… 42
1.7.6. Afectación renal .......................................................................... 44
1.7.7. Afectación del retroperitoneo y del mesenterio …………………. 45
1.7.8. Afectación del tiroides ................................................................. 46
1.7.9. Afectación de mamas ………………………………………………. 46
1.7.10. Afectación pulmonar ..…………………………………………….. 47
1.7.11. Afectación de la próstata …………………………………………. 48
4
ÍNDICE
1.7.12. Afectación de nódulos linfoides ………………………………….. 48
1.8. Histopatología ………………………………………………………………. 50
1.9. Estudios de imagen ………………………………………………………... 55
1.9.1. Ultrasonografía ……………………………………………………… 55
1.9.2. Tomografía computerizada (CT) ………………………………….. 55
1.9.3. Resonancia magnética (RM) y Colangio-pancreatografía por RM (CPRM) ................................................................................ 57
1.9.4. Colangio-pancreatografía retrógada endoscópica (CPRE) ……. 57
1.9.5. Ultrasonografía endoscópica (USE) ……………………………… 58
1.10. Marcadores serológicos …………………………………………………. 60
1.10.1. Niveles séricos elevados de inmunoglobulina G4 (IgG4) …….. 60
1.10.2 Autoanticuerpos ……………………………………………………. 65
1.10.2.1. Anticuerpos anti-anhidrasa carbónica (AC) .…………........ 66
1.10.2.1.a. Expresión de los isoenzimas de la CAen el páncreas 66
1.10.2.1.b. Papel fisiológico de los isoenzimas de la CA en el páncreas ..................................................................... 68
1.10.2.1.c. Las AC como dianas antigénicas en la PAI ………….. 69
1.10.2.1.d. Anticuerpos anti-AC II como marcadores serológicos en la PAI …………………………………………………. 72
1.10.2.2. Anticuerpos anti-lactoferrina (LF) …………………………… 73
1.10.2.3. Anticuerpos anti-amilasa α-2A (AMY α-2A) ……………….. 74
1.10.2.4. Anticuerpos anti-inhibidor de secreción de tripsina pancreática (PSTI) …………………………………………... 75
1.10.2.5. Anticuerpos anti-péptido de la proteína de unión al plaminógeno (PBP) …………………………………………… 77
1.10.2.6. Anticuerpos anti-tripsinógeno (PRSS) ……………………… 78
1.12. Diagnóstico de la PAI .......................................................................... 79
5
ÍNDICE
1.12.1. Criterios diagnósticos ................................................................ 79
1.12.1.1. Criterios diagnósticos Japoneses ……………………..……. 79
1.12.1.2. Criterios diagnósticos Coreanos ……………………………. 80
1.12.1.3. Criterios diagnósticos de Estados Unidos …………………. 81
1.12.1.4. Comparación de los tres criterios …………………………… 83
1.12.2. Diagnóstico de la PAI tipo 1 ……………………………………… 84
1.12.2.1. Estudios de imagen + serológía o histología compatibles .. 84
1.12.2.2. Diagnóstico histológico/inmunohistoquímico ………………. 84
1.12.2.3. Respuesta a esteroides ……………………………………… 85
1.12.3. Diagnóstico de la PAI tipo 2 ……………………………………… 85
1.13. Tratamiento ……………………………………………………………….. 86
1.14. Diagnóstico erróneo ……………………………………………………… 89
1.14.1. Diagnóstico erróneo de cáncer de páncreas como PAI ………. 89
1.14.2. Diagnóstico erróneo de dolor abdominal crónico como PAI …. 91
1.14.3. Diagnóstico erróneo de PAI como cáncer de páncreas ............ 92
1.15. Autoinmunidad y linfomagénesis ……………………………………….. 94
1.15.1. Enfermedades autoinmunes asociadas con riesgo de linfomas 95
1.15.1.1. Enfermedades asociadas con un riesgo significativo de linfomas ………………………………………………………... 95
1.15.1.2. Enfermedades asociadas probablemente con linfomas …. 96
1.15.2. Subtipos de linfomas asociados con enfermedades autoinmunes ……………………………………………………….. 97
1.15.3. Factores de riesgo ………………………………………………… 97
1.15.3.1. Factores de riesgo clínicos ………………………………….. 97
1.15.3.2. Factores de riesgo asociados con el tratamiento ………… 98
1.15.3.3. Factores de riesgo biológicos ……………………………….. 99
6
ÍNDICE
1.15.3.3.a. Selección antigénica …………………………………… 100
1.15.3.3.b. Papel de BAFF (BLyS) ………………………………… 100
1.15.4. Posibles modelos de autoinmunidad y linfomagénesis …….. 101
1.15.5. Linfomas en la enfermedad esclerosante asociada a IgG4 ... 104
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS …………………………………………………... 106
2.1. Hipótesis …………………………………………………………………… 107
2.2. Objetivos …………………………………………………………………... 108
2.2.1. Diagnóstico serológico diferencial de PAI ……………………… 108
2.2.2. Estudio de clonalidad en la PAI …………………………………. 108
2.2.3. Estudio del riesgo de cáncer en la PAI …………………………. 109
3. MATERIAL Y MÉTODOS …………………………………………………...... 110
3.1. Utilidad diagnóstica de los marcadores serológicos en la PAI ………. 111
3.1.1. Pacientes y diseño del estudio …………………………………... 111
3.1.2. Algoritmo diagnóstico de la PAI …………………………………. 113
3.1.3. Medición de los nivéles séricos de IgG y de IgG4 …………….. 114
3.1.4. Detección de los anticuerpos anti-AC II en suero ……………... 114
3.1.5. Detección de los anticuerpos anti-AMY α ………………………. 118
3.1.6. Análisis estadístico …………………………………………….….. 121
3.2. Utilidad diagnóstica de la IgG y la IgG4 en la PAI ……………………. 121
3.2.1. Pacientes y diseño del estudio …………………………………... 121
3.2.2. Medición de los nivéles séricos de IgG y de IgG4 ….…….…… 122
3.2.3. Análisis estadístico ……………………………………..…………. 122
7
ÍNDICE
3.3. Correlación entre la IgG4 y la afectación extrapancreática en la PAI 123
3.3.1. Pacientes y diseño del estudio …………………………………... 123
3.3.2. Medición de los nivéles séricos de IgG y de IgG4 …………….. 123
3.3.3. Análisis estadístico ……………………………………………….. 123
3.4. Caracterización clínica de los pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática …………………………………………… 124
3.5. Niveles séricos de CA 19.9 y utilidad diagnóstica de los anticuerpos anti-CA 19.9 ……………………………………………………………….. 125
3.5.1. Pacientes y diseño del estudio ……………………………………125
3.5.2. Detección de los anticuerpos anti-CA 19.9 en suero …………. 126
3.5.3. Análisis estadístico ................................................................... 128
3.6. Análisis de la presencia de anticuerpos anti-p53 ………………………129
3.6.1. Pacientes y diseño del estudio …………………………………... 129
3.6.2. Detección de los anticuerpos anti-p53 en suero ………………. 129
3.6.3. Análisis estadístico ………………………………………………... 131
3.7. Análisis de los niveles séricos de Interleucina-6 ……………………… 132
3.7.1. Pacientes y diseño del estudio …………………………………... 132
3.7.2. Cuantificación de los niveles séricos de IL-6 …………………... 132
3.7.3. Análisis estadístico ………………………………………………... 135
3.8. Estudio de las subpoblaciones linfocitarias en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática .............................. 135
3.8.1. Pacientes y diseño del estudio …………………………………... 135
3.8.2. Marcaje superficial por citometría de flujo ……………………… 136
3.8.3. Resultados …………………………………………………………. 139
3.8.4. Análisis estadístico ………………………………………………... 139 3.9. Análisis inmunofenotípico de las subpoblaciones de células B en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática 140
8
ÍNDICE
3.9.1. Pacientes y diseño del estudio …………………………………... 140
3.9.2. Aislamiento de PBMCs …………………………………………… 141
3.9.3. Marcaje superficial por citometría de flujo ……………………… 141
3.9.4. Marcaje intracelular por citometría de flujo …………………….. 142
3.9.5. Análisis inmunofenotípico ………………………………………… 143
3.9.5.1.Clasificación IgD/CD27 …………………………………….. 144
3.9.5.2.Clasificación CD38/IgD …………………………………….. 145
3.9.5.3.Anális de clonalidad de células plasmáticas .................... 146
3.9.6. Análisis estadístico ………………………………………………... 146
3.10. Estudio de cadenas ligeras libres y ratios Kappa/Lambda en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitiscrónica idiopática 148
3.10.1. Pacientes y diseño del estudio …………………………………. 148
3.10.2. Cuantificación de las cadenas ligeras libres en suero ……….. 149
3.10.3. Interpretación de los resultados ………………………………... 149
3.10.4. Análisis estadístico ………………………………………………. 150
3.11. Estudio de proteínas monoclonales en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática …………………...152
3.11.1. Pacientes y diseño del estudio …………………………………. 152
3.11.2. Detección de proteínas monoclonales ………………………… 152
3.11.3. Análisis estadístico ………………………………………………. 153
3.12. Analisis de clonalidad de células B en infiltrados linfoplasmocíticos en lesiones pancreáticas y extrapancreáticas en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática …………………... 153
3.12.1. Pacientes y diseño del estudio …………………………………. 153
3.12.2. Análisis de reordemientos clonales del gen IgH ……………....154
3.12.2.1.Fundamentos del ensayo ………………………………… 154
9
ÍNDICE
3.12.2.2. Pasos previos …………………………………………….. 155
3.12.2.2.a. Extracción del DNA de tejidos embebidos en parafina ………………………………………………. 155
3.12.2.2.b. Cuantificación del DNA .......................................... 155
3.12.2.3. Protocolo de ensayo ……………………………………... 156
3.12.2.3.a. Reacción de amplificación …………………………. 156
3.12.2.3.b. Amplificación ………………………………………… 156
3.12.2.3.c. Análisis de los productos amplificados mediante electroforesis en gel ………………………………… 157
3.12.2.4. Interpretación de los resultados …………………………… 157
3.12.2.4.a. Control interno de amplificación (CI) ………………... 157
3.12.2.4.b. Reordenamientos de Fragmentos IgH………………. 158
3.12.2.4.b.1. Controles positivos y negativos de amplificación 158
3.12.2.4.b.2. Análisis de la muestra problema ………………… 159
3.13. Analisis mutacional de K-ras en páncreas y lesiones de pacientes con PAI, sospecha de PAI ypancreatitis crónica idiopática …….... 160
3.13.1. Pacientes y diseño del estudio …………………………………. 160
3.13.2. Análisisis mutacional de K-Ras ………………………………... 162
3.13.2.1. Fundamentos del ensayo .............................................. 162
3.13.2.1.a. Tecnología ARMS …………………………………... 163
3.13.2.1.b. Tecnología Scorpions ………………………………. 163
3.13.2.1.c. Análisis de los datos: método ∆Ct ………………... 163
3.13.2.2. Protocolo de ensayo ……………………………………... 164
3.12.2.2.a. Configuración experimental del sistema ABI7500 164
3.12.2.2.b. Configuración del equipo ABI7500 ………………... 166
3.12.2.2.c. Análisis de las muestras en el sistema ABI 7500 .. 166
10
ÍNDICE
3.13.2.3. Interpretación de los resultados del sistema ABI7500 .. 167
3.12.2.3.a. Valores de Ct de control ……………………………. 167
3.12.2.3.b. Valores de ∆Ct de la mezcla estándar …………… 168
3.12.2.3.c. Valores de ∆Ct de la muestra ………………………168
4. RESULTADOS ………………………………………………………………….170
4.1. Utilidad diagnóstica de los marcadores serológicos en la PAI ……….171
4.1.1. Prevalencia de los marcadores serológicos ………………….... 171
4.1.2. Valor diagnóstico de los niveles elevados de IgG4,los Abs anti-CA II, y los Abs anti-AMY α ………………………………… 175
4.1.3. Valor diagnóstico de la combinación de los marcadores serológicos ………………………………………………………… 177
4.2. Utilidad diagnóstica de la IgG y la IgG4 en la PAI ……………………. 179
4.3. Correlación entre la IgG4 y la afectación extrapancreática en la PAI 186
4.3.1. Diferencias entre PAI con IgG4 > 190 mg/dl e IgG4 < 190 mg/dl ........................................................................................ 187
4.3.2. Diferencias entre sospecha PAI con IgG4 >190 mg/dl e IgG4 <190 mg/dl ............................................................................... 189
4.3.3. Diferencias entre PCI con IgG4 >190 mg/dle IgG4 <190 mg/dl 190
4.3.4. Diferencias globales entre PAI,Sospecha PAI y PCI con IgG4 > 190mg/dl e IgG4 < 190 mg/dl …………………………………. 191
4.4. Caracterización clínica de los pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática ………………………………………….. 192
4.5. Niveles séricos de CA 19.9 y utilidad diagnóstica de los anticuerpos anti-CA 19.9 …………………………………………………………….... 196
4.6. Análisis de la presencia de anticuerpos anti-P53 …………………….. 201
4.7. Análisis de los niveles séricos de Interleucina-6 ……………………… 203
4.8. Estudio de las subpoblaciones linfocitarias en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática ……………………. 204
11
ÍNDICE
4.9. Análisis inmunofenotípico de las subpoblaciones de células B en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática 209
4.10. Estudio de cadenas ligeras libres y de los ratios Kappa/Lambda en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática …………………………………………………………………. 222
4.10.1. Oscilaciones de los niveles de sFLC y de los ratios k/λ en pacientes con sospecha de PAI y PCI ………………………... 226
4.10.2. Influencia del tratamiento esteroideo en los niveles de sFLC y los ratios k/λ en pacientes con PAI ………………………… 227
4.10.3. Alteraciones al diagnóstico en los niveles de sFLCy de los ratios k/λ ………………………………………………………….. 228
4.10.4. Alteraciones en el tiempo de los niveles de sFLC y de los ratios k/λ ………………………………………………………….. 230
4.10.5. Cambios en los niveles desFLC y ratios k/λ en función de la ausencia/presencia de afectación extrapancreática ………… 232
4.10.6. Correlación entre los niveles de IgG4 y los de sFLC o los ratios k/λ ………………………………………………………….. 232
4.10.7. Monitorización de los niveles de sFLC y de los ratios k/λ en pacientes con PAI ………………………………………………. 233
4.11. Análisis de inmunoglobulinas monoclonales en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………………………………………………… 238
4.12. Analisis de clonalidad de células B en infiltrados infoplasmocíticos en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática ………………………………………………………………… 239
4.13. Analisis mutacional de K-ras en páncreas y lesiones extrapancreáticas de pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática …………………………………………. 241
5. DISCUSIÓN ……………………………………………………………………. 245
5.1. Utilidad diagnóstica de los marcadores serológicos en la PAI ……… 249
5.2. Utilidad de la IgG y la IgG4 en el diagnóstico de la PAI ……………... 254
5.3. Niveles séricos de IgG4 y afectación extrapancreática ……………... 255
12
ÍNDICE
5.4. Características clínicas de los pacientes ………………………………. 258
5.5. Niveles de CA 19.9 y anticuerpos anti-CA 19.9 en la PAI ………….. 261
5.6. Subpoblaciones linfocitarias en la PAI …………………………………. 264
5.7. Subpoblaciones de células B en la PAI ………………………………... 265
5.8. Anticuerpos anti-P53 en la PAI ………………………………………… 271
5.9. Niveles de IL-6 en la PAI ………………………………………………… 274
5.10. Cadenas ligeras libres en la PAI ………………………………………. 275
5.11. Inmunoglobulinas monoclonales circulantes en la PAI ……………... 280
5.12. Clonalidad de células B en infiltrados linfoplasmocíticos en la PAI .. 281
5.13. Analisis mutacional de K-ras en lo órganos afectados en la PAI ….. 283
5.14. Analisis global del riesgo de malignidad en la PAI ………………….. 286
6. CONCLUSIONES ..……………………………………………………………. 292
7. BIBLIOGRAFÍA ………………………………………………………………… 298
13
LISTA DE TABLAS
LISTA DE TABLAS
TABLA 1. Características de autoinmunidad encontradas en la PAI ………... 29
TABLA 2. Características clínicas de la pancreatitis autoinmune ................... 39
TABLA 3. Órganos afectados en la enfermedad esclerosante asociada a IgG4 …………………………………………………………………….. 49
TABLA 4. Datos demográficos, perfil clínico, tratamiento y seguimiento de PAI tipo 1 y 2 …………………………………………………………… 54
TABLA 5. Detalles de los 7 estudios sobre la utilidad de la IgG4 en el diagnóstico de la PAI ………………………………………………….. 64
TABLA 6. Detalles de los 7 estudios sobre la utilidad de la IgG4 en el diagnóstico de la PAI ...................................................................... 65
TABLA 7. Criterios diagnósticos para la PAI (2006) en Japón ……………….. 80
TABLA 8. Criterios diagnósticos para la PAI (2006) en Corea ....................... 81
TABLA 9. Criterios diagnósticos para la PAI ( Criterios HISORT, Clínica Mayo) .............................................................................................. 82
TABLA 10. Pautas cínicas que ayudan a evitar el diagnóstico erróneo de la PAI ……………………………………………………………………... 93
TABLA 11. Características generales de los pacientes incluidosen el estudio 112
TABLA 12. Características generales de los pacientes incluidosen el estudio 122
TABLA 13.Características generales de los pacientes incluidosen el estudio 123
TABLA 14.Características generales de los pacientes incluidos en el estudio 125
TABLA 15.Características generales de los pacientes incluidos en el estudio 125
TABLA 16.Características generales de los pacientes incluidosen el estudio 129
TABLA 17.Características generales de los pacientes incluidosen el estudio 132
TABLA 18.Características generales de los pacientes incluidosen el estudio 135
TABLA 19.Características generales de los pacientes incluidosen el estudio 143
TABLA 20. Panel para el marcaje de células B ............................................. 143
TABLA 21. Perfil inmunofenotípico de las subpoblaciones de células B …… 144
14
LISTA DE TABLAS
TABLA 22.Características generales de los pacientes incluidosen el estudio 148
TABLA 23.Características generales de los pacientes incluidosen el estudio 152
TABLA 24.Características generales de los pacientes incluidosen el estudio 153
TABLA 25. Muestras analizadas en los pacientes incluidos en el estudio …. 154
TABLA 26. Rango de tamaños esperado de los fragmentos amplificados .... 158
TABLA 27.Características generales de los pacientes incluidos en el estudio 161
TABLA 28. Muestras analizadas en los pacientes incluidos en el estudio …. 161
TABLA 29. Mutaciones en el gen K-ras detectadas mediante el kit de DxS 162
TABLA 30. Volúmenes de “Master mix” ......................................................... 15
TABLA 31. Disposición de la placa de K-ras en el sistema ABI7500 ………. 166
TABLA 32. Ciclos en el sistema ABI 7500 ..................................................... 166
TABLA 33. Valores de ∆Ct de la mezcla estándar y puntos de corte del 1% en el sistema ABI7500Ciclos en el sistema ABI 7500 …………... 169
TABLA 34. Niveles séricos de IgG y de IgG4 en los sujetos de estudio ….... 172
TABLA 35. Marcadores serológicos de PAI en los grupos incluidos en el estudio .........................................................................................173
TABLA 36. Niveles séricos de IgG y de IgG4 en los sujetos de estudio ....... 180
TABLA 37. Diferencias en los niveles aumentados de IgG entre la PAI y el resto de grupos incluidos en el estudio ........................................ 181
TABLA 38. Diferencias en los niveles aumentados de IgG4 entre la PAI y el resto de grupos incluidos en el estudio ………………………….... 182 TABLA 39. Diferencias en los niveles aumentados de IgG entre la sospecha de PAI o y los grupos control incluidos en el estudio ................... 183
TABLA 40. Diferencias en los niveles aumentados de IgG4 entre la sospecha de PAI o PCI y los grupos control incluidos en el estudio ……………………………………………………………….. 184
TABLA 41. Diferencias demográficas, clínicas y en el grado de AEP entre los pacientes con PAI con IgG4 > 190 mg/dl y PAI con IgG4 < 190 mg/dl …………………………………………………………... 188
15
LISTA DE TABLAS
TABLA 42. Diferencias demográficas, clínicas y en el grado deAEP entre los pacientes con S.PAI con IgG4 > 190 mg/dl y S.PAI con IgG4 < 190 mg/dl ………………………………………………………….. 189
TABLA 43. Diferencias demográficas, clínicas y en el grado deAEP entre los pacientes con PCI con IgG4 > 190 mg/dl y PCI con IgG4 < 190 mg/dl …………………………………………………………... 190
TABLA 44. Diferencias demográficas, clínicas y en el grado deAEP entre los pacientes con PAI, S.PAI y PCI con IgG4 > 190 mg/dl y con IgG4 < 190 mg/dl ………………………………………………. 192
TABLA 45. Diferencias en la frecuencia de Abs anti-CA 19.9+ entre la PAI y el resto de grupos incluidos en el estudio ................................ 197
TABLA 46. Diferencias en la frecuencia de Abs anti-CA 19.9+ entre la sospecha de PAI o la PCI y los grupos control incluidos en el estudio ………………………………………………………………... 198
TABLA 47. Diferencias en la frecuencia de Abs anti-p53+ entre la PAI y el resto de grupos incluidos en el estudio ….................................. 202
TABLA 48. Diferencias en la frecuencia de anticuerpos anti-p53+ entre la sospecha de AI o la PCI y los grupos control incluidosen el estudio ……………………………………………………………….. 203
TABLA 49. Frecuencias absolutas de las subpoblaciones linfocitarias en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………………………205
TABLA 50. Porcentaje de las subpoblaciones linfocitarias en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ……………………………………….. 206
TABLA 51. Frecuencias absolutas de las subpoblaciones de linfocitos B en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ................................ 213
TABLA 52. Frecuencias relativas de las subpoblaciones de linfocitos B en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………………………. 216
TABLA 53. Analisis de reordenamientos clonales del gen IgH ...................... 240
TABLA 54. Analisis mutacional de K-ras ………………………………………. 243
TABLA 55. Riesgo de malignidad en la PAI .................................................. 287
TABLA 56. Riesgo de malignidad en pacientes con sospecha de PAI .......... 288
TABLA 57. Riesgo de malignidad en la PCI ................................................. 289
16
17
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Ilustración esquemática mostrando la relación entre distintas enfermedades esclerosantes asociadas a IgG4 .......................... 27
FIGURA 2. Modelo propuesto de la patogénesis de la PAI ………………….. 34
FIGURA 3. Histopatología de la pancreatitis autoinmune .............................. 51
FIGURA 4. Patrón histológico de la pancreatitis autoinmune ......................... 53
FIGURA 5. PAI forma difusa ........................................................................... 56
FIGURA 6. CT de un paciente con PAI no tratada ......................................... 56
FIGURA 7. CPRE mostrando estenosis del conducto biliar común distal ...... 58
FIGURA 8. USE .............................................................................................. 60
FIGURA 9. Estructura molecular y localización subcelular de las isoenzimas de la anhidrasa carbónica (CA) ……………………………………. 67
FIGURA 10. Papel fisiológico de la anhidrasa carbónica (CA) II ..................... 69
FIGURA 11. Algoritmo para el tratamiento de la PAI …………………………... 88
FIGURA 12. Puntos de control del crecimiento de linfocitos ………………… 102
FIGURA 13. Factores inmunológicos implicados en el desarrollo de autoinmunidad y linfomas ……….............................................. 104
FIGURA 14. Plantilla IL-6 ………………………………………………………... 134
FIGURA 15. Identificación de los linfocitos en un dot plot CD45 vs SSC …. 138
FIGURA 16. Bead de recuento absoluto Trucount …………………………… 138
FIGURA 17. Identificación de linfocitos T citotóxicos (CD3+CD8+) y colaboradores (CD3+CD4+) en un dot plot CD4 vs CD8 ……… 138 FIGURA 18. Bead de recuento absoluto Trucount …………………………… 139
FIGURA 19. Identificación de linfocitos B (CD19+) y linfocitos NK (CD3–CD16+ o CD56+ o ambos) en una imagen de dot plot CD16 + CD56 vs CD19 …………………………………………… 139 FIGURA 20. Distribución de células B en sangre en función de la expresión en superficie de IgD y CD27 …………………………………….. 145
18
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 21. Distribución de células B CD19+ CD27- en sangre en función de la expresión en superficie de CD38 …………………………. 145
FIGURA 22. Análisis de clonalidad de células plasmáticas (CD19+ CD38++) en función del cociente kappa/lambda ………………………….. 146
FIGURA 23. Ejemplo de análisis de resultados en gel de agarosa 4% ……...160
FIGURA 24. Mediana de los nivéles séricos de IgG y de IgG4 en pacientes con PAI, PAI con cáncer de páncreas y cáncer de páncreas ... 174
FIGURA 25. Comparación de los marcadores serológicos entre pacientes con PAI, PAI con cancer de páncreas y cáncer de páncreas .. 175
FIGURA 26. Valor diagnóstico de los marcadores serológicos en la PAI ….. 176
FIGURA 27. Valor diagnóstico de los marcadores serológicos en la PAI, excluyendo la PCI como grupo control ………………………… 177
FIGURA 28. Valor diagnóstico de la combinación de los marcadores serológicos en la PAI ……………………………………………... 178
FIGURA 29. Valor diagnóstico de la combinación de los marcadores serológicos en la PAI, excluyendo la PCI como grupo control 179
FIGURA 30. Frecuencia de niveles aumentados de IgG y de IgG4 en los grupos de pacientes incluidos en el estudio ..................... 188
FIGURA 31. Curvas ROC de los niveles séricos de IgG y de IgG4 para el diagnóstico de la PAI ……………………………………………… 185
FIGURA 32. Curvas ROC de los niveles séricos de IgG y de IgG4 para diferenciar entre PAI con y sin afectación extrapancreática….. 187
FIGURA 33. Frecuencia de los síntomas de presentación el los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ............................................... 193
FIGURA 34. Frecuencia de la presencia de Diabetes Mellitus tipo 2 en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI .............................. 193
FIGURA 35. Frecuencia de la presencia de afectación extrapancreática en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………………… 194
FIGURA 36. Frecuencia del número de órganos afectados en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ……………………………….. 195
FIGURA 37. Frecuencia de órganos afectados en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………………………………………….. 195
19
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 38. Frecuencia de anticuerpos anti-CA 19.9 positivos en los diferentes grupos de sujetos incluidos en el estudio ………….. 196
FIGURA 39. Valor diagnóstico de los anticuerpos anti-CA 19.9+ en la PAI .. 198
FIGURA 40. Niveles de CA 19.9 ………………………………………………... 200
FIGURA 41. Relación entre la concentración elevada de CA 19.9 y la presencia de anticuerpos anti-CA 19.9 ………………………… 200
FIGURA 42. Frecuencia de anticuerpos anti-p53 positivos en los diferentes grupos de pacientes incluidos en el estudio ............................. 201 FIGURA 43. Niveles de IL-6 (pg/ml) ………………………………………….. 204
FIGURA 44. Cociente LT CD4+/LT CD8+ en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI …………………………………………………….. 207
FIGURA 45. Frecuencia de linfocitopenia B (% Linfocitos B < 6%) y de incremento de células NK (% NK >26%) en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI …………………………………………. 208
FIGURA 46. Distribución de las subpoblaciones de células B en función de la expresión en superficie de CD19 y CD27 .............. 209
FIGURA 47. Distribución de las subpoblaciones de células B en función de la expresión en superficie de CD38 y de CD24 …….. 210
FIGURA 48. Distribución de las subpoblaciones de células B en función de la expresión en superficie de CD38 y de IgD …………… 210
FIGURA 49. Distribución de las subpoblaciones de células B en función de la expresión en superficie de IgD y de CD27 ....................... 210
FIGURA 50. Distribución de las células plasmáticas (CD19+ CD38++) en función de la expresión en superficie de CD138 ................. 211
FIGURA 51.Análisis de clonalidad de células plasmáticas (CD19+ CD38++) 211
FIGURA 52. Frecuencia del ratio k/λ en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI …………………………………………………………….... 217
FIGURA 53. Frecuencia del aumento de células B transicionales y del descenso de células B pre-naive en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI …………………………………………. 219
FIGURA 54. Frecuencia del descenso de células B naive en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ...…………………………………. 219
20
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 55. Frecuencia del aumento de células B memoria totales y memoria dobles negativas en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………………………………………………………….. 220
FIGURA 56. Frecuencia del aumento de células plasmáticas totales, plasmáticas 138- y plasmáticas 138+ en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………………………………………….. 220
FIGURA 57. Frecuencia del ratio Kappa/Lambda normal y disminuido de las células plasmáticas en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI …………………………………………………………… 221
FIGURA 58. Niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda (mg/L) y del cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda en muestras de suero al diagnóstico ……………………………….. 223
FIGURA 59. Niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda (mg/L) y del cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda en las últimas muestras de suero disponibles de cada paciente ……. 225
FIGURA 60. Niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda (mg/L) y del cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda en las muestras de suero post-tratamiento en pacientes con PAI …... 226
FIGURA 61. Niveles séricos de cadenas ligeras libres kappa y lambda (Log de la concentración (mg/L)) en muestras al diagnóstico en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI …………………….. 229
FIGURA 62. Frecuencia del aumento de cadenas ligeras libres kappa (>19,4mg/L) y lambda (> 26,3 mg/L) y de la alteración del ratio k/λ (< 0,26 o > 1,65) al diagnóstico en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………………………………………… 229
FIGURA 63. Niveles séricos de cadenas ligeras libres kappa y lambda (Log de la concentración (mg/L)) en las últimas muestras de suero extraídas en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI …….. 231
FIGURA 64. Frecuencia del aumento de cadenas ligeras libres kappa (> 19,4mg/L) y lambda (> 26,3 mg/L) y de la alteración del ratio k/λ (< 0,26 o > 1,65) en las últimas muestras de suero extraídas pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI ………. 231
FIGURA 65.Monitorización de los niveles séricos de cadenas ligeras libres Kappa, Lambda y del ratio k/λ sFLC en los pacientes con PAI 238
FIGURA 66. Ejemplo gráfico de un paciente con análisis mutacional de K-ras negativo ........................................................................... 241
21
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 67. Ejemplo gráfico de un paciente con análisis mutacional de K-ras positivo ……………………………………………………… 241
FIGURA 68. Principales alteraciones en la distribución en sangre de las subpoblaciones de células B en la PAI ………………………... 266
FIGURA 69.Posible modelo de desarrollo de malignidad en la PAI ……….. 290
22
23
ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
Ab: Absorbancia
AcMo: Anticuerpo monoclonal AC: Anhidrasa carbónica
AC II: Anhidrasa carbónica tipo II
Ag: Antígeno
APC: Aloficocianina
APCs: Células presentadoras de antígenos AMY α-2A: Amilasa α-2A
ANA: Anticuerpos anti-nucleares
AR: Artritis reumatoide
ASMA: Anticuerpos anti-músculo liso
BAFF: Factor activante de células B
BLyS: Factor estimulador de linfocitos B
BSA: Albúmina sérica bobina
C+: Control positivo
CEP: Colangitis esclerosante primaria
CEUS: Ultrasonografía aumentada por contraste
CMF: Citometría de flujo
CO: Cut off
CPRE: Colangio-pancreatografía retrógrada endoscópica
CPRM: Colangio- pancreatografía por resonancia magnética
CT: Tomografía computerizada
DE: Desviación estándar
24
ABREVIATURAS
DM: Diabetes mellitus
DM-1: Diabetes mellitus tipo 1
DMARDs: Drogas aintirreumáticas modificadoras de la enfermedad
EAI: Enfermedades autoinmunes
FITC: Feniliosotiocianato de fluoresceina
FN: Falsos negativos
FP: Falsos positivos
HPF: Campo de alta resolución
IAC: Colangitis asociada a IgG4
IBD: Enfermedad inflamatoria intestinal
IDCP: Pancreatitis idopática ductulo-céntrica
IFE: Electroforesis por inmunofijación
IL-6: Interleucina-6
ISD: Enfermedad esclerosante asociada a IgG4
LF: Lactoferrina
LES: Lupus eritematoso sistémico
LH: Linfomas Hodgking
LNH: Linfomas no Hodgking
LPSP: Pancreatitis esclerosante linfoplasmocitaria
LR: Límite de referencia
LT CD4+: Linfocitos T colaboradores
LT CD8+: Linfocitos T citotóxicos
MALT: Tejido linfoide asociado a las mucosas
MESA: Sialadenitis mioepitelial
25
ABREVIATURAS
MTX: Metotrexato
Nk: Natural killer
OR: Odd ratio
PAI: Pancreatitis autoinmune
PE: Ficoeritrina PerCP: Proteína peridin-clorofila PBMCs: Células mononucleares de sangre periférica PBP: Proteína de unión al plasminógeno
PBS: Tampón fosfato salino
PC: Pancreatitis crónica
PCI: Pancreatitis crónica idiopática
PRSS: Tripsinógeno
PSTI: Inhibidor de la secreción pancreática de tripsina
Ratio k/ λ sFLC: Cociente entre cadenas ligeras libres k y λ
RI: Respuesta inmunitaria
RM: Resonancia magnética
RT: Temperatura ambiente
sFLC: Cadenas ligeras libres en suero
sFLC K: Cadenas ligeras libres Kappa
sFLC λ: Cadenas ligeras libres Lambda
SPE: Electroforesis de proteínas séricas
SS: Síndrome de Sjögren
Tregs: T reguladoras
USE: Ultrasonografía endoscópica
26
ABREVIATURAS
USE-PAAF: Punción aspirativa con aguja fina guiada por USE
URB3: Ubiquitina-proteína ligasa E3
VN: Verdaderos negativos
VP: Verdaderos positivos
VPP: Valor predictivo positivo
VPN: Valor predictivo negativo
27
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
11111111........ IIIIIIIINNNNNNNNTTTTTTTTRRRRRRRROOOOOOOODDDDDDDDUUUUUUUUCCCCCCCCCCCCCCCCIIIIIIIIÓÓÓÓÓÓÓÓNNNNNNNN
28
29
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Pancreatitis autoinmune. Antecedentes
La pancreatitis crónica es una enfermedad caracterizada por inflamación
crónica y fibrosis del páncreas, que conduce a cambios irreversibles en la
estructura y función pancreática [1]. El alcohol es la principal causa de
pancreatitis crónica, aunque factores metabólicos, genéticos y estructurales se
han asociado también con la enfermedad.
En 1961, Sarles et al [2, 3] describieron por primera vez un cuadro de
pancreatitis crónica asociado con marcada inflamación, infiltración linfocítica e
hipergammaglobulinemia no asociado con el consumo de alcohol, sugiriendo
la implicación de fenómenos autoinmunes en la patogénesis de la enfermedad.
A partir de ese momento se han descrito casos de pancreatitis asociados con
enfermedades autoinmunes.
La pancreatitis autoinmune (PAI) fue denominada por primera vez como
pancreatitis inflamatoria primaria, y clasificada en la reunión de Marsella-Roma
de 1988 como pancreatitis crónica inflamatoria [4]. Además la enfermedad ha
sido designada con otros nombres, como pancreatitis esclerosante
linfoplasmocitaria, pancreatitis crónica ductodestructiva no alcohólica y
pseudotumor inflamatorio. En la última década han surgido numerosas
evidencias de una existencia de una base autoinmune para ciertas formas de
pancreatitis crónica, y Yoshida et al [5] proponen el término de PAI en 1995.
Desde entonces, se han descrito múltiples casos, y la PAI se ha convertido en
una entidad reconocida mundialmente.
30
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
En el 2008, a partir del examen histológico e inmunohistoquímico de varios
órganos de pacientes con PAI, Kamisawa et al [6] proponen una nueva entidad
clinicopatológica, la enfermad esclerosante asociada a IgG4.
1.2. Definición y concepto
La PAI fue definida originalmente como un tipo de pancreatitis crónica
causada por un proceso inflamatorio autoinmune, caracterizado por la
presencia de un infiltrado linfocítico asociado con fibrosis del páncreas que
conduce a disfunción orgánica [7].
En el 2008, Kamisawa et al, proponen el concepto de enfermedad
esclerosante asociada a IgG4 (ISD). Se trata de una enfermedad sistémica
caracterizada por la existencia de una densa infiltración de células plasmáticas
IgG4+ y linfocitos T en varios órganos [6]. Las manifestaciones clínicas
aparecen en páncreas, conductos biliares, vesícula biliar, glándulas salivares,
retroperitoneo, riñones, pulmones, próstata, etc; donde se induce
patológicamente flebitis obliterativa y fibrosis tisular [6]. Esta entidad incluye
numerosas enfermedades como la PAI, colangitis esclerosante, colecistitis,
sialadenitis, fibrosis retroperitoneal, nefritis tubulointersticial, neumonía
intersticial, prostatitis, pseudotumor inflamatorio y linfadenopatía, todas ellas
asociadas a IgG4 [7]. De acuerdo con este nuevo concepto, la PAI podría
definirse en el momento actual, como la manifestación pancreática de esta
enfermedad fibroinflamatoria sistémica (Figura 1).
31
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
Figura 1 . Ilustración esquemática mostrando la relación entre distintas erfermedades esclerosantes asociadas a IgG4. World J Gastroenterol 2008;14:3948-55.
1.3. Epidemiología
Aunque el número de casos de PAI esta incrementando a lo largo del mundo,
hasta el momento actual no se ha determinado con exactitud la verdadera
incidencia y prevalencia de la enfermedad.
En el 2002 Nishimori et al [8] estimaron que la prevalencia de la PAI en
Japón era de 0,82 por 100000 habitantes. Otras series japonesas han descrito
una prevalencia entre un 5% y un 6% de todos los pacientes con pancreatitis
crónica [9, 10].
En Estados Unidos se desconoce la prevalencia de la enfermedad. Como la
PAI a menudo mimetiza el cáncer de páncreas, la mejor estimación se ha
hecho en pacientes sometidos a resección pancreática por sospecha de
cáncer de páncreas. En tres estudios recientes, 43 de 1808 (2,4%) resecciones
pancreáticas fueron reportadas como PAI, tras el examen histológico de la
muestra extirpada [11-13]. En otra evaluación retrospectiva realizada en la
32
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
Clínica Mayo, se diagnosticaron 27 casos de PAI de 245 (11%) muestras
patológicas de pacientes sometidos a resección por enfermedad pancreática
benigna [14].
En Europa los análisis son escasos, pero en un estudio multicéntrico italiano
coordinado por la universidad de Verona se diagnosticaron 23 (6%) casos de
PAI de 383 pacientes con pancreatitis crónica [15].
La PAI se presenta más frecuentemente en personas mayores entre los 60-
70 años. [16, 17]. La media de edad al diagnóstico es de 55 años [8], sin
embargo la enfermad se puede presentarse en un amplio rango, ya que se han
descrito casos de PAI en pacientes de tan sólo 10 años de edad [18].
Los varones son aproximadamente el doble de propensos a desarrollar PAI
que las mujeres [8]. En tres series quirúrgicas se ha reportado un ratio hombre:
mujer de 1,7:1-2:1 [11, 14, 19].
En aproximadamente un 20-40% de los pacientes, la PAI se asocia con
otras enfermedades autoinmunes, como el síndrome de Sjögren (SS), artritis
reumatoide (AR), colangitis esclerosante primaria, fibrosis retroperitoneal,
enfermedad de Crohn, cirrosis biliar primaria, hepatitis autoinmune, lupus
eritematoso sistémico (LES) y úlcera péptica [20-26].
1.4. Patogénesis
Aunque se desconoce la patogénesis precisa de la PAI, numerosas
evidencias apoyan la hipótesis de una causa autoinmune (Tabla 1).
Al igual que otras enfermedades autoinmunes, la PAI se asocia con ciertos
haplotipos HLA. En la población japonesa se ha descrito una asociación con el
haplotipo DRB1*0405-DQB1*0401 de clase II [27], y con la región ABCF1
33
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
TABLA 1 . Características de autoinmunidad encontradas en la PAI
Características Características
vistas en la PAI
Comentarios
RI frente a autoantigenos Probablemente Posibles autoantígenos: CAII, LF, PSTI
Predisposición femenina No Predominio masculino
Asociación HLA Probablemente HLA DRB1*0405-DQB1*0401 en la población japonesa
Inducción por sensibilización con autoantígenos
Probablemente
En ratones timectomizados inmunizados con CA-II y LF. Células Th1 implicadas en el desarrollo temprano de PAI murina
Respuesta a terapia inmunosupresora
Sí
Producción de la enfermedad por transferencia adoptiva de células autorreactivas y/o autoanticuerpos
Probablemente La transferencia adoptiva de células T CD4+ específicas de amilasa desencadena pancreatitis
Modelos animales espontáneos con idéntica especificidad antigénica
Probablemente Hay modelos animales espontáneos de PAI, pero no se ha identificado el autoantígeno
Afectación de niños y adultos
No
Distribución de autoantígenos asociada con la distribución de la enfermedad
Sí CA-II y LF están distribuidas en células de varios órganos exocrinos, incluyendo páncreas, glándulas salivares, conducto biliar y túbulos renales distales. La distribución de la enfermedad está altamente restringida
RI: Respuesta inmunitaria. PAI: Pancreatitis autoimmune. CA-II: Anhidrasa carbónica II. LF: Lactoferrina. PSTI: Inhibidor de la secreción pancreática de tripsina.
Gut 2009;58:1680-9.
proximal de la región HLA-E de clase I [28]. Además se ha descrito
recientemente la asociación de la PAI con polimorfismos de receptores Fc [29].
La PAI esta relacionada con hipergammaglobulinemia y niveles elevados en
suero de IgG4. Kamisawa et al [30] han descrito la asociación entre los niveles
séricos de IgG4 y la presencia de lesiones extrapancreáticas en pacientes con
34
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
PAI. Estos hallazgos sugieren que la IgG4 puede jugar un papel clave en la
patogénesis de la enfermedad.
Se desconocen los agentes desencadenantes de la PAI. En pacientes con
PAI se han detectado en suero autoanticuerpos como factor reumatoide,
anticuerpos anti-nucleares (ANA), anti-músculo liso (ASMA), anti-lactoferrina
(LF), anti-anhidrasa carbónica II (CA-II) y anti-amilasa α-2A (AMY α-2A) [31-33].
Se ha hipotetizado que una reacción autoinmunitaria frente a CA II o LF
mediada por Linfocitos T CD4+ tipo Th1 desempeñaría un papel esencial en la
patogénesis de la PAI [31]. El primer paso en el desarrollo de la enfermedad
podría ser una alteración antigénica en las células ductales y acinares del
páncreas, como la expresión aberrante de HLA-DR [34]. A continuación los
complejos HLA-DR/péptidos autoantigénicos serían reconocidos por linfocitos T
CD4+, induciendo probablemente apoptosis e infamación del páncreas [34].
Además de los genes HLA, hay estudios que apoyan la participación de
genes no HLA en el desarrollo de la PAI. En pacientes con PAI, se ha
demostrado la presencia de polimorfismos de CTLA4, un regulador clave de la
respuesta inmunitaria de linfocitos T [35]. En este sentido, Chang et al [35]
han demostrado que el haplotipo 2318C/+49A/CT60G confiere mayor
susceptibilidad a desarrollar la PAI. Por otro lado, el polimorfismo del promotor
del TNF-α, -863A, se ha correlacionado con afectación extrapancreática en
pacientes con PAI [35].
La PAI se ha asociado ocasionalmente con un descenso de los niveles del
complemento. Muraki et al [36] han observado altos niveles de
inmunocomplejos circulantes en pacientes con PAI y un descenso significativo
35
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
después del tratamiento con corticosteroides. En este estudio, se encontró una
asociación significativa entre niveles elevados de inmunocomplejos circulantes
y un incremento de IgG1 junto con un descenso de C4 y de C3 en suero. Estos
hallazgos sugieren que la PAI en un estado activo se asocia con altos niveles
de inmunocomplejos circulantes, que inducen la activación del complemento a
través de la vía clásica y causan un descenso de los niveles séricos de C3 y C4.
Recientemente los mismos investigadores describieron la existencia de
inmunocomplejos formados por IgG4 unida a IgG1, 2 y 3, mediante
interacciones Fc-Fc, en pacientes con PAI [37]. En consecuencia, han sugerido
que los inmunocomplejos tipo IgG1 desencadenan la activación del
complemento a través de la vía clásica, mientras que la IgG4 contribuye al
aclaramiento de los inmunocomplejos para amortiguar el proceso inflamatorio.
Otra posibilidad es que la IgG4 podría bloquear las funciones efectoras de la
IgG1 para frenar la respuesta inflamatoria.
Existen estudios que se han centrado en el papel de las células T
reguladoras (Tregs) en La PAI. Zen et al [38] han documentado que la
respuesta inmunitaria en la PAI esta mediada fundamentalmente por linfocitos
Th2 y por células Tregs en el de pacientes con colangitis esclerosante y PAI.
Miyoshi el al [39] han estudiado el papel de las células Tregs en la patogénesis
de la PAI, encontrando un descenso de células Tregs circulantes naive
y un incremento de células Tregs memoria circulantes en sangre de pacientes
con PAI. Estos autores sugieren que el incremento de células Tregs memoria
se correlaciona con la producción de IL-10 en sitios locales del páncreas y en
lesiones extrapancreáticas. A su vez, la IL10 conduce a la maduración de
36
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
células B a células plasmáticas productoras de IgG4 y a la secrección de IgG4
en suero.
El mimetismo molecular es un posible mecanismo utilizado por los
microorganismos para romper la tolerancia inmunitaria. Para ello, los agentes
infecciosos comparten uno o más epitopos con varios componentes
autorreacivos. Otra posibilidad es que los microorganismos pueden conducir a
la activación de células inmunitarias potencialmente autoagresivas.
Kountouras el al [34] han propuesto como agente etiológico, a través de
mimetismo molecular al microorganismo Helicobacter pylori. Estos autores han
sugerido que H. pylori puede desencadenar la enfermedad a través de la
inducción de autoinmunidad y apoptosis. De acuerdo con esta teoría Guarneri
et al [40] han encontrado una homología significativa entre CA-II y α-CA de H.
pylori, un enzima fundamental para la supervivencia y proliferación de la
bacteria en el ambiente gástrico. Además, los segmentos homólogos contienen
el motivo de unión de la molécula DRB1*0405 [40] y la posesión del genotipo
HLA DRB1*0405-DQB1*0401 confiere susceptibilidad al desarrollo de PAI.
Estos datos apoyan la hipótesis de que la infección gástrica por H. pylori puede
desencadenar PAI en individuos genéticamente predispuestos [40].
Finalmente, cambios en la microcirculación, incluyendo vasoconstricción,
estasis capilar, descenso de la saturación de oxígeno e isquema progresiva,
pueden conducir a fracaso microcirculatorio local, edema y amplificación del
daño pancreático [41]. A ello se suman radicales libres de oxígeno, citoquinas
proinflamatorias liberadas por granulocitos y macrófagos (TNF-α, IL-1, IL-6 e IL-
8), metabolitos del ácido araquidónico (prostaglandinas, factor activador de
37
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
plaquetas y leucotrienos) y enzimas proteolíticos y lipolíticos; interaccionan con
la microcirculación pancreática y aumentan la permeabilidad vascular,
conduciendo a necrosis pancreática [41]. La infección por H. Pylori puede
exacerbar estos eventos, promoviendo la agregación de plaquetas y de
plaquetas/leucocitos e induciendo la liberación de sustancias proinflamatorias y
vasoconstrictoras, como endotelina-1, IL-1, IL-6, IL-8, leucotrienos y
prostaglandinas [40].
Park et al [41] han propuesto un modelo posible para la patogénesis de la
PAI. Este modelo se basa la existencia de elementos bifásicos para la
iniciación y progresión de la PAI y en el mantenimiento por células Tregs
(Figura 2). La inducción de una respuesta a autoantígenos (LF, ACA II o PSTI)
y el mimetismo molecular (H.Pylori) puede conducir a la activación de células
presentadoras de antígenos. En este medio, bajo condiciones de depleción de
células Tregs, se produce la activación de células Th1 y la liberación de
citocinas inflamatorias (INF-γ, IL-2 y TNF-α), induciéndose así una respuesta
inmunitaria celular. En contraposición, bajo condiciones de activación de
Tregs (aunque insuficiente para suprimir el desarrollo de la PAI), se induce la
activación de células Th2 y la liberación de las citocinas IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y
TGF-β, induciéndose así una respuesta inmunitaria humoral. Los
inmunocomplejos IgG4 pueden estar relacionados con la fase de diferenciación
de la PAI o con la función de las células Tregs. Finalmente, teniendo en cuenta
que se han identificado dos formas de PAI, tipo 1 y tipo 2, y que sólo la primera
se ha asociado con niveles aumentados de IgG4; los autores han especulado
38
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
Figura 2 . Modelo propuesto de la patogénesis de la PAI. La inducción de la respuesta a autoantígenos y el mimetismo molecular (H.Pylori) puede activar las células presentadoras de antígenos (APCs). En este medio, bajo condiciones de depleción de Tregs, se produce la activación de células Th1 y la liberación de citocinas inflamatorias (INF-γ, IL-2 y TNF-α), induciéndose así una respuesta inmunitaria celular. La activación del complemento por inmunocomplejos IgG1 es otra posible vía de iniciación de la PAI. Bajo condiciones de activación de Tregs, se desencadena la activación de células Th2 y la liberación de las citocinas IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 y TGF-β, induciéndose así una respuesta inmunitaria humoral. Finalmente los inmunocomplejos IgG4 estarían relacionados con la PAI IgG4+ (pancreatitis esclerosante linfoplasmocitaria (LPSP)), mientras que los immunocomplejos IgG1 estarían relacionados con la PAI-IgG4- (pancreatitis idiopática ducto-céntrica (IDCP)). CA-II: anhidrasa carbónica. PSTI: inhibidor de la secreción pancreática de tripsina. Gut 2009;58:1680-9.
que los inmunocomplejos IgG4 estarían relacionados con la PAI tipo 1 y los
immunocomplejos IgG1 con la PAI tipo 2.
1.5. Pancreatitis autoinmune experimental en modelo s animales
Hasta la fecha se han descrito dos modelos animales de PAI. Se han
encontrado similitudes entre estos dos modelos y la clasificación propuesta de
PAI [31, 38, 42].
El primer modelo implica la transferencia adoptiva de células T-CD4+
específicas para la amilasa (un antígeno localizado en las células acinares del
39
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
páncreas) a ratones singénicos [38]. Las lesiones histológicas de este modelo
mimetizan la reacción inflamatoria lóbulo-céntrica de la PAI tipo 1; ya que se
caracterizan por un predominio de linfocitos y algunas células plasmáticas,
neutrófilos, y mastocitos y por la destrucción del tejido acinar acompañada de
inflamación ductular. El análisis inmunhistoquímico revela la presencia de
numerosas células T CD4+ y CD8+, macrófagos y células dendríticas.
El segundo modelo ha sido desarrollado mediante inmunización de ratones
timectomizados neonatalmente con AC (un antígeno localizado en el epitelio
pancreático) y la transferencia posterior de células T CD4+. Las lesiones
histológicas de este modelo mimetizan el patrón ductulo-céntrico de la PAI tipo
2 [38].
Davidson et al [43] han desarrollado un modelo de rata específico de la
amilasa, donde células T específicas de AC-II o de LF no son capaces de
inducir PAI. Los autores han especulado que los anticuerpos frente a estos
enzimas representarían una consecuencia tardía de la destrucción tisular y no
un mecanismo patogénico de la enfermedad. En este sentido, estos
autoanticuerpos podrían originarse a través del fenómeno de expansión del
epitopo [43]. Recientemente, Kojima et al [44] han mostrado la existencia de un
patrón policlonal del receptor de células T y de genes IgH-FR3 en la PAI. Estos
hallazgos apoyan la teoría de “expansión del epitopo” en la PAI.
En otro modelo los ratones NTx-NFS/sld desarrollan espontáneamente una
forma de sialoadenitis donde la α-fodrina se ha implicado como autoantígeno.
Adicionalmente los anticuepos frente a la α-fodrina se han descrito en algunos
pacientes con SS y PAI [45].
40
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
En varios modelos animales sin especificidad antigénica, como los ratones
alinfoplásticos (aly-/aly-) [46] y los ratones MRL/lpr [47], se ha observado el
desarrollo espontáneo de pancreatitis o sialoadenitis, donde células CD4+ tipo
Th1 actuan como efectoras.
El TGF-β, un importante factor regulador en el mantenimiento de la
homeostasis inmunitaria, parece intervenir en el desarrollo de la PAI. En este
sentido, la pérdida de la señalización del TGF-β contribuye al desarrollo de PAI
en ratones mutantes dominantes negativos [48].
La afectación extrapancreática en la PAI se ha descrito en varios modelos
animales. La inmunización subcutánea con CA-II induce sialoadenitis en
ratones PL/J y SJL/JCr [49] . En ratones BALB/c y DBA/1 la inmunización
intraperitoneal con AC-II induce colangitis [50].
Recientemente se han propuesto dos nuevos modelos de PAI. El modelo de
rata WBN/Kob, asociado con la disminución congénita de células Tregs
periféricas, desarrolla espontáneamente sialoadenitis, tiroiditis, colangitis
esclerosante y nefritis tubulointersticial [51]. El otro modelo es el de ratones
NOD deficientes en células Tregs [52], donde los autoanticuerpos y las células
autorreactivas reconocen la amilasa pancreática.
Los modelos animales existentes de PAI tienen varias limitaciones [53]. En
la mayoría de ellos la PAI es inducida mediante la transferencia adoptiva de
células autorreactivas y/o anticuerpos, pero la enfermedad no se desarrolla
espontáneamente con idéntica especificidad antigénica. La distribución de las
lesiones desarrolladas en los modelos animales de PAI es variable, debido
probablemente a la diversidad de dianas antigénicas y al empleo de diferentes
41
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
cepas murinas. Por otro lado, los hallazgos histológicos típicos de la PAI
(infiltración linfoplasmocitaria con fibrosis, flebitis obliterativa y lesiones
epiteliales granulocíticas) se observan raramente en los modelos animales
existentes. En consecuencia es necesario desarrollar modelos animales
espontáneos con idénticos autontígenos y con los hallazgos histopatológicos
típicos de la PAI.
1.6. Características clínicas
La mayoría de los individuos con PAI son varones de más de 50 años de
edad [8, 54]. Sin embargo, los pacientes femeninos son más propensos a
presentar afectación de la glándula parótida [55].
La presentación clínica de la PAI es diversa (Tabla 2). Se puede clasificar en
función del modo de establecimiento de la enfermedad, en agudo y tardío; o en
función de los órganos afectados, en presentación pancreática o
extrapancreática.
La presentación aguda más común es la ictericia obstructiva sin dolor, en un
70-80% de los pacientes con PAI [7, 56]. Esta manifestación se relaciona con
la afectación de la cabeza pancreática en la forma focal de la enfermedad o
con el compromiso de la vía biliar. Es mucho menos frecuente la presentación
de la enfermedad como una pancreatitis aguda típica [57], con dolor abdominal
y elevación de enzimas pancreáticos. En estos casos el dolor agudo severo
es raro y la pancreatitis necrotizante no ha sido descrita nunca en la literatura
[58-60].
En la fase post-aguda la PAI se puede descubrir accidentalmente por la
presencia de una masa pancreática persistente, atrofia pancreática con o sin
42
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
calcificación o esteatorrea pancreática. Aunque los pacientes con PAI pueden
tener evidencias radiológicas de calcificación o atrofia pancreática, a diferencia
de la pancreatitis crónica, no existe dolor [57].
Las manifestaciones extrapancreáticas son muy diversas y se pueden
presentar simultáneamente a las pancreáticas, precederlas u ocurrir muchos
años después. La afectación extrapancreática más común es la del tracto biliar,
donde el compromiso biliar proximal puede mimetizar el cáncer de páncreas,
mientras que el compromiso biliar distal puede desencadenar la sospecha de
colangiocarcinoma. También puede existir afectación de glándulas salivares
simulando el SS, adenopatía mesenquimal simulando sarcoidosis, fibrosis
retroperitoneal o nefritis tubulointersticial [58-65].
La presentación aguda de la PAI con ictericia obstructiva y agrandamiento
del páncreas puede mimetizar la forma de presentación del cáncer de páncreas.
Adicionalmente, como los pacientes también experimentan pérdida de peso y
diabetes mellitus (DM) de establecimiento reciente, la distinción clínica entre
PAI y cáncer de páncreas se hace difícil. De hecho, antes de reconocimiento
de la PAI como una entidad clínica, muchos pacientes eran sometidos a
resecciones pancreáticas por sospecha de adenocarcinoma pancreático [54, 66,
67].
La ictericia generalmente es secundaria al atrapamiento del conducto biliar
intrahepático en la glándula inflamada [68-70]. Aunque se trata de la forma de
presentación clínica más común, se han descrito otros muchos síntomas, como
dolor abdominal, dolor de espalda, vómitos recurrentes y pérdida de peso [71,
72].
43
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
TABLA 2 . Características clínicas de la pancreatitis autoinm une
Síntomas típicos
(>50%)
Síntomas menos comunes
(10-50%)
Síntomas raros
(<10%)
Ictericia obstrutiva
Dolor abdominal
Pérdida de peso
Diabetes
Esteatorrea
Clínica de pancreatitis aguda
Asintomática
Curr Gastroenterol Rep 2005;7:101–6.
Muchos pacientes con PAI tienen alteraciones del páncreas endocrino y
desarrollan DM [73, 74]. En muchos casos, ambas enfermedades son
diagnosticadas simultáneamente, pero en otros se observa una exacerbación
de la DM pre-existente cuando se establece la PAI [75]. La DM se ha descrito
al diagnóstico de la PAI en un 50% de los pacientes [15, 76].
Aproximadamente la mitad de los pacientes presentan mejoría de su
intolerancia a la glucosa y resolución completa de la DM tras el tratamiento con
corticosteroides [75, 77].
1.7. Afectación extrapancreática en la ISD
La ISD se asocia frecuentemente con varias lesiones extrapancreáticas. La
afectación de otros órganos se describe en la Tabla 3, y la prevalencia y
distribución de lesiones extrapancreáticas se ha propuesto en un estudio
reciente [63]. La ISD puede afectar a un solo órgano, presentándose como
pseudotumor inflamatorio, o puede afectar a entre 2 y 4 órganos.
1.7.1. Afectación del tracto biliar
El tracto biliar se encuentra afectado en un 60-100% de los pacientes con
PAI [63, 69, 72, 78, 79]. Recientemente se ha introducido el término de
44
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
colangitis asociada a IgG4 (IAC) para definir las manifestaciones biliares en la
ISD [80]. Aunque la PAI esta presente en la mayoría de los pacientes con IAC,
se han descrito casos de IAC con afectación aislada del tracto biliar, en
ausencia de enfermedad pancreática [81, 82].
La IAC afecta a los conductos biliares intra- y extrahepáticos, principalmente
al conducto biliar común distal [83]. Histológicamente se puede observar un
infiltrado linfoplasmocitario rodeando los conductos biliares [4, 80, 84].
La IAC puede confundirse con la colangitis esclerosante primaria (CEP),
especialmente por los hallazgos radiológicos solapantes. La IAC difiere de la
CEP, en que en la primera la afectación intrahepática es menor [56, 85] y en la
menor asociación con la enfermedad inflamatoria intestinal [86]. Clínicamente,
la IAC ocurre de forma abrupta con ictericia obstructiva, mientras que la CEP
se presenta en individuos asintomáticos con alteraciones de las pruebas de
función hepática [87]. Por último, la IAC se caracteriza por la elevación en
suero de IgG4 y por la respuesta drástica al tratamiento esteroideo, a diferencia
de la CEP [68].
1.7.2. Afectación hepática
En la PAI, es frecuente observar disfunción hepática. Puede deberse a la
presencia de lesiones obstructivas extrapancreáticas o a un daño hepático
inflamatorio.
Hirano et al [69] han encontrado infiltración linfoplasmocitaria en el área portal
en 7 de 7 muestras de biopsia hepática de pacientes con PAI.
45
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
En otro estudio reciente [88] se ha propuesto en término de hepatopatía
asociada a IgG4 para definir las manifestaciones hepáticas en la ISD,
describiéndose 5 patrones histológicos en hígado:
Inflamación portal evidente con o sin hepatitis.
Gran obstrucción biliar ductal
Esclerosis portal
Hepatitis lobular
Colestasis canalicular
La afectación hepática en la ISD se puede poner también de manifiesto
como pseudotumores inflamatorios hepáticos [89, 90]. Zen et al [91] los han
clasificado en dos tipos, fibrohistiocitarios y linfoplasmocitarios. Como en el
segundo tipo las células plasmáticas IgG4+ son más numerosas [91], estos
autores han concluido que el tipo linfoplamocitario presenta unas
características histológicas similares a la PAI y pertenecería por tanto a la ISD.
También se ha asociado con la PAI la neumonía intersticial [92-94]. En estos
pacientes, se ha observado una densa infiltración de células plasmáticas IgG4+
en el septo alveolar adelgazado [92-94].
1.7.3. Afectación de la vesícula biliar
La afectación de la vesícula biliar en la PAI es frecuente, se caracteriza por
colecistitis alitiásica y linfoplasmocitaria [95-97].
Kamisawa et al [95] han encontrado afectación de la vesícula biliar en un
32% de los pacientes con PAI. En este grupo se ha observado un aumento de
las células plasmáticas IgG4+ y fibrosis transmural en la vesícula biliar.
46
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
1.7.4. Afectación del tracto gastrointestinal
En la mucosa gastrointestinal de individuos sanos suelen encontrarse
aisladamente células plasmáticas IgG4+.
Deheragoda et al [98] han encontrado un marcado incremento de células
plasmáticas IgG4+ en la mucosa gastrointestinal de pacientes con PAI.
La enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) se asocia ocasionalmente con la
PAI [19, 99]. Se ha estimado que la incidencia de pancreatitis crónica en
pacientes con IBD es de un 1-2%, 250 veces mayor que en la población
general [100]. En los pacientes con PAI, la incidencia de IBD es de un 7,6%
[85].
Barthet et al [100] ha propuesto que la pancreatitis es una manifestación
extraintestinal de la IBD. En su estudio ha encontrado 11 pacientes con
pancreatitis de 427 con IBD en el Sur de Francia.
1.7.5. Afectación del glándulas salivares y lacrimales
Las glándulas salivares y lacrimales están afectadas frecuentemente en la
ISD [63, 101-103].
La sialadenitis esclerosante, también llamada tumor de Küttner, se presenta
como una inflamación crónica y asimétrica de las glándulas submandibulares
[104]. Kitagawa et al [102] han descrito una serie de 12 pacientes con tumor de
Küttner, 5 de los cuales con lesiones esclerosantes en tejidos glandulares
extrasalivares. Histológicamente, las glándulas salivares presentan una
marcada infiltración linfoplasmocitaria con fibrosis y destrucción de los lóbulos
glandulares. Inmunohistoquimicamente, la proporción de células
plasmáticas
47
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
IgG4+/IgG+ es de más de un 45% [102]. Estos hallazgos sugieren que la
sialadenitis esclerosante es la manifestación en glándulas salivares de la ISD.
La enfermedad de Mikulick se define como una inflamación idiopática,
asintomática, bilateral y simétrica de las glándulas lacrimales, parótidas y
submandibulares [105]. Histológicamente, se observa una marcada infiltración
linfoplasmocitaria, con folículos linfoides rodeando células epiteliales, fibrosis
estromal y atrofia acinar [105]. La enfermedad de Mikulick se ha considerado
un subtipo del SS por sus características histológicas similares. Sin
embargo existen varias diferencias entre ambas enfermedades. Los pacientes
con la enfermedad de Mikulick carecen de anticuerpos anti-SS-A y anti-SS-B,
presentan niveles elevados en suero de IgG4 y una infiltración de células
plasmáticas IgG4+ en glándulas salivares y lacrimales [103, 106-108]. En
consecuencia, la enfermedad de Mikulick es considerada actualmente como
una ISD.
El SS se observa ocasionalmente en pacientes con PAI [109-112]. Aunque
existen similitudes histológicas entre ambas enfermedades, algunos estudios
muestran que la glándula submandibular de pacientes con PAI difiere de la
encontrada típicamente en SS. En el SS, los niveles séricos de IgG4 son
significativamente menores que en pacientes con PAI [108, 113], y no suelen
observarse células plasmáticas IgG4+ [102, 114]. Estos datos sugieren que la
IgG4 no parece tener un papel importante en la patogénesis de esta
enfermedad.
48
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
1.7.6. Afectación renal
Las lesiones renales en la ISD suelen presentarse como nefritis
tubulointersticial. Esta enfermedad se puede asociar con la PAI, aunque se han
descrito algunos casos asociados con niveles séricos elevados de IgG4 sin
lesiones pancreáticas importantes [50, 115-118].
Clínicamente, la nefritis tubulointersticial se puede presentar como
insuficiencia renal, vasculitis o como una “masa renal”; estos síntomas a
menudo están asociados con PAI [50, 115, 118-122]. Histológicamente, las
lesiones renales se caracterizan por un denso infiltrado linfoplasmocitario
parcheado o difuso, con abundantes eosinófilos. Generalmente, existe tubulitis,
daño y atrofia tubular, adelgazamiento de la membrana basal tubular y
afectación glomerular [50, 121]. Inmunohistoquimicamente, se detecta un
denso infiltrado de células plasmáticas IgG4+ en el intersticio renal [50, 118,
120, 121]. También se han encontrado depósitos inmunes granulares en la
membrana basal tubular [121]. Según la distribución de estos infiltrados, las
lesiones se pueden clasificar en nefritis tubulointersticial difusa y en masas tipo
tumorales [50]. Algunos pacientes con PAI que presentan lesiones nodulares
en el riñón, simulando tumores metastáticos [115, 116]. Estas lesiones
consisten en masas tipo tumorales compuestas por numerosos agregados de
células plasmáticas y linfocitos en el intersticio renal [50].
En algunos casos, se ha descrito la asociación de la PAI con nefropatía
membranosa, donde se observan depósitos de células IgG4+ en el glomérulo o
en la membrana basal tubular [118].
49
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
1.7.7. Afectación del retroperitoneo y del mesenterio
La fibrosis retroperitoneal es una enfermedad caracterizada por la
proliferación de tejido fibroso en el retroperitoneo [122]. Las lesiones presentan
infiltrados inflamatorios activos y crónicos formados por células plasmáticas
IgG4+, esclerosis y folículos linfoides con centros germinales [122].
Clínicamente, la fibrosis retroperitoneal, se presenta como un síndrome
constitucional, con fatiga, fiebre, pérdida de peso y malestar [122]. El hallazgo
patognomónico de la enfermedad es una espesa masa fibrótica retroperitoneal
que cubre la aorta abdominal y comprime los uréteres. El proceso fibrótico
puede conducir a obstrucción de los uréteres, fracaso renal o hidronefrosis
[123].
Aproximadamente en un 70% de los casos de fibrosis retroperitoneal, la
causa es desconocida [124], aunque se han descrito casos asociados con la
PAI [99, 124-128]. En estos pacientes se ha observado una densa infiltración
de células plasmáticas IgG4+ en el páncreas y en las masas fibróticas
retroperitoneales [129]. Neild et al [124] han descrito los hallazgos histológicos
de 12 pacientes con fibrosis retroperitoneal idiopática, encontrando fibrosis y
densos infiltrados de linfocitos T y células plasmáticas IgG4+, junto con
venulitis y arteritis obliterativa. Estos hallazgos sugieren que algunos casos de
fibrosis retroperitoneal constituyen las lesiones retroperitoneales de la ISD.
La mesenteritis esclerosante es un raro trastorno fibroinflamatorio de
etiología desconocida, que afecta primariamente al mesenterio de intestino
delgado [130, 131]. Histológicamente, se observa intensa fibrosis, escasa
inflamación y necrosis [130]. Se ha descrito afectación del páncreas en
50
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
pacientes con mesenteritis esclerosante [130, 131]. Akram et al [132], han
encontrado abundantes infiltrados de células plasmática IgG4+ en un 33% de
los pacientes con mesenteritis esclerosante. Sugiriendo que la IgG4 podría
jugar un papel clave en la patogénesis de la enfermedad.
1.7.8. Afectación del tiroides
Aproximadamente la cuarta parte de los pacientes con PAI presentan
hipotiroidismo, generalmente con anticuerpos anti-tiroglobulina [133]. La
tiroiditis de Riedel es una forma rara de tiroiditis crónica, donde la glándula
tiroidea es reemplazada por tejido fibroso. Aunque se desconoce la causa de la
enfermedad, se considera que forma parte de un proceso fibroinflamatorio
sistémico que afecta también a otros órganos. Esta entidad se asocia no sólo
con tiroiditis, sino también con fibrosis retroperitoneal, mediastinitis
esclerosante, colangitis esclerosante o pseudotumor orbital [134, 135]. En la
tiroditis de Riedel se han observado numerosas células plasmáticas IgG4+, lo
que sugiere que podría constituir otra forma de ISD [136].
1.7.9. Afectación de mamas
Cheuk et al [137] han descrito 4 casos de mastitis esclerosante asociada a
IgG4, que se presentan como nódulos indoloros palpable, solitarios o múltiples.
Patológicamente, se observan densos infiltrados linfoplamocitarios con
formación de folículos linfoides, extensa esclerosis y atrofia de los lóbulos
mamarios. Inmunohistoquimicamente, se detectan abundantes células
plasmáticas IgG4+.
Zen el al [138] han descrito un caso de pseudotumor inflamatorio en la mama.
El paciente presentaba induración de la mama izquierda, con niveles séricos
51
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
elevados de IgG4 e incremento de células plasmáticas IgG4+ en la lesión.
Como las características histológicas de este caso parecen ser idénticas a las
descritas en la serie de Cheuk et al, se ha sugerido que esta entidad podría
constituir una manifestación de la ISD en la mama [137].
1.7.10. Afectación pulmonar
La afectación pulmonar en la ISD se puede presentar como neumonía
intersticial o como pseudotumor inflamatorio.
Hamed et al [139] han descrito un paciente con un nódulo pulmonar
mimentizando clínicamente el cáncer de pulmón. Este paciente presentaba
niveles séricos elevados de IgG4, lesiones inflamatorias en la próstata,
glándulas submandibulares y conductos biliares y numerosas células
plasmáticas IgG4+ en la biopsia del nódulo pulmonar. Todos estos hallazgos
llevaron al diagnóstico final de ISD.
Se han descrito dos casos de neumonía intersticial asociada a PAI.
Taniguchi et al [140] han descrito un paciente con PAI que desarrolló
neumonía intersticial bilateral durante el seguimiento. Histológicamente, se
observaron densos infiltrados linfoplasmocitarios y un incremento de células
plasmáticas IgG4+ en el pulmón. Nieminen et al [141] también han descrito un
caso de PAI asociada con colangitis esclerosante, sialadenitis y neumonía
intersticial nodular
Zen et al [142] han reportado 9 pacientes con pseudotumores pulmonares
inflamatorios. Histológicamente se caracterizan por la presencia densos
infiltrados linfoplamocitarios en el septo alveolar adelgazado, fibrosis,
infiltración eosinofílica, estrechamiento irregular de los bronquiolos y un
52
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
patrón de neumonía intersticial en los límites de los lóbulos. Además, se
observó arteritis obliterativa en 5 de ellos.
Shrestha et al [143] han descrito histológicamente las biopsias hepáticas de
6 pacientes con PAI. Las muestras presentaban endotelialitis de las venas
pulmonares, fibrosis activa, infiltrados inflamatorios ricos en células plasmáticas
e histiocitos y pleuritis. Inmunohistoquimicamente, se detectaron numerosas
células plasmáticas distribuidas difusamente en los nódulos.
1.7.11. Afectación de la próstata
Recientemente se ha descrito la prostatitis asociada a IgG4 en pacientes
con o sin PAI. Los síntomas se manifiestan en el tracto urinario inferior.
Histológicamente la próstata muestra densa infiltración de células plasmáticas
IgG4+ y linfocitos, flebitis obliterativa, atrofia glandular e intensa fibrosis [144-
146].
1.7.12. Afectación de nódulos linfoides
La linfadenopatía es común en la ISD [147-149].
Cheuk et al [150] han estudiado las características morfológicas de los
nódulos linfoides en la ISD, encontrando tres patrones:
Enfermedad tipo Castleman
Hiperplasia folicular
Expansión interfolicular por inmunoblastos y células plasmáticas
Los nódulos linfoides de los pacientes con linfadenopatía y PAI, presentan
un marcado incremento de células plasmáticas IgG4+/IgG+ [150]. Este hallazgo
sugiere que estos casos podrían representar la manifestación en nódulos
linfoides de la enfermedad.
53
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
TABLA 3 . Órganos afectados en la enfermedad esclerosante aso ciada a IgG4
Órgano o sitio
Características clinicopatológicas
Referencias
Páncreas Pancreatitis autoinmune tipo 1
Pancreatitis autoinmune tipo 2
7,19, 113, 151-153
9, 41, 71, 78, 154
Conductos biliares Colangitis esclerosante asociada a IgG4
Pseudotumor inflamatorio
85, 97
155, 156
Hígado
Colangitis esclerosante afectando a conductos intrahepáticos Inflamación portal con/sin hepatitis Obstrucción de conductos biliares Esclerosis portal Hepatitis lobular Colestasis canalicular Pseudotumor inflamatorio
69, 87, 88, 90, 91
Vesícula biliar Colecistitis difusa, acalculosa, linfoplasmocitaria 95-97
Tracto gastrointestinal Aumento de células IgG4+ en la mucosa
Enfermedad inflamatoria intestinal
19, 98, 101
79
Glándulas salivares y lacrimales
Tumor de Küttner ( Sialadenitis esclerosante)
Enfermedad de Mikulick
Dacrioadenitis crónica esclerosante
102, 103, 106-108, 157
Riñón Nefritis tubulointersticial
Glomerulopatía membranosa
115, 118-121, 158
Retroperitoneo y mesenterio
Fibrosis retroperitoneal
Mesenteritis esclerosante
122, 126-132
Tiroides Hipotiroidismo. Tiroiditis de Riedel 133-135
Mama Pseudotumor inflamatorio 138
Pulmón Neumonía intersticial
Pseudotumor inflamatorio
141-148
Aorta Aneurisma de la aorta abdominal 89, 159
Órbita Pseudotumor inflamatorio 160
Mediastino Mediastinitis esclerosante 161
Glándula pituitaria Hipofisitis
Pseudotumor inflamatorio
162
Próstata Prostatitis asociada a IgG4 144
Nódulos linfoides
Linfadenopatía tipo Enfermedad Castleman
Linfadenopatía con hiperplasia folicular
Linfadenopatía con expansión interfolicular
147-151
54
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
1.8. Histopatología
Desde el punto de vista histopatológico, la PAI puede considerarse una
forma única de pancreatitis [163]. En un examen grosero, se observa un
endurecimiento focal o difuso del páncreas [15].
Yoshida et al [15] describieron las 4 características histológicas cardinales
de la PAI (Figura 3).
Infiltración linfoplasmocitaria
Fibrosis intersticial
Infamación periductal
Periflebitis
Por tanto, el marcador histológico de la PAI es la densa infiltración del
espacio periductal por células inflamatorias. Asociado a este infiltrado, existe
destrucción acinar, flebitis obliterativa, y fibrosis del parénquima pancreático,
que se puede extender al tejido blando peripancreático adyacente [19, 56].
El infiltrado inflamatorio varía en celularidad y suele presentar una
distribución parcheada. Consiste fundamentalmente en linfocitos y células
plasmáticas (a menudo productoras de IgG4) con macrófagos, neutrófilos y
eosinófilos dispersos. El marcaje inmunohistoquímico muestra que los linfocitos
consisten fundamentalmente en células T CD4+, con algunas células T CD8+ y
células B [164]. Estos infiltrados predominan en conductos intralobulares de
tamaño medio y grande, afectando a menudo al conducto de Wirsung [11, 31,
167]. El infiltrado se localiza fundamentalmente en el área subepitelial con
la capa epitelial prácticamente intacta. Esto conduce a un plegamiento del
epitelio que comprime el lumen ductal formando una estructura tipo estrella.
55
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
a) Infiltración linfoplasmocitaria b) Fibrosis intersticial
c) Inflamación periductal d) Periflebitis
Figura 3 . Histopatología de la pancreatitis autoinmune. a) Infiltración linfoplasmocitaria, b) Fibrosis intersticial, c) Inflamación periductal, d) Periflebitis. British Journal of Surgery 2007;94:1067–74.
Además la fibrosis periductal conduce a adelgazamiento de las paredes
ductales [165, 166]. En el proceso inflamatorio se observa ocasionalmente un
predominio de eosinófilos y neutrófilos que destruye el epitelio ductal [168, 169].
La fibrosis intersticial con atrofia acinar es otra de las características
patológicas. Cuando afecta a un área de gran tamaño, se manifiesta como una
pancreatitis formadora de masas [170].
El elemento vasculítico, consiste generalmente en una flebitis de pequeñas
venas que puede progresar a una venulitis obliterativa [17, 151, 165, 166]. La
flebitis suele predominar en el tejido inflamado y a menudo se extiende a
tejidos peripancreáticos.
56
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
La PAI se puede clasificar histológicamente en 2 tipos [151, 171]:
El patrón histológico en la PAI tipo 1 es llamado pancreatitis
esclerosante linfoplasmocitaria (LPSP). La LPSP consiste en una
densa infiltración linfoplasmocitaria y fibrosis que afecta a los lóbulos y
conductos pancreáticos y al tejido adiposo peripancreático [41, 148,
171, 172]. La fibrosis en un patrón estoriforme y la flebitis obliterativa,
se consideran características diagnósticas de la LPSP. Los eosinófilos
pueden aparecer en los infiltrados inflamatorios, pero no se observan
neutrófilos (Figura 4A).
El patrón histológico en la PAI tipo 2 se denomina pancreatitis
idiopática ductulo-céntrica (IDCP). A diferencia de la LPSP, en la IDCP
el proceso inflamatorio se centra en el sistema pancreático exocrino
[151, 171, 174]. La infiltración neutrofílica en el lumen y el epitelio de
los conductos interlobulares se considera un rasgo característico de la
IDCP (Figura 4B). Estos infiltrados conducen a lesiones epiteliales
granulocíticas que pueden asociarse con daños en el epitelio ductal e
incluso obliteración ductal [151, 171]. Aunque se conoce menos de la
IDCP, parece no estar asociada con enfermedades sistémicas
(excepto con la IBD, presente en un 30% de los pacientes), ni con
ningún marcador serológico [41].
Notablemente, a diferencia de la IDCP, la LPSP se asocia con niveles
elevados en suero de IgG4 y con la presencia de numerosas células
plasmáticas IgG4+ (Figura 4C), sugiriendo que sólo la LPSP es la
manifestación pancreática de la ISD [172, 173].
57
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
Figura 4. Patrón histológico de la pancreatitis autoinmune.A) Fibrosis estoriforme y flebitis obliterativa (fechas) en LPSP. B) Infiltración neutrofílica (flechas) en el lumen ductal y el epitelio en la IDCP. C) Numerosas células plasmáticas IgG4 positivas en LPSP (inmunomarcaje de IgG4). Gastroenterology 2010;139:140–8.
Sah et al [154] han descrito el perfil clínico de una larga cohorte de pacientes
con PAI, incluyendo 78 casos de LPSP y 19 casos de IDCP (Tabla 4). La edad
al diagnóstico de IDCP es de más de una década menor, los pacientes con
IDCP son menos propensos a presentar niveles elevados de IgG4 en suero y
lesiones extrapancreáticas esclerosantes, tienden a presentar características
focales y sufren más comúnmente reseciones quirúrgicas debido a la dificultad
diagnóstica. Tanto la LPSP como la IDCP responden bien a la terapia
esteroidea, aunque la LPSP es más propensa recaída.
El páncreas y otros órganos afectados en la PAI presentan una densa
infiltración con numerosas células IgG4+. El inmunomarcaje del tejido
pancreático para IgG4 contribuye al diagnóstico de la PAI [152].
El diagnóstico histológico de la PAI requiere la preservación de la
arquitectura del tejido. En este sentido, el uso de la biopsia transendoscópica
guiada por ultrasonido ha emergido como una herramienta eficaz y segura
para obtener biopsias pancreáticas en la PAI [175-176]. Cuando se obtienen
mediante biopsias por punción con aguja gruesa, la sensibilidad diagnóstica
de la histología pancreática depende del tamaño de la muestra tisular.
58
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
TABLA 4 . Datos demográficos, perfil clínico, tratamiento y seguimiento de PAI tipo 1 y 2
PAI tipo 1 (n=50)
PAI tipo 2 (n=19)
Valor P
Edad (años) (media +/- DE) 6,5+/- 15,3 47,7 +/- 18,8 0,005
Sexo (M/F) 38/12 14/5 0,53
Presentación (pancreatitis aguda /otras con ictericia obstructiva)
6/46 6/13 0,059
Imagen Inflamación difusa Otras características
16 (30) 36 (70)
3 (16) 16 (84)
0,36
Niveles séricos elevados IgG4 (>140 mg/dl)
25/33 (76) 1/6 (17) 0,11
Afectación extrapancreática 26 (52) 0 <0,0001
IBD 2 (4) 3 (16) 0,12
Tratamiento inicial Corticosteroides Cirugía Tratamiento de soporte
21 (42) 25 (50) 4 (8)
6 (32) 13 (68)
0
0,39 0,17 0,33
Seguimiento clínico (meses) Mediana >1 año >3 años >5 años
42
70 (90) 48 (62) 23 (30)
29
16 (84) 9 (47) 8 (42)
_
45 44 (23-86) 14/31
Datos expresados n (%). DE: desviación estándar
Gastroenterology 2010;139:140–8
A menudo, el páncreas no esta afectado uniformemente por las características
clásicas de la PAI, por eso, cuando son biopsiadas áreas visiblemente no
implicadas, pueden producirse errores diagnósticos [177]. Además, el
inmunomarcaje de tejidos extrapancreáticos, como el árbol biliar, retroperitoneo
o colon, ha revelado positividad para IgG4 en pacientes con PAI [114].
Actualmente, no está claro cómo la histología pancreática puede predecir la
severidad o progresión de la insuficiencia pancreática exocrina o endocrina.
59
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
1.9. Estudios de imagen
1.9.1. Ultrasonografía
El papel de la ultrasonografía en el diagnóstico de la PAI no se ha
establecido con claridad. En general, las imágenes no son específicas ni
diagnósticas de la PAI. Típicamente se ha descrito hinchazón hipoecoica del
páncreas con compresión del conducto pancreático principal por el parénquima
(Figura 5) [57]. En la forma focal afectando a la cabeza pancreática, se han
descrito masas pancreáticas hipoecoicas únicas o múltiples, dilatación del
conducto biliar común, y menos frecuentemente dilatación por encima del
conducto pancreático principal [178-180]. La ultrasonografía aumentada por
contraste (CEUS) constituye una herramienta sensible para evaluar el patrón
de vascularización típica de la PAI. Además es un buen indicador para
monitorizar la eficacia de la terapia esteroidea [178, 181].
1.9.2. Tomografía computerizada (CT)
La forma clásica de la PAI en la CT abdominal se presenta como
alargamiento difuso del parénquima pancreático, dando a la glándula una forma
de salchicha, junto con borramiento de los límites pancreáticos (Figura 6) [16,
71, 78, 182]. Después de la inyección de medio de contraste, se observa un
aumento moderado del páncreas, ectasia de los conductos pancreáticos,
borramiento de la grasa peripancreática y una cápsula tipo anillo de baja
densidad rodeando a la glándula (halo de hipo-atenuación) [56, 183].
La forma focal, afectando mayoritariamente a la cabeza del páncreas y/o al
proceso uncinado, aparece como una masa hipo-atenuante o iso-atenuante
[57].
60
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
Figura 5. PAI forma difusa. Ultrasonografía transversa epigástrica mostrando aumento difuso del páncreas (flechas). Dig. Liver Dis 2010;42: 92–8.
Figura 6. CT de un paciente con PAI no tratada mostrando aumento difuso del parénquima pancreático (forma de salchica), con el contorno parenquimal suavizado. Gastroenterol Clin N Am 2008;37:439–60.
61
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
1.9.3. Resonancia magnética (RM) y Colangio-pancreatografía por RM (CPRM)
La imagen por RM revela aumento focal o difuso del páncreas con intensidad
de señal disminuida en T1 y aumentada en T2, y, ocasionalmente, una cápsula
tipo anillo en T2 [184].
La CPRM es útil en la caracterización de los conductos biliares y
pancreáticos. Permite observar múltiples estructuras intrahepáticas, la
dilatación de los conductos intrahepáticos y las características del conducto
biliar común [16].
La porción estrechada del conducto pancreático principal no se puede
visualizar en la CPRM, por esta razón, no permite diferenciar entre un
estrechamiento irregular del conducto pancreático principal y la estenosis típica
del cáncer de páncreas. Estos hallazgos sugieren que la CPRM puede ser útil
en el seguimiento de los pacientes en tratamiento, pero no en el diagnóstico de
la PAI [185].
1.9.4. Colangio-pancreatografía retrógada endoscópica (CPRE)
La CPRE es esencial en el diagnóstico de la PAI, ya que uno de los criterios
diagnósticos de la enfermedad, es el estrechamiento difuso o segmental del
conducto pancreático principal con pared irregular en la CPRE (Figura 7) [57].
En la forma focal, puede observarse dilatación adyacente o por encima del
conducto pancreático principal, junto con estenosis del conducto biliar común,
mimetizando la imagen típica del cáncer de páncreas [57].
Otra característica común en la CPRE, es el estrechamiento irregular de la
región hepática hiliar, y menos frecuentemente, de las estructuras
intrahepáticas ductales [186].
62
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
Figura 7. CPRE mostrando estenosis del conducto biliar común distal (flechas). Dig. Liver Dis 2010;42: 92–8.
Se ha visto que la CPRE constituye un método preciso para diferenciar la
PAI de la colangitis esclerosante primaria. Nakazawa et al [187] observado que
la presencia de una estructura tipo cinta, la apariencia de árbol podado y la
formación tipo divertículo son significativamente más frecuentes en pacientes
con colangitis esclerosante primaria. En contraste, el estrechamiento segmental,
la dilatación pre-estenótica y el estrechamiento del conducto biliar común distal
son significativamente más comunes en pacientes con PAI y colangitis
esclerosante.
1.9.5. Ultrasonografía endoscópica (USE)
La USE es la mejor técnica de imagen para detectar pequeñas masas
pancreáticas y para el diagnóstico de la PAI, ya que permite realizar biopsias
pancreáticas eficaces y seguras [188, 189].
63
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
En la PAI, la USE muestra una inflamación pancreática hipoecoica difusa,
y/o masas hipoecoicas en la cabeza del páncreas (Figura 8). Otro hallazgo
sugestivo de la PAI es la dilatación del conducto biliar común con
engrosamiento de su pared. El adelgazamiento de la pared del conducto biliar
presenta unas características únicas: es homogéneo, con una capa intermedia
hipoecoica y capas externa e interna hiperecoicas formando un patrón tipo
sándwich que puede alcanzar 5 mm de espesor (Figura 8) [190, 191]. En la
forma focal de la PAI se puede observar dilatación del conducto pancreático
principal mientras que en la forma difusa puede encontrarse comprimido por el
parénquima agrandado [190].
La punción aspirativa con aguja fina guiada por ultrasonografía endoscópica
(USE-PAAF) es una técnica sensible y específica para el diagnóstico de
malignidad pancreática. En contraste, el diagnóstico citopatológico de la PAI no
se encuentra estandarizado. La USE-PAAF de masas pancreáticas, de nódulos
linfoides y de la pared del conducto biliar común, revela la existencia de fibrosis
y de infiltrados linfoplasmocitarios; estos hallazgos se correlacionan con el
diagnóstico patológico [190]. Sin embrago, es difícil obtener suficiente tejido
pancreático para llegar a un diagnóstico definitivo sin hacer una laparotomía.
Se ha propuesto que el frotis citológico con fragmentos estromales ricos en
células inflamatorias y epiteliales es diagnóstico de la PAI [192].
La USE también proporciona la oportunidad de obtener biopsias por punción
con aguja gruesa. Levy et al [175] han estudiado su utilidad diagnóstica en tres
pacientes con sospecha de adenocarcinoma de páncreas. En dos de ellos la
PAI fue diagnosticada, mientras que en el otro se hizo el diagnóstico de
64
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
Figura 8. a) USE mostrando una lesión hipoecoica focal en la cabeza pancreática (PH) (flechas) y engrosamiento difuso de la pared del conducto biliar común (puntas de flecha). b) Patrón tipo sándwich de la pared del conducto biliar común, con una capa intermedia hipoecoica y capas externa e interna hiperecoicas (flechas). PV= Vena portal. Dig. Liver Dis 2010;42: 92–8. pancreatitis crónica. En todos ellos, esta técnica permitió evitar una cirugía
innecesaria.
1.10. Marcadores serológicos
Los pacientes con PAI presentan a menudo niveles séricos elevados de
enzimas pancreáticos, como amilasa y lipasa, aunque estos hallazgos no se
consideran específicos de la PAI [31, 54, 194]. Adicionalmente, la enfermedad
se asocia con hipergammaglobulinemia [6] y con niveles séricos elevados de
IgG4, y con la presencia en suero de varios autoanticuerpos, como los
anticuerpos anti-nucleares (ANA), anti-lactoferrina (LF), anti-anhidrasa
carbónica II (AC-II) ,anti-amilasa α-2A (AMY-2A) y anti-inhibidor de la secreción
de la tripsina pancreática (PSTI) [31-33, 193].
1.10.1. Niveles séricos elevados de inmunoglobulina G4 (IgG4)
La IgG4 es la subclase menos abundante en suero de IgG y representa de
un 3 a un 6% de la IgG total en individuos sanos. La IgG4 es la única subclase
de IgG que es incapaz de unir el C1q del complemento para activar la vía
clásica y que presenta baja afinidad por el antígeno diana [195].
65
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
Se han encontrado altas concentraciones séricas de IgG4 en un pequeño
número de condiciones patológicas, como en la dermatitis atópica [196],
enfermedades parasitarias [197], pénfigo vulgar y pénfigo foliáceo [198]. En
estas condiciones la IgG4 se considera un anticuerpo patológico. En pacientes
con dermatitis atópica, asma y en algunas enfermedades parasitarias, las
concentraciones séricas elevadas de IgE e IgG4 representan una respuesta
directa frente a antígenos exógenos [199]. En pacientes con pénfigo vulgar y
foliáceo, la IgG4 actúa como autoanticuerpo frente a las moléculas de adhesión,
desmogleina 1 y 3 [200, 201]. En pacientes con nefropatía membranosa se ha
escrito la presencia de inmunocomplejos con IgG4 en suero y de depósitos de
IgG4 en la superficie epitelial de la membrana basal glomerular [202, 203].
Hamano et al [113] fueron los primeros en mostrar que las elevaciones en
los niveles de IgG4 eran características de la PAI. Estos autores estudiaron 20
pacientes con PAI, 20 controles sanos y 154 pacientes con otras enfermedades,
incluyendo pancreatitis crónica, cáncer de páncreas, cirrosis biliar primaria,
CEP y SS, encontrando que los niveles séricos elevados de IgG4 (punto
de corte de 135 mg/dl) eran muy sensibles (95%) y específicos (97%) para
diferenciar la PAI del cáncer de páncreas
Aparisi et al [32] han analizado la importancia de los niveles séricos de IgG4
para el diagnóstico de la PAI. En este estudio multicéntrico participaron 227
sujetos de 5 hospitales españoles, incluyendo 54 pacientes con pancreatitis
crónica idiopática, 86 con pancreatitis crónica alcohólica, 33 con SS y 54
controles sanos. Estos autores concluyeron que los niveles séricos elevados de
IgG4 no son específicos de la PAI, ya que se encontraron en un 15% de los
66
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
pacientes con pancreatitis crónica idiopática y en un 8% de los pacientes con
pancreatitis crónica alcohólica [32].
Ghazale et al [204] han determinado la utilidad de la IgG4 sérica en el
diagnóstico de la PAI en una cohorte de 510 pacientes de Estados Unidos
Incluyendo 45 con PAI, 135 con cáncer de páncreas, 268 con otras
enfermedades pancreáticas y 62 sin enfermedad pancreática. La sensibilidad,
especificidad y valor predictivo positivo de los niveles séricos elevados de IgG4
(punto de corte de 140 mg/dl) para el diagnóstico de la PAI, fue de un 76%,
93% y 36%, respectivamente. Cuando usaron un punto de corte del doble de
los límites normales de IgG4 (280 mg/dl), los correspondientes valores fueron
de un 53%, 99% y 75%, respectivamente. En este estudio se encontraron
elevaciones de IgG4 en un 3-10% de pacientes sin PAI, incluyendo cáncer de
páncreas, pancreatitis aguda y crónica y ausencia de enfermedad pancreática.
Estos autores llegaron a la conclusión de que los niveles séricos elevados de
IgG4 son característicos pero no diagnósticos de la PAI [204].
Kamisawa et al [30], han analizado la correlación entre los niveles séricos de
IgG4 y la presencia de lesiones extrapancreáticas en la PAI. En 40 pacientes
con PAI, se midieron los niveles de IgG4 pre-tratamiento y se evaluaron
retrospectivamente 4 lesiones extrapancreáticas asociadas (colangitis
esclerosante, colecistitis esclerosante, sialadenitis esclerosante y fibrosis
retrperitoneal). Mediante un análisis, basado en curvas ROC, encontraron que
el punto de corte óptimo de los niveles de IgG4 en suero para diferenciar entre
pacientes con PAI sin y con lesiones extrapancreáticas, era de 220 mg/dl. En
consecuencia, los pacientes con niveles séricos de IgG4 superiores a 220
67
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
mg/dl tienen más lesiones extrapancreáticas asociadas y parecen presentar
una enfermedad más activa que aquellos con niveles inferiores a 220 mg/dl [30].
En el 2008 se ha publicado un meta-análisis donde se han revisado todos
los datos existentes en la literatura en ingles sobre el uso de los niveles séricos
de IgG4 en el diagnóstico y seguimiento de pacientes con PAI [205]. Se
seleccionaron 7 artículos acerca de la utilidad de la IgG4 en el diagnóstico de a
PAI, donde se incluyeron 159 pacientes con PAI y 1099 controles (Tabla 5).
Los criterios diagnósticos utilizados fueron, el japonés en 4 estudios [113, 173,
206, 207], el español en uno [32], el coreano en otro [208], y el de la Clínica
Mayo en el último [204]. Debido al uso de criterios diagnósticos diferentes, la
selección de los pacientes en los 7 estudios analizados fue heterogénea. El
punto de corte de los niveles elevados de IgG4 fue de 135 mg/dl en 5 de los
estudios [101, 173, 206-208], 130 mg/dl en uno [32] y 140 mg/dl en el restante
[204]. Globalmente, el rango de sensibilidad fue de un 66,7% a un 94,3% [206].
A pesar de la elevada heterogeneidad encontrada entre estos 7 estudios,
debido al empleo de diferentes criterios diagnóstico y controles, la sensibilidad
fue bastante alta, aunque serían necesarios nuevos estudios diseñados
específicamente, evitando estos factores de confusión, para determinar la
verdadera precisión de la IgG4 en el diagnóstico de la PAI [205]. Es importante
diferenciar la PAI del cáncer de páncreas, con respecto a ello se analizaron 4
estudios que comparaban la PAI con el cáncer de páncreas. La sensibilidad, la
especificidad y el OR (odd ratio) fueron significativamente heterogéneos entre
esos 4 estudios, aunque la IgG4 mostró una buena precisión para
la diferenciación entre esas dos condiciones.
68
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
TABLA 5. Detalles de los 7 estudios sobre la utilid ad de la IgG4 en el diagnóstico de la PAI
Estudio LR (mg/dl)
Criterios para PAI n Cáncer de páncreas
EAI Otras Nº total controles
Ghazale et al204 140 Criterios Clínica Mayo 45 135 - 330 465
Choi et al208 135 Criterios Coreanos 30 76 - 67 143
Hirano et al206 135 Criterios Japoneses 35 23 11 48 82
Hamano et al113 135 Criterios Japoneses 20 70 36 64 170
Aparisi et al32 130 Puntuación española 6 - 33 144 177
Uehara et al207 135 Criterios Japoneses 6 - 6 - 6
Kamisawa et al173 135 Criterios Japoneses 17 - 10 46 56
Total - - 159 304 96 699 1099
LR: Límite de referencia. EAI: Enfermedades autoinmunes
J Gastroenterol Hepatol 2009;24:15–36.
Con respecto a la utilidad de la IgG4 como marcador de eficacia del
tratamiento esteroideo en el seguimiento de pacientes con PAI, se incluyeron 4
estudios [88, 113, 164, 209] con un total de 34 pacientes. Los autores
concluyeron que la IgG4 era un marcador útil para evaluar la eficacia del
tratamiento esteroideo, sólo en pacientes con niveles séricos IgG4 elevados
previos al tratamiento. La tabla 6 muestra los datos de la literatura, subdivididos
de acuerdo a los tres análisis llevados a cabo: Análisis global de los 7 estudios
(análisis A), análisis de los 4 estudios que comparan la PAI con el cáncer de
páncreas (análisis B), análisis de los 5 estudios que comparan la PAI con
otras enfermedades autoinmunes no pancreáticas (análisis C).
69
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
TABLA 6. Detalles de los 7 estudios sobre la utilid ad de la IgG4 en el diagnóstico de la PAI
Estudio VP FP FN VN Sensibilidad (%)
Especificidad (%)
OR
Análisis A: PAI vs Co
Ghazale et al204
Choi et al208
Hirano et al206
Hamano et al113
Aparisi et al32
Uehara et al207
Kamisawa et al173
Total
34
22
33
18
4
6
14
131
32
9
4
0
8
0
6
59
11
8
2
2
2
0
3
28
433
134
78
170
169
6
50
1040
75,6(60,5-87,1)
73,3(54,1-87,7)
94,3(80,0-99,3)
90,0(88,3-98,8)
66,7(22,2-95,7)
100(54,1-100)
82,4(56,6-96,2)
82,4(75,6-88,0)
P=0,0078
93,1(90,4-95,2)
93,7(88,4-97,1)
95,1(88,0-98,7)
100(97,9-100)
95,5(91,3-98,0)
100(54,1-100)
89,3(78,1-96,0)
94,6(93,1-95,9)
P<0,001
40,0(18,8-85,3)
37,5(13,4-104,7)
233,8(47,3-54579)
2523(116,7–54579)
35,9(6,6–195,0)
169,0(2,9–9876)
32,2(7,7–133,8)
63.9(28.9–141.4)
P=0,071
Análisis B: PAI vs CP
Ghazale et al204
Choi et al208
Hirano et al206
Hamano et al113
Total
34
22
33
18
107
13
1
0
0
14
11
8
2
2
23
122
75
93
70
290
75,6(60,5–87,1)
73,3(54,1–87,7)
94,3(80,8–99,3)
90,0(68,3–98,8)
82,3(74,6–88,4)
P=0,043
90,4(84,1–94,8)
98,7 (92,9–100)
100(85,2–100)
100(94,9-100)
95,4(92,4–97,5)
P=0,001
27,2(11,4–65,1)
133,2(22,1–804,8)
629,8(28,9–13729)
1043(48,0–22685)
144,6 (24,l4–857,6)
P=0,021
Análisis C: PAI vs EAI
Hirano et al206
Hamano et al113
Aparisi et al32
Uehara et al207
Kamisawa et al173
Total
33
18
4
6
14
75
4
0
0
0
0
4
2
2
2
0
3
9
7
36
33
6
10
92
94,3(80,8–99,3)
90,0(68,3–98,8)
66,7(22,3–95,7)
100(54,1–100)
82,4(56,6–96,2)
89,3(80,6–95,0)
P=0,250
63,6(30,8–89,1)
100(90,3–100)
100(89,4–100)
100(54,1–100)
100(69,2–100)
95,8(89,7–98,9)
P=0,001
22,3(3,9–122,9)
540,2(24,6–11842)
120,6(5,0–2935)
169,0 (2,9–9876)
87,0(4,0–1870)
66,6(20,2–220,0)
0,444
Analisis A: Análisis global de los 7 estudios. Análisis B: Análisis de los 4 estudios que comparan la PAI con CP. Análisis C: Análisis de los 5 estudios que comparan la PAI con otras EAI. Valor P: test X2 de homogeneidad de sensibilidades, especificadades y OR entre los diferentes estudios. Entre paréntesis se muestra el intervalo de confianza de un 95% para la sensibilidad, especificidad y OR. Co: Controles. CP: Cáncer de páncreas. EAI: Enfermedades autoinmunes. OR: Odd ratio. FN: Falsos negativos. FP: Falsos positivos. VN: Verdaderos negativos. VP: Verdaderos positivos.
J Gastroenterol Hepatol 2009;24:15–36.
1.10.2 Autoanticuerpos
La PAI se asocia con la presencia en suero de numerosos autoanticuerpos,
principalmente los anticuerpos anti-LF, anti-AC II y anti-AMY-2A [31-33]. En
nuestra experiencia los anticuerpos anti-AC II junto con los nivéles séricos
elevados de IgG4 constituyen los marcadores serológicos más útiles para el
diagnóstico de la PAI [32].
70
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
11..1100..22..11.. AAnnttiiccuueerrppooss aannttii--aannhhiiddrraassaa ccaarrbbóónniiccaa ((AACC))
La AC es un metaloenzima dependiente de Zinc que cataliza la hidratación-
deshidratación reversible del CO2 y HCO3 mediante la siguiente reacción [210]:
CO2 + H2O ↔ H+ + HCO3
Como esta reacción es esencial en numerosos procesos fisiológicos, como
la respiración, el equilibrio ácido-base, el transporte iónico, la resorción ósea, la
acidificación renal, la gluconeogénesis o la ureagénesis; la AC se encuentra
presente en todos los tejidos y tipos celulares [211, 212]. La AC está
ampliamente distribuida en el tracto gastrointestinal, en particular en glándulas
salivares, duodeno, colon y tracto biliar [213]. Se han descrito 14 isoenzimas
de AC y AC asociadas a proteínas (AC-RP) [214]. Se pueden dividir en dos
tipos: intracelulares y extracelulares (Figura 9). Las ACs intracelulares incluyen
isoenzimas citoplasmáticos (AC I, II y III) e isoenzimas mitocondriales (AC VA y
VB). Las ACs extracelulares incluyen isoenzimas unidas a la membrana (AC
IV), una isoenzima secretada (AC VI) e isoformas de transmembrana (AC IX,
XII y XIV). En contraste a esas isoenzimas activas, la AC-RP VIII, IX Y XI se
consideran isoenzimas inactivas [215]. La actividad catalítica de la AC reside
en tres residuos de histidina de unión a Zinc [216].
1.10.2.1.a. Expresión de los isoenzimas de la AC en el páncreas
De todos los isoenzimas citoplasmáticos, la AC II es la que presenta mayor
actividad y una expresión más amplia en diferentes órganos y tipos celulares,
incluyendo el páncreas [211]. La AC II se encuentra en el citoplasma de las
células epiteliales de los conductos pancreáticos intra- e interlobulares [216].
71
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
Figura 9. Estructura molecular y localización subcelular de las isoenzimas de la anhidrasa carbónica (AC). Las isoenzimas se subdividen en 2 tipos: intracelulares y extracellares. GPI: glicofosfatidilinositol. PG: Dominios tipo proteoglicanos. TM: dominios transmembrana. IC: Cola intracitoplasmática. Dig Liver Dis 2001;33:68–74. En contraste, la AC I se expresa únicamente en las células A de los islotes
pancreáticos, mientras que la AC III no se expresa en la páncreas [216].
Con respecto a los isoenzimas mitocondriales, la AC VA y la AC VB
presentan una expresión específica de tejido, ya que la AC VA se expresa
únicamente en el hígado y la AC VB se encuentra en numerosos tejidos
incluyendo el páncreas (en las células B de los islotes pancreáticos), pero no
en el hígado [213].
En cuanto a los isoenzimas de transmembrana, la AC XII y la XIV también
muestran una expresión específica de tejido; la AC XII se expresa en páncreas
(en la membrana de las células epiteliales de los conductos pancreáticos),
riñones y glándulas salivares, mientras que la AC XIV se encuentra en hígado
y médula espinal [215]. Adicionalmente, la AC IX se expresa en páncreas (en
72
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
la membrana basolateral de las células epiteliales ductales), vesícula biliar y
tracto gastrointestinal [215].
Finalmente, de los isoenzimas unidos a la membrana, la AC IV se localiza en
el páncreas (en las células epiteliales ductales) [213], mientras que la CA VI se
encuentra en células acinares de páncreas y de glándulas salivares y
lacrimales [217, 218].
1.10.2.1.b. Papel fisiológico de los isoenzimas de la AC en el páncreas
La AC II, que abunda en el citoplasma de las células epiteliales ductales,
cataliza la hidratación del CO2 para generar HCO3. En consecuencia, la AC II
interviene en la producción del fluido isotónico rico en bicarbonato secretado
por las células ductales pancreáticas [219]. El bicarbonato secretado juega un
papel clave en el mantenimiento del jugo pancreático en un pH de neutro a
ligeramente básico, y en la neutralización del ácido gástrico en el tracto
intestinal superior para permitir la actuación de los enzimas digestivos [215].
Con respecto al papel fisiológico del resto de los isoenzimas de la AC en el
páncreas, Nishimori et al [215] han propuesto que las ACs juegan un
importante papel en la regulación del pH luminal en los conductos pancreáticos,
actuando como un mecanismo de defensa frente a la acidificación (figura 10).
El incremento de la presión intraduodenal conduce al reflujo ácido del
jugo duodenal a través del esfínter de Oddi hacia el sistema ductal pancreático.
El reflujo ácido puede inducir el daño de las células epiteliales del conducto
pancreático, conduciendo a la disminución del pH luminal. Un descenso del pH
por debajo de 6, conduce a la activación espontánea del tripsinógeno y de otras
proenzimas y a la agregación de proteínas secretoras [220], lo que puede
73
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
Figura 10. Papel fisiológico de la anhidrasa carbónica (AC) II. Hipótesis explicando la regulación del pH luminal en el páncreas. En páncreas, las células ductales tienen un contenido elevado de AC II en el citoplasma que cataliza la hidratación del CO2 a HCO3. Las células ductales también captan HCO3 mediante un cotransportador Na+/HCO3 en la membrana basolateral. Se cree que el HCO3 es secretado por una intercambiador Cl-/ HCO3 acoplado a un canal de Cl- regulado por cAMP. Se ha hipotetizado que la AC IV y probablemente la AC XII catalizan la reacción H+ + HCO3→ CO2 + H2O eliminado el exceso de ácido en forma de CO2
del lumen ductal. Esto constituye un sistema que mantiene el pH luminal en los conductos pancreáticos. CA: Anhidrasa carbonica. Dig Liver Dis 2001;33:68–74. desencadenar el desarrollo de pancreatitis y de otros procesos patológicos
[215]. Bajo estas condiciones ácidas, las AC extracelulares pueden catalizar la
reacción (H+ + HCO3→ CO2 + H2O) para eliminar el exceso de ácido del lumen
ductal.
1.10.2.1.c. Las AC como dianas antigénicas en la PAI
Nishimori et al [221-223] fueron los primeros en mostrar que pacientes con
pancreatitis crónica idiopática y SS, presentaban una respuesta inmunitaria
humoral y celular frente a una proteína de 60 kDa, que había sido aislada de
extractos pancreáticos porcinos y humanos. Para ello emplearon un anticuerpo
74
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
monoclonal, SP3-1, que además de dirigirse frente a esta proteína de 60 kDa,
también reaccionaba frente a las células ductales de numerosos órganos
exocrinos, incluyendo páncreas, glándulas salivares, lacrimales y esofágicas,
hígado (conductos biliares) y riñones (túbulos renales distales) [224].
Posteriormente este antígeno fue identificado como la AC II [49]. Desde
entonces, se han ido describiendo anticuerpos anti-AC II en el suero de
pacientes con enfermedades autoinmunes, como la PAI [31], colangitis
autoinmune [225], cirrosis biliar primaria [226, 227], LES [228, 229] y SS [228,
230]. La presencia de estos auto-anticuerpos puede representar la expresión
serológica de la participación del sistema inmunitario en un proceso
inflamatorio específico [231]. Adicionalmente, los anticuerpos anti-AC II podrían
desempeñar un papel patogénico en el desarrollo de enfermedades
autoinmunes en cepas de ratones predispuestas, ya que la inmunización activa
de ratones susceptibles con la AC II conduce a inflamación de glándulas
submandibulares [49] y a colangitis autoinmune [50].
La PAI se puede observar ocasionalmente como una complicación del SS, la
cirrosis biliar primaria, y/o la colangitis esclerosante [17, 165, 232, 233].
Basándose en estas evidencias clínicas, algunos autores han introducido el
concepto de “exocrinopatía autoinmune”, “síndrome seco” o “epitelitis
autoinmune” [234-236]; para hablar de una enfermedad compleja
desencadenada por una reacción inmunitaria frente a una diana antigénica
común expresada en las células epiteliales ductales de órganos exocrinos.
Uchida et al [237] han descrito el desarrollo de pancreatitis y sialoadenitis en
ratones timectomizados mediante la inmunización con AC II. Estos hallazgos
75
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
sugieren que la AC II puede ser una diana antigénica común en las células
epiteliales de múltiples órganos exocrinos [238].
En el suero de pacientes con pancreatitis crónica idiopática y SS, también se
han observado anticuerpos anti-AC I [109]. La AC I se expresa
mayoritariamente en glóbulos rojos, pero no en las células ductales de
glándulas exocrinas [211]. En esos pacientes los anticuerpos anti-AC I y anti-
AC II no presentan reactividad cruzada [109]. Una posible explicación de estos
hallazgos es que los autoanticuerpos inducidos primariamente por otro
isoenzima de la AC pueden presentar reactividad cruzada con la AC I y la AC
II [238]. Basándose en esta hipótesis, Nishimori et al [238] han estudiado la
presencia de anticuerpos frente a la CA IV, IX y XII, isoenzimas expresados en
las células ductales del páncreas, en el suero de pacientes con PAI y SS;
encontrando anticuerpos séricos anti-AC IV. La AC IV se expresa en las
células epiteliales de varios órganos; incluyendo la vesícula biliar y conductos
biliares [239], túbulo contorneado proximal y el asa de Henle [240], intestino
delgado y grueso [241], esófago [242], y glándulas salivares [243]. En contraste
con la expresión ubicua de la AC II [211], la presencia de la AC IV se
encuentra más restringida a los tejidos y tipos celulares donde se han
observado lesiones inflamatorias en pacientes con PAI y enfermedades
asociadas [238]. Por ello, se ha sugerido que la AC IV podría desempeñar un
importante papel en la patogénesis de la epitelitis autoinmune, incluyendo la
PAI y el SS.
76
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
1.10.2.1.d. Anticuerpos anti-AC II como marcadores serológicos en la PAI
Desde el nacimiento de la PAI como una nueva entidad clínica en 1995 [5],
los anticuerpos anti-AC II surgieron como marcadores serológicos candidatos
de la enfermedad [31, 231].
Ya en 1994, Nishimori et al [223] observaron que un 30% de pacientes con
pancreatitis crónica idiopática y un 27% de pacientes con SS, presentaban en
suero anticuerpos frente a una proteína pancreática desconocida , que fue
identificada posteriormente como AC II. En 1996, Kino-Ohsaki et al [230]
detectaron la presencia de anticuerpo anti-AC II en un 33% de pacientes con
pancreatitis crónica idiopática.
Frulloni et al [231] en el 2000, evaluaron la presencia de anticuerpos anti-AC
I y anti-AC II en un estudio prospectivo que incluyó 78 pacientes con
pancreatitis crónica, encontrando anticuerpos anti-AC I en un 26% de los
pacientes y anticuerpos anti-AC II en un 27%. En comparación con sujetos
sanos, la frecuencia de anticuerpos anti-AC II en pacientes con PAI fue de un
88,9%, sin embargo estos autoanticuerpos también se detectaron en pacientes
con otras enfermedades pancreáticas y en pacientes con SS. Estos hallazgos
sugieren que los anticuerpos anti-AC II no son un marcador específico de la
PAI.
Aparisi et al [32] en el 2004, analizaron la importancia de los anticuerpos
anti-AC II y de los niveles de IgG4 en suero para el diagnóstico de la PAI en un
estudio multicéntrico donde participaron 227 sujetos de 5 hospitales españoles.
Los anticuerpos anti-AC II se detectaron en un 28% de pacientes con
pancreatitis crónica idiopática. Adicionalmente, se encontró una fuerte
77
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
asociación entre los niveles séricos aumentados de IgG4, la presencia de
anticuerpos anti-CA II y las manifestaciones compatibles con la PAI.
11..1100..22..22.. AAnnttiiccuueerrppooss aannttii--llaaccttooffeerrrriinnaa ((LLFF))
La LF es una proteína de unión a hierro presente principalmente en
secreciones externas, como la leche materna, y en leucocitos
polimorfonucleares [244]. La proteína es liberada por leucocitos
polimorfonucleares activados, y su presencia en los fluidos corporales es
proporcional al flujo de neutrófilos [245, 246]. En consecuencia, la
determinación del contenido de LF en los fluidos corporales se considera un
marcador de inflamación [245].
La LF se encuentra normalmente presente a bajas concentraciones en las
secreciones pancreáticas y tiende a incrementarse en la pancreatitis crónica
[247].
La presencia de anticuerpos anti-LF se ha descrito en numerosas
enfermedades autoinmunes, como la PAI [31, 148, 165, 247-249], hepatitis
autoinmune [250, 251], LES [252], enfermedad de Crohn [165], colangitis
esclerosante primaria [250, 251], cirrosis biliar primaria [250], y DM tipo 1 (DM-
1) [73, 249].
Hardt et al analizaron la presencia de anticuerpos anti-LF en 48 pacientes
con pancreatitis crónica no alcohólica y 48 con DM-1, encontrando una
frecuencia de un 21% en los primeros y de un 8,3% en los segundos [249]. En
otro estudio realizado por Okazaki et al [53] los anticuerpos anti-LF se
detectaron en un 75% de 30 pacientes con PAI. Taniguchi et al también
observaron anticuerpos anti-LF en un 67% de 43 pacientes con DM-1.
78
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
En consecuencia, el valor diagnóstico y pronóstico de estos autoanticuerpos
en la pancreatitis PAI es limitado, debido a su baja sensibilidad y especificidad
[253].
Desde el punto de vista patogénico, la asociación de la PAI con
enfermedades autoinmunes extrapancreáticas y de los anticuerpos anti-LF con
la PAI y enfermedades hepáticas, sugiere que la LF podría ser una diana
antigénica común; ya que se encuentra presente en varios tejidos, incluyendo
el páncreas, hígado, tracto biliar y leucocitos. No esta claro si los anticuerpos
anti-LF son un simple epifenómeno del proceso autoinmune o si podrían jugar
un papel patogénico en la iniciación y perpetuación de la PAI [253].
11..1100..22..33.. AAnnttiiccuueerrppooss aannttii--aammiillaassaa αα--22AA ((AAMMYY αα--22AA))
La elevación de la amilasa en suero se considera un marcador típico de la
pancreatitis aguda, generalmente tres veces por encima de su valor normal.
Sin embargo, su especificidad es menor de un 70%, ya que se puede elevar en
otras muchas condiciones. En contraste, la mayoría de los pacientes con
pancreatitis crónica y PAI, suelen presentar niveles normales o ligeramente
aumentados de amilasa en suero.
En el 2002 Barera et al [254] describieron la existencia de hiperamilasemia
en una niña con enfermedad celiaca e hipotiroidismo. La hiperamilasemia
llevó a la sospecha de de pancreatitis crónica, sin embargo no se demostró
daño pancreático. En contraste observaron la presencia anticuerpos frente a la
amilasa porcina y su desaparición con la instauración de la dieta libre en gluten.
Este estudio constituye la primera evidencia de la presencia de
anticuerpos anti-amilasa en pacientes con ciertas enfermedades autoinmunes.
79
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
Endo et al [32] han analizado la presencia de anticuerpos frente a la AMY α
en pacientes con PAI. Los autores enfrentaron sueros de pacientes con PAI
con una librería de cDNA de páncreas humano y seleccionaron los clones
positivos. Mediante análisis de secuenciación observaron que 7 de 10 clones
positivos tenían una secuencia idéntica a la amilasa humana α-2A. A
continuación, desarrollaron una técnica de ELISA empleando una proteína
recombinante AMY α-2A, para detectar anticuerpos frente a la AMY α-2A en
15 pacientes con PAI, 25 con pancreatitis crónica alcohólica y 25 con cáncer
de páncreas. Los anticuerpos anti-AMY α-2A se encontraron en el 100% de los
pacientes con PAI, mientras que ninguno de los pacientes con pancreatitis
crónica alcohólica y cáncer de páncreas presentaron estos autoanticuerpos.
Adicionalmente estudiaron la presencia de anticuerpos anti-AC II y anti-LF en el
grupo de pacientes con PAI, encontrando una frecuencia de un 66% en los
primeros y de 53% en los segundos. En consecuencia concluyeron que los
anticuerpos anti-AMY α-2A podrían constituir un marcador mas sensible para el
diagnóstico de la PAI, que los anticuerpos anti-AC II y los anticuerpos anti-LF.
11..1100..22..44.. AAnnttiiccuueerrppooss aannttii--iinnhhiibbiiddoorr ddee sseeccrreecciióónn ddee ttrriippssiinnaa ppaannccrreeááttiiccaa ((PPSSTTII))
El PSTI es un péptido de 56 aminoácidos sintetizado en las células acinares
del páncreas que se colocaliza con el tripsinígeno en forma de gránulos de
zimógeno [255]. El PSTI inhibe aproximadamente el 20% de la actividad de
tripsina contenida en el páncreas mediante el bloqueo de su centro activo [255,
256]. En situaciones de estrés pancreático (por ejemplo, por una ingesta
excesiva de alcohol) se puede saturar la capacidad protectora del PSTI como
consecuencia de la activación aberrante del tripsinógeno, desencadenándose
80
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
pancreatitis [257-258]. Junto a su efecto protector en las células acinares del
páncreas, el PSTI también inhibe la activación del tripsinógeno en el conducto
pancreático principal [259]. Hay estudios que sugieren que la mutación exónica
N34S en el gen de la PSTI esta estrechamente asociada con la patogénesis de
la pancreatitis hereditaria y la pancreatitis crónica idiopática [260-261].
En el 2006, Asada et al [193] describieron la presencia anticuerpos anti-
PSTI en pacientes con PAI. En este estudio fueron reclutados 26 pacientes con
PAI, 53 con otras enfermedades pancreáticas y 12 sujetos sanos. Los
anticuerpos anti-PSTI se detectaron en un 42,3% mediante Western blot y en
un 30,8% mediante ELISA de los pacientes con PAI, mientras que ninguno de
los individuos de los otros dos grupos presentaron estos autoanticuerpos. Cabe
destacar que los anticuerpos anti-PSTI fueron de la subclase IgG1, y no de la
subclase IgG4, considerada más específica de la PAI. Adicionalmente,
estudiaron la presencia de anticuerpos anti-AC II y anti-LF en el grupo de
pacientes con PAI, encontrando un 90% de sueros positivos para alguno de
estos dos marcadores, y un 30% de positivos para los dos marcadores. Dentro
del 10% de pacientes sin anticuerpos anti-AC II y anti-LF, 2 de 3 tenían
anticuerpos anti-PSTI. En consecuencia, algunos pacientes con PAI podrían
ser diagnosticados únicamente con los anticuerpos anti-PSTI. Estos hallazgos
sugieren que los anticuerpos anti-PSTI son altamente específicos de la PAI, ya
que no se detectaron en pacientes con otras enfermedades pancreáticas, y
podrían constituir un nuevo marcador diagnóstico para diferenciar la PAI de
otras enfermedades pancreáticas.
81
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
Se desconoce cómo los anticuerpos anti-PSTI pueden contribuir al desarrollo
de PAI. Una posibilidad es que los autoanticuerpos podrían neutralizar e inhibir
la acción del PSTI, conduciendo a una activación excesiva de la tripsina en el
páncreas [193].
11..1100..22..55.. AAnnttiiccuueerrppooss aannttii--ppééppttiiddoo ddee llaa pprrootteeíínnaa ddee uunniióónn aall ppllaammiinnóóggeennoo ((PPBBPP))
Frulloni et al [262] buscaron dianas antigénicas relevantes en la patogénesis
de la PAI, mediante el enfrentamiento de una librería aleatoria de péptidos con
un pool de IgG obtenido de 20 pacientes con PAI, para obtener péptidos
recocidos específicamente por estos anticuerpos. Como la infección por
H.pylori se ha relacionado con la patogénesis de la PAI [25, 34, 40], los autores
compararon estos péptidos con secuencias proteicas conocidas de la bacteria,
encontrando un elevado grado de homología con un péptido de la proteína de
unión la plasminógeno (PBP) codificado por H.pylori. A continuación analizaron
la presencia de anticuerpos IgG frente a este péptido en 20 pacientes con PAI,
40 con cáncer de páncreas y 40 controles sanos, encontraron una frecuencia
de un 95% en los primeros y de un 10% en los segundos. En contraposición,
ninguno de los controles sanos presentó estos autoanticuerpos. Estos estudios
han permitido identificar un nuevo marcador serológico de la PAI, sin embargo
no es específico de la enfermedad, ya que se encuentra presente en algunos
pacientes con cáncer de páncreas.
Adicionalmente, se ha encontrado homología entre el péptido PBP y la
ubiquitina-proteína ligasa E3 (URB3) humana, expresada en niveles elevados
en células acinares del páncreas, sugierendo que las células acinares del
páncreas pueden constituir una diana antigénica importante en la PAI [262].
82
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
11..1100..22..66.. AAnnttiiccuueerrppooss aannttii--ttrriippssiinnóóggeennoo ((PPRRSSSS))
Como la PAI es un proceso inflamatorio mediado por una respuesta
inmunitaria dirigida frente a componentes epiteliales del páncreas, Löhr et al
[263] han buscado dianas antigénicas clave en este proceso inflamatorio. Para
ello han analizado el perfil de expresión génica y proteica en muestras de tejido
pancreático de 12 pacientes con PAI y lo han comparado con el de 8 con
pancreatitis cónica. El perfil de expresión génica de los pacientes con PAI
mostró 272 genes sobre-regulados, incluyendo los codificantes de
inmunoglobulinas y de quimiocinas y sus receptores, y 86 genes infra-
regulados, incluyendo los codificantes de proteasas pancreáticas, como las tres
isoenzimas del tripsinógeno (PRSS1, 2 y 3). El perfil de expresión proteica
mostró una reducción significativa de la expresión de proteasas pancreáticas,
como el tripsinógeno. Como estos enzimas son sintetizadas por las células
acinares del páncreas, los autores analizaron el número de células acinares
positivas para tripsina mediante inmunohistoquímica y Western blot,
encontrando que estaba correlacionado con la disminución de la expresión de
tripsinógeno observada en el perfil proteico. Estos hallazgos sugieren que el
proceso inflamatorio característico de la PAI podría conducir a la destrucción
irreversible de las células acinares del páncreas y, en consecuencia, a una
deficiencia de proteasas. Adicionalmente, se analizó la presencia de
anticuerpos dirigidos frente a los tres isoenzimas del tripsinógeno y frente al
PSTI, presentes en las células acinares del páncreas, en pacientes con PAI
y con pancreatitis crónica. Los autores encontraron anticuerpos frente a PRSS1
y 2, pero no contra el isoenzima 3, y frente al PSTI, en pacientes con PAI;
83
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
mientras que ninguno de los pacientes con pancreatitis crónica presentó estos
autoanticuerpos. Estos datos sugieren que no sólo los anticuerpos anti-PSTI,
sino también los anti-PRSS podrían constituir un marcador serológico
importante en la PAI.
1.12. Diagnóstico de la PAI
1.12.1. Criterios diagnósticos
En 1995 Yoshida et al [264] describieron una lista de 12 características
sugestivas de PAI, pero no llegaron a constituir unos criterios clínicos útiles
para su diagnóstico. Los primeros criterios diagnósticos para la PAI fueron
propuestos por la Sociedad Japonesa de Páncreas en el 2002 [265] y
revisados en el 2006 [266]. En el 2006, fueron propuestos los criterios
diagnósticos de Corea [267] y de Estados Unidos [268].
11..1122..11..11.. CCrriitteerriiooss ddiiaaggnnóóssttiiccooss jjaappoonneesseess
Los criterios diagnósticos japoneses [15, 265] del 2002, incluyen tres items:
1. Estudios de imagen: Aumento difuso del páncreas y estrechamiento
irregular del conducto pancreático principal (más de 1/3 del páncreas).
2. Datos de laboratorio: Incremento de los niveles séricos de
gammaglobulinas o de IgG, o la presencia de autoanticuerpos.
3. Examen histológico del páncreas: Infiltración linfoplasmocitaria y fibrosis.
El diagnostico de la PAI se hace cuando están presentes los tres items o el 1
junto con el 2 o el 3, siendo esencial la presencia de hallazgos radiológicos
compatibles con la enfermedad. Estos criterios fueron desarrollados para
poder diferenciar la PAI del cáncer de páncreas. A medida que se fueron
diagnosticando más casos de PAI, se pudo observar que en muchos de ellos
84
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
TABLA 7 . Criterios diagnósticos para la PAI (2006) en Japón
1. Estudios de imagen (US, CT o RM): Estrechamiento difuso o segmentario del conducto pancreático principal con pared irregular y aumento difuso o focal del páncreas.
2. Estudios de laboratorio: Aumento de γ-globulinas, IgG o IgG4 en suero, o presencia de autoanticuerpos como anticuerpos antinucleares y factor reumatoide.
3. Estudios histopatológicos: Marcada fibrosis interlobular e infiltración de linfocitos y células plasmáticas en el área periductal, ocasionalmente con folículos linfoides en el páncreas.
Diagnóstico de la PAI establecido cuando se cumple el criterio 1 junto con el 2 y/o el 3. Es necesario excluir enfermedades malignas, como cánceres de páncreas o biliar.
US:Ultrasonografía. CT:Tomografía computerizada.RM: Resonancia magnética.
J Clin Gastroenterol 2008;42:404–7
el grado de estrechamiento del conducto pancreático principal era inferior a 1/3
del páncreas y que los niveles séricos de IgG4 estaban siginificativamente
elevados. En consecuencia, los criterios fueron revisados en el 2006 [269]
(Tabla 7), sustituyendo el requerimiento de “más de 1/3 de de páncreas” por
estrechamiento segmentario el conducto pancreático principal y añadiendo los
niveles aumentados de IgG4 al criterio de laboratorio. Además los criterios del
2006 hacen énfasis en excluir enfermedades malignas como los cánceres de
páncreas y biliar, antes de hacer el diagnóstico de la PAI.
11..1122..11..22.. CCrriitteerriiooss ddiiaaggnnóóssttiiccooss ccoorreeaannooss
Los criterios diagnósticos coreanos [267], propuestos por el “Asan Medical
Center” en el 2006, estratifican la PAI en “definitiva”, “probable” y “posible”
(Tabla 8). Junto a los criterios japoneses, los coreanos incluyen respuesta a la
terapia esteroidea y la presencia de lesiones extrapancreáticas. La categoría
de PAI definitiva incluye los mismos criterios que los japoneses. Cuando los
pacientes presentan únicamente las características típicas de la PAI en los
85
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
TABLA 8 . Criterios diagnósticos para la PAI (2006) en Corea
1. Estudios de imagen (esencial): a. CT: Aumento difuso o focal del páncreas b. CPRE: Estrechamiento difuso o segmentario del conducto pancreático principal
2. Estudios de laboratorio: a. Aumento de IgG o IgG4 en suero b. Presencia de autoanticuerpos
3. Estudios histopatológicos: Marcada fibrosis interlobular e infiltración de linfoplamocítica
4. Asociación con otras enfermedades autoinmunes
Definitivo: Criterio 1+2+3+4 o 1+2+3 o 1+3 Probable: 1+4. Rediagnosticado como definitivo si existe respuesta a esteroides Posible: Sólo 1. Rediagnosticado como definitivo si existe respuesta a esteroides
Los pacientes son estratificados en: definitiva, posible y probable
US:Ultrasonografía. CPRE: Colangio-pancreatografía retrógada endoscópica
J Clin Gastroenterol 2008;42:404–7
estudios de imagen, o junto con varias lesiones extrapancreáticas, son
diagnosticados como PAI posible. La respuesta de los pacientes a la terapia
esteroidea conduce a la resolución del estrechamiento del conducto
pancreático principal y permite reasignarles en la categoría de PAI definitiva.
11..1122..11..33.. CCrriitteerriiooss ddiiaaggnnóóssttiiccooss ddee EEssttaaddooss UUnniiddooss
En Estados Unidos, los criterios diagnósticos de la PAI fueron propuestos
por la Clínica Mayo en el 2006 (criterios HISORt) [268]. Según estos criterios la
PAI puede ser diagnosticada en pacientes que cumplan ≥1 de los siguientes
ítems (Tabla 9):
1. Estudios histológicos: Pancreatitis esclerosante linfoplasmocitaria o
densa infiltración de células plasmáticas IgG4+.
2. Hallazgos de imagen compatibles en la CT junto con niveles séricos
aumentados de IgG4.
86
INTRODUCCIÓN
TABLA 9 . Criterios diagnósticos para la PAI ( Criterios HI SORT, Clínica Mayo)
1. Histología (al menos uno de los siguientes): a. Infiltrado linfoplasmocitario periductal, flebitis obliterativa y fibrosis estoriforme (LPSP) b. Infiltrado linfoplasmocitario con fibrosis estoriforme y abundantes células plasmáticas IgG4+ (10 células/HPF)
2. Estudios de imagen a. Típico: Aumento difuso del páncreas con una cápsula tipo anillo de baja densidad y estrechamiento irregular del conducto pancreático principal b. Otros: Masas pancreáticas focales/aumento, constricción ductal pancreática focal, atrofia pancreática, calcificación pancreática o pancreatitis.
3. Estudios serológicos: Niveles séricos aumentados de IgG4 (normal 8-140 mg/dl)
4. Otra afectación orgánica: Constricción biliar hiliar/intrahepática, constricción biliar distal persistente, afectación glandular parótida/lacrimal, linfadenopatía mediastinal, fibrosis retroperitoneal
5. Respuesta a la terapia esteroidea: Resolución/marcada mejoría de las manifestaciones pancreáticas/extrapancreáticas con la terapia esteroidea
Grupos diagnóstico a
Grupo A. Diagnóstico por histología pancreática (presencia ≥ 1 de los siguientes criterios):
* Muestra demostrando el espectro completo de LPSP * ≥ 10 células IgG4+/HPF en la inmunohistoquímica de infiltrados linfoplasmocitarios
Grupo B. Imagen típica + serología (presencia de los siguientes criterios):
* Aumento difuso del páncreas con cápsula tipo anillo de baja densidad mediante CT o RM * Pancreatograma mostrando el conducto pancreático difusamente irregular * Niveles séricos aumentados de IgG4
Grupo C. Respuesta a corticosteroides (presencia de los siguientes criterios):
* Enfermedad pancreática idiopática, después de descartar otras causas * Niveles séricos aumentados de IgG4 y otra afectación orgánica confirmada por la presencia de numerosas células IgG4+ * Resolución/marcada mejoría de las manifestaciones pancreáticas/extrapancreáticas con la terapia esteroidea
a:Los pacientes que cumple los criterios para 1 o más grupos son diagnosticados con PAI
HPF: Campo de alta resolución. CT: Tomografía computerizada. RM: Resonancia magnética. LPSP: Pancreatitis esclerosante linfoplasmocitaria.
Clin Gastroenterol Hepatol 2006;4:1010–6.
87
INTRODUCCIÓN
3. Respuesta a la terapia esteroidea de las lesiones pancreáticas y/o
extrapancreáticas.
EL criterio histológico constituye el “gold standard” para el diagnóstico de la
PAI, de modo que en la Clínica Mayo muchos pacientes son diagnosticados
utilizando únicamente este criterio.
11..1122..11..44.. CCoommppaarraacciióónn ddee llooss ttrreess ccrriitteerriiooss
Los criterios japoneses revisados [266] requieren de la presencia de los
hallazgos de imagen característicos de la PAI, y de al menos 1 de los criterios
de laboratorio o histopatológicos. Los criterios coreanos [267], añaden a los
japoneses la respuesta a la terapia esteroidea y la presencia de lesiones
extrapancreáticas. Usando los criterios de la Clínica Mayo [268], la PAI puede
ser diagnosticada únicamente en base a la existencia de hallazgos histológicos
compatibles, a la presencia del criterio de imagen junto con la elevación de los
niveles séricos de IgG4 y/o afectación extrapancreática.
Es importante evitar el diagnóstico erróneo de la PAI como cáncer de
páncreas y viceversa. Los criterios japoneses se basan en unas características
de consenso mínimas, para reducir el riesgo de diagnóstico erróneo de la PAI
como malignidad. Cuando se añade la respuesta a la terapia esteroidea a estos
criterios, aumenta la sensibilidad diagnóstica. Los investigadores coreanos
recomiendan realizar un ensayo de repuesta a terapia esteroidea en los casos
en que no se cumplan por completo los criterios diagnósticos japoneses. Como
la remisión del estrechamiento del conducto pancreático con la terapia
esteroidea se puede ver a las dos semanas del comienzo del tratamiento en
pacientes con PAI, los investigadores coreanos recomiendan realizar un
88
INTRODUCCIÓN
ensayo de respuesta a terapia esteroidea para diferenciar entre la PAI y el
cáncer de páncreas [267].
1.12.2. Diagnóstico de la PAI tipo 1
Se puede establecer mediante los criterios HISORt [268] y también,
salvando pequeñas diferencias, mediante los criterios consenso asiáticos [270].
11..1122..22..11.. EEssttuuddiiooss ddee iimmaaggeenn ++ sseerroollóóggííaa oo hhiissttoollooggííaa ccoommppaattiibblleess
En un paciente con hallazgos de imagen característicos (aumento difuso del
páncreas y estrechamiento irregular del conducto pancreático principal), y
elevación de los niveles séricos de IgG4 o histología compatible, se puede
diagnosticar con toda claridad la PAI tipo 1 [41]. La presencia de
autoanticuerpos, como los ANA o el factor reumatoide, podrían utilizarse como
marcadores serológicos, cuando no se han podido medir los niveles séricos de
IgG4 [271].
11..1122..22..22.. DDiiaaggnnóóssttiiccoo hhiissttoollóóggiiccoo//iinnmmuunnoohhiissttooqquuíímmiiccoo
De acuerdo con los criterios HISORt [271], los hallazgos histológicos son
suficientes para hacer el diagnóstico de la PAI tipo 1. En los criterios consenso
asiáticos también se han incluido los estudios histológicos [270], aunque a
diferencia de la Clínica Mayo, sólo se pueden realizar en muestras quirúrgicas
y no en biopsias pancreáticas.
La histología pancreática muestra las tres características clave de la LPSP
(densos infiltrados linfoplasmocitarios generalmente rodeando a pequeños
conductos, fibrosis estoriforme y flebitis obliterativa). De acuerdo con los
criterios HISORt, el diagnóstico de la PAI se puede realizar cuando estos
rasgos histológicos están presentes en, al menos, un 20% de las biopsias, o
89
INTRODUCCIÓN
mediante inmunomarcaje para IgG4, cuando se observan > 10 células IgG4+
por campo de alta resolución (HPF). Se han descrito inmunomarcajes para
IgG4 falsos positivos en pacientes con cáncer de páncreas [42, 152], en
consecuencia se debe evitar el diagnóstico de la PAI tipo 1 cuando se observan
células IgG4+ en ausencia del patrón histológico de la LPSP.
11..1122..22..33.. RReessppuueessttaa aa eesstteerrooiiddeess
Los pacientes con PAI tipo 1 responden drásticamente a la terapia
esteroidea [272]. En estos pacientes, la inflamación pancreática y el
estrechamiento del conducto pancreático principal se resuelve varias semanas
después del comienzo del tratamiento.
1.12.3. Diagnóstico de la PAI tipo 2
Todos los criterios diagnósticos publicados para la PAI están orientados
hacia el diagnóstico de la PAI tipo 1.
Una posible aproximación diagnóstica, es la presentación de la PAI tipo 2 en
pacientes jóvenes con ictericia obstructiva (descartando la existencia de cáncer
de páncreas), que no presentan ni marcadores serológicos, ni afectación
extrapancreática, con excepción de la enfermedad inflamatoria intestinal [41].
Sin embargo, más de un 25% de los pacientes con PAI tipo 1 (con confirmación
histológica) son seronegativos y un 30-40% no presentan afectación
extrapancreática [41]. En consecuencia, debido a la ausencia de un marcador
que se correlacione específicamente con el patrón histológico de la PAI tipo 2,
es difícil realizar un diagnóstico definitivo en ausencia de estudios histológicos.
Esta puede ser la razón por la cual el número de casos descritos de PAI tipo 2
es muy inferior al de casos de PAI tipo 1 [41].
90
INTRODUCCIÓN
1.13. Tratamiento
Los corticosteroides constituyen la primera línea de tratamiento en la PAI,
conduciendo a menudo a rápidas y drásticas tasas de respuesta [78, 113, 273-
275]. Aunque no se ha descrito la remisión espontánea en la PAI, el uso de
corticosteroides parece acelerar la recuperación y prevenir las recurrencias
[273].
Antes de iniciar el tratamiento, la sospecha de PAI debe de ser alta. Una vez
iniciada la terapia, los pacientes requieren de un seguimiento estrecho,
especialmente en caso de presentar algún síntoma más consistente con
malignidad que con PAI, como por ejemplo gran pérdida de peso, anorexia o
sudores nocturnos [276].
El tratamiento puede conducir a la desaparición de los síntomas clínicos
(como insuficiencia pancreática endocrina o síntomas de pancreatitis aguda) o
de las manifestaciones extrapancreáticas (como ictericia por afectación biliar o
sialadenitis) [75, 272, 273,277-279]. También puede llevar a la mejoría de las
alteraciones estructurales, por ejemplo del conducto pancreático principal [70].
El grado de respuesta estructural depende de la extensión de la fibrosis versus
inflamación; de modo que los pacientes con mayor grado de lesión inflamatoria
presentan mayor tasa de respuesta estructural, mientras que el predominio de
lesiones fibróticas no permite la remisión completa [273].
El protocolo de tratamiento corticosteroideo exacto en pacientes con PAI no
se encuentra estandarizado. La mayoría de los profesionales médicos inician la
terapia con 30-40 mg de prednisona diaria. Estas dosis son generalmente
efectivas para inducir la remisión. La resolución de los síntomas es
91
INTRODUCCIÓN
generalmente rápida, a las 2-3 semanas de inicio del tratamiento, mientras que
la remisión serológica (normalización de IgG4) y radiológica ocurre
generalmente en un periodo de semanas a meses [273].
En la Clínica Mayo, el tratamiento de los pacientes con PAI se realiza con
una disminución gradual de esteroides. La terapia se inicia con una dosis de
prednisona de 40 mg/día durante 4 semanas. Después de este periodo se
evalúa la respuesta clínica, radiológica y serológica al tratamiento. Si existe
respuesta, se va bajando la dosis de prednisona 5mg/semana hasta quitarla
por completo. Durante el tratamiento es necesario seguir los niveles de IgG4,
generalmente se produce un descenso (aunque no necesariamente
normalización) a las 4 semanas de inicio del tratamiento (Figura 11).
Entre un 30% y un 40% de pacientes presentan recaída clínica o radiológica
tras el tratamiento, requiriendo re-tratamientos durante un periodo prolongado
de tiempo [78, 85, 272, 280]. Las recaídas suelen ocurrir en un corto periodo de
tiempo, y pueden ser sintomáticas, serológicas o histológicas.
No esta claro si ciertos tipos de afectación orgánica son más propensos a
recaída que otros. Ghazale et al [85] observaron que en los pacientes con IAC
tratados con corticosteroides durante 11 semanas, aquellos que presentaban
afectación biliar proximal recaían con una tasa de un 65%, mientras que los
que presentaba constricción de la estructura biliar intrahepática del conducto
biliar común distal recaían con una tasa de un 25%. Cuando los pacientes
recaen tras el tratamiento con un segundo curso prolongado de esteroides, se
hace necesario el un tratamiento inmunosupresor crónico, como la terapia
92
INTRODUCCIÓN
Diagnóstico de Pancreatitis autoinmune
Comienzo Prednisona 40 mg/día. 4 Semanas
A las 4 semanas:Medir IgG4 y repetir estudios de imagen
Respuesta clínica, ↓ IgG4, mejoría radiológica
Sin cambios en síntomas, niveles de IgG4 o estudios radiológicos
Considerar diagnóstico alternativoDisminuir prednisona5 mg/semana hasta cero
Medir IgG4 y repetir estudios imagen a las 4-6 semanas de finalizar el tratamiento
No síntomas, ↓ IgG4, mejoría radiológica
Seguimiento clínico y radiológico seriado (6 meses inicialmente)
Recaída clínica, serológicao de imagen
> 1 recaída, iniciar terapia inmunosupresora crónica
Figura 11. Algoritmo para el tratamiento de la PAI. Datos recientes sugieren que la recaída de tras la retirada de la terapia esteroidea se produce en un 70% de pacientes con constricción de estructuras biliares extrahepáticas o intrahepáticas. Gastroenterology 2008;134:706–15.
93
INTRODUCCIÓN
crónica con prednisona, azatioprina o –mercaptopurina [276]. Aunque hay
pocos estudios que evalúen la eficacia del tratamiento a largo plazo de la PAI
con la terapia inmunosupresora, en la Clínica Mayo se han obtenido respuestas
favorables con este tipo de tratamientos [281].
1.14. Diagnóstico erróneo
La ausencia de un único test diagnóstico, el desconocimiento del espectro
clínico completo y la falta de consenso internacional en los criterios
diagnósticos de la PAI, ha conducido a un diagnóstico cambiante de la
enfermedad. Por otro lado, el aumento del conocimiento de la PAI ha
incrementado la probabilidad de considerara dentro del diagnóstico diferencial
de las distintas enfermedades pancreáticas. En consecuencia, el número de
pacientes diagnosticados erróneamente de PAI y a la inversa, ha ido
incrementando. El diagnóstico erróneo ocurre esencialmente en tres
situaciones [282]:
1. Pacientes con adenocarcinoma de páncreas o colangitis tratados con
corticosteroides a largo plazo y/o inmunoduladores.
2. Pacientes con dolor abdominal crónico tratados con corticosteroides
y/o inmunomoduladores.
3. Pacientes con PAI sometidos erróneamente a cirugía.
1.14.1. Diagnóstico erróneo de cáncer de páncreas como PAI
El diagnóstico erróneo de PAI en pacientes con adenocarcinoma de
páncreas supone la peor situación, ya que cualquier retraso en el diagnóstico
puede cerrar la estrecha ventana terapéutica para la resección quirúrgica del
adenocarcinoma de páncreas [282].
94
INTRODUCCIÓN
En pacientes con ictericia obstructiva, la malignidad pancreática debería de
ser considerada hasta que se demuestre lo contrario, especialmente si los
estudios radiológicos muestran masas pancreáticas hipoecoicas, dilatación de
los conductos pancreáticos o atrofia pancreática [282].
El estrechamiento irregular del conducto pancreático principal, constituye un
criterio de imagen esencial para el diagnóstico de la PAI. En contraposición, la
presencia de masas hipoecoicas o dilatación del conducto pancreático
incrementan la sospecha de cáncer de páncreas.
Es esencial que los pacientes con hallazgos de imagen atípicos, aunque
presenten un aumento difuso del páncreas con la apariencia característica de
“forma de salchicha”, presenten evidencias adicionales de PAI antes de
comenzar la terapia esteroidea. El tratamiento de masas pancreáticas con
corticosteroides únicamente en base a la existencia de niveles séricos elevados
de IgG4 supone un problema, ya que cerca de un 10% de pacientes con cáncer
de páncreas presentan niveles elevados de IgG4, generalmente inferiores al
doble de su valor normal. En consecuencia es esencial tener en cuenta que los
niveles séricos elevados de IgG4 por sí solos no son suficientes para el
diagnóstico de la PAI [193]. Los anticuerpos anti-AC II se consideran
marcadores serológicos inespecíficos de la PAI, ya que se encuentran
presentes en otras enfermedades pancreáticas. Sin embargo, Hosoda et al
[283] han encontrado estos marcadores en una elevada frecuencia en el suero
de pacientes con PAI en comparación con pacientes con cáncer de páncreas.
Estos hallazgos sugieren que los anticuerpos anti-AC II pueden constituir
una herramienta útil para diferenciar entre la PAI y el cáncer de páncreas [283].
95
INTRODUCCIÓN
El uso del ensayo de la respuesta a esteroides debe de restringirse a
pacientes seleccionados que presenten estudios negativos para cáncer de
páncreas, incluyendo biopsia pancreática, afectación extrapancreática y/o
niveles séricos elevados de IgG4. Adicionalmente, la respuesta se debe de
medir objetivamente e interpretar con precaución. Para realizar el diagnóstico
de la PAI, es esencial observar una mejoría objetiva de la apariencia del
páncreas en los estudios de imagen en un corto periodo de tiempo tras el inicio
del tratamiento. Por otro lado, en algunos pacientes con cáncer de páncreas y
niveles de IgG4 falsamente elevados, se ha observado una bajada de los
mismos con la terapia esteroidea. En consecuencia la disminución de los
niveles de IgG4 tras el tratamiento esteroideo, no se considera diagnóstico de
la PAI. Una mejoría clínica subjetiva, como disminución del dolor abdominal o
mejoría del apetito, tampoco se considera un criterio diagnóstico satisfactorio
de la PAI, ya que puede representar una respuesta inespecífica y transitoria a
la terapia con dosis elevadas de corticosteroides, incluso en el contexto de
cáncer de páncreas [282].
1.14.2. Diagnóstico erróneo de dolor abdominal crónico como PAI
Se han descrito casos de pacientes con síndromes de dolor abdominal
funcional que han sido diagnosticados erróneamente con PAI. Suele tratarse de
mujeres jóvenes con hinchazón abdominal, plenitud posprandial y dolor. El
hallazgo de elevaciones moderadas (< 2 o 3 veces) de los niveles de amilasa
y/o lipasa conduce a la sospecha de una etiología pancreática. La PAI puede
ser diagnosticada erróneamente en base a elevaciones de los niveles séricos
96
INTRODUCCIÓN
de IgG4, a la presencia de otros marcadores autoinmunes (ANA o factor
reumatoide), o a estudios de imagen falsamente positivos [282].
La dispepsia crónica no se ha descrito como forma de presentación de la PAI
[276]. Como el aumento de los niveles de IgG4 presenta un valor predictivo
positivo bajo, su elevación en pacientes con dispepsia crónica representa
probablemente un resultado falso positivo [193]. A diferencia de los pacientes
con PAI, donde el tratamiento puede inducir la remisión clínica completa, en
estos pacientes los corticosteriodes conducen únicamente a la mejoría
transitoria de los síntomas funcionales.
1.14.3. Diagnóstico erróneo de PAI como cáncer de páncreas
En la Clínica Mayo, de los pacientes que sufrieron resección de la cabeza
pancreática por enfermedad pancreática benigna desde 1985 hasta el 2001, un
11% fueron diagnosticados con PAI [14]. Cuando se aplican los tres criterios
diagnósticos existentes en la actualidad, es esencial obtener estudios de
imagen apropiados para hacer un diagnóstico correcto. Adicionalmente, se
debería de realizar una biopsia pancreática para evaluar la presencia de
infiltrados linfoplasmocitarios. Una vez tomada la decisión de aplicar el
tratamiento con corticosteroides o de realizar una resección quirúrgica, es
esencial reevaluar a los pacientes en un periodo inferior a 4 semanas [282]. En
un estudio prospectivo realizado por Moon et al, en 22 pacientes con sospecha
de PAI vs cáncer de páncreas, debido a la presencia de estudios de imagen
atípicos, el ensayo de respuesta al tratamiento esteroideo permitió en
diagnóstico de la PAI [284]. Sin embargo, si después de un corto ensayo de
97
INTRODUCCIÓN
respuesta a esteroides el diagnóstico continúa siendo dudoso, la resección
quirúrgica es razonable [282].
Con el fin de minimizar el diagnóstico erróneo de la PAI, Gardner et al [282]
han descrito varias pautas que pueden ayudar a los médicos realizar un
diagnóstico correcto (Tabla 10).
TABLA 10. Pautas cínicas que ayudan a evitar el diagnóstico e rróneo de la PAI
1. Utilizar los criterios diagnósticos de la Clínica Mayo, de Japón y de Corea contribuye a diferenciar entre la PAI y enfermedad maligna.
2. Recordar que la PAI es una enfermedad rara, mucho menos común que el adenocarcinoma de páncreas o el colangiocarcinoma.
3. Los niveles séricos de IgG4 están elevados en un 5% de pacientes sin enfermedad pancreática, 10% de pacientes con cáncer de páncreas y 6% con pancreatitis crónica. Un incremento de IgG4 no es específico de la PAI.
4. Los niveles séricos de IgG4 pueden disminuir en pacientes con cáncer de páncreas tratados inapropiadamente con corticoides.
5. Antes de iniciar la terapia con corticosteroides, identificar un marcador seguro para monitorizar una respuesta objetiva durante el tratamiento.
6. La respuesta a la terapia esteroidea se puede ver a las 2-4 semanas. Si no se encuentra respuesta objetiva dentro de las primeras 4 semanas, el diagnóstico de PAI es improbable.
7. Los coticosteroides conducen a menudo a una mejoría subjetiva de los síntomas, incluso en pacientes sin PAI.
8. Antes de iniciar el tratamiento se deben de examinar las masas pancreáticas focales.
Am J Gastroenterol 2009;104:1620–3.
98
INTRODUCCIÓN
1.15. Autoinmunidad y linfomagénesis
Las neoplasias linfoides constituyen un grupo heterogéneo de
malignidades desde el punto de vista etiológico [285], morfológico y clínico
[286]. Se piensa que la desregulación inmune juega un papel esencial en la
linfomagénesis, ya que se ha encontrado un aumento del riesgo de ciertos
linfomas tras el trasplante de órganos, infecciones, inmunodeficiencias y
enfermedades autoinmunes [287]. Desde hace más de 50 años, se ha descrito
la asociación entre autoinmunidad y linfomagénesis en numerosos estudios
humanos y animales. Se ha encontrado un incremento significativo del riesgo
de linfomas malignos en numerosas enfermedades autoinmunes, como la AR
[288-291], SS [292-293], LES [294-295], enfermedad celiaca [296-299],
tiroiditis autoinmune [300-302] y dermatitis herpetiforme [303-304]. En otras
enfermedades, como la enfermedad inflamatoria intestinal [305-306], la
psoriasis [307-308], y la esclerosis sistémica [309] se ha descrito una
asociación no significativa.
En los últimos años los estudios se han centrado en la investigación de las
variaciones en el riesgo de linfomas dentro de una misma enfermedad
autoinmune, en función del fenotipo de los pacientes o del tratamiento. En
pacientes con SS o AR el riesgo de linfoma esta fuertemente correlacionado
con la severidad de la enfermedad [310-311].
99
INTRODUCCIÓN
1.15.1. Enfermedades autoinmunes asociadas con riesgo de linfomas
11..1155..11..11.. EEnnffeerrmmeeddaaddeess aassoocciiaaddaass ccoonn uunn rriieessggoo ssiiggnniiffiiccaattiivvoo ddee lliinnffoommaass
En la AR, SS, LES, dermatitis herpetiforme y tiroiditis de Hashimoto, se ha
observado un aumento del riesgo de linfomas no Hodgking (LNH) en
numerosos estudios realizados en diferentes poblaciones [312]. Estudios en
grandes series de pacientes, han descrito un riesgo relativo promedio de
aproximadamente el doble en la AR [288-291, 310, 311], de 3 a 6 veces en el
LES [294, 295], de 2 a 10 veces en la dermatitis herpetiforme [303, 304], de 9 a
18 veces en el SS [292, 293], enfermedad celiaca [296-299] y tiroiditis
autoinmune [300-302].
Las investigaciones acerca de la asociación entre autoinmunidad y linfomas
Hodgkin (LH) son escasas, siendo el riesgo estimado más elevado, pero menos
preciso que para los LNH [313]. Tanto en la AR [288, 289, 314] como en el LES,
se ha observado un riesgo aumentado de LH de 3 a 5 veces [315].
Con respecto al riesgo de subtipos específicos de LNH, el SS, la tiroiditis de
Hashimoto y la enfermedad celiaca se ha asociado especificamente con el
desarrollo de linfomas en los órganos diana. En consecuencia, el SS se ha
asociado fuertemente con el linfoma del tejido linfoide asociado a las mucosas
(MALT) en la glándula parótida [316, 317], la tiroiditis de Hashimoto con el
linfoma MALT en la glándula tiroidea (trasformándose ocasionalmente a linfoma
de células B grande difuso) [301, 318], y la enfermedad celiaca con el linfoma
de células T tipo enteropático en el intestino delgado [286, 319].
Estudios recientes muestran la asociación entre numerosas enfermedades
autoinmunes y un subtipo concreto de LNH, el linfoma de células B grande
100
INTRODUCCIÓN
difuso. Theander et al [293] han observado que 7/12 LNH asociados con el SS,
son linfomas de células B grandes difusos (58%). En un análisis conjunto de
datos de estudios caso-control realizado por el Consorcio Internacional de
Epidemiología del Linfoma [320], el SS se ha asociado con un aumento del
riesgo de 9 veces con el linfoma de células B grande difuso y de 30 veces con
linfomas MALT. Baeklund et al [311], han analizado los linfomas presentes en
400 pacientes con AR, observando linfomas de células B grandes difusos en un
50% de ellos y caracterizándose posteriormente como de tipo centro no
germinal en su gran mayoría [311, 321]. Adicionalmente en el LES también se
ha encontrado una mayor incidencia de linfomas de células B grandes difusos
[295, 312, 320, 322], principalmente de tipo agresivo de centro no germinal
[322]. Finalmente, en enfermedad celiaca existen cada vez más evidencias de
un incidencia aumentada de linfomas de células B, además del linfoma de
células T tipo enteropático [297, 323].
11..1155..11..22.. EEnnffeerrmmeeddaaddeess aassoocciiaaddaass pprroobbaabblleemmeennttee ccoonn lliinnffoommaass
La psoriasis se ha relacionado con un mayor riesgo de LNH de células T [300,
307, 320], principalmente con el cutáneo de tipo micosis fungoide [307] y el
anaplásico de células grandes [300,320]. En pacientes con la enfermedad de
Crohn, se ha realizado estudios que muestran un aumento moderado, aunque
no significativo, del riesgo de LNH, de un 30 a un 40% [305, 306]. En la
esclerosis sistémica, el riesgo de LNH es del doble y tampoco es significativo
[309, 324, 325]. Finalmente, la sarcodosis se ha relacionado tanto con LH [326]
como con LNH [300, 314].
101
INTRODUCCIÓN
1.15.2 Subtipos de linfomas asociados con enfermedades autoinmunes
Los LH, se han asociado con enfermedades autoinmunes sistémicas. Dentro
de los LNH, el linfoma de células B grande difuso es el que se ha asociado más
fuertemente con enfermedades autoinmunes sistémicas. El linfoma de la zona
marginal y los linfomas de células T se han asociado tanto con las
enfermedades autoinmunes sistémicas como con las órgano-específicas. El
linfoma MALT se ha observado en condiciones inflamatorias crónicas, tanto
autoinmunes como infecciosas. Dentro de los subtipos más indolentes de
linfomas, el folicular y la macroglobulinemia de Waldenstrom se han asociado
con enfermedades autoinmunes sistémicas. Finalmente, no se ha encontrado
una asociación consistente entre las enfermedades autoinmunes y el mieloma
múltiple [327].
1.15.3. Factores de riesgo
11..1155..33..11.. FFaaccttoorreess ddee rriieessggoo ccllíínniiccooss
La severidad y las características propias de cada enfermedad autoinmune
se consideran factores de riesgo potenciales para el desarrollo de linfomas
[313].
En la AR, las primeras evidencias de la asociación entre severidad de la
enfermedad y linfoma provienen de estudios realizados en pacientes con el
síndrome de Felty [328], una complicación a largo plazo de la AR, donde se ha
observado un aumento del riesgo de LNH de aproximadamente 13 veces.
Baecklund et al [311] han estudiado los factores de riesgo potenciales de
linfoma en pacientes con AR, encontrando una fuerte asociación entre el riesgo
de linfomas, principalmente del linfomas de células B grandes difusos, y la
102
INTRODUCCIÓN
actividad acumulativa de la enfermedad. Estos hallazgos indican que las
células B periféricas activadas podrían desempeñar un papel importante en la
linfomagénesis en pacientes con AR.
En el SS, los marcadores de enfermedad severa, como púrpura palpable,
aumento de la glándula parótida e hipocomplementemia, permiten predecir el
desarrollo de linfomas [293, 317, 329-332]. Adicionalmente la presencia de
crioglobulinemia mixta monoclonal [293, 330] y de linfocitopenia CD4+ [293] en
pacientes con SS, se asocia con mayor riesgo de linfoma.
En el LES, la presencia de manifestaciones hematológicas de larga
evolución, de síntomas sicca y de afectación pulmonar se asocian con mayor
riesgo de LNH [322, 333].
En la enfermedad celiaca, se ha hipotetizado que la dieta libre en gluten
puede ejercer un efecto protector frente al desarrollo de linfomas [296], aunque
la mayoría de las evidencias se han basado en observaciones indirectas y en
estudios realizados con un reducido número de pacientes [299, 334, 335].
11..1155..33..22.. FFaaccttoorreess ddee rriieessggoo aassoocciiaaddooss ccoonn eell ttrraattaammiieennttoo
Dentro del grupo de las drogas aintirreumáticas modificadoras de la
enfermedad (DMARDs), el metotrexato (MTX) y la azatioprina se ha
relacionado con un mayor riesgo de linfoma [286, 311]. En este sentido, existen
numerosos estudios que relación el tratamiento con MTX con el desarrollo de
lesiones linfoproliferativas-virus de Epstein-Barr+ [286, 336, 337].
Los corticosteroides se han utilizado como tratamiento eficaz de numerosas
enfermedades autoinmunes. Numerosas estudios han permitido demostrar que
los esteroides no se asocian con un mayor riesgo de linfomas [311, 338-340].
103
INTRODUCCIÓN
En un estudio realizado en pacientes con arteritis de células gigantes y
polimialgia reumática [341], el tratamiento esteroideo a largo plazo codujo a
una reducción de la tasa de LNH, constituyendo una prueba convincente de
que los esteroides no aumentan el riesgo de linfoma.
Los fármacos biológicos se han convertido en la principal línea de
tratamiento de numerosas enfermedades autoinmunes. Los antagonistas del
TNF-α (adalimumab, etanercept e infliximab) se utilizan desde hace más de 10
años en el tratamiento de la AR, psoriasis, enfermedad de Crohn y colitis
ulcerosa, etc. En la mayoría de los estudios del riesgo de linfoma en pacientes
tratados con antagonistas del TNF, no se ha encontrado un riesgo significativo
en comparación con los DMARDs [290, 342, 343]. En dos meta-análisis
recientes [344, 345] se ha analizado el riesgo de linfoma en pacientes con AR
tratados con antagonistas del TNF-α, encontrándose sólo en uno de ello un
aumento del riesgo de linfoma [344]. En pacientes con la enfermedad
inflamatoria intestinal tratados con antagonistas del TNF, se han observado
varios casos de linfoma T hepatoesplénico [346].
11..1155..33..33.. FFaaccttoorreess ddee rriieessggoo bbiioollóóggiiccooss
Los dos elementos clave en la patogénesis de las enfermedades
autoinmunes son, la inflamación crónica y la activación persistente de células
B autorreactivas. En la AR se pueden encontrar signos tanto de inflamación
sistémica (hinchazón articular y elevación de la velocidad de sedimentación
globular y de la proteína C reactiva), como de activación de células B
autorreactivas (presencia de factor reumatoide, anticuerpos anti-péptidos
ciclicos citrulinados y cadenas ligeras libres). En contraste, en el SS sólo se
104
INTRODUCCIÓN
observan signos de activación de células B autorreactivas [347]. En
consecuencia es posible que esos dos mecanismos conduzcan a diferentes
tipos de linfomas [313]. En la AR, la actividad inflamatoria a largo plazo podría
desencadenar linfomas no localizados, como se pone en evidencia por el
mayor riesgo de linfomas de células B grandes difusos en la AR [311]. En
contraste la estimulación a largo plazo de células B autorreactivas podría ser
más relevante en la linfomagénesis en enfermedades autoinmunes órgano-
específicas, como por ejemplo el desarrollo del linfoma de células B de la zona
marginal en glándulas salivares activadas en el SS [316, 317]. Junto a ello, la
asociación reciente entre el SS y el linfoma de células B grande difuso [293]
podría explicarse por la posible existencia de un componente inflamatorio
sistémico en el SS [313].
1.15.3.3.a. Selección antigénica
En un estudio realizado en linfomas de glándulas salivares en pacientes con
SS, se ha observado una homología entre las regiones CDR3 de las
inmunoglobulinas de membrana de las células B y las de los factores
reumatoides. Estos hallazgos sugieren que la IgG, probablemente a través de
inmunocomplejos, podría ser la responsable de la activación de las células B
autorreactivas. [348].
1.15.3.3.b. Papel de BAFF (BLyS)
El aumento de la expresión del factor activante de células B (BAFF), una
citocina también llamada factor estimulador de linfocitos B (BLyS) [349],
podría explicar la activación patogénica de células B en varias enfermedades
autoinmunes y en linfomas [313]. BAFF es esencial en la maduración de
105
INTRODUCCIÓN
células B, la supervivencia de células plasmáticas y en la recombinación de
clase de las inmunoglobulinas [350]. En pacientes con LES y SS, se han
observado niveles séricos elevados de BAFF [351, 352], correlacionándose
además con los niveles de autoanticuerpos [352]. Además en los órganos
diana de ciertas enfermedades autoinmunes se puede observar la presencia de
niveles elevados de BAFF y su secreción por las células residentes, como las
células epiteliales salivares en el SS [353] o los sinoviocitos en la AR [354].
Por otro lado, los niveles de BAFF también están elevados en pacientes con
linfoma, donde es secretado por las células B linfomatosas y conduce a su
activación autocrina [355]. En consecuencia, los mecanismos relacionados con
los niveles de BAFF y/o su función representan un nexo común entre
autoinmunidad y linfomagénesis.
1.15.4. Posibles modelos de autoinmunidad y linfomagénesis
Existen varios mecanismos por los cuales la autoinmunidad podría conducir
al desarrollo de linfomas [356].
Goodnow [357] ha descrito las rutas y genes implicados en el desarrollo
tanto de enfermedades autoinmunes como de linfomas. El crecimiento de
células B inducido por autoantígenos, es inhibido por los mecanismos de
tolerancia inmunológica, que bloquean o limitan la señalización del receptor
antigénico mediada por NF-kB, PI3K/AKT, MYC y BCL-2/BCL-XL/A1 (Figura
12). Cuando estos mecanismos fallan, se desencadenan enfermedades
autoinmunes. Para este autor, tanto las enfermedades autoinmunes como los
linfomas son consecuencia de un proceso secuencial que conduce a la
eliminación de los puntos de control que inhiben el crecimiento descontrolado
106
INTRODUCCIÓN
Ras/ERK
Calcio/NFAT
Carma1/Bcl10/NFkB
PI3K/AKTReceptorAntigénico
Antígeno
Supervivencia
Crecimiento y división
Funciones efectoras
Aclaramiento de antígenos foraneos
Mutaciones en rutas de control
Autoantígenos que no pueden ser aclarados
Las células dejan de dividirse y se transforman en célulasde memoria o mueren
Crecimientodescontrolado ⇒
Linfoma, leucemia, mieloma
Estimulación descontrolada⇒ daño orgánico⇒Enfermedad autoinmune
Requerimiento de
Receptores inhibitorios y feedback intracelulares CTLA4, PD-1, FCRg2, SHP1, SHIP, CD5, CBL.B, Roquin
Inhibición por células TRegs
B7/CD28Componente microbiano/TLR
CD40L/CD40
IL-7, IL-15, BAFF
Mecanismos que inhiben el crecimiento
Apoptosis inducida por Bim
Apoptosis inducida por Fas
Mecanismos que limitan el crecimiento
Figura 12. Puntos de control del crecimiento de linfocitos. Múltiple mecanismos bloquean o limitan la capacidad de los receptores antigénicos de estimular el crecimiento de los linfocitos. La unión del antígeno a su receptor puede activar rutas de señalización de crecimiento y supervivencia (flechas negras). En los linfocitos que reconocen antígenos microbianos, esas señales conducen a su expansión clonal. Los autoantigenos no puedes ser aclarados por esta vía, conduciendo a la activación crónica del receptor antigénico y a la inducción ilimitada del crecimiento de los clones autorreactivos. La mutaciones que afectan a estos mecanismos, conducen a la extensión de los clones autorreactivos y al desarrollo de malignidades linfoides. Cell 2007;130:25–35.
de las células B, incluyendo las células B autorreactivas. Este proceso
secuencial esta asociado a la presencia de mutaciones somáticas y germinales
de genes que intervienen en estas rutas, como las que afectan al gen FAS, que
codifica para una mólécula implicada en la apoptosis de células B y T
autorreactivas, y que conducen al desarrollo de enfermedades autoinmunes y
de linfomas [358-362].
107
INTRODUCCIÓN
Hansen et al [363] han resumido los posibles mecanismos de progresión de
las enfermedades autoinmunes a linfomas, como la desregulación específica
de las células B autorreactivas, la hiperreactividad de las células B y las
alteraciones en las funciones de las células T.
Los principales factores inmunológicos que pueden contribuir a la
linfomagénesis se resumen en la figura 13. La autoinmunidad puede conducir a
la sobre-estimulación y apoptosis defectiva de las células B. Secundariamente,
la inflamación desencadenada por estimulación autoinmune puede promover
estos procesos. Adicionalmente, las infecciones asociadas con el proceso
autoinmune pueden actuar a través de las mismas vías [357]. Por otro lado los
factores genéticos también desempeñan un papel importante. En este sentido,
existen numerosos datos que demuestran el carácter hereditario tanto de las
enfermedades autoinmunes [364-367] como de los linfomas [368].
En base a estas observaciones se ha sugerido que las mutaciones
hereditarias podrían ser las responsables de la susceptibilidad a ambas
enfermedades [357].
Si esta hipótesis es cierta, debería de observarse agregación familiar de
enfermedades autoinmunes y de linfomas. Sin embargo todos los estudios
realizados hasta la fecha demuestran que una historia familiar de enfermedad
autoinmune, no es buena predictora del riesgo de linfoma [314, 300, 369].
108
INTRODUCCIÓN
LINFOMAGÉNESIS
Vigilancia inmunitaria- Adquirida (por ej. Infección por VIH, idiopática- Iatrogénica (por ej. transpante, fármacos)- Genética (por ej. Anemia de Fanconi, inmunodeficiencia 1ª)
Estimulación inmunitaria 1ª-Autoinmunidad- Infección- Inflamación crónica
Estimulación inmunitaria 2ª- Reactivación viral (por ej. VEB)- Disminución del control de agentes
infecciosos
Inflamación 2ª- Activación de células inmunitarias- Liberación de citoquinas y quimioquinas
Mutaciones somáticas y germinales
Figura 13. Factores inmunológicos implicados en el desarrollo de autoinmunidad y linfomas. Cell 2007;130:25–35.
1.15.5. Linfomas en la enfermedad esclerosante asociada a IgG4
Ochoa et al, han reportado un caso de linfoma MALT de la zona marginal en
la gándula submandibular, en un paciente con siladenitis esclerosante cónica
[371].
Cheuk et al [372] han descrito recientemente 3 casos de LNH ocular
adnexal en pacientes con dacrioadenitis esclerosante crónica asociada a IgG4.
Dos casos fueron linfomas de tipo marginal extranodal del MALT y uno fue
linfoma folicular de alto grado. Adicionalmente, Takahashi et al [373] han
reportado 3 casos de LNH en pacientes con ISD, dos de ellos en glandulas
salivares, y el otro extranodal. Estos hallazgos ponen de manifiesto la
concurrencia de la ISD y del linfoma en un mismo órgano.
109
INTRODUCCIÓN
Kim et al [373] han reportado un caso de LNH de tipo linfocítico de células
pequeñas afectando a nódulos linfoides mesentéricos un paciente con ISD. En
este sentido, los autores han especulado que la preexistencia de ISD podría
constituir un factor de predisposición para el desarrollo de este tipo de linfoma.
Finalmente Esposito et al [374] han descrito la presencia de oligoclonalidad
para el TCR-γ en un pseudotumor inflamatorio del páncreas.
110
111
HHIIPPÓÓTTEESSIISS YY OOBBJJEETTIIVVOOSS
22222222........ HHHHHHHHIIIIIIIIPPPPPPPPÓÓÓÓÓÓÓÓTTTTTTTTEEEEEEEESSSSSSSSIIIIIIIISSSSSSSS
YYYYYYYY
OOOOOOOOBBBBBBBBJJJJJJJJEEEEEEEETTTTTTTTIIIIIIIIVVVVVVVVOOOOOOOOSSSSSSSS
112
113
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
2.1. Hipótesis
La PAI constituye una entidad emergente con un diagnóstico diferencial
frente a otras enfermedades pancreáticas, destacando el cáncer de páncreas,
complicado. Esta situación es debida a la ausencia de un único test diagnóstico,
al desconocimiento del espectro clínico completo y a la falta de consenso
internacional en los criterios diagnósticos de la PAI. En consecuencia, es
esencial caracterizar a los pacientes clínica, histológica y serológicamente y
establecer una batería de ensayos que permitan llegar al diagnóstico de la PAI
con la mayor precisión posible.
La clonalidad de células B se ha descrito en diversas enfermedades
autoinmunes, como el SS primario. Se ha sugerido que en pacientes con SS, la
expansión clonal de células B en glándulas salivares constituye un factor de
riesgo elevado de desarrollo de linfomas. De modo similar, en la PAI la
respuesta inmunológica podría estar mediada por unos pocos clones de células
B dirigidos frente a autoantígenos potenciales presentes en el páncreas. Si esta
hipótesis es cierta, poblaciones de células B oligoclonales o monoclonales
deberían de predominar tanto en lesiones pancreáticas y extrapacreáticas
como en sangre periférica de pacientes con PAI.
114
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
2.2. Objetivos
2.2.1. Diagnóstico serológico diferencial de PAI
Determinar la utilidad diagnóstica de los anticuerpos anti-CA II, anti-LF y
anti-AMY α-2A y de los niveles elevados de IgG4 en el suero de pacientes
con PAI.
Comparar la sensibilidad y especificidad de los niveles séricos de IgG y de
IgG4 en el diagnóstico de la PAI
Analizar la asociación entre losniveles séricos de IgG4 incrementados y la
presencia de lesiones extrapancreáticas en pacientes con PAI.
Determinar la utilidad diagnóstica de los anticuerpos anti-CA 19.9 y
correlacionarlos con los niveles séricos de CA 19.9 en pacientes con PAI.
Analizar la presencia de anticuerpos anti-p53 en pacientes con PAI,
sospecha de PAI, pancreatitis crónica idiopática, pancreatitis crónica y
cáncer de páncreas.
Examinar los niveles séricos de Interleucina-6 (IL-6) en pacientes con PAI,
sospecha de PAI, pancreatitis crónica idiopática, pancreatitis crónica y
cáncer de páncreas.
2.2.2. Estudio de clonalidad en la PAI
Realizar el análisis inmunofenotípico de las poblaciones linfocitarias y de las
subpoblaciones de células B circulantes en pacientes con PAI, sospecha de
PAI y pancreatitis crónica idiopática
Cuantificar los niveles de cadenas ligeras libres y del cociente entre
cadenas ligeras libres Kappa y Lambda en el suero de pacientes con PAI,
sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática.
115
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
Evaluar la presencia de proteínas monoclonales en el suero de pacientes
con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática.
Analizar la clonalidad de células B presentes en sangre y en infiltrados
linfoplasmocíticos presentes en lesiones pancreáticas y extrapancreáticas
en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiopática.
2.2.3. Estudio del riesgo de cáncer en la PAI
Analizar la existencia de mutaciones de K-ras en el páncreas y en lesiones
extrapancreáticas de pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis
crónica idiopática.
116
117
MMAATTEERRIIAALL YY MMÉÉTTOODDOOSS
33333333........ MMMMMMMMAAAAAAAATTTTTTTTEEEEEEEERRRRRRRRIIIIIIIIAAAAAAAALLLLLLLL
YYYYYYYY
MMMMMMMMÉÉÉÉÉÉÉÉTTTTTTTTOOOOOOOODDDDDDDDOOOOOOOOSSSSSSSS
118
119
MATERIAL Y MÉTODOS
3. MATERIAL Y METÓDOS
Todos los estudios planteados en el presente proyecto han sido aprobados
por el Comité de Ética e Investigación Clínica (CEIC) de Cantabria. El
consentimiento informado de los pacientes se obtuvo de acuerdo al Código
Internacional de Ética Médica (Declaración de Helsinki).
Los análisis estadísticos han sido realizados con el programa SPSS versión
15.0 para Windows (SPSS Inc, Chicago, Illinois, Estados Unidos).
La distribución normal de las variables cuantitativas fue analizada mediante
el test de Kolmogoroz-Smirnov.
3.1. Utilidad diagnóstica de los marcadores serológ icos en la PAI
3.1.1. Pacientes y diseño del estudio
En este estudio retrospectivo se incluyeron 93 pacientes con sospecha
clínica de PAI y 93 pacientes como grupos control. Para la detección de los
marcadores serológicos se emplearon muestras de suero obtenidas entre junio
del 2003 y octubre del 2009 y almacenadas a -80ºC en el Servicio de
Inmunología del Hospital Universitario Marqués de Valdecilla (HUMV).
Los pacientes con sospecha clínica de PAI, fueron subdivididos en función
del tipo de enfermedad pancreática en los siguientes grupos: PAI (n=12),
pancreatitis crónica (PC; n=23), pancreatitis crónica idiopática (PCI; n=26),
pancreatitis aguda (PA; n=11), cáncer de páncreas ( n=21). En el grupo de PC,
se incluyeron 15 casos de PC alcohólica, 5 de PC hereditaria y 3 de páncreas
divisum. Como grupos control se incluyeron 45 sujetos sanos, 9 pacientes con
síndrome de Sjögren (SS) y 40 pacientes con Diabetes Mellitus tipo 1 (DM-1).
Las características demográficas de los pacientes se muestran en la tabla 11.
120
MATERIAL Y MÉTODOS
TABLA 11 . Características generales de los pacientes inclui dos en el estudio
n Edad* Sexo (Masculino/Femenino)
Pancreatitis autoinmune 12 67 (16-78) 11/1
Pancreatitis crónica 23 44 (24-72) 22/1
Pancreatitis crónica idiopática 26 58 (20-87) 16/10
Pancreatitis aguda 11 59 (33-86) 5/6
Cáncer de páncreas 21 65 (38-84) 12/11
Síndrome de Sjögren 9 63 (45-71) 0/9
Diabetes Mellitus tipo 1 40 31 (5-67) 19/21
Sujetos sanos 45 44 (23-86) 14/31
*Datos expresados como mediana en años (rango)
El diagnóstico de PAI fue realizado de acuerdo con los criterios HISORt [268]
y el algoritmo diagnóstico de PAI propuesto por nuestro grupo [32]. El
diagnóstico de PC fue realizado en función de la existencia de disfunción del
páncreas exocrino, depósitos de calcio, cambios ductales o presencia de
piedras, todo ello demostrado mediante estudios funcionales y morfológicos.
Los pacientes fueron diagnosticados de PCI en base a la ausencia de causas
aparentes de PC, como alcoholismo, piedras o autoinmunidad según los
Criterios de Cambridge y Marsella [375, 376]. La pancreatitis aguda fue
diagnosticada en función de la elevación de los niveles séricos de amilasa junto
con la presencia de hallazgos clínicos y radiológicos característicos. El
diagnóstico del SS fue realizado según los criterios establecidos por el Grupo
de Estudio específico de la Comunidad Europea [377] y el de DM-1 según los
Criterios de la OMS [378].
121
MATERIAL Y MÉTODOS
3.1.2. Algoritmo diagnóstico de la PAI
Nuestro grupo en colaboración con otros grupos españoles ha propuesto el
siguiente algoritmo diagnóstico de la PAI [32].
En primer lugar se aplica un sistema de puntuación para identificar pacientes
con diagnóstico compatible con PAI según los siguientes criterios:
1. Manifestaciones clínicas: Ausencia de ataques agudos de pancreatitis,
ausencia de dolor abdominal, presencia de colestasis/ictericia y otras
enfermedades autoinmunes asociadas. Se da un valor de 1 cuando al
menos dos de esas condiciones están presentes y de 0 cuando una o
ninguna de ellas se cumple.
2. Parámetros morfológicos: Ausencia de calcificaciones y pseudoquistes,
presencia de masas pancreáticas o aumento del páncreas, y ausencia
de dilatación del conducto de Wirsung. Se da un valor de 1 cuando al
menos dos de esas condiciones están presentes y de 0 cuando una o
ninguna de ellas se cumple.
3. Parámetros de laboratorio: Aumento de los niveles de IgG y ANA en
suero. Se da un valor de 1 cuando al menos una de esas condiciones
están presentes y de 0 cuando ninguna de ellas se cumple.
Una puntuación total de 0 o 1 se considera como “probablemente no PAI”, de
1 como “posible PAI” y de 2 como “probable PAI”. A continuación, si existe un
diagnóstico compatible con PAI (“posible” o “probable”), se determinan la
presencia de niveles de IgG4 elevados (>130 mg/dl) y de anticuerpos anti-AC II
en suero. Finalmente si ambos marcadores son positivos se realizan los
122
MATERIAL Y MÉTODOS
estudios radiológicos de CPRE y se ensaya la respuesta al tratamiento
esteroideo para confirmar el diagnóstico.
3.1.3. Medición de los nivéles séricos de IgG y de IgG4
Los niveles séricos de IgG total y de IgG4 fueron medidos por nefelometría
(Nefelómetro BNII Siemens, Munich, Alemania). Se consideraron niveles
elevados aquellos valores por encima de los puntos de corte establecidos en
nuestro laboratorio y que son de 1200 mg/dl para la IgG total y de 130 mg/dl
para la IgG4 (estos valores han sido establecidos empleando 50 muestras de
suero de sujetos sanos).
3.1.4. Detección de los anticuerpos anti-AC II en suero
Los anticuerpos anti-AC II fueron determinados en suero mediante una
técnica de ELISA según habían descrito previamente Kino et al [109], con
pequeñas modificaciones, empleando el siguiente protocolo:
PPaassooss pprreevviiooss
-- Preparar el control positivo (C+). El C+ se realizará mezclando en
cantidades iguales un mínimo de 5 sueros de pacientes con
anticuerpos anti-AC II. Hacer alícuotas de 100 µl y congelar a
-20 ºC.
-- Preparar un pool de pacientes sanos. El pool se realizará
mezclando en cantidades iguales un mínimo de 15 sueros de
individuos sanos. Hacer alícuotas de 200 µl y congelar a -20ºC.
-- Preparar alícuotas de 50 µl del antígeno (Ag) AC II (Sigma
Chemical Co. St. Louis, MO) resuspendido en tampón carbonato
(1mg/ml) y congelar a -20ºC.
123
MATERIAL Y MÉTODOS
-- Preparar el tampón sustrato, pH 10,5: 8 mmol/L p-nitrofenil-fosfato
en 100 mmo/L de dietiletanolamina y 0,25 mmol/L MgCl2.
Conservar en un frasco opaco a temperatura ambiente.
DDííaa 11--RReeaalliizzaarr eell ““ccoottttiinngg””
El cotting se realiza en placas de micotitulación de fondo plano de 96 pocillos
(Linbro® 96-Well Microplates, LabWare ICN).
Con el fin de descartar la unión inespecífica de los sueros a los pocillos, en
paralelo a la placa cubierta con el antígeno diluido, se realizará una placa con
tampón carbonato sin antígeno.
- Diluir 50 µl del Ag AC II resuspendido (1mg/ml) en 10 ml de
tampón carbonato.
- Añadir 100 µl de antígeno diluido/pocillo en la placa “Con Ag”.
- Añadir 100 µl de tampón carbonato/pocillo en la placa “Sin Ag”.
- Incubar toda la noche a temperatura ambiente (RT).
DDííaa 22--BBllooqquueeaarr yy ccaarrggaarr llaass ppllaaccaass
- Lavar las placas 3 veces con PBS. Aspirar el contenido y lavar 3
veces con 250 µl/pocillo de PBS. Dejar la placa completamente
seca, golpeándola sobre un papel de filtro.
-- Añadir 200 µl de tampón bloqueo-diluyente (PBS-2% albúmina
sérica bovina o BSA)/pocillo.
- Tapar las placas e incubar 2 horas a 4ºC.
-- Diluir los sueros de los pacientes, el C+ y el pool 1/25 en tampón
bloqueo-diluyente.
124
MATERIAL Y MÉTODOS
-- Eliminar la solución de bloqueo. Secar la placa golpeándola sobre
un papel de filtro.
- Añadir 100 µl muestra/pocillo (El blanco se hace con el tampón
bloqueo-diluyente) en cada placa de acuerdo con la siguiente
plantilla:
11 22 33 44 55 66 77 88 99 1100 1111 1122
BL P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 pool pool
BL P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 pool pool
C+ P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 pool pool
C+ P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 pool pool
C+ P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 pool pool
C+ P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 pool pool
C+ P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 pool pool
C+ P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 pool pool
BL: Blanco. C+: Control positivo. P1: Paciente 1. P2: Paciente 2…
- Incubar las tapas tapadas toda la noche a 4ºC.
DDííaa 33:: AAññaaddiirr ccoonnjjuuggaaddoo yy ssuussttrraattoo
- Diluir el conjugado (Anticuerpo anti-IgG humana conjugado con
fosfatasa alcalina (Sigma Chemical Co)) 1/1000 en tampón
bloqueo-diluyente.
- Lavar las placas 3 veces con PBS en las condiciones indicadas
anteriormente.
- Añadir 100 µl conjugado diluido/pocillo.
- Incubar las placas tapadas 2 horas a RT.
125
MATERIAL Y MÉTODOS
- Diluir el sustrato (fosfatasa alcalina (Sigma Chemical Co)) en el
tampon sustrato: 1 pastilla fosfatasa alcalina en 5ml tampón
sustrato.
- Lavar las placas 3 veces con PBS en las condiciones indicadas
anteriormente.
- Añadir 100 µl sustrato diluido/pocillo.
- Incubar las placas tapadas en oscuridad durante dos horas.
- Medir la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de
onda de 405 nm.
IInntteerrpprreettaacciióónn ddee llooss rreessuullttaaddooss
Calcular la media (XM) de los valores de absorbancia (Ab) del C+, de los
pacientes y del pool, en la placa “Con Ag” y en la placa “Sin Ag”.
Los valores de Ab promedio obtenidos en la placa “Sin Ag”, implican uniones
inespecíficas de los sueros a la placa. Por tanto, para calcular el valor de Ab
promedio real de cada una de las muestras, es necesario obtener la diferencia
(Dif) entre el valor de Ab promedio de la muestra en la placa “Con Ag” y en la
placa “Sin Ag”, a partir de las siguientes fórmulas:
Dif Ab C+=X M (Abs C+) placa “Con Ag” - X M (Abs C+) placa “Sin Ag”
Dif Ab Pacientes= X M (Abs P1) placa “Con Ag”- X M (Abs P1) placa “Sin Ag”
Dif Ab pool= X M (Abs Pool) placa “Con Ag”- X M (Abs Pool) placa “Sin Ag”
El Cut-off (CO) se establece como las 3 desviaciones estándar (DE) por
encima de la diferencia entre el valor de Ab media del pool en la placa “Con Ag”
y en la placa “Sin Ag”, a partir de la siguiente fórmula:
XM (Dif Ab pool) + 3*DE (Abs pool) placa “Con Ag”
126
MATERIAL Y MÉTODOS
El valor de la Dif Ab C+ debe de ser superior al valor del CO. Cuando el valor
de la Dif Ab Paciente es superior al valor del CO, la muestra se considera
positiva; mientras que cuando es inferior, la muestra se considera negativa.
3.1.5. Detección de los anticuerpos anti-AMY α
Los anticuerpos anti-AMY α fueron determinados en suero mediante una
técnica de ELISA, empleando el siguiente protocolo:
PPaassooss pprreevviiooss
- La preparación del control positivo y del pool de sujetos sanos se
realiza de forma similar a la descrita para los anticuerpos anti-AC
II
- Preparar el tampón BBS, pH 8,3-8,5: Ácido bórico 0,01 M +
Borax (Tetraborato sódico) 0,025 M + NaCl 0,075 M. Guardar a
4ºC.
-- Preparar alícuotas de 100 µl del Ag AMY α (Alpha amylase 1437
unidades/mg, pH 7,5. Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) en
tampón BBS (100 µg/ml) y congelar a -20ºC.
- Preparar el tampón sustrato, pH 10,5: 8 mmol/L p-nitrofenil-fosfato
en 100 mmo/L de dietiletanolamina y 0,25 mmol/L MgCl2.
Conservar en un frasco opaco a temperatura ambiente.
DDííaa 11--RReeaalliizzaarr eell ““ccoottttiinngg””
El cotting se realiza en placas de micotitulación de fondo plano de 96 pocillos
(Linbro® 96-Well Microplates, LabWare ICN).
- Diluir 100 µl del Ag AMY α resuspendido (100 µg/ml) en 10 ml de
tampón BBS.
127
MATERIAL Y MÉTODOS
- Añadir 100 µl de antígeno diluido/pocillo en la placa.
- Incubar toda la noche a 4ºC.
DDííaa 22--BBllooqquueeaarr yy ccaarrggaarr llaass ppllaaccaass
- Preparar el tampón de lavado: PBST (PBS + 0,05% Tween 20).
- Lavar la placa 3 veces con PBST. Aspirar el contenido y lavar 3
veces con 250 µl/pocillo de PBS. Dejar la placa completamente
seca, golpeándola sobre un papel de filtro.
- Añadir 200 µl de tampón bloqueo-diluyente (PBS 1%BSA)/pocillo.
- Tapar la placa e incubar 2 horas a 4ºC.
- Diluir los sueros de los pacientes, el C+ y el pool 1/50 en tampón
de bloqueo-diluyente.
- Eliminar el bloqueo. Secar la placa golpeándola sobre un papel de
filtro.
-- Añadir 100 µl muestra/pocillo (el blanco será el tampón bloqueo-
diluyente) en la placa de de forma similar a los anticuerpos anti-
ACII.
-- Incubar la placa tapada 1 hora a RT.
AAññaaddiirr ccoonnjjuuggaaddoo yy ssuussttrraattoo
- Diluir el conjugado (anticuerpo anti-IgG humana conjugado con
fosfatasa alcalina) 1/1000 en tampón bloqueo-diluyente.
- Lavar las placas 3 veces con PBST en las condiciones indicadas
anteriormente.
- Añadir 100 µl conjugado diluido/pocillo.
- Incubar la placa tapada 1 hora a RT.
128
MATERIAL Y MÉTODOS
- Diluir el sustrato (fosfatasa alcalina (Sigma Chemical Co)) en el
tampón sustrato: 1 pastilla fosfatasa alcalina en 5ml tampón
sustrato.
- Lavar 3 veces con PBST en las condiciones indicadas
anteriormente.
- Añadir 100 µl sustrato diluido/pocillo.
- Incubar las placas tapadas en oscuridad durante dos horas.
- Medir la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de
onda de 405 nm.
IInntteerrpprreettaacciióónn ddee llooss rreessuullttaaddooss
Calcular la Media (XM) de los valores de absorbacia (Ab) del C+, de los
pacientes y del pool, en la placa.
El Cut-off (CO) se establece como las 3 desviaciones estándar (DE) por
encima del valor de Ab media del pool en la placa, a partir de la siguiente
fórmula:
XM (Ab pool) + 3*DE (Abs pool)
El valor de la Ab media del C+ debe de ser superior al valor del CO. Cuando
el valor de la Ab media de un paciente es superior al valor del CO, la muestra
se considera positiva; mientras que cuando es inferior, la muestra se considera
negativa.
129
MATERIAL Y MÉTODOS
3.1.6. Análisis estadístico
El análisis estadístico de las diferencias en la frecuencia de los marcadores
serológicos positivos entre la PAI y los diferentes grupos de pacientes y los
sujetos sanos fueron calculadas mediante el test Chi-cuadrado. Las diferencias
fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.
El valor diagnóstico de cada marcador serológico por separado y de forma
combinada fue calculado como sensibilidad, especificidad, valor predictivo
positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN).
3.2. Utilidad diagnóstica de la IgG y la IgG4 en la PAI
3.2.1. Pacientes y diseño del estudio
En este estudio retrospectivo se incluyeron 14 pacientes con PAI, 9 con
sospecha de PAI y 24 con PCI, diagnosticados entre marzo del 2004 y abril del
2010.
Como grupos control se incluyeron 25 pacientes con PC, 28 con pancreatitis
aguda, 25 con cáncer de páncreas y 45 sujetos sanos. En el grupo de PC, se
incluyeron 16 casos de PC alcohólica, 6 de PC hereditaria y 3 de páncreas
divisum. Las características demográficas de los pacientes se muestran en la
tabla 12.
Los pacientes fueron incluidos en el grupo “sospecha de PAI” cuando la
sospecha de PAI era alta, aunque el diagnóstico definitivo no se había
realizado aún debido al incumplimiento de alguno de los criterios diagnóstico de
la enfermedad.
130
MATERIAL Y MÉTODOS
TABLA 12 . Características generales de los pacientes inclui dos en el estudio
n Edad* Sexo (Masculino/Femenino)
Pancreatitis autoinmune 14 66,5 (16-78) 12/2
Sospecha PAI 9 51 (39-84) 5/4
Pancreatitis crónica idiopática 24 61 (31-91) 18/6
Pancreatitis crónica 25 46 (24-73) 23/2
Pancreatitis aguda 28 69 (33-92) 14/14
Cáncer de páncreas 25 65 (32-87) 16/9
Sujetos sanos 45 44 (23-86) 14/31
*Datos expresados como mediana en años (rango). PAI: Pancreatitis autoinmune
3.2.2. Medición de los nivéles séricos de IgG y de IgG4
Los niveles séricos de IgG total y de IgG4 fueron medidos por nefelometría
tal como se indica en el apartado 3.1.2.
3.2.3. Análisis estadístico
Los análisis estadísticos de las diferencias en la frecuencia de los niveles
séricos elevados de IgG y de IgG4 entre la PAI, sospecha de PAI y PCI y los
diferentes grupos control fueron realizados mediante el test Chi-cuadrado o el
test exacto de Fisher, cuando alguna de las frecuencias esperadas fue inferior
a 5. Las diferencias fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.
Mediante un análisis basado en curvas ROC, se determinaron los valores de
punto de corte óptimo de los niveles séricos de IgG y de IgG4 para el
diagnóstico de la PAI.
131
MATERIAL Y MÉTODOS
3.3. Correlación entre la IgG4 y la afectación extr apancreática en la PAI
3.3.1. Pacientes y diseño del estudio
En este estudio retrospectivo se incluyeron 14 pacientes con PAI, 9 con
sospecha de PAI y 24 con PCI, diagnosticados entre marzo del 2004 y abril del
2010.
Las características demográficas de los pacientes se muestran en la tabla 13.
Los niveles séricos de IgG total e IgG4 fueron medidos (mediante
nefelometría) en todos los pacientes al diagnóstico. En esos pacientes se
analizaron la presencia de lesiones extrapancreáticas y de factores
demográficos y clínicos, como la edad, sexo y síntomas iniciales.
TABLA 13 . Características generales de los pacientes inclui dos en el estudio
n Edad* Sexo (Masculino/Femenino)
Pancreatitis autoinmune 14 66,5 (16-78) 12/2
Sospecha de Pancreatitis autoinmune 9 51 (37-84) 6/4
Pancreatitis crónica idiopática 24 61 (31-91) 18/6
*Datos expresados como mediana en años (rango)
3.3.2. Medición de los nivéles séricos de IgG y de IgG4
Los niveles séricos de IgG total y de IgG4 fueron medidos por nefelometría
tal como se indica en el apartado 3.1.2.
3.3.3. Análisis estadístico
Mediante un análisis basado en curvas ROC, se determinaron los valores
de punto de corte óptimo de los niveles séricos de IgG y de IgG4 para
diferenciar entre pacientes con PAI, sospecha de PAI o PCI; sin y con
lesiones extrapancreáticas. En función del punto de corte establecido para la
IgG4, los pacientes con PAI, sospecha de PAI o PCI, fueron divididos en dos
132
MATERIAL Y MÉTODOS
grupos: Con niveles de IgG4 superiores al punto de corte y con niveles de IgG4
inferiores al punto de corte.
Las diferencias en la presencia de lesiones extrapancreáticas entre estos
dos grupos fueron analizadas mediante el test exacto de Fisher. Las diferencias
fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.
Las diferencias demográficas y clínicas entre los dos grupos fueron
determinadas mediante el test mediante el test Chi-cuadrado o el test exacto de
Fisher, cuando alguna de las frecuencias esperadas fue inferior a 5 en el caso
de variables cualitativas, y mediante el test de U de Mann-Withney en el caso
de variables cuantitativas. Las diferencias en el grado de afectación
extrapancreática fueron analizadas mediante el test de ANOVA con
aproximación de Welch o el test de U de Mann-Withney cuando no se
cumplieron las condiciones de normalidad. Las diferencias fueron consideradas
significativas cuando P < 0,05.
3.4. Caracterización clínica de los pacientes con P AI, sospecha de PAI y
pancreatitis crónica idiopática
En este estudio retrospectivo se incluyeron 14 pacientes con PAI, 9 con
sospecha de PAI y 24 con PCI, diagnosticados entre marzo del 2004 y abril del
2010.
Las características demográficas de los pacientes se muestran en la tabla 14.
Los datos clínicos fueron obtenidos mediante la revisión de las historias clínicas
de los pacientes.
133
MATERIAL Y MÉTODOS
TABLA 14 . Características generales de los pacientes inclui dos en el estudio
n Edad* Sexo (Masculino/Femenino)
Pancreatitis autoinmune 14 66,5 (16-78) 12/2
Sospecha de Pancreatitis autoinmune 9 51 (37-84) 5/4
Pancreatitis crónica idiopática 22 61 (31-91) 17/5
*Datos expresados como mediana en años (rango)
3.5. Niveles séricos de CA 19.9 y utilidad diagnóst ica de los anticuerpos
anti-CA 19.9
3.5.1. Pacientes y diseño del estudio
En este estudio retrospectivo se incluyeron 14 pacientes con PAI, 7 con
sospecha de PAI y 34 con PCI, diagnosticados entre marzo del 2004 y abril del
2010.
Como grupos control se incluyeron 23 pacientes con pancreatitis aguda, 27
con PC, 26 con cáncer de páncreas y 45 sujetos sanos. En el grupo de PC, se
incluyeron 18 casos de PC alcohólica, 6 de PC hereditaria y 3 de páncreas
divisum. Las características demográficas de los pacientes se muestran en la
tabla 15.
TABLA 15 . Características generales de los pacientes inclui dos en el estudio
n Edad* Sexo (Masculino/Femenino)
Pancreatitis autoinmune 14 66,5 (16-78) 12/2
Sospecha de PAI 7 39 (30-75) 3/4
Pancreatitis crónica idiopática 34 62 (32-91) 20/14
Pancreatitis aguda 23 69 (33-92) 12/11
Pancreatitis crónica 27 45 (24-78) 25/2
Cáncer de páncreas 26 65,5 (32-87) 15/11
Sujetos sanos 45 44 (23-86) 14/31
*Datos expresados como mediana en años (rango)
134
MATERIAL Y MÉTODOS
Los datos de los niveles séricos del CA 19.9 al diagnóstico, fueron obtenidos
mediante técnica de quimiolumiscencia en el autoanalizador Immulite 2000
(Siemens, Munich, Alemania). Valores referencia: 1-37 U/ml.
3.5.2. Detección de los anticuerpos anti-CA 19.9 en suero
Los anticuerpos anti-CA 19.9 fueron determinados en suero mediante una
técnica de ELISA, empleando el siguiente protocolo:
PPaassooss pprreevviiooss
- Preparación del C+ y pool de sanos de forma similar a otras
técnicas de anticuerpos descritas previamente.
- Resuspender el antígeno CA 19.9 (Gastrointestinal tumor antigen
17000 unidades/ml, pH 7,4) en 0,15 M PBS + 0,1% AZIDA Na,
(Sigma Chemical Co. St. Louis, MO).
-- Preparar el tampón sustrato, de igual modo que para los ELISA
descritos anteriormente.
DDííaa 11--RReeaalliizzaarr eell ““ccoottttiinngg””
El cotting se realiza en placas de micotitulación de fondo plano de 96 pocillos
(Linbro® 96-Well Microplates, LabWare ICN).
- Diluir el antígeno CA 19.9 en 10 ml de PBS a una concentración
final de 17 U/ml). Añadir 100 µl de antígeno diluido/pocillo en la
placa.
- Incubar toda la noche a 4ºC.
DDííaa 22--BBllooqquueeaarr yy ccaarrggaarr llaass ppllaaccaass
- Preparar el tampón de lavado: PBST (PBS + 0,1% Tween 20).
135
MATERIAL Y MÉTODOS
- Preparar el tampón bloqueo-diluyente:
Albúmina sérica bovina (BSA) (Sigma Chemical Co) al 1% en
PBST 0,1%.
- Lavar la placa 3 veces con PBST. Aspirar el contenido y lavar 3
veces con 250 µl/pocillo de PBS. Dejar la placa completamente
seca, golpeándola sobre un papel de filtro.
- Añadir 200 µl de tampón bloqueo-diluyente/pocillo.
- Tapar la placa e incubar 2 horas a 4ºC.
- Diluir los sueros de los pacientes, el C+ y el pool 1/100 en tampón
de bloqueo-diluyente.
- Eliminar el bloqueo. Secar la placa golpeándola sobre un papel de
filtro.
-- Añadir 100 µl muestra/pocillo (El blanco será el tampón bloqueo-
diluyente) siguiendo la plantilla descrita para los Acs anti-
anhidrasa carbónica II.
-- Incubar la placa tapada 1 hora y 30 minutos a temperatura
ambiente.
AAññaaddiirr ccoonnjjuuggaaddoo yy ssuussttrraattoo
- Diluir el conjugado (Anticuerpo anti-IgG humana conjugado con
fosfatasa alcalina (Sigma Chemical Co)) 1/1000 en BSA al 1% en
PBS (0,2 g BSA + 200 µl PBS).
- Lavar las placas 3 veces con PBST en las condiciones indicadas
anteriormente.
- Añadir 100 µl conjugado diluido/pocillo.
136
MATERIAL Y MÉTODOS
- Incubar las placas tapadas 1 hora a temperatura ambiente.
- Lavar 3 veces con PBST en las condiciones indicadas
anteriormente.
- Añadir 100 µl sustrato diluido/pocillo.
- Incubar las placas tapadas en oscuridad.
- Medir la absorbancia en el espectrofotómetro a una longitud de
onda de 405 nm.
IInntteerrpprreettaacciióónn ddee llooss rreessuullttaaddooss
Se ha emplea un método semejante al descrito para el resto de
anticuerpos anteriores
3.5.3. Análisis estadístico
El análisis estadístico de las diferencias en la frecuencia de los Abs anti-CA
19.9 positivos entre los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI y el resto de
grupos fueron calculadas mediante el test Chi-cuadrado o el test exacto de
Fisher, cuando alguna de las frecuencias esperadas fue inferior a 5. Las
diferencias fueron consideradas significativas cuando P < 0,05. El valor
diagnóstico de los anti-CA 19.9 Abs fue calculado como sensibilidad,
especificidad, VPP y VPN.
Después de comprobar la distribución no normal de los niveles séricos de
CA 19.9, las diferencias en los niveles séricos de CA 19.9 en función de la
presencia de ictericia, niveles séricos aumentados de IgG4 o afectación
extrapancreática, en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI fueron
analizadas mediante el test de U de Mann-Withney. Las diferencias fueron
consideradas significativas cuando P < 0,05.
137
MATERIAL Y MÉTODOS
La correlación entre la presencia de Abs anti-CA 19.9 positivos y de niveles
séricos aumentados de CA 19.9 fue analizada mediante el coeficiente de
contingencia de Pearson. Los valores del coeficiente oscilan de -1 a 1. El valor
absoluto del coeficiente indica el grado de la relación lineal entre las variables.
Los valores absolutos más próximos a 1 indican las relaciones más fuertes. El
signo del coeficiente indica la dirección de la relación (inversa: -1; directa: 1).
3.6. Análisis de la presencia de anticuerpos anti-p 53
3.6.1. Pacientes y diseño del estudio
En este estudio retrospectivo se incluyeron 14 pacientes con PAI, 9 con
sospecha de PAI y 33 con PCI entre marzo del 2004 y abril del 2010.
Como grupos control se incluyeron, 27 con PC y 26 con cáncer de páncreas.
En el grupo de PC se incluyeron 18 casos de PC alcohólica, 6 de PC
hereditaria y 3 de páncreas divisum. Las características demográficas de los
pacientes se muestran en la tabla 16.
TABLA 16 . Características generales de los pacientes inclui dos en el estudio
n Edad* Sexo (Masculino/Femenino)
Pancreatitis autoinmune 14 66,5 (16-78) 12/2
Sospecha de PAI 9 51 (37-84) 5/4
Pancreatitis crónica idiopática 33 64 (32-91) 19/14
Pancreatitis crónica 27 45 (24-78) 25/2
Cáncer de páncreas 26 65,5 (32-87) 15/11
*Datos expresados como mediana en años (rango)
3.6.2. Detección de los anticuerpos anti-p53 en suero
Los anticuerpos anti-p53 fueron determinados en suero mediante una
técnica de ELISA comercial (p53 Ab ELISA, IBL international, Hamburgo,
Alemania) empleando el siguiente protocolo:
138
MATERIAL Y MÉTODOS
PPaassooss pprreevviiooss
-- Preparar el tampón de lavado: 50 ml “wash buffer 20x” + 950 ml
de agua destilada.
-- Reconstituir el tampón de dilución de las muestras (liofilizado):
Añadir 12 ml de agua destilada.
- Diluir las muestras 1:100 con el tampón de dilución reconstituido.
PPrroottooccoolloo ddee eennssaayyoo
-- Añadir 200 µl de tampón de lavado diluido/pocillo de la placa
ELISA. Dejar 3 minutos. Eliminar con un golpe seco. Secar la
placa sobre un papel de filtro.
-- Reconstituir el tampón de dilución de las muestras (liofilizado):
Añadir 12 ml de agua destilada.
-- Añadir 100 µl/ pocillo de blanco (tampón de dilución), calibrador,
control negativo y muestras diluidas.
-- Incubar la placa tapada 1 hora a temperatura ambiente.
- Lavar la placa 5 veces con el tampón de lavado diluido. Dejar la
placa completamente seca, golpeándola sobre un papel de filtro.
- Añadir 100 µl/pocillo de conjugado.
- Incubar la placa tapada 1 hora a temperatura ambiente.
- Lavar la placa 5 veces con el tampón de lavado diluido en las
condiciones indicadas anteriormente.
- Añadir 100 µl/pocillo de solución sustrato (TMB).
- Incubar la placa tapada 30 minutos a temperatura ambiente en
oscuridad.
139
MATERIAL Y MÉTODOS
- Añadir 50 µl/pocillo de solución de parada (HCl 2M).
- Medir la absorbancia en el espectrofotómetro a 450 nm.
IInntteerrpprreettaacciióónn ddee llooss rreessuullttaaddooss
Teniendo en cuenta que 100 µl de calibrador contiene 1 unidad de actividad
de unión a p53. El Cut-off (CO) es calculado multiplicando el valor de la
absorbancia a 450nm del calibrador por un factor de corrección de 0,15:
CO= Ab 450nm Calibrador X 0,15
El control negativo ha de tener una Ab450nm inferior al valor del CO
establecido. Todos los sueros con una Ab450nm inferior o igual al valor del CO
son interpretados como negativos para la presencia de anticuerpos anti-p53,
mientras que aquellos con una Ab450nm superior al valor del CO son
interpretados como positivos para la presencia de anticuerpos anti-p53.
3.6.3. Análisis estadístico
El análisis estadístico de las diferencias en la frecuencia de los anticuerpos
anti-p53+ entre la PAI, sospecha de PAI y PCI y el resto de grupos fueron
calculadas mediante el test Chi-cuadrado o el test exacto de Fisher, cuando
alguna de las frecuencias esperadas fue inferior a 5. Las diferencias fueron
consideradas significativas cuando P < 0,05.
La correlación entre la presencia de anticuerpos anti-p53 y de lesiones
extrapancreáticas fue analizada mediante el coeficiente de contingencia de
Pearson.
140
MATERIAL Y MÉTODOS
3.7. Análisis de los niveles séricos de Interleucin a-6
3.7.1. Pacientes y diseño del estudio
En este estudio retrospectivo se incluyeron 13 pacientes con PAI, 7 con
sospecha de PAI y 14 con pancreatitis crónica idiopática, diagnosticados entre
marzo del 2004 y abril del 2010.
Como grupos control se incluyeron, 21 con PC y 19 con cáncer de páncreas
y 18 controles sanos. En el grupo de PC se incluyeron 16 casos de PC
alcohólica, 4 de PC hereditaria y 1 de páncreas divisum. Las características
demográficas de los pacientes se muestran en la tabla 17.
TABLA 17 . Características generales de los pacientes inclui dos en el estudio
n Edad* Sexo (Masculino/Femenino)
Pancreatitis autoinmune 13 68 (16-78) 11/2
Sospecha de PAI 7 59 (39-84) 3/4
Pancreatitis crónica idiopática 14 52 (32-91) 11/3
Pancreatitis crónica 21 47 (24-73) 20/1
Cáncer de páncreas 19 66 (32-87) 13/6
Controles sanos 18 48 (23-86) 12/6
*Datos expresados como mediana en años (rango)
3.7.2. Cuantificación de los niveles séricos de IL-6
Los niveles de IL-6 fueron medidos en suero mediante una técnica de ELISA
comercial (Human IL-6 ELISA, Diaclone, Besancon Cedex, Francia) empleando
el siguiente protocolo:
PPaassooss pprreevviiooss
-- Preparar el tampón de lavado: 10 ml “wash buffer 200x” + 2000 ml
de agua destilada.
-- Reconstituir el estándar IL-6 (liofilizado) con 1 ml del diluyente del
estándar, para producir una solución stock de 200 pg/ml.
141
MATERIAL Y MÉTODOS
-- Preparar el control: Reconstituir el control (liofilizado) con el
volumen del diluyente de estándar indicado en el vial.
PPrroottooccoolloo ddee eennssaayyoo
- Preparar la curva estándar a partir del estándar A (200 pg/ml)
mediante diluciones ½ con solución de dilución. Las
concentraciones finales del estándar serán de 200, 100, 50, 25,
12.5, y 6.25 pg/ml en los pocillos A1, B1, C1, D1, E1 y F1,
respectivamente (Figura 14).
- Añadir 100 µl del tampón diluyente del estándar en el pocillo G1
(Blanco).
- Añadir 100 µl del control positivo en el pocillo H1.
- Añadir 100 µl de las muestras de suero de los pacientes, a partir
del pocillo A2.
- Preparar el anticuerpo anti-IL-6 biotinilado: 240 µl de anticuerpo
anti-IL-6 biotinilado + 6360 µl de diluyente del anticuerpo
biotinilado.
- Añadir 50 µl/pocillo de anticuerpo anti-IL-6 biotinilado diluido.
- Incubar la placa tapada 1 hora a temperatura ambiente.
- Lavar la placa 3 veces con el tampón de lavado diluido. Dejar la
placa completamente seca, golpeándola sobre un papel de filtro.
- Preparar la estreptavidina-HRP mediante una pre-dilución 1:100
de la streptavidina-HRP. Diluir 150 µl de la estreptavidina-HRP
prediluida con 10 ml del diluyente HRP
142
MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 14. Plantilla IL-6 mostrando las diluciones seriadas del estándar y la posición del blanco, el control positivo y las muestras de suero de los pacientes. E200, E100, E50, E25, E12.5, E6.25: Curva estándar. BL: Blanco. C+: Control positivo.
- Añadir 100 µl/pocillo de estreptavidina-HRP diluida.
- Incubar la placa tapada 30 minutos a temperatura ambiente.
- Lavar la placa 3 veces con el tampón de lavado diluido, en las
condiciones indicadas anteriormente.
- Añadir 100 µl/pocillo de solución sustrato (TMB).
- Incubar la placa tapada de 12 a 15 minutos a temperatura
ambiente en oscuridad.
- Añadir 100 µl/pocillo de Solución de parada (H2SO4).
- Medir la absorbancia en el espectrofotómetro a 450 nm.
IL-6 ESTÁNDAR
200 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
100 µl
Descartar 100 µl
E200
E100
E50
E25
E12.5
E6.25
BL
C+
MUESTRAS
143
MATERIAL Y MÉTODOS
IInntteerrpprreettaacciióónn ddee llooss rreessuullttaaddooss
Crear una curva estándar lineal mediante la representación gráfica de las
concentraciones del estándar en el eje de abscisas y del valor de absorbancia
a 450 nm en el eje de ordenadas.
El límite de detección del ensayo es de 2 pg/ml.
3.7.3. Análisis estadístico
Después de comprobar la distribución no normal de los niveles séricos de IL-
6, las diferencias en los niveles séricos de IL-6 entre los pacientes con PAI,
sospecha de PAI y PCI y el resto de grupos incluidos en el estudio fueron
calculadas mediante el test de U de Mann-Withney. Las diferencias fueron
consideradas significativas cuando P < 0,05.
3.8. Estudio de las subpoblaciones linfocitarias en pacientes con PAI,
sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiop ática
3.8.1. Pacientes y diseño del estudio
En este estudio prospectivo se incluyeron 10 pacientes con PAI, 5 con
sospecha de PAI y 13 con PCI, diagnosticados entre marzo del 2004 y abril del
2010.
Las características demográficas de los pacientes se muestran en la tabla 18.
TABLA 18 . Características generales de los pacientes inclui dos en el estudio
n Edad* Sexo (Masculino/Femenino)
Pancreatitis autoinmune 10 69 (16-78) 9/1
Sospecha de Pancreatitis autoinmune 5 51 (39-84) 3/2
Pancreatitis crónica idiopática 13 59 (31-83) 11/2
*Datos expresados como Mediana, años (rango)
144
MATERIAL Y MÉTODOS
3.8.2. Marcaje superficial por citometría de flujo
El estudio de las subpoblaciones linfocitarias fue realizado por citometría de
flujo (CMF) utilizando el “BD Multitest™ kit” (Becton Dickinson, San José,
Estados Unidos), en muestras de sangre total anticoaguladas con EDTA y
procesadas durante las 24 horas siguientes a su extracción. Este kit consiste
en reactivos de inmunofluorescencia directa con combinaciones de cuatro
anticuerpos monoclonales conjugados a diferentes fluorocromos, que permiten
identificar y determinar el porcentaje y el número absoluto de las siguientes
subpoblaciones linfocitarias en sangre completa con eritrocitos lisados:
linfocitos B (CD19+), linfocitos T (LT) (CD3+), linfocitos T colaboradores (LT
CD4+) (CD3+ CD4+), linfocitos T citotóxicos (LT CD8+) (CD3+ CD8+), y linfocitos
natural killer (NK) (CD3- CD16+ y/o CD56+). Los tubos “BD Trucount™” fueron
empleados para determinar el recuento absoluto de cada una de las
subpoblaciones de linfocitos. Estos tubos utilizan el sistema de plataforma
única para cuantificar los números absolutos sin necesidad de extrapolar desde
el número de linfocitos obtenidos en el hemograma clásico. Los tubos “BD
Trucount™” permiten el marcaje directo de un volumen conocido de muestra.
Cuando el pelled liofilizado se disuelve en los tubos, libera una cantidad
conocida de cuentas fluorescentes. Durante el análisis el número absoluto de
células positivas en la muestra (células/µl) se determina comparando los
eventos celulares con los eventos de las cuentas fluorescentes.
145
MATERIAL Y MÉTODOS
PPrroottooccoolloo ddee eennssaayyoo
- Para cada muestra marcar dos tubos de poliestireno de 12 X 75
mm (BD Falcon™. Becton Dickinson, San José, Estados Unidos),
como A y B; y dos tubos “BD Trucount” de igual modo, para el
recuento absoluto.
- Pipetear 20 µl del reactivo “BD Miltitest CD3/CD8/CD45/CD4 en el
fondo de cada tubo marcado como A.
- Pipetear 20 µl del reactivo “BD Miltitest CD3/CD16 +
CD56/CD45/CD19 en el fondo de cada tubo marcado como B.
- Pipetear 50 µl de sangre completa anticoagulada en el fondo de
cada tubo.
- Tapar los tubos y vortear.
- Incubar 15 minutos en oscuridad a RT.
- Añadir 450 µl de solución de lisis 1X “BD Multitest lysing solution”
(proteger los tubos de la luz).
- Tapar los tubos y vortear.
- Incubar 15 minutos en oscuridad a RT.
- Adquirir las muestras en el citómetro FACScalibur. - Analizar las muestras con el sofware BD CellQuest.
En la figuras 15, 16 y 17 se muestra un ejemplo de estudio para una
muestra de sangre de un adulto sano, marcada con CD3/CD8/CD45/CD4 en un
tubo BD Trucount.
146
MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 15. Identificación de los linfocitos en un dot plot CD45 vs SSC
Figura 16. Bead de recuento absoluto Trucount
Figura 17. Identificación de linfocitos T citotóxicos (CD3+CD8+) y colaboradores (CD3+CD4+) en un dot plot CD4 vs CD8
CD3 FITC
CD
8 P
E
Beads recuento absoluto
CD45 PerCp
SS
C
Linfocitos CD45+
CD
4 A
PC
CD8 PE
147
MATERIAL Y MÉTODOS
En la figuras 18 y 19 se muestran los datos obtenidos para una muestra de
sangre de un adulto sano, marcada con CD3/CD16 + CD56/CD45/CD19 en un
tubo BD Trucount.
Figura 18. Bead de recuento absoluto Trucount
Figura 19. Identificación de linfocitos B (CD19+) y linfocitos NK (CD3–CD16+ o CD56+ o ambos) en una imagen de dot plot CD16 + CD56 vs CD19.
3.8.3. Resultados
Los resultados son informados como porcentaje de células positivas por
población de linfocitos o como número de células positivas por µl de sangre.
3.8.4. Análisis estadístico
Después de comprobar la distribución no normal de las frecuencias de las
subpoblaciones linfocitarias, las diferencias en las frecuencias absolutas y
CD3 FITC
CD
16 + 56 P
E
CD19 APC
CD
16 + 56 P
E
Beads recuento absoluto
148
MATERIAL Y MÉTODOS
los porcentajes de cada una de las subpoblaciones linfocitarias y del cociente
entre células T CD4+/T CD8+ entre los pacientes con PAI, sospecha de PAI y
PCI fueron calculadas mediante el test de U de Mann-Withney. Las diferencias
fueron consideradas significativas cuando P < 0,05. El análisis estadístico de
las diferencias en la frecuencia de la presencia de linfocitopenia B (% linfocitos
B < 6%) y de aumento de células Nk (% células NK > 26%) entre los pacientes
con PAI, sospecha de PAI y PCI fueron calculadas mediante el test Chi-
cuadrado o el test exacto de Fisher, cuando alguna de las frecuencias
esperadas fue inferior a 5. Las diferencias fueron consideradas significativas
cuando P < 0,05. El análisis estadístico de las diferencias el porcentaje de
células Nk entre pacientes sin y con afectación extrapancreática fueron
determinadas mediante el test de U de Mann-Withney. Las diferencias fueron
consideradas significativas cuando P < 0,05.
3.9. Análisis inmunofenotípico de las subpoblacione s de células B en
pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis c rónica idiopática
3.9.1. Pacientes y diseño del estudio
En este estudio prospectivo se incluyeron 10 pacientes con PAI, 5 con
sospecha de PAI y 13 con PCI, diagnosticados entre marzo del 2004 y abril del
2010.
Las características demográficas de los pacientes se muestran en la tabla 19.
TABLA 19 . Características generales de los pacientes inclui dos en el estudio
n Edad* Sexo (Masculino/Femenino)
Pancreatitis autoinmune 10 69 (16-78) 9/1
Sospecha de Pancreatitis autoinmune 5 51 (39-84) 3/2
Pancreatitis crónica idiopática 13 59 (31-83) 11/2
*Datos expresados como mediana en años (rango)
149
MATERIAL Y MÉTODOS
3.9.2. Aislamiento de PBMCs
Las muestras de sangre total, anticoaguladas con EDTA, fueron procesadas
durante las 2 horas siguientes a su extracción.
Como las inmunoglobulinas solubles presentes en la sangre completa
pueden interferir en el marcaje de las inmunoglobulinas de superficie de
linfocitos B, las células mononucleares de sangre periférica (PMBCs) fueron
obtenidas mediante centrifugación en gradiente de densidad usando Ficoll-
Hstopaque (Sigma-Aldrich, Ayrshire, Reino Unido).
3.9.3. Marcaje superficial por citometría de flujo
El estudio de las subpoblaciones de células B fue realizado por CMF de 4
colores en las muestras de PBMCs.
Las PBMCs fueron marcadas con los anticuerpos monoclonales conjugados
con fluorocromos (AcMo-Fluorocromo) de acuerdo con el panel descrito en la
tabla 20. Todos los AcMo-Fluorocromos fueron obtenidos de Becton-Dickinson
(BD, San José, EEUU), excepto CD10-FITC, CD10-Per-CP y CD24-PE
(Inmunostep, Salamanca, España), CD38-PerCP (Biolegend, San Diego,
EEUU), CD5-FITC (Dako, Glostrup, Dinamarca) y CD138-FITC (Cytognos SL,
Salamanca, España).
PPrroottooccoolloo ddee eennssaayyoo
- Añadir de 750000-800000 PBMCs/Tubo.
- Añadir los Ac-Mo-Fluorocromos según el panel de la tabla 19.
- Incubar 20 minutos en oscuridad a temperatura ambiente.
- Lavar dos veces con PBS-BSA: Añadir 2 ml de PBS-BSA,
centrifugar 1500 rpm 5-10 minutos y decantar el sobrenadante.
150
MATERIAL Y MÉTODOS
TABLA 20 . Panel para el marcaje de células B
AcMo - Fluorocromo/ Nº Tubo AcMo-FITC AcMo-PE AcMo-PerCP AcMo-APC
1 CD10 20 µl*
CD24 10 µl
CD38 3 µl
CD19 5 µl
2 CD 5 30 µl
CD24 10 µl
CD38 3 µl
CD19 5 µl
3 CD 27
3 µl IgD 2 µl
CD 19 10 µl
IgM 10 µl
4 CD 27
3 µl CD 25
3 µl CD 38
3 µl CD 19
5 µl
5 CD 27
3 µl IgD 2 µl
CD 38 3 µl
CD 19 5 µl
6 CD 27
3 µl CD 10
2 µl CD 38
3 µl CD 19
5 µl
7 CD 10 20 µl
IgD 2 µl
CD 38 3 µl
CD 19 5 µl
8 CD 138
3 µl CD 19
5 µl CD 38
3 µl CD 56
5 µl
9 CD 19 2,5 µl
Lambda 2,5 µl
CD 38 3 µl
Kappa 2,5 µl
AcMo: Anticuerpo monoclonal. AcMo-Fluorocromo: Anticuerpo monoclonal conjugado con fluorocromo. FITC: Isotiocianato de fluoresceína. PE: Ficoeritrina. PerCP: Proteína peridin-clorofila. APC: Aloficocianina. * Cantidad de AcMo-Fluorocrocromo añadida por tubo.
- Resuspender en 200 µl de PBS-BSA.
3.9.4. Marcaje intracelular por citometría de flujo
El reactivo triple TC669 (CD 19-FITC + Lambda PE + Kappa APC) (Dako,
Glostrup, Dinamarca), en combinación con CD38-PerCP (Becton Dickinson,
San José, Estados Unidos), fueron utilizados para el análisis de clonalidad de
las células plasmáticas.
151
MATERIAL Y MÉTODOS
PPrroottooccoolloo ddee eennssaayyoo
- Rotular un tubo de poliestireno de 12 X 75 mm (BD Falcon™.
Becton Dickinson, San José, Estados Unidos) con el número 9.
- Añadir de 750000-800000 PBMCs/Tubo.
- Añadir 3 µl de CD 38-PerCP (Tubo 9 del panel descrito en la
figura 19).
- Incubar 20 minutos en oscuridad a temperatura ambiente.
- Lavar dos veces con PBS-BSA
- Añadir 500 µl de permeabilizante diluido 1/10 en agua destilada
(Fix/Perm, Becton Dickinson, San José, Estados Unidos).
- Incubar 10 minutos en oscuridad.
- Lavar dos veces con PBS-BSA.
- Lavar dos veces con PBS-BSA: Añadir 2 ml de PBS-BSA,
centrifugar 1500 rpm 5-10 minutos y decantar el sobrenadante.
- Resuspender en 200 µl de PBS-BSA.
Finalmente, todas las muestras fueron adquiridas en el citómetro FACS-
calibur.
3.9.5. Análisis inmunofenotípico
El análisis inmunofenotípico de las subpoblaciones de células B fue realizado
con el sofware “Paint A GATE”. En la tabla 21 se describe el perfil
inmunofenotípico de las subpoblaciones de células B analizadas.
152
MATERIAL Y MÉTODOS
TABLA 21 . Perfil inmunofenotípico de las subpoblaciones de células B
Subpoblaciones/
Marcador CD Transicionales Pre-Naive Naive Memoria Plasmáticas
CD5 ++* + + - -
CD10 + + - - -
CD19 + + + + +
CD 24 + +d +d + -
CD 25 - - + - -
CD 27 - - - + ++
CD 38 ++ + +d -/+d ++
CD 56 - - - - -
Cd 138 - - - - -/+
IgD + + + -/+ -
IgM + + + -/+ -
CD: Cluster de diferenciación. * Intensidad de marcaje expresada como -: Negativo, +d:
Positivo débil, +: Positivo, ++: Positivo fuerte -/+:Negativo o positivo.
33..99..55..11..CCllaassiiffiiccaacciióónn IIggDD//CCDD2277 El marcador universal de las células B memoria es el CD27, de modo que
permite diferenciar entre células B memoria (CD27+) y células B naive (CD27-
IgD+). Las células B memoria CD27+ se pueden subdividir en IgD+ (unswitched)
e IgD- (switched). Adicionalmente se ha identificado en los últimos años una
subpoblación de células B memoria que carece de la expresión tanto de CD27,
como de IgD: CD27- IgD- (dobles negativas). Las células plasmáticas expresan
niveles elevados de CD27 y carecen de la expresión de IgD: CD27++ IgD- [379,
380] (Figura 20).
153
MATERIAL Y MÉTODOS
Naive
Células plasmáticas
Memoria unswitched
Memoria Switched
Memoria DN
IgD
CD
27
IgD
CD
27
Figura 20. Distribución de células B en sangre en función de la expresión en superficie de IgD y CD27. N: Naive. NSM: Nonswitched memory. SM: Switched memory. DN: Memoria dobles negativas. PC: Células plasmáticas. 33..99..55..22..CCllaassiiffiiccaacciióónn CCDD3388//IIggDD Las células B CD19+ CD27- se subdividieron en función de los niveles de
expresión de CD38 en: naive (niveles bajos de CD38: CD38+d), pre-naive
(niveles intermedios de CD38: CD38+) y transicionales (niveles altos de CD38:
CD38++) [381] (Figura 21).
IgD
CD38
CD19+ CD27-
Figura 21. Distribución de células B CD19+ CD27- en sangre en función de la expresión en superficie de CD38: Naive (CD38+d), pre-naive (CD38+) y transicionales (cd38++). N: Naive. Int: Pre-naive. Tr: Transicionales.
154
MATERIAL Y MÉTODOS
33..99..55..33.. AAnnáálliissiiss ddee cclloonnaalliiddaadd ddee ccéélluullaass ppllaassmmááttiiccaass El estudio de la clonalidad de las células plasmáticas (CD19+ CD38++) fue
realizado mediante el cálculo del cociente entre las cadenas ligeras
intracitoplasmáticas kappa y lambda (ratio k/λ). Los ratios k/λ con valores
comprendidos entre 0,5 y 4 se corresponden con poblaciónes policlonales,
mientras que los valores por debajo o por encima se corresponden con
poblaciones monoclonales, con restricción kappa (ratio k/λ > 4) o lambda (ratio
k/λ < 0,5) (Figura 22).
Kappa
Lam
bda
CD19+ CD38++
Figura 22. Análisis de clonalidad de células plasmáticas (CD19+ CD38++) en función del cociente kappa/lambda. 3.9.6. Análisis estadístico
Después de comprobar la distribución no normal de las frecuencias
absolutas y de los porcentajes de las distintas subpoblaciones de linfocitos B y
del ratio k/λ, las diferencias en las frecuencias absolutas y de los porcentajes
de cada una de las subpoblaciones de linfocitos B y del ratio k/λ entre los
pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI fueron calculadas mediante el test
de U de Mann-Withney. Las diferencias fueron consideradas significativas
cuando P < 0,05.
155
MATERIAL Y MÉTODOS
El análisis estadístico de las diferencias en el aumento en la frecuencia de
células B memoria totales (rango normal: 28-68%), memoria dobles negativas
(valor normal < 5%), plasmaticas totales (rango normal: 0,5-1,4%), plasmáticas
CD138+ (rango normal: 0,28-0,8%) y plasmáticas CD138- (rango normal: 0,22-
0,6%); y en un descenso en la frecuencia de células B pre-naive (rango normal:
3-16%) y naive (rango normal: 57-73%); entre los pacientes con PAI, sospecha
de PAI y PCI fueron calculadas mediante el test Chi-cuadrado o el test exacto
de Fisher, cuando alguna de las frecuencias esperadas fue inferior a 5. Las
diferencias fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.
El análisis estadístico de las diferencias en el porcentaje de células B
transicionales, prenaive, memoria totales, memoria dobles negativas y
plasmáticas entre pacientes sin y con afectación extrapancreática fue
determinado mediante el Test de U de Mann-Withney. Las diferencias fueron
consideradas significativas cuando P < 0,05.
El análisis estadístico de las diferencias en la frecuencia de la presencia de
un ratio k/λ normal (0,5-4) y disminuido (< 0,5) entre los pacientes con PAI,
sospecha de PAI y PCI fueron calculadas mediante el test Chi-cuadrado o el
test exacto de Fisher, cuando alguna de las frecuencias esperadas fue inferior
a 5. Las diferencias fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.
156
MATERIAL Y MÉTODOS
3.10. Estudio de cadenas ligeras libres y ratios Ka ppa/Lambda en
pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancre atitis crónica idiopática
3.10.1. Pacientes y diseño del estudio
En este estudio retrospectivo se incluyeron 14 pacientes con PAI, 9 con
sospecha de PAI y 16 con PCI, diagnosticados entre marzo del 2004 y abril del
2010.
Las características demográficas de los pacientes se muestran en la tabla 22.
TABLA 22 . Características generales de los pacientes inclui dos en el estudio
n Edad* Sexo (Masculino/Femenino)
Pancreatitis autoinmune 14 66,5 (16-78) 12/2
Sospecha de Pancreatitis autoinmune 9 51 (37-84) 5/4
Pancreatitis crónica idiopática 16 61,5 (31-83) 14/2
*Datos expresados como mediana en años (rango)
En pacientes con PAI se monitorizaron los niveles de cadenas ligeras libres
en suero k (sFLC k) y λ (sFLC λ) y los cocientes entre las cadenas ligeras
libres k y λ (ratio k/λ sFLC) en muestras de suero extraídas al diagnóstico y a
distintos tiempos tras el comienzo de la terapia esteroidea. El efecto del
tratamiento esteroideo sobre los niveles de sFLC y sobre los ratios sFLC k/λ
fue determinado a corto y a largo plazo. Para analizar la influencia a corto plazo
se compararon estos parámetros en las muestras de suero al diagnóstico y en
muestras extraídas durante los tres primeros meses tras el comienzo del
tratamiento esteroideo (muestras post-tratamiento). Para analizar la influencia a
largo plazo se compararon estos parámetros entre las muestras de suero al
diagnóstico y las últimas muestras de suero extraídas (un tiempo después del
comienzo del tratamiento esteroideo) (muestras finales).
157
MATERIAL Y MÉTODOS
En pacientes con sospecha de PAI y PCI, sin ningún tratamiento
farmacológico, se analizaron las oscilaciones en el tiempo de niveles de sFLC k,
sFLC λ los ratios k/λ sFLC, mediante la comparación de estos parámetros entre
las muestras de suero al diagnóstico y las últimas muestras de suero
extraídas (muestras finales).
3.10.2. Cuantificación de las cadenas ligeras libres en suero
Los niveles de sFLC k y sFLC λ fueron medidos por nefelometría
(Nefelómetro BNII Siemens, Munich, Alemania), utilizando en inmunoensayo
FreeliteTM (The Binding Site, Birmingham, Inglaterra). Los rangos de referencia
para sFLC y el ratio k/λ sFLC fueron publicados por Katzmann [379] et al:
sFLC k (3,3-19,4 mg/L), sFLC λ (5,7-26,3 mg/L) y ratio k/λ sFLC (0,26-1,65).
3.10.3. Interpretación de los resultados
La relación de cadenas ligeras libres en suero es un indicador potente de la
monoclonalidad y puede ayudar a distinguir una respuesta policlonal de una
monoclonal.
Los ratios k/λ sFLC anormales apoyarían el diagnóstico de gammapatias
monoclonales. Los ratios con valores inferiores a 0,26 serian indicativos de la
presencia de gammapatias monoclonales con restricción λ, mientras que
los ratios con valores superiores a 1,65 serian indicativos de gammapatias
monoclonales con restricción k.
Los incrementos de sFLC k (>19,4 mg/L), sFLC λ (>26,3 mg/L), o de ambas,
asociados con ratios k/λ sFLC normales (0,26-1,65); podría deberse a los
siguientes mecanismos:
158
MATERIAL Y MÉTODOS
Reducción del aclaramiento renal de sFLC.
Incremento en la producción policlonal de sFLC en procesos
inflamatorios y en enfermedades autoinmunes.
Los incrementos en suero de sFLC k (>19,4 mg/L), sFLC λ (>26,3
mg/L), o de ambas, asociados con ratios k/λ sFLC anormales,
sugerirían la combinación de la presencia de gammapatías
monoclonales, y de reducción del aclaramiento renal de sFLC,
incremento en la producción policlonal de sFLC, o de ambas.
Los descensos en suero de sFLC k (< 19,4 mg/L), sFLC λ (< 26,3
mg/L), o de ambas, indicarían un descenso en la producción de
sFLC en la médula ósea.
3.10.4. Análisis estadístico
La ausencia de distribución normal de los niveles de sFLC k, sFLC λ, y del
ratio k/λ sFLC en las muestras al diagnóstico, post-tratamiento y finales, en
cada grupo de pacientes, fue determinada mediante el test de Kolmogoroz-
Smirnov.
Las diferencias en los niveles de sFLC k, sFLC λ, y el ratio k/λ en las
muestras al diagnóstico y finales entre los pacientes con PAI, sospecha de PAI
y PCI fueron calculadas mediante el test de U de Mann-Withney.
Las diferencias entre los niveles de sFLC k, sFLC λ, y el ratio k/λ entre las
muestras al diagnóstico y post-tratamiento en pacientes con PAI, fueron
determinadas mediante el test de Wilcoxon para muestras pareadas. Las
diferencias fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.
159
MATERIAL Y MÉTODOS
Las diferencias entre los niveles de sFLC k, sFLC λ, y el ratio k/λ entre las
muestras al diagnóstico y finales en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI,
fueron determinadas mediante el test de Wilcoxon para muestras pareadas.
Las diferencias fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.
La significación estadística de las diferencias entre los niveles de sFLC k,
sFLC λ, y el ratio k/λ entre las muestras al diagnóstico y finales en pacientes
con PAI, sospecha de PAI y PCI, fue determinada mediante el test de Wilcoxon
para muestras pareadas. Las diferencias fueron consideradas significativas
cuando P < 0,05.
El análisis estadístico de las diferencias en la frecuencia de los niveles
aumentados de sFLC k (> 19,4 mg/L) y de sFLC λ (> 26,3 mg/L), y de la
presencia de ratios k/λ sFLC alterados (< 0,26 o > 1,65) fue realizado mediante
el test Chi-cuadrado o el test exacto de Fisher, cuando alguna de las
frecuencias esperadas fue inferior a 5. Las diferencias fueron consideradas
significativas cuando P < 0,05.
Las diferencias en los niveles de sFLC k, sFLC λ, y el ratio k/λ en los pacientes
sin y con afectación extrapancreática fueron determinadas mediante el test de
U de Mann-Withney.
La correlación entre los niveles séricos de IgG4 y los niveles de sFLC k, sFLC
λ o los ratios k/λ sFLC, en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, fue
analizada mediante el coeficiente de correlación de Spearman (ρ).
La correlación entre la presencia de ratios sFLC k/λ alterados y de afectación
extrapancreática, fue analizada mediante el coeficiente de contingencia de
Pearson.
160
MATERIAL Y MÉTODOS
3.11. Estudio de proteínas monoclonales en pacient es con PAI, sospecha
de PAI y pancreatitis crónica idiopática
3.11.1. Pacientes y diseño del estudio
En este estudio retrospectivo se incluyeron 14 pacientes con PAI, 9 con
sospecha de PAI y 16 con PCI, diagnosticados entre marzo del 2004 y abril del
2010.
Las características demográficas de los pacientes se muestran en la tabla 23.
TABLA 23 . Características generales de los pacientes inclui dos en el estudio
n Edad* Sexo (Masculino/Femenino)
Pancreatitis autoinmune 14 66,5 (16-78) 12/2
Sospecha de Pancreatitis autoinmune 9 51 (37-84) 5/4
Pancreatitis crónica idiopática 16 61,5 (31-83) 14/2
*Datos expresados como mediana en años (rango)
3.11.2. Detección de proteínas monoclonales
El análisis de las proteínas séricas fue realizado mediante electroforesis en
geles de agarosa (SPE). Las bandas obtenidas fueron cuantificadas mediante
escaneo del gel de SPE por densitometría. Las proteínas monoclonales son
generalmente visibles como una banda definida en la electroforesis o como un
pico angosto en el trazo densitométrico, generalmente en la región γ o β, y
raramente en la región α2. Los aumentos policlonales de proteínas se ven
como espigas de base ancha limitadas a la región γ. El tipo específico de
proteína monoclonal fue determinado mediante Inmunofijación electroforesis
(IFE) utilizando el sistema semi-automatizado de Sebia (Herví Francia), según
las condiciones indicadas por el fabricante.
161
MATERIAL Y MÉTODOS
3.11.3. Análisis estadístico
El análisis estadístico de las diferencias en la frecuencia de la presencia de
inmunoglobulinas monoclonales fue calculado mediante el test Chi-cuadrado o
el test exacto de Fisher, cuando alguna de las frecuencias esperadas fue
inferior a 5. Las diferencias fueron consideradas significativas cuando P < 0,05.
La correlación entre la presencia de inmunoglobulinas monoclonales y de
afectación extrapancreática, fue analizada mediante el coeficiente de
contingencia de Pearson.
3.12. Analisis de clonalidad de células B en infilt rados linfoplasmocíticos
en lesiones pancreáticas y extrapancreátic as en pacientes con PAI,
sospecha de PAI y pancreatitis crónica idi opática
3.12.1. Pacientes y diseño del estudio
En este estudio retrospectivo se incluyeron 10 pacientes con PAI, 3 con
sospecha de PAI y 2 con PCI, en función de la disponibilidad de muestras de
biopsia de los tejidos afectados, diagnosticados entre marzo del 2004 y abril del
2010.
Las características demográficas de los pacientes se muestran en la tabla 24.
TABLA 24 . Características generales de los pacientes inclui dos en el estudio
n Edad* Sexo (Masculino/Femenino)
Pancreatitis autoinmune 10 69 (16-78) 9/1
Sospecha de Pancreatitis autoinmune 3 51 (43-82) 2/1
Pancreatitis crónica idiopática 2 68 (64-72) 2/0
*Datos expresados como mediana en años (rango)
Las muestras analizadas en cada uno de los pacientes se describen en la
tabla 25.
162
MATERIAL Y MÉTODOS
TABLA 25 . Muestras analizadas en los pacientes incluidos en el estudio
Paciente Diagnóstico Muestras
1 Pancreatitis autoinmune Páncreas
Glándulas salivares
2 Pancreatitis autoinmune Páncreas
Glanglio cístico
3 Pancreatitis autoinmune Próstata
4 Pancreatitis autoinmune Vesícula biliar
Glandulas salivares
5 Pancreatitis autoinmune Próstata
6 Pancreatitis autoinmune Páncreas
7 Pancreatitis autoinmune Vesícula biliar
8 Pancreatitis autoinmune Páncreas
9 Pancreatitis autoinmune Hígado
10 Pancreatitis autoinmune Papila duodenal
11 Sospecha de PAI Vesícula biliar
12 Sospecha de PAI Papila duodenal
13 Sospecha de PAI Páncreas
Médula ósea
14 Pancreatitis crónica idiopática Vesícula biliar
15 Pancreatitis crónica idiopática Estómago
3.12.2. Análisis de reordemientos clonales del gen IgH
33..1122..22..11.. FFuunnddaammeennttooss ddeell eennssaayyoo
Los reordenamientos del gen IgH en las muestras de DNA fueron
analizados mediante el “kit para el análisis molecular de reordenamientos
clonales del gen IgH” (Master Diagnóstica, Granada, España).
163
MATERIAL Y MÉTODOS
Este kit permite detectar la presencia de clonalidad en procesos
linfoproliferativos de células B, mediante la amplificación de los segmentos
reordenados VDJ de la región hipervariable de la cadena pesada de las
inmunoglobulinas (IgH), empleando múltiples cebadores consenso que hibridan
con regiones conservadas dentro de dichos genes.
33..1122..22..22.. PPaassooss pprreevviiooss
3.12.2.2.a. Extracción del DNA de tejidos embebidos en parafina
El DNA fue aislado de las muestras de tejidos embebidos en parafina
utilizando el “QIAamp DNA FFPE Tissue Kit” (Qiagen, Izasa, España), según
el protocolo indicado por el proveedor.
El procedimiento consiste básicamente en 6 pasos:
Eliminación de la parafina: La parafina es disuelta en xileno.
Lisis: La muestra es lisada en condiciones desnaturalizantes
con proteinasa k.
Calor: La incubación a 90º C revierte los puentes cruzados de
formalina.
Unión: El DNA se une a una membrana.
Lavado: Los contaminantes residuales son eliminados.
Elución: El DNA concentrado es eluido de la membrana.
3.12.2.2.b. Cuantificación del DNA
El DNA fue cuantificado con el fluorímetro NanoDropTM 2000 (Termo
Scientific, Wilmington, EEUU).
164
MATERIAL Y MÉTODOS
33..1122..22..33.. PPrroottooccoolloo ddee eennssaayyoo
3.12.2.3.a. Reacción de amplificación
Por cada muestra de DNA problema a analizar se amplificarán 4 mezclas:
una para cada fragmento FR1, FR2 y FR3 y otra para el control interno (CI).
Preservar las mezclas de la luz, ya que contienen cebadores marcados con
fluorescencia.
- Descongelar 1 tubo rojo (FR1-JH), 1 tubo verde (FR2-JH), un tubo
púrpura (FR3-JH) y un tubo amarillo (CI) por cada muestra y
mantener en hielo.
- Añadir a cada uno de ellos: 1 µl de enzima Taq-DNA polimerasa
(2U/µl) y 3 µl de la muestra de DNA (Añadir de 200-500 ng)
- Mezclar bien y centrifugar 5 segundos en una microcentrífuga
para eliminar las burbujas.
- Mantener los tubos en hielo hasta el momento de colocar en el
termociclador, para evitar uniones inespecíficas de los “primers”.
3.12.2.3.b.Amplificación
- Colocar todos los tubos en el termociclador y amplificar según el
siguiente programa:
94ºC 10 min 40 ciclos:
94ºC 45 seg 60ºC 45 seg 72ºC 90 seg
72ºC 10 min
- Mantener los tubos a 12-15 ºC cuando finalice la reacción. Si no
se van a procesar las muestras en el momento, se pueden
almacenar a 4 ºC o a -20 ºC hasta su uso.
165
MATERIAL Y MÉTODOS
3.12.2.3.c.Análisis de los productos amplificados mediante electroforesis en gel
- Con objeto de diferenciar productos derivados de poblaciones
mono ó policlonales, llevar a cabo un análisis de “heterodúplex”
de los productos de PCR, mediante desnaturalización
/renaturalización de los productos amplificados:
Desnaturalizar los productos de PCR a 94º C, 5 min.
Re-naturalizar transfiriendo rápidamente a hielo (4 ºC) y
mantener 10-60 min.
- Correr la muestras en un gel de poliacrilamida.
3.12.2.4. Interpretación de los resultados
3.12.2.4.a. Control interno de amplificación (CI)
En todas las muestras debe aparecer una banda intensa de 274 pares de
bases pb), lo que indica que el proceso de manipulación de la muestra y la
calidad del DNA han sido adecuados. Este control de amplificación es
imprescindible, sobre todo en muestras obtenidas de material incluido en
parafina, en donde la calidad y cantidad del DNA obtenido son desconocidas.
Si no aparece banda de amplificación con el CI, no se puede valorar un
resultado negativo de amplificación de los fragmentos IgH; ya que puede
deberse a que no se haya obtenido DNA suficiente en el proceso de extracción,
o a que el DNA esté parcialmente degradado. En estos casos se puede
mejorar el rendimiento y la calidad del DNA prolongando la incubación del
tejido con el tampón de lisis+proteasa durante 24-48 horas más. Si tras repetir
el proceso no se consigue amplificación, la muestra se conserará como: “no
valorable para análisis de fragmentos del gen IgH por PCR”.
166
MATERIAL Y MÉTODOS
3.12.2.4.b. Reordenamientos de Fragmentos IgH
En la tabla 26 se indica el rango de tamaños esperado de los fragmentos
amplificados para cada una de las mezclas de amplificación:
TABLA 26 . Rango de tamaños esperado de los fragmentos ampli ficados
Mezcla de cebadores Rango de Tamaño DNA control
positivo clonal Color
(Tubo de PCR)
FR1-JH 310-360 pb 338 pb Rojo
FR2-JH 250-295 pb 274 pb Verde
FR3-JH 100-170 pb 133 pb Púrpura
Pb: pares de bases
3.12.2.4.b.1. Controles positivos y negativos de amplificación
El control negativo de amplificación realizado con una muestra “blanco”
tendría que dar ausencia de amplificación en todas las mezclas ensayadas
(incluido CI). Si se detecta producto amplificado en alguna mezcla de PCR,
estaría indicando la presencia de contaminación de los reactivos y habría que
repetir el ensayo para validarlo.
El control positivo policlonal debería dar múltiples bandas (gel) o picos
(GeneScan) dentro del rango de tamaño indicado en la tabla 24 para cada
mezcla de amplificación.
El control positivo clonal dará una banda o pico único para cada una de las
mezclas de PCR ensayas, cuyo tamaño se indica en la tabla 25.
Cualquier resultado diferente al esperado, obtenido tras analizar los DNA
controles positivos, estaría indicando que el ensayo no es válido y las muestras
problema no podrían ser interpretadas.
167
MATERIAL Y MÉTODOS
.12.2.4.b.2. Análisis de la muestra problema
Antes de interpretar los resultados obtenidos con la muestra problema es
necesario que todos los controles incluidos en el test, tanto positivos como
negativos hayan sido correctos.
El reordenamiento clonal del gen IgH, se visualiza mediante electroforesis
por la presencia de una única banda intensa y nítida dentro del rango de
tamaño esperado (Figura 22). Se considera que una muestra es “positiva”
cuando se detecta una banda con todas o alguna de las tres mezclas de
amplificación ensayadas: FR1-JH, FR2-JH o FR3-JH.
Si no hay reordenamiento clonal y la muestra problema está compuesta por
una población heterogénea policlonal de células B, se formará un heterodúlex y
el resultado será una multitud de bandas dentro del rango de tamaño, que se
visualizan en el gel como una mancha o “smear” ancha y difusa (Figura 23).
168
MATERIAL Y MÉTODOS
Figura 23. Ejemplo de análisis de resultados en gel de agarosa 4%. A). Mix Fr1-JH: 1. escalera estándar de tamaño molecular, 2. muestra monoclonal B, 3. muestra monoclonal B, 4. muestra monoclonal B, 5. muestra policlonal B, 6. muestra monoclonal B, 7. Línea celular B, 8. Amígdala. B). Mix Fr2-JH: 1. escalera estándar de tamaño molecular, 2. Línea celular B, 3. muestra monoclonal B, 4. muestra monoclonal B, 5. muestra policlonal B, 6. muestra policlonal B, 7. muestra policlonal B, 8. Amígdala. C). Mix Fr3-JH: 1. escalera estándar de tamaño molecular, 2. amígdala, 3. Línea celular B, 4. caso monoclonal B, 5. caso policlonal B, 6. caso monoclonal B, 7. caso policlonal B.
3.13. Analisis mutacional de K-ras en páncreas y le siones extrapancreáticas
de pacientes con PAI, sospecha de PAI ypan creatitis crónica idiopática
3.13.1. Pacientes y diseño del estudio
En este estudio retrospectivo se incluyeron 6 pacientes con PAI, 3 con
sospecha de PAI y 2 con PCI, en función de la disponibilidad de muestras de
biopsia de los tejidos afectados, diagnosticados entre marzo del 2004 y abril del
2010.
Las características demográficas de los pacientes se muestran en la tabla 27.
169
MATERIAL Y MÉTODOS
TABLA 27 . Características generales de los pacientes inclui dos en el estudio
n Edad* Sexo (Masculino/Femenino)
Pancreatitis autoinmune 6 69 (16-78) 5/1
Sospecha de Pancreatitis autoinmune 3 51 (43-82) 2/1
Pancreatitis crónica idiopática 2 68 (64-72) 2/0
*Datos expresados como mediana en años (rango)
Las muestras analizadas en cada uno de los pacientes se describen en la
tabla 28.
TABLA 28 . Muestras analizadas en los pacientes incluidos en el estudio
Paciente Diagnóstico Muestras
1 Pancreatitis autoinmune Páncreas
2 Pancreatitis autoinmune Páncreas
3 Pancreatitis autoinmune Vesícula biliar
Glandulas salivares
4 Pancreatitis autoinmune Páncreas
5 Pancreatitis autoinmune Páncreas
6 Pancreatitis autoinmune Páncreas
Vesícula biliar
7 Sospecha de PAI Vesícula biliar
8 Sospecha de PAI Papila duodenal
9 Sospecha de PAI Páncreas
10 Pancreatitis crónica idiopática Vesícula biliar
11 Pancreatitis crónica idiopática Estómago
170
MATERIAL Y MÉTODOS
3.13.2. Análisisis mutacional de K-ras
33..1133..22..11.. FFuunnddaammeennttooss ddeell eennssaayyoo
El análisisis mutacional de K-ras fue realizado con el “Kit de mutaciones K-
RAS de DxS TheraScreen®” (Qiagen Manchester Ltd, Manchester,
Inglaterra).
El kit de mutaciones K-ras es una prueba de diagnóstico in vitro diseñada
para la detección de siete mutaciones somáticas en los codones 12 y 13 del
oncogen K-ras (Tabla 29), con el fin de proporcionar una validación cualitativa
del estado de las mutaciones. Este método es altamente selectivo.
Siempre que se disponga de suficientes copias de ADN, existe la posibilidad de
detectar aproximadamente un 1% de mutaciones en el ADN genómico normal.
TABLA 29 . Mutaciones en el gen K-ras detectadas mediante el kit de DxS
Mutación Cambio de base ID de Cosmic*
Gly12Ala (GGT>GCT) 522
Gly12Asp (GGT>GAT) 521
Gly12Arg (GGT>CGT) 518
Gly12Cys (GGT>TGT) 516
Gly12Ser (GGT>AGT) 517
Gly12Val (GGT>GTT) 520
Gly13Asp (GGC>GAC) 532
* Identificadores (ID) COSMIC del catálogo de mutaciones somáticas del cáncer (Catalogue of Somatic Mutations in Cancer). http://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/
El Kit de K-ras combina dos tecnologías, ARMS® y Scorpions® [380-382],
para la detección de las mutaciones mediante ensayos realizados con la
técnica de PCR en tiempo real.
171
MATERIAL Y MÉTODOS
3.13.2.1.a. Tecnología ARMS
La ARMS permite llevar a cabo una amplificación específica de los alelos o las
mutaciones. La enzima Taq DNA polimerasa resulta extremadamente eficaz
para diferenciar entre una coincidencia y un error de coincidencia en el extremo
3’ de un primer o cebador de PCR. Algunas secuencias mutadas se pueden
amplificar de forma selectiva, incluso en muestras cuya mayoría de secuencias
no presentan la mutación, por ejemplo:
Cuando la coincidencia con el “primer” es completa, la amplificación
se produce con total eficacia.
Cuando no hay coincidencia con la base 3’, únicamente tiene lugar
una amplificación complementaria de bajo nivel.
3.13.2.1.b. Tecnología Scorpions
La detección de la amplificación se realiza mediante Scorpions. Scorpions es
una técnica de moléculas bifuncionales que contienen un cebador de PCR
unido covalentemente a una sonda. El fluoróforo de esta sonda interactúa con
un “quencher” o silenciador, también incorporado en la sonda, lo que reduce la
fluorescencia. Durante la reacción de la PCR, cuando la sonda se une al
amplicón, se separan el fluoróforo y el silenciador. El resultado es un aumento
de la fluorescencia en el tubo de reacción.
3.13.2.1.c. Análisis de los datos: método ∆Ct
Los ensayos en tiempo real de Scorpions utilizan el número de ciclos de
PCR necesarios para detectar una señal de fluorescencia superior a la señal de
referencia como medida de las moléculas diana presentes al comienzo de la
172
MATERIAL Y MÉTODOS
reacción. El punto en el que se detecta una señal superior a la lectura de
fluorescencia de referencia se denomina "ciclo umbral" (Ct).
El cálculo de los valores de ∆Ct de una muestra se obtiene de la diferencia
entre el valor de Ct del ensayo de mutación y el valor de Ct del ensayo de
control de una misma muestra. Las muestras se clasifican como positivas para
mutaciones si su valor de ∆Ct es inferior al valor de ∆Ct del 1%
correspondiente a dicho ensayo. Por encima de este valor, se considera que la
muestra contiene menos de un 1% de mutaciones (por encima del límite de los
ensayos) o que la muestra es negativa para la mutación.
33..1133..22..22.. PPrroottooccoolloo ddee eennssaayyoo
Utilizar la mezcla para ensayo de control adicional suministrada con el Kit para
valorar el ADN total de la muestra. El ensayo de control amplifica una región
del exón 4 del gen K-RAS. Las muestras deben prepararse únicamente con el
ensayo de control y utilizando el estándar mezclado como control positivo y
agua como control sin plantilla (negativo).
3.12.2.2.a. Configuración experimental del sistema ABI7500
- Descongelar las mezclas de reacción y la mezcla estándar a
temperatura ambiente. Mezclar cada solución invirtiendo cada
tubo 10 veces. Preparar suficientes mezclas para las muestras de
ADN, la mezcla estándar y los controles sin DNA (controles
negativos), además de 2 reacciones adicionales por mezcla, tal y
como se indica en la tabla 30.
- No mezclar en vórtex la enzima Taq ni ninguna mezcla de
reacción que contenga Taq, ya que se podría inactivar.
173
MATERIAL Y MÉTODOS
- Atemperar la enzima Taq. Pipetear la cantidad indicada colocando
la punta de la pipeta bajo la superficie de la enzima Taq para
minimizar el riesgo de que la punta quede excesivamente
recubierta de Taq.
- Mezclar la “Master mix”, pipeteando con cuidado en la zona
superior e inferior.
TABLA 30 . Volúmenes de “Master mix”
“Master mix”
Ensayo Mezcla de reacción ( µl) x 1 Taq (µl) x 1 Mezcla de reacción ( µl)
x placa (x 14) Taq (µl) x placa
(x 14)
Ensayo control 19,8 0,2 277,2 2,8
Ensayo de mutación 19,8 0,2 277,2 2,8
- Añadir inmediatamente 20 µl de la “Master mix” de control en
cada pocillo de reacción.
- Añadir inmediatamente 5 µl de muestra, mezcla estándar o agua
(en el caso de los controles negativos) en los pocillos de reacción.
Cada muestra de ADN se debe analizar tanto con el ensayo de
control como con el ensayo de mutación. En la tabla 31 se ilustra
la configuración de la placa.
- Preparar la placa añadiendo la mezcla estándar al pocillo A1 y el
control negativo (agua) al pocillo A2. El resto de los pocillos que
se utilicen deben contener las muestras.
- Cerrar y girar brevemente la placa de PCR para que los reactivos
se depositen en el fondo de los pocillos.
174
MATERIAL Y MÉTODOS
TABLA 31. Disposición de la placa de K-ras en el si stema ABI7500
Disposición de 96 pocillos
ENSAYO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
CONTROL MEZCLA ESTÁNDAR
CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10
12ALA MEZCLA ESTÁNDAR CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10
12ASP MEZCLA ESTÁNDAR CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10
12ARG MEZCLA ESTÁNDAR CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10
12CYS MEZCLA ESTÁNDAR CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10
12SER MEZCLA ESTÁNDAR CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10
12VAL MEZCLA ESTÁNDAR CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10
13ASP MEZCLA ESTÁNDAR CN M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10
CN: Control negativo. M1, … M12: Muestras
3.12.2.2.b. Configuración del equipo ABI7500
TABLA 32 . Ciclos en el sistema ABI 7500
Temperatura Tiempo Ciclos Obtención de datos
Fase 1
95ºC 4 minutos 1
Fase 2
95ºC 30 segundos
60ºc 1 minuto 40 FAM, JOE
3.12.2.2.c. Análisis de las muestras en el sistema ABI 7500
- Asegurarse de que la referencia pasiva está definida en el valor
‘none’ en la pantalla de inspección de pocillos.
175
MATERIAL Y MÉTODOS
- Comprobar que cada pocillo emite una señal JOE desde el
ensayo de control exógeno.
Si el ensayo de control exógeno arroja un resultado positivo,
continuar con el análisis.
Si el ensayo de control exógeno es erróneo pero la reacción
de FAM se ha amplificado suficientemente, continuar con el
análisis puesto que la reacción de FAM tiene prioridad sobre
la reacción del control exógeno.
Si las dos reacciones, la de FAM y la del control exógeno, no
se producen correctamente, descarte los datos puesto que
puede haber inhibidores. Estos inhibidores podrían conducir a
falsos negativos.
- Analizar los datos y calcular el valor de ∆Ct de la siguiente forma:
[Ct del ensayo de mutación de la muestra] – [Ct del ensayo de control de la muestra] =∆Ct
33..1133..22..33.. IInntteerrpprreettaacciióónn ddee llooss rreessuullttaaddooss ddeell ssiisstteemmaa AABBII77550000
3.12.2.3.a. Valores de Ct de control
- El valor de Ct de control debe ser ≥ 24 para evitar una sobrecarga
del ensayo.
- Ct de control < 29: El kit ofrece una capacidad de detección hasta
un mínimo de un 1% de mutaciones en estas muestras.
- En las muestras con un Ct de control ≥ 29, el kit no detectará
mutaciones menores del 1%, aunque sí detectará mutaciones
de nivel más elevado.
176
MATERIAL Y MÉTODOS
- En las muestras con un Ct de control ≥ 35, sólo habrá presentes
algunas copias amplificables de ADN, y las mutaciones
únicamente son detectables si hay numerosas copias con
mutaciones.
- En el caso de un Ct de control ≥ 38, el ADN será limitado y no se
podrán usar los datos.
3.12.2.3.b. Valores de ∆Ct de la mezcla estándar
- Los valores de ∆Ct de la mezcla estándar deben ser los indicados
en la tabla 32, aunque se pueden producir variaciones de ±2
debido a configuraciones de umbrales distintas en equipos
diferentes.
3.12.2.3.c. Valores de ∆Ct de la muestra
- Si el valor de ∆Ct de la muestra es superior al valor del 1% (como
se indica en la tabla 33), la muestra de ADN será clasificada como
negativa para las mutaciones o por debajo de los límites del kit.
- Si el valor de ∆Ct es inferior al valor del 1%, el ADN de la muestra
se clasificará como positiva para las mutaciones.
- Los valores de Ct de mutación de 38 o superiores se deben
clasificar como negativos o por debajo de los límites del kit.
177
MATERIAL Y MÉTODOS
TABLA 33 . Valores de ∆Ct de la mezcla estándar y puntos de corte del 1% e n el sistema ABI7500Ciclos en el sist ema ABI 7500
Ensayos ∆ Ct de la mezcla estándar
Intervalo aceptable de la mezcla estándar
∆ Ct del 1% de la mezcla
12ALA -0,70 De -2,70 a 1,30 6,5
12ASP -1,04 De -3,04 a 0,96 8
12ARG -0,02 De -2,02 a 1,98 8
12CYS -0,98 Se -2,98 a 1,02 7
12SER 0,02 De -1,98 a 2,202 9
12VAL -0,19 De -2,19 a 1,81 6,5
13ASP -1,12 De -3,12 a 0,88 9
178
179
RREESSUULLTTAADDOOSS
44444444........ RRRRRRRREEEEEEEESSSSSSSSUUUUUUUULLLLLLLLTTTTTTTTAAAAAAAADDDDDDDDOOOOOOOOSSSSSSSS
180
181
RESULTADOS
4. RESULTADOS
4.1. Utilidad diagnóstica de los marcadores serológ icos en la PAI
4.1.1. Prevalencia de los marcadores serológicos
En la tabla 34 se describen los valores, expresados como mediana (rango), de
los niveles séricos de IgG y de IgG4 en los grupos incluidos en el estudio. La
frecuencia de niveles séricos elevados de IgG y de IgG4 y de anticuerpos anti-
AC II y AMY α positivos en los sujetos de estudio se describe en la tabla 35.
Dentro del grupo de 12 pacientes con PAI, 9 muestras de suero fueron
obtenidas antes de comenzar el tratamiento esteroideo y tres post-tratamiento.
En un 50% de los pacientes (6/12) se observaron niveles séricos elevados de
IgG y de IgG4. De ellos, 4 presentaron niveles séricos elevados tanto de IgG
como de IgG4, mientras que en los dos restantes sólo uno de estos
marcadores estuvo presente. La mediana de los niveles séricos de IgG y de
IgG4 fue de 1550 mg/dl (rango, 785-3110) y 136 mg/dl (rango, 26-4990),
respectivamente. Los anticuerpos anti-AC II y AMY α se detectaron en un 83%
de los pacientes (10/12).De ellos, 8 presentaron ambos marcadores.
Cabe destacar que 4 de los 12 pacientes con PAI (33%) desarrollaron cáncer
de páncreas durante el curso de la enfermedad. En un 75% de ellos (3/4) se
observaron niveles séricos elevados tanto de IgG como de IgG4. La mediana
de los niveles séricos de IgG y de IgG4 fue de 1905 mg/dl (rango 785-3110) y
273 mg/dl (rango 26-4990), respectivamente. Los anticuerpos anti-AC II y anti-
AMY α se detectaron en el suero de todos ellos (4/4).
182
RESULTADOS
TABLA 34. Niveles séricos de IgG y de IgG4 en los s ujetos de estudio
IgG (mg/dl)* IgG4 (mg/dl)*
PAI 1550 (785-3110) 136 (26-4490)
PC 1010 (564-1490) 28 (10-113)
PCI 1085 (495-1620) 50 (3-205)
Pancreatitis aguda 883 (789-1580) 17 (1-190)
Cáncer de páncreas 901 (523-2500) 32 (1-278)
SS 2300 (436-2630) 20 (0,32-32)
DM-1 ND 27 (1-218)
Sujetos sanos 871 (528-1230) 40 (2,27-164)
*Resultados expresados como mediana ( rango)
PAI: Pancreatitis autoinmune. PC: Pancreatitis crónica. PCI: Pancreatitis crónica
idiopática. SS: Síndrome de Sjögren. DM.1: Abs: Anticuerpos. ND: No
determinado.
Dentro del grupo de pacientes con cáncer de páncreas, se detectaron
niveles séricos elevados de IgG y de IgG4 en un 10% (2/21) y en un 14% (3/21)
respectivamente. La mediana de los niveles séricos de IgG y de IG4 fue de
901 mg/dl (rango, 523-2500) y de 32 mg/dl (rango, 1-278) respectivamente.
Loa anticuerpos anti-AC II se detectaron en un 29% de los pacientes (6/21),
mientras que los anticuerpos anti-AMY α no se encontraron en el suero de
ninguno de ellos.
183
RESULTADOS
TABLA 35. Marcadores serológicos de PAI en los grup os incluidos en el estudio
IgG ↑ IgG4 ↑ Abs anti-AC II + Abs anti-AMY α+
PAI 58 (7/12) a 58 (7/12) b 83 (10/12) c 83 (10/12) d
PC 17 (4/23) 0 (0/23) 9 (2/23) 13 (3/23)
PCI 38 (10/26) 8 (2/26) 50 (13/26) 31 (8/26)
Pancreatitis aguda 27 (3/11) 9 (1/11) 54 (6/11) 18 (2/11)
Cáncer de páncreas 10 (2/21) 14 (3/21) 29 (6/21) 0 (0/21)
SS 67 (6/9) 0 (0/9) 67 (6/9) 23 (2/9)
DM-1 ND 7 (3/40) 32 (13/40) 22 (9/40)
Sujetos sanos 0 (0/45) 2 (1/45) 8 (4/45) 2 (1/45)
Resultados expresados como porcentaje (número de casos positivos/número total de casos)
PAI: Pancreatitis autoinmune. PC: Pancreatitis crónica. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.
SS: Síndrome de Sjögren. DM.1: Diabetes mellitus tipo 1. ↑ IgG: Niveles aumentados de
IgG. ↑ IgG4: Niveles aumentados de IgG4. Abs: Anticuerpos. AC II: Anhidrasa carbónica II.
AMY α: Amilasa α. ND: No determinado.
a. PAI vs PC: P=0,03; PAI vs PCI: P= 0,252; PAI vs cancer de páncreas: P =0,002; PAI vs sujetos sanos: P<0,0001. b. PAI vs PC: P<0,0001; PAI vs PCI: P=0,001; PAI vs pancreatitis aguda: P=0,013; PAI vs cáncer de páncreas: P=0,008; PAI vs SS: P=0,005; PAI vs DM-1: P<0,0001; PAI vs sujetos sanos: P<0,0001. c. PAI vs PC: P<0,0001; PAI vs PCI: P=0,05; PAI vs cáncer de páncreas: P=0,002; PAI vs DM-1: P=0,002; PAI vs sujetos sanos: P<0,0001. d. PAI vs PC: P <0.0001; PAI vs PCI: P=0.003; PAI vs pancreatitis aguda: P=0.002; PAI vs cancer de páncreas: P<0.0001; PAI vs SS: P=0.005; PAI vs DM-1: P<0.0001; AIP vs sujetos sanos: P<0.0001.
En la figura 24 se observa la mediana de los niveles séricos de IgG y de IgG4
en los pacientes con PAI aislada, PAI con cáncer de páncreas y cáncer de
páncreas aislado.
184
RESULTADOS
1190
136
1905
273
901
32
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
PAI sin cáncer
de páncreas
PAI con cáncer
de páncreas
Cáncer de
páncreas
IgG (mg/dl)
IgG4 (mg/dl)
Figura 24. Mediana de los nivéles séricos de IgG y de IgG4 en pacientes con PAI, PAI con cáncer de páncreas y cáncer de páncreas. Sólo fue significativa la diferencia entre PAI con cáncer de páncreas y cáncer de páncreas para los niveles de IgG. PAI: Pancreatitis autoinmune. La comparación de la presencia de los marcadores serológicos entre
pacientes con PAI aislada, PAI con cáncer de páncreas y cáncer de páncreas
aislado, se muestra en la figura 25. Las diferencias en las frecuencias de
marcadores serológicos positivos entre los pacientes con PAI aislada y los
pacientes con PAI y cáncer de páncreas no fueron significativas. Mientras que
las diferencias en las frecuencias de marcadores serológicos positivos entre
pacientes con PAI y pacientes con cáncer de páncreas fueron significativas
para todos ellos (IgG4 aumentada: P = 0,008; Abs anti-AC II+ P = 0,002; Abs
anti-AMY α: P < 0,0001).
185
RESULTADOS
75% 75%
55%
100% 100%
75%
29%
0%
14%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
PAI sin cáncer
de páncreas
PAI con cáncer
de páncreas
Cáncer de
páncreas
Abs ant i-CA II+
Abs ant i-AMY-α+
IgG4 aumentada
Figura 25. Comparación de los marcadores serológicos entre pacientes con PAI, PAI con cancer de páncreas y cáncer de páncreas. PAI: Pancreatitis autoinmune. AC II Abs+:Anticuerpos anti-Anhidrasa carbónica II positivos. AMY α Abs+: Anticuerpos anti-amilasa α positivos.
4.1.2. Valor diagnóstico de los niveles elevados de IgG4, los Abs anti-CA II, y
los Abs anti-AMY α
En la figura 26 se muestra la sensibilidad, la especificidad, el VPP y el VPN
de los niveles elevados de IgG4, los Abs anti-CA II y los Abs anti-AMY α para el
diagnóstico de la PAI. Como grupos control se incluyeron los pacientes con PC,
PCI, pancreatitis aguda, cáncer de páncreas y los sujetos sanos.
Tanto los anticuerpos anti-AC II como los anticuerpos anti-AMY α presentan
la mayor sensibilidad (83%), aunque la especificidad es mayor para los
anticuerpos anti-AMY α (89%) que para los Abs anti-AC II (75%). Los niveles
aumentados de IgG4 constituyen el marcador serológico más específico (94%),
aunque con una sensibilidad baja (58%).
186
RESULTADOS
58%
83% 83%
94%
75%
89%
50%
24%
42%
96% 98%98%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Sensibilidad Especificidad VPP VPN
↑ IgG4
Abs anti-CA II
Abs anti-AMY α
Figura 26. Valor diagnóstico de los marcadores serológicos en la PAI. PAI: Pancreatitis autoinmune. VPP: Valor predictivo positivo. VPN: Valor predictivo negativo. ↑ IgG4: Nivéles aumentados de IgG4. Abs: anticuerpos. CA II: Anhidrasa carbónica II. AMY α: Amilasa α.
Como algunos individuos con PAI son diagnosticados erróneamente de PCI,
los pacientes con PCI han sido excluidos como grupo control para recalcular la
el valor diagnóstico de los marcadores serológicos en la PAI. Los resultados
muestran idéntica sensibilidad y VPN que en el análisis anterior para los tres
marcadores serológicos, un incremento de la especificidad de los anticuerpos
anti-AC II (81%) y de los anticuerpos anti-AMY α (94%) y del VPP de los
niveles aumentados de IgG4, los anticuerposs anti-AC II y los anticuerpos anti-
AMY α en un 58%, 64% y 34%, respectivamente (Figura 27).
187
RESULTADOS
58%
83%83%95%
81%
94%
58%
34%
63%
95%98%98%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Sensibilidad VPP
↑ IgG4
Abs anti-CA II
Abs anti-AMY α
Figura 27. Valor diagnóstico de los marcadores serológicos en la PAI, excluyendo la PCI como grupo control. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. VPP: Valor predictivo positivo. VPN: Valor predictivo negativo. ↑ IgG4: Niveles aumentados de IgG4. Abs: anticuerpos. CA II: Anhidrasa carbónica II. AMY α: Amilasa α.
4.1.3. Valor diagnóstico de la combinación de los marcadores serológicos
Las combinaciones de los niveles elevados de IgG4 y de los Abs anti-AMY α
o de los 3 marcadores serológicos muestran la mayor especificidad (99%) y
VPP (86%), aunque con una baja sensibilidad (50%). La combinación de los
anticuerpos anti-AC II y los Abs anti-AMY α presenta una elevada sensibilidad
(75%) y VPN (98%), aunque con una menor especificidad (93%) y VPP (50%)
(Figura 28).
188
RESULTADOS
50%50%
75%
50%
98% 99%93%
99%
67%
86%
50%
86%
95% 95%98%95%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Sensibilidad Especificidad VPP VPN
↑ IgG4 + CA II Abs
↑ IgG4 + AMY α Abs
CA II Abs + AMY α Abs
Los 3 marcadores
Figura 28. Valor diagnóstico de la combinación de los marcadores serológicos en la PAI. PAI: Pancreatitis autoinmune. VPP: Valor predictivo positivo. VPN: Valor predictivo negativo. ↑ IgG4: Niveles aumentados de IgG4. CA II Abs: Anticuerpos anti-anhidrasa carbónica II. AMY α Abs: Anticuerpos anti-amilasa α. Cuando se excluye la PCI como grupo control, los resultados muestran un
aumento de la especificidad y el VPP de la combinación de los niveles
aumentados de IgG4 y los anticuerpos anti-AMY α y/o los anticuerpos anti-AC II
en un 100%. La combinación de los anticuerpos anti-CA II y los anticuerpos
anti-AMY α, muestra la misma sensibilidad (75%), un aumento tanto de la
especificidad (97%) como del VPP (75%), y un descenso del VPN (97%)
(Figura 29).
189
RESULTADOS
50%50%
75%
50%
98%99%93%
99%
67%
86%
50%
86%95%95%98%95%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Sensibilidad Especificidad VPP VPN
↑ IgG4 + CA II Abs
↑ IgG4 + AMY α Abs
CA II Abs + AMY α Abs
Los 3 marcadores
Figura 29. Valor diagnóstico de la combinación de los marcadores serológicos en la PAI, excluyendo la PCI como grupo control. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. VPP: Valor predictivo positivo. VPN: Valor predictivo negativo. ↑ IgG4: Nivéles aumentados de IgG4. CA II Abs: Anticuerpos anti-anhidrasa carbónica II. AMY α Abs: Anticuerpos anti-amilasa α. 4.2. Utilidad diagnóstica de la IgG y la IgG4 en la PAI
El objetivo de este estudio ha sido determinar la sensibilidad y especificidad
diagnóstica de los niveles séricos elevados de la IgG y la IgG4 por encima de
los valores de puntos de corte empleados rutinariamente en nuestro laboratorio,
con el fin de compararlas con las obtenidas con los valores de puntos de corte
óptimos calculados mediante un análisis basado en curvas ROC.
En la tabla 36 se muestran los valores, expresados como mediana (rango),
de los niveles séricos de IgG y de IgG4 en los grupos de pacientes incluidos en
el estudio. Las frecuencias de los niveles séricos aumentados de IgG y de IgG4
se representan en la figura 30.
Dentro de los pacientes con PAI, la comparación de la presencia de niveles
séricos aumentados de IgG entre pacientes con PAI y el resto de grupos se
muestra en la tabla 37.
190
RESULTADOS
TABLA 36. Niveles séricos de IgG y de IgG4 en los sujetos de estudio
IgG (mg/dl)* Ig4 (mg/dl)*
Pancreatitis autoinmune 1525 (785-3110) 178,5 (19-4490)
Sospecha PAI 1360 (350-2060) 63 (29-315)
Pancreatitis crónica idiopática 1075 (722-1960) 70 (3-2979)
Pancreatitis aguda 1020 (564-1490) 30 (9-113)
Pancreatitis crónica 920 (325-1580) 24,5 (0,72-190)
Cáncer de páncreas 971 (497-2500) 48 (1,77-278)
Sujetos sanos 871 (528-1230) 33,9 (2,27-164)
*Resultados expresados como Mediana (rango).
57%
64%
56%
11%
38%
17%21%
7%
20%
0%
24%
20%
7%
2%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
PA I Sospecha PA I PC I Pancreat i t isag uda
Pancreat i t iscró nica
Cáncer d ep ancreas
C ont ro lessano s
IgG aumentada
IgG4 aumentada
Figura 30. Frecuencia de niveles aumentados de IgG y de IgG4 en los grupos de pacientes incluidos en el estudio. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. IgG aumentada: Niveles séricos de IgG > 1200 mg/dl. IgG aumentada: Niveles séricos de IgG4 > 130 mg/dl.
191
RESULTADOS
Cuando los pacientes presentaron de niveles séricos aumentados de IgG,
por encima del valor de punto de corte utilizado en nuestro laboratorio (1200
mg/dl), comparamos la frecuencia de niveles elevados de IgG entre los
pacientes con PAI y el resto de grupos de sujetos (Tabla 37). La sensibilidad y
especificidad de los niveles aumentados de IgG para el diagnóstico de la PAI a
este valor de punto de corte fueron de un 57 % y un 84% respectivamente. En
el grupo de pacientes con PAI, la frecuencia de IgG aumentada fue
significativamente mayor que en pacientes con pancreatitis aguda, pancreatitis
crónica, cáncer de páncreas y controles sanos. En contraposición, cuando se
compararon el grupo de pacientes con PAI con el grupo de sospecha de PAI y
de PCI, no se observaron diferencias significativas.
TABLA 37. Diferencias en los niveles aumentados de IgG entre la PAI y el resto de grupos incluidos en el estudio
Grupos comparados Frecuencia IgG aumentada 1 Test estadístico Valor P
PAI vs Sospecha PAI 8/14 vs 5/9 Exacto de Fisher 1,00
PAI vs PCI 8/14 vs 9/24 Chi-cuadrado 0,24
PAI vs Pancreatitis aguda 814 vs 6/28 Exacto de Fisher 0,036*
PAI vs Pancreatitis crónica 8/14 vs 5/25 Exacto de Fisher 0,033*
PAI vs Cáncer de páncreas 8/14 vs 6/25 Chi-cuadrado 0,038 *
PAI vs Controles sanos 8/14 vs 3/45 Exacto de Fisher < 0,0001*
PAI vs Total controles 8/14 vs 20/123 Exacto de Fisher 0,001*
1Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos. PAI: Pancreatitis
autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. Total controles: Pancreatitis aguda +
Pancretitis crónica + Cáncer de páncreas + Controles sanos.
*Diferencias significativas (P < 0,05).
192
RESULTADOS
Cuando los pacientes presentaron niveles séricos aumentados de IgG4, por
encima del valor de punto de corte utilizado en nuestro laboratorio (130 mg/dl),
comparamos la frecuencia de niveles aumentados de IgG4 entre los pacientes
con PAI y el resto de grupos de sujetos (Tabla 38). La sensibilidad y
especificidad de los niveles aumentados de IgG4 para el diagnóstico de la PAI
a este valor de punto de corte fueron de un 64 % y un 93% respectivamente.
En el grupo de pacientes con PAI, la frecuencia de IgG4 aumentada fue
significativamente mayor que en cada uno de los grupos control (pancreatitis
aguda, pancreatitis crónica, cáncer de páncreas y controles sanos).
Adicionalmente, cuando comparamos el grupo de pacientes con PAI con el
grupo de sospecha de PAI y de PCI, también encontramos diferencias
significativas.
TABLA 38. Diferencias en los niveles aumentados de IgG4 entre la PAI y el resto de grupos incluidos en el estudio
Grupos comparados Frecuencia IgG aumentada 1 Test estadístico Valor P
PAI vs Sospecha PAI 9/14 vs 1/9 Exacto de Fisher 0,029*
PAI vs PCI 9/14 vs 4/24 Exacto de Fisher 0,005*
PAI vs Pancreatitis aguda 9/14 vs 2/28 Exacto de Fisher <0,0001*
PAI vs Pancreatitis crónica 9/14 vs 0/25 Exacto de Fisher <0,0001*
PAI vs Cáncer de páncreas 9/14 vs 5/25 Chi-cuadrado 0,006*
PAI vs Controles sanos 9/14 vs 1/45 Exacto de Fisher <0,0001*
PAI vs Total controles 9/14 vs 8/123 Exacto de Fisher <0,0001*
1Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos. PAI: Pancreatitis
autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. Total controles: Pancreatitis aguda +
Pancretitis crónica + Cáncer de páncreas + Controles sanos.
* Diferencias significativas (P < 0,05).
193
RESULTADOS
La comparación de la frecuencia de niveles elevados de IgG entre el grupo
de pacientes con sospecha de PAI y el de pacientes con PCI, y el resto de
grupos control se muestra en la tabla 39. La frecuencia de IgG aumentada fue
significativamente mayor en los pacientes con sospecha de PAI (5/9) y con PCI
(9/24), que en los controles sanos (3/45) (P = 0,002 en ambos casos); mientras
que no se encontraron diferencias significativas con el resto de grupos control.
TABLA 39. Diferencias en los niveles aumentados de IgG entre la s ospecha de PAI o PCI y los grupos control inclui dos en el estudio
Grupos comparados Frecuencia IgG aumentada 1 Test estadístico Valor P
S.PAI vs Pancreatitis aguda 5/9 vs 6/28 Exacto de Fisher 0,091
S.PAI vs Pancreatitis crónica 5/9 vs 5/25 Exacto de Fisher 0,085
S.PAI vs Cáncer de páncreas 5/9 vs 6/25 Exacto de Fisher 0,111
S.PAI vs Controles sanos 5/9 vs 3/45 Exacto de Fisher 0,002*
S. PAI vs Total controles 5/9 vs 20/123 Exacto de Fisher 0,012*
PCI vs Pancreatitis aguda 9/24 vs 6/28 Chi-cuadrado 0,202
PCI vs Pancreatitis crónica 9/24 vs 5/25 Chi-cuadrado 0,175
PCI vs Cáncer de páncreas 9/24 vs 6/25 Chi-cuadrado 0,305
PCI vs Controles sanos 9/24 vs 3/45 Exacto de Fisher 0,002*
PCI vs Total de controles 9/24 vs 20/123 Chi-cuadrado 0,017*
1Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos. PAI: Pancreatitis
autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. Total controles: Pancreatitis aguda +
Pancretitis crónica + Cáncer de páncreas + Controles sanos.
*Diferencias significativas (P < 0,05).
194
RESULTADOS
En la tabla 40 se describe la comparación de la frecuencia de niveles
elevados de IgG4 entre el grupo de pacientes con sospecha de PAI y el de
pacientes con PCI, y el resto de grupos control. La frecuencia de IgG4
aumentada fue significativamente mayor en los pacientes con PCI (4/24) que
en los controles sanos (1/45) (P = 0,046), mientras que no se encontraron
diferencias significativas con el resto de grupos control.
TABLA 40. Diferencias en los niveles aumentados de IgG4 entre la sospecha de PAI o PCI y los grupos control inclui dos en el estudio
Grupos comparados Frecuencia IgG aumentada 1 Test estadístico Valor P
S.PAI vs Pancreatitis aguda 1/9 vs 2/28 Exacto de Fisher 1,00
S.PAI vs Pancreatitis crónica 1/9 vs 0/25 Exacto de Fisher 0,265
S.PAI vs Cáncer de páncreas 1/9 vs 5/25 Exacto de Fisher 1,00
S.PAI vs Controles sanos 1/9 vs 1/45 Exacto de Fisher 0,308
S. PAI vs Total controles 1/9 vs 8/123 Exacto de Fisher 0,481
PCI vs Pancreatitis aguda 4/24 vs 2/28 Exacto de Fisher 0,284
PCI vs Pancreatitis crónica 4/24 vs 0/25 Exacto de Fisher 0,05
PCI vs Cáncer de páncreas 4/24 vs 5/25 Exacto de Fisher 1,00
PCI vs Controles sanos 4/24 vs 1/45 Exacto de Fisher 0,046*
PCI vs Total de controles 4/24 vs 8/123 Exacto de Fisher 0,109
1Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos. PAI: Pancreatitis
autoinmune. S.PAI: Sospecha de pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica
idiopática. Total controles: Pancreatitis aguda + Pancretitis crónica + Cáncer de páncreas +
Controles sanos. *Diferencias significativas (P < 0,05).
195
RESULTADOS
Los valores de punto de corte óptimo de los niveles aumentados de IgG y de
IgG4 usando curvas ROC se representan en la figura 31. El valor de punto de
corte más óptimo para la IgG fue de1494 mg/dl, con el cual se obtuvieron una
sensibilidad y especificidad de un 57% y un 96%, respectivamente (área bajo
la curva = 0,808). El valor de punto de corte más óptimo para la IgG4 fue de
137 mg/dl, con el cual se obtuvieron una sensibilidad y la especificidad de un
64% y un 94%, respectivamente (área bajo la curva = 0,807).
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
1 - Especificidad
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Sen
sibi
lidad
IgG 0,808IgG4 0,807
ABC
Figura 31. Curvas ROC de los niveles séricos de IgG y de IgG4 para el diagnóstico de la PAI. ABC: Área bajo la curva. La sensibilidad y la especificidad óptimas en el diagnóstico de la PAI de los niveles de IgG para un valor de 1495 mg//dl, fueron de un 57% y un 96% respectivamente. La sensibilidad y especificidad óptimas en el diagnóstico de la PAI de los niveles de IgG4 para un valor de 137 mg/dl, fueron de un 64% y un 94% respectivamente.
196
RESULTADOS
4.3. Correlación entre la IgG4 y la afectación extr apancreática en la PAI
La presencia de niveles de IgG4 superiores a 130 mg/dl fue detectada en un
64% (9/14), 11% (1/9) y 17% (4/24) de los pacientes con PAI, sospecha de PAI
y PCI, respectivamente. La afectación extrapancreática se encontró en un 57%
(8/14), 11% (1/9) y 8% (2/24) de los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI,
respectivamente.
Los valores de punto de corte óptimo de los niveles de IgG y de IgG4 para
diferenciar entre pacientes con y sin afectación extrapancreática mediante un
análisis basado en curvas ROC se representan en la figura 32. El valor de
punto de corte óptimo de los niveles de IgG, fue de 1600 mg/dl, con el cual se
obtuvieron una sensibilidad y especificidad de un 64% y un 92%,
respectivamente (área bajo la curva = 0,913). El valor de punto de corte óptimo
de los niveles de IgG4 fue de 190 mg/dl, con el cual se obtuvieron una
sensibilidad y la especificidad de un 91% y un 100%, respectivamente (área
bajo la curva = 0,981).
197
RESULTADOS
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
1 - Especificidad
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Sen
sibi
lidad IgG 0,913
IgG4 0,981
ABC
Figura 32. Curvas ROC de los niveles séricos de IgG y de IgG4 para diferenciar entre PAI con y sin afectación extrapancreática. ABC: Área bajo la curva. La sensibilidad y la especificidad óptimas de los Ios niveles de IgG para un valor de 1600 mg//dl, fueron de un 64% y un 92% respectivamente. La sensibilidad y especificidad óptimas de los niveles de IgG4 para un valor de 190 mg/dl, fueron de un 91% y un 100% respectivamente.
4.3.1. Diferencias entre PAI con IgG4 > 190 mg/dl e IgG4 < 190 mg/dl
De los 14 pacientes con PAI, un 50% (7/14) presentaron niveles de IgG4
superiores a 190 mg/dl y el otro 50% (7/14%) presentaron niveles inferior a 190
mg/dl. Siete (100%) de los 7 pacientes con IgG4 superior a 190 mg/dl
presentaron afectación extrapancreática, mientras que uno (14%) de los 7
pacientes con niveles de IgG4 inferiores a 190 mg/dl presentó afectación
extrapancreática (P = 0,005).
198
RESULTADOS
No se encontraron diferencias significativas entre el grupo de pacientes con
PAI y niveles de IgG4 superiores a 190 mg/dl y el grupo de pacientes con
niveles de IgG4 inferiores a 190 mg/dl, en edad, sexo, frecuencia de ictericia,
dolor abdominal o ausencia de síntomas. Mientras que el grado de afectación
extrapancreática fue significativamente mayor en el grupo de pacientes con
niveles de IgG4 superiores a 190 mg/dl que en el grupo de pacientes con
niveles inferiores a 190 mg/dl (P = 0,002) (Tabla 41).
TABLA 41. Diferencias demográficas, clínicas y en el grad o de AEP entre los pacientes con PAI con IgG4 > 190 mg/dl y PAI con IgG4 < 190 mg/dl
IgG4 > 190 mg/dl 1 IgG4 < 190 mg/dl 2 Test estadístico Valor P
Frecuencia de casos 7/14 (50%) 7/14 (50%)
Media Edad (rango intercuartílico) 67 (66-77) 51,1 (30-76) U de Mann-
Withney 0,165
Sexo masculino 6/7 (86%) 6/7 (86%) F Fisher 1,00
Ictericia 2/7 (29%) 1/7 (14%) F Fisher 1,00
Dolor abdominal 3/7 (43%) 6/7 (85%) F Fisher 0,266
Asintomático 2/7 (29%) 0/7 (0%) F Fisher 0,462
Grado AEP
0 órganos: 0/7 (0%)
1 órgano: 2/7 (29%)
2 órganos: 2/7 (29%)
3 órganos: 2/7 (29%)
4 órganos: 1/7 (14%)
0 órganos: 6/7 (86%)
1 órgano: 1/7 (14%)
2 órganos: 0/7 (0%)
3 órganos: 0/7 (0%)
4 órganos: 0/7 (0%)
ANOVA con aproximación de Welch
0,002*
1,2Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos (porcentaje).
PAI: Pancreatitis autoinmune. AEP: Afectación extrapancreática.
*Diferencias significativas (P < 0,05).
199
RESULTADOS
4.3.2. Diferencias entre sospecha PAI con IgG4 >190 mg/dl e IgG4 <190 mg/dl
De los 9 pacientes con sospecha de PAI, un 89% (8/9) presentaron niveles
de IgG4 superiores a 190 mg/dl y el otro 11% (1/9%) niveles inferior a 190
mg/dl. El único paciente (100%) con IgG4 superior a 190 mg/dl presentó
afectación extrapancreática, mientras que ninguno (0%) de los 8 pacientes con
niveles de IgG4 inferiores a 190 mg/dl presentaron afectación extrapancreática
(P = 0,111). Ninguno de los pacientes con sospecha de PAI presentó ictericia.
No se encontraron diferencias significativas entre el grupo de pacientes con
sospecha de PAI y niveles de IgG4 superiores a 190 mg/dl y el grupo de
pacientes con niveles de IgG4 inferiores a 190 mg/dl, en edad, sexo, frecuencia
de dolor abdominal o ausencia de síntomas. Mientras que el grado de
afectación extrapancreática fue significativamente mayor en el grupo de
pacientes con niveles de IgG4 superiores a 190 mg/dl que en el grupo de
pacientes con niveles inferiores a 190 mg/dl (P = 0,005) (Tabla 42).
TABLA 42. Diferencias demográficas, clínicas y en el grad o de AEP entre los pacientes con S.PAI con IgG4 > 1 90 mg/dl y S.PAI con IgG4 < 190 mg/dl
IgG4 > 190 mg/dl 1 IgG4 < 190 mg/dl 2 Test estadístico Valor P
Frecuencia de casos 1/9 (11%) 8/9 (89%)
Mediana Edad (rango intercuartílico) 45 (45-45) 55 (40-80,25) U de Mann-
Whitney 0,699
Sexo masculino 0/1 (0%) 3/8 (37%) F Fisher 0,444
Ictericia 0/0 (0%) 0/0 (0%) - -
Dolor abdominal 1/1 (100%) 4/8 (50%) F Fisher 1,00
Asintomático 0/1 (0%) 4/8 (50%) F Fisher 1,00
Grado AEP 0 órganos: 0/1 (0%)
1 órgano: 1/1 (100%)
0 órganos: 8/8 (100%)
1 órgano: 0/8 (14%)
U de Mann-Whitney 0,005*
1,2Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos (porcentaje). S.PAI: Sospecha de Pancreatitis autoinmune. AEP: Afectación extrapancreática. *Diferencias significativas (P < 0,05).
200
RESULTADOS
4.3.3. Diferencias entre PCI con IgG4 > 190 mg/dl e IgG4 < 190 mg/dl
De los 24 pacientes con PCI, un 8% (2/24) presentaron niveles de IgG4
superiores a 190 mg/dl y el otro 92% (22/24%) niveles inferior a 190 mg/dl. Los
2 pacientes (100%) con IgG4 superior a 190 mg/dl presentaron afectación
extrapancreática, mientras que ninguno (0%) de los 22 pacientes con niveles
de IgG4 inferiores a 190 mg/dl presentaron afectación extrapancreática (P =
0,004). Ninguno de los pacientes con PCI presentó ictericia. No se encontraron
diferencias significativas entre el grupo de pacientes con PCI y niveles de IgG4
superiores a 190 mg/dl y el grupo de pacientes con niveles de IgG4 inferiores a
190 mg/dl, en edad, sexo, frecuencia de dolor abdominal o ausencia de
síntomas. Mientras que el grado de afectación extrapancreática fue
significativamente mayor en el grupo de pacientes con niveles de IgG4
superiores a 190 mg/dl que en el grupo de pacientes con niveles inferiores a
190 mg/dl (P = 0,005) (Tabla 43).
TABLA 43. Diferencias demográficas, clínicas y en el grad o de AEP entre los pacientes con PCI con IgG4 > 190 mg/dl y PCI con IgG4 < 190 mg/dl
IgG4 > 190 mg/dl 1 IgG4 < 190 mg/dl 2 Test estadístico Valor P
Frecuencia de casos 2/24 (8%) 22/24 (92%)
Mediana Edad +/- (rango intercuartílico) 71 (64-78) 59 (41,5-76) U de Mann-
Whitney 0,326
Sexo masculino 2/2 (100%) 16/22 (73%) F Fisher 1,00
Ictericia 0/2 (0%) 0/20 (0%) - -
Dolor abdominal 2/2 (100%) 19/20 (95%) F Fisher 1,00
Asintomático 0/2 (0%) 1/20 (5%) F Fisher 1,00
Grado AEP 0 órganos: 0/0 (0%)
1 órgano: 2/2 (100%)
0 órganos: 22/22 (100%)
1 órgano: 0/22 (0%)
U de Mann-Whitney <0,0001*
1,2Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos (porcentaje). PCI: Pancreatitis crónica idiopática. AEP: Afectación extrapancreática. *Diferencias significativas (P < 0,05).
201
RESULTADOS
4.3.4. Diferencias globales entre PAI,Sospecha PAI y PCI con IgG4 > 190
mg/dl e IgG4 < 190 mg/dl
De los 47 pacientes con PAI, sopecha de PAI y PCI, un 21% (10/47)
presentaron niveles de IgG4 superiores a 190 mg/dl y el otro 79% (37/47)
niveles inferior a 190 mg/dl. Diez (100%) de los 10 pacientes con IgG4 superior
a 190 mg/dl presentaron afectación extrapancreática, mientras que 1 (9%) de
los 22 pacientes con niveles de IgG4 inferiores a 190 mg/dl presentaron
afectación extrapancreática (P = <0,0001). No se encontraron diferencias
significativas entre el grupo de pacientes con niveles de IgG4 superiores a 190
mg/dl y el grupo de pacientes con niveles de IgG4 inferiores a 190 mg/dl, en
edad, sexo, frecuencia de ictericia, dolor abdominal o ausencia de
síntomas. Mientras que el grado de afectación extrapancreática fue
significativamente mayor en el grupo de pacientes con niveles de IgG4
superiores a 190 mg/dl que en el grupo de pacientes con niveles inferiores a
190 mg/dl (P = <0,0001) (Tabla 44).
202
RESULTADOS
TABLA 44. Diferencias demográficas, clínicas y en el grad o de AEP entre los pacientes con PAI, S.PAI y PCI c on IgG4 > 190 mg/dl y con IgG4 < 190 mg/dl
IgG4 > 190 mg/dl 1 IgG4 < 190 mg/dl 2 Test estadístico Valor P
Frecuencia de casos 10/47 (21%) 37/47 (79%)
Mediana Edad +/- (rango intercuartílico) 69 (59,25-77,25) 56 (40-75,75) U de Mann-
Whitney 0,236
Sexo masculino 9/10 (90%) 25/37 (68%) F Fisher 0,244
Ictericia 2/10 (20%) 1/37 (3%) F Fisher 0,110
Dolor abdominal 6/10 (60%) 29/37 (78%) F Fisher 0,251
Asintomático 2/10 (20%) 5/37 (14%) F Fisher 0,630
Grado AEP
0 órganos: 0/10 (0%)
1 órgano: 5/10 (50%)
2 órganos:2/10 (20%)
3 órganos:2/10 (20%)
4 órganos:1/10 (10%)
0 órganos: 36/37 (97%)
1 órgano: 1/37 (3%)
2 órganos:0/37 (0%)
3 órganos: 0/37 (0%)
4 órganos: 0/37 (0%)
U de Mann-Whitney <0,0001*
1,2Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos (porcentaje). PCI: Pancreatitis crónica idiopática. AEP: Afectación extrapancreática. *Diferencias significativas (P < 0,05).
4.4. Caracterización clínica de los pacientes con P AI, sospecha de PAI y
pancreatitis crónica idiopática
De los 14 pacientes con PAI, 4 (29%) desarrollaron cáncer de páncreas
durante el curso de la enfermedad, mientras que ninguno de los pacientes con
sospecha de PAI y PCI desarrolló cáncer de páncreas.
En la figura 33 se muestra la frecuencia de los síntomas de presentación en
los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. El síntoma más frecuente fue el
dolor abdominal, presente en un 64% (9/14), 56% (5/9) y 95% (21/22) de los
pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente. La ictericia se
encontró en un 22% (3/14) de los pacientes con PAI, mientras que ninguno de
los pacientes con sospecha de PAI y PCI presentaron este síntoma.
203
RESULTADOS
64%
22%14%
56%
0%
44%
95%
0%5%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
PAI Sospecha PAI PCI
Dolor abdominal
Ictericia
Asintomático
Figura 33. Frecuencia de los síntomas de presentación el los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmune, PCI: Pancreatitis crónica idiopática. Un 14 % (2/14), 44% (4/9) y 5% (1/22) de los pacientes con PAI, sospecha de
PAI y PCI, respectivamente; se presentaron asintomáticos al diagnóstico.
La presencia de DM-2 fue detectada en un 43% (6/14), 11%(1/9) y 21%(5/25)
de los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente (Figura 34).
43%
11%
21%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
PAI Sospecha PAI PCI
Frecuencia Diabetes Mellitus tipo 2
Figura 34. Frecuencia de la presencia de Diabetes Mellitus tipo 2 en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmune, PCI: Pancreatitis crónica idiopática.
204
RESULTADOS
La afectación extrapancreática estuvo presente en un 57% (8/14), 11% (1/9)
y 8% (2/24) de los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente
(Figura 35).
57%
11% 8%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
PAI Sospecha PAI PCI
Frecuencia Afectación extrapancreática
Figura 35. Frecuencia de la presencia de afectación extrapancreática en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmune, PCI: Pancreatitis crónica idiopática. Dentro del grupo de pacientes con PAI, un 21% (3/14) presentaron
afectación de un único órgano, un 14% (2/14) afectación tanto de dos como de
tres órganos, y un 7% (1/14) afectación de 4 órganos. Un 11% (1/9) y 8% (2/24)
de los pacientes con sospecha de PAI y PCI, respectivamente; presentaron
afectación de un órgano. Mientras que ninguno de los pacientes con sospecha
de PAI y PCI presentó un mayor número de órganos afectados (Figura 36).
205
RESULTADOS
21%14%14%
7% 11%8%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
PAI Sospecha PAI PCI
Grado Afectación extrapancreática
1 órgano
2 órganos
3 órganos
4 órganos
Figura 36. Frecuencia del número de órganos afectados en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmune, PCI: Pancreatitis crónica idiopática. Tanto la vesícula biliar, como la próstata estuvieron afectadas con una mayor
frecuencia dentro del grupo de pacientes con PAI, en un 36% (5/14). La
afectación del tracto biliar se encontró en un 14% (2/14) y11% (1/9) de los
pacientes con PAI y sospecha de PAI, respectivamente; mientras que ninguno
de los pacientes con PCI presento afectación de este órgano. Dentro del grupo
de PCI, la afectación tanto de la próstata como la vesícula biliar fue encontrada
en un 4% (1/24) de los pacientes (Figura 37).
36%36%
14%7%7%7%
7% 11%4% 4%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
PAI Sospecha PAI PCI
Vesícula biliar
Próstata
Tracto biliar
Retroperitoneo
Mesenterio
Riñón
Pulmón
Figura 37. Frecuencia de órganos afectados en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmune, PCI: Pancreatitis crónica idiopática.
206
RESULTADOS
4.5. Niveles séricos de CA 19.9 y utilidad diagnóst ica de los anticuerpos
anti-CA 19.9
La frecuencia de anticuerpos anti-CA 19.9 positivos en los diferentes grupos
de sujetos incluidos en el estudio se describe en la figura 38. Un 57%, 43% y
35% de los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente;
presentaron anticuerpos anti-CA 19.9.
57%
43%35%
48%39%
39%
7%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Frecuencia Anticuerpos anti-CA 19.9 +
PAI
Sospecha PAI
PCI
Pancreatitis crónica
Pancreatitis aguda
Cáncer de páncreas
Controles sanos
Figura 38. Frecuencia de anticuerpos anti-CA 19.9 positivos en los diferentes grupos de sujetos incluidos en el estudio.
207
RESULTADOS
La comparación de la frecuencia de anticuerpos anti-CA 19.9 positivos entre
el grupo de pacientes con PAI y el resto de grupos de sujetos se describe en la
tabla 45. La frecuencia de anticuerpos anti-CA 19.9 positivos fue
significativamente mayor en pacientes con PAI (9/14) que en controles sanos
(3/45) (P < 0,0001), mientras que no se encontraron diferencias significativas
con el resto de grupos control.
TABLA 45 . Diferencias en la frecuencia de Abs anti-CA 19.9 + entre la PAI y el resto de grupos incluidos en el estudio
Grupos comparados Frec. Abs anti-CA 19.9 + 1 Test estadístico Valor P
PAI vs Sospecha PAI 9/14 vs 3/7 Exacto de Fisher 0,397
PAI vs PCI 9/14 vs 12/34 Chi-cuadrado 0,066
PAI vs Pancreatitis aguda 9/14 vs 9/23 Chi-cuadrado 0,138
PAI vs Pancreatitis crónica 9/14 vs 13/27 Chi-cuadrado 0,326
PAI vs Cáncer de páncreas 9/14 vs 11/26 Chi-cuadrado 0,185
PAI vs Controles sanos 9/14 vs 3/45 Exacto de Fisher <0,0001*
PAI vs Total controles 9/14 vs 36/121 Exacto de Fisher 0,015*
1Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos. Frec. Abs anti-CA 19.9 +:
Frecuencia de anticuerpos anti-CA 19.9 positivos. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI:
Pancreatitis crónica idiopática. Total controles: Pancreatitis aguda + Pancretitis crónica +
Cáncer de páncreas + Controles sanos.
* Diferencias significativas (P < 0,05).
En la tabla 46 se describe la comparación de la frecuencia de anticuerpos
anti-CA 19.9 positivos entre el grupo de pacientes con sospecha de PAI y el de
PCI y el resto de grupos control. La frecuencia de anticuerpos anti-CA 19.9
positivos fue significativamente mayor en pacientes con sospecha de PAI (3/7)
y con PCI (12/34), que en controles sanos (3/45) (P = 0,026 y P = 0,001,
respectivamente); mientras que no se encontraron diferencias significativas con
el resto de grupos control.
208
RESULTADOS
TABLA 46. Diferencias en la frecuencia de Abs anti-CA 19. 9+ entre la sospecha de PAI o la PCI y los grupos control i ncluidos en el estudio
Grupos comparados Frec. anti-CA 19.9 Abs + 1 Test estadístico Valor P
S.PAI vs Pancreatitis aguda 3/7 vs 9/23 Exacto de Fisher 1,00
S.PAI vs Pancreatitis crónica 3/7 vs 13/27 Exacto de Fisher 1,00
S.PAI vs Cáncer de páncreas 3/7 vs 11/26 Exacto de Fisher 1,00
S.PAI vs Controles sanos 3/7 vs 3/45 Exacto de Fisher 0,026*
PCI vs Pancreatitis aguda 12/34 vs 9/23 Chi-cuadrado 0,768
PCI vs Pancreatitis crónica 12/34 vs 13/27 Chi-cuadrado 0,311
PCI vs Cáncer de páncreas 12/34 vs 11/26 Chi-cuadrado 0,580
PCI vs Controles sanos 12/34 vs 3/45 Chi-cuadrado 0,001*
1Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos. PAI: Pancreatitis
autoinmune. S.PAI: Sospecha de pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica
idiopática.
*Diferencias significativas (P < 0,05).
La sensibilidad, la especificidad, el VPP y el VPN de los anticuerpos anti-CA
19.9 para el diagnóstico de la PAI fueron de un 57%, 69%, 14% y 95%,
respectivamente (Figura 39).
57%69%
14%
95%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD VPP VPN
Anticuerpos anti-CA 19.9 +
Figura 39. Valor diagnóstico de los anticuerpos anti-CA 19.9+ en la PAI.
209
RESULTADOS
La media, los percentiles (25 y 75) y el rango intercuartílico de los niveles
séricos de CA 19.9 en los pacientes con PAI, sospecha de PAI, PCI,
pancreatitis aguda y pancreatitis crónica se representa en la figura 40. La
mediana (rango intercuartílico) de los niveles séricos de CA 19.9 en pacientes
con cáncer de páncreas fue de 134 UI/ml (134-1425).
Los niveles de CA 19.9 estuvieron elevados por encima de su valor normal
(1-37 U/ml) en un 33% (4/12) y un 7% (4/24) de los pacientes con PAI (2 de
ellos con cáncer de páncreas) y PCI, respectivamente (uno de ellos con
adenocarcinoma gástrico); mientras que ninguno de los pacientes con
sospecha de PAI presentó niveles aumentados de CA 19.9.
Como los niveles de CA 19.9 se pueden elevar en situaciones de ictericia
obstructiva no maligna, se han estudiado los niveles séricos de CA 19.9 en
pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI sin y con ictericia. Adicionalmente,
se ha evaluado la asociación de los niveles séricos de CA 19.9 con la actividad
de la enfermedad. Para ello, se han comparado los niveles del marcador
tumoral en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, sin y con niveles de
IgG4 aumentados y en pacientes sin y con afectación extrapancreática. En este
sentido, no se han encontrado diferencias significativas en los niveles de CA
19.9 en función de la presencia de ictericia, niveles de IgG4 aumentados y
afectación extrapancreática en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI.
Tampoco se ha encontrado una correlación significativa entre la presencia de
anticuerpos anti-CA 19.9 y de niveles aumentados de CA 19.9 (> 37 UI/ml)
(coeficiente de contingencia de Pearson = 0,052, P = 0,609) (Figura 41).
210
RESULTADOS
PAISOSPECHA.PAI
PCIP.AGUDA
P.CRÓNICA
0,00
25,00
50,00
75,00
100,00
125,00
150,00
175,00
NIV
ELE
S C
A19
.9 (U
/ml)
A
AS
S
S
SS
n=12 n=5 n=24 n=11 n=25
Figura 40. Niveles de CA 19.9. Se muestran los valores de la mediana, percentiles (25 Y 75) y el rango. Los círculos indican los valores atípicos y los asteriscos los valores extremos.
SI NO
Anticuerpos anti-CA19.9
10
15
20
25
30
35
40
Núm
ero
de p
acie
ntes
NIVELES AUMENTADOS CA19.9 (> 37 U/ml)
SI
NO
Figura 41. Relación entre la concentración elevada de CA 19.9 y la presencia de anticuerpos anti-CA 19.9.
211
RESULTADOS
4.6. Análisis de la presencia de anticuerpos anti-p 53
Dado que algunos individuos con lesiones premalignas y con distintos
tipos de cáncer, mediante un mecanismo desconocido, desarrollan anticuerpos
frente a la proteína p53 se ha analizado la presencia de anticuerpos anti-p53 en
los pacientes con PAI con el fin de evaluar el potencial maligno de la
enfermedad. Adicionalmente, se ha analizado la correlación entre la presencia
de estos anticuerpos y de lesiones extrapancreáticas (como marcador de
actividad de enfermedad).
La frecuencia de anticuerpos anti-p53 en los diferentes grupos de pacientes
incluidos en el estudio se describe en la figura 42. Un 71%, 22% y 12% de los
pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente, presentaron
anticuerpos anti-p53. Dentro de los grupos control, un 19% y un 15% de los
pacientes con cáncer de páncreas y PC, respectivamente, presentaron
anticuerpos anti-p53.
71%
22%
12% 19% 15%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
Frecuencia de Abs anti-p53 +
PAI
Sospecha PAI
PCI
Cáncer de páncreas
Pancreatitis crónica
Figura 42. Frecuencia de anticuerpos anti-p53 positivos en los diferentes grupos de pacientes incluidos en el estudio.
212
RESULTADOS
La comparación de la frecuencia de anticuerpos anti-p53 positivos entre el
grupo de pacientes con PAI y el resto de grupos de pacientes se describe en la
tabla 47. La frecuencia de anticuerpos anti-p53 positivos fue significativamente
mayor en pacientes con PAI (11/14) que en pacientes con sospecha de PAI
(2/9) (P = 0,013), PCI (4/33) (P < 0,0001), PC (4/27) (P < 0,0001) y cáncer de
páncreas (4/26) (P < 0,0001).
TABLA 47. Diferencias en la frecuencia de Abs anti-p53 + entre la PAI y el resto de grupos incluidos en el estudio
Grupos comparados Frec. Abs anti-p53 + 1 Test estadístico Valor P
PAI vs Sospecha PAI 11/14 vs 2/9 Exacto de Fisher 0,013*
PAI vs PCI 11/14 vs 4/33 Exacto de Fisher <0,0001*
PAI vs Pancreatitis crónica 11/14 vs 4/27 Chi-cuadrado <0,0001*
PAI vs Cáncer de páncreas 11/14 vs 4/26 Chi-cuadrado <0,0001*
1Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos. Frec. Abs anti-p53+:
Frecuencia de anticuerpos anti-p53 positivos. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI:
Pancreatitis crónica idiopática.
* Diferencias significativas (P < 0,05).
En la tabla 48 se describe la comparación de la frecuencia de anticuerpos
anti-p53 positivos entre el grupo de pacientes con sospecha de PAI y el de PCI
y el resto de grupos control. No se encontraron diferencias significativas en la
frecuencia de anticuerpos anti-p53 positivos entre los pacientes con sospecha
de PAI o PCI y los pacientes con PC o cáncer de páncreas, ni tampoco entre
los pacientes con PCI y los pacientes con PC o cáncer de páncreas.
213
RESULTADOS
TABLA 48. Diferencias en la frecuencia de anticuerpos ant i-p53+ entre la sospecha de PAI o la PCI y los grupos contr ol incluidos en el estudio
Grupos comparados Frec. anti-CA 19.9 Abs + 1 Test estadístico Valor P
S.PAI vs Pancreatitis crónica 2/9 vs 4/27 Exacto de Fisher 0,627
S.PAI vs Cáncer de páncreas 2/9 vs 4/26 Exacto de Fisher 0,635
PCI vs Pancreatitis crónica 4/33 vs 4/27 Chi-cuadrado 1,00
PCI vs Cáncer de páncreas 4/33 vs 4/26 Chi-cuadrado 0,722
1Resultados expresados como nº casos positivos/nº total de casos. PAI: Pancreatitis autoinmune. S.PAI: Sospecha de PAI. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. *Diferencias significativas (P < 0,05).
Adicionalmente, se ha encontrado una correlación positiva entre la presencia
anticuerpos anti-p53 y de lesiones extrapancreáticas (coeficiente de
contingencia de Pearson = 0,53, P = < 0,001).
4.7. Análisis de los niveles séricos de interleucin a-6 (IL-6)
La IL-6 se ha propuesto como un marcador sensible pero inespecífico de
inflamación. Adicionalmente es esencial en la patogénesis y desarrollo de
malignidades. En el presente estudio se han determinado los niveles séricos de
IL-6 en los pacientes con PAI con el fin de evaluar su papel como citocina
proinflamatoria y marcador de malignidad.
La media, los percentiles (25 y 75) y el rango intercuartílico de los niveles de
IL-6 (pg/ml) en los pacientes con PAI, sospecha de PAI, PCI, PC, cáncer de
páncreas y controles sanos se representan en la figura 43. No se han
encontrado diferencias significativas en los niveles de IL-6 entre los pacientes
con PAI y los pacientes con pancreatitis crónica (P = 0,643) y cáncer de
páncreas (P = 0,496). Mientras que los niveles de IL-6 se encuentraron
214
RESULTADOS
PAIS.PAI
PCIPC
C.PANCREASC.SANOS
0,00
25,00
50,00
75,00
NIV
ELES IL
-6 (pg/m
l)
A
A
A
A
S
S
S
S
n=13 n=7 n=14 n=21 n=19 n=18
Figura 43. Niveles de IL-6 (pg/ml). Se muestran los valores de la mediana, percentiles 25 y 75) y el rango. Los círculos indican los valores atípicos y los asteriscos los valores extremos. PAI: Pancreatitis autoinmune. S.PAI: Sospecha de PAI. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. PC: Pancreatitis crónica. C.Páncreas: Cáncer de páncreas. C.Sanos: Controles sanos.
significativamente más elevados en los pacientes con PAI que en controles
sanos (P= 0,045). En el grupo de sospecha de PAI no se han encontrado
diferencias significativas con el grupo de PC (P = 0,366) y el de cáncer de
páncreas (P = 0,532). Mientras que los niveles de IL-6 se encontraron
significativamente elevados en los pacientes con sospecha de PAI que en
controles sanos (P= 0,015). En el grupo de PCI no se han encontrado
diferencias significativas con el grupo de cáncer de páncreas (P = 0,373).
Mientras que los niveles de IL-6 se encontraron significativamente más
elevados en los pacientes con PCI que en el grupo de PC (P =0,033) y en
controles sanos (P= 0,0001).
215
RESULTADOS
4.8. Estudio de las subpoblaciones linfocitarias en pacientes con PAI,
sospecha de PAI y pancreatitis crónica idiop ática
En la tabla 49 se muestran los números absolutos por µl de sangre de los
linfocitos totales, células T, T CD4+, T CD8+, B y Nk, expresados como media
+/- desviación estándar y mediana (rango intercuatílico), en pacientes con PAI,
sospecha de PAI y PCI. No se han encontrado diferencias significativas entre
los tres grupos de pacientes, ni en el número absoluto de linfocitos totales, ni
en ninguna de las subpoblaciones linfocitarias analizadas.
TABLA 49. Frecuencias absolutas de las subpoblaciones lin focitarias en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI
Subpoblaciones (rango normal)
PAI1
(n=10) Sospecha PAI 2
(n=5) PCI3
(n=13)
Linfocitos (1000-4800)
2098 +/- 774
1889,5 (1230-2766,5)
1607 +/- 456
1612,5 (1169,5-2038)
2182 +/- 765
2071 (1507-2972,5)
Linfocitos T (690-2540)
1368,5 +/- 426
1376,5 (968,5-1647,5)
185 +/- 437
1154 (789-1611,5)
1438 +/- 584
1318 (914-1916,5)
Linfocitos T CD4+ (410-1590)
797 +/- 306
695,5 (534-1074)
771 +/- 655
484 (380-1449,5)
858 +/- 284 827,5 (612-1106)
Linfocitos T CD8+ (190-1140)
431 +/- 108
449,5 (331,5-529)
596 +/- 271
634 (318,5-835,5)
452 +/- 258
388 (287,5-551)
Linfocitos B (90-660)
193 +/- 169
129 (75,5-275)
158,5 +/- 95
146 (76,5-253)
239 +/- 162
153 (129,5-398)
Células Nk (90-590)
583 +/- 433
484 (251-827)
218 +/- 122
250,5 (89,5-315)
423 +/- 224
407 (200,5-603,5)
1,2,3 Resultados expresados como Media +/- Desviación estandar (parte superior) y mediana (rango
intercuartílico) (parte inferior) de la frecuencia absoluta de células/µl. n= número de pacientes.
PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.
216
RESULTADOS
En la tabla 50 se muestran los porcentajes de la frecuencia de cada una de
las subpoblaciones linfocitarias, con respecto al total de linfocitos, expresados
como media +/- desviación estándar y mediana (rango intercuatílico), en
pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. Los valores medios y de la mediana
del porcentaje de todas las subpoblaciones linfocitaria estuvieron dentro del
rango normal en los tres grupos de pacientes, con excepción del valor de la
mediana del porcentaje de linfocitos B, que estuvo ligeramente disminuido en
pacientes con PAI (5,5%). La frecuencia relativa de LT CD8+ fue
significativamente mayor en pacientes con sospecha de PAI que en pacientes
con PCI (P = 0,041). Para el resto de subpoblaciones linfocitarias no se
encontraron diferencias significativas entre los tres grupos de pacientes.
TABLA 50. Porcentaje de las subpoblaciones linfocitarias en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI
Subpoblaciones (rango normal)
PAI1
(n=10) Sospecha PAI 2
(n=5) PCI3
(n=13)
Linfocitos T (55-84%)
67% +/- 8,3
66% (60-74%)
72% +/- 6,6
71,5% (66,5-79%)
67% +/- 10,4
66% (60-76%)
Linfocitos T CD4 +
(31-60%) 42% +/- 5,1
41% 37-45%)
37,5% +/- 7
39% (30-43%)
43% +/- 7,5
42,5% (38-50%)
Linfocitos T CD8 + (13-41%)
23% +/- 8
20,5% (17-32%)
34% +/- 10
32,5% (25-44%)* a
22% +/- 7,3
19% (17,5-30%)
Linfocitos B (6-25%)
9% +/- 5,7
5,5% (5-14%)
9% +/- 4,4
9% (4-12,5%)
11% +/- 6,4
10% (5,5-17,5%)
Células Nk (5-26%)
23,5% +/- 9,5
21% (16-30%)
14% +/- 8,3
17,5% (5,5-20%)
18,5% +/- 8
16% (11,5-24%)
1,2,3 Resultados expresados como mediana (rango intercuartílico) de la frecuencia de cada
subpoblación con respecto al porcentaje total de linfocitos. n= número de pacientes. PAI:
Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. a Sospecha de PAI vs PCI P = 0,041
*Diferencias significativas (P < 0,05)
217
RESULTADOS
En la figura 44 se muestran la frecuencias del cociente entre células T CD4+
y CD8+ (CD4/CD8) en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. El ratio
CD4/CD8 fue significativamente mayor en pacientes con PAI (2+/-0,74) que en
pacientes con sospecha de PAI (1,2+/-0,74), mientras que no se encontraron
diferencias significativas entre el resto de los grupos.
PAI SOSPECHA.PAI PCI
0,00
2,00
4,00
6,00
Co
cien
te C
D4/
CD
8
NS
NS
P = 0,034*
Figura 44. Cociente LT CD4+/LT CD8+ en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmume. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. NS: No significativo. Las barras representan la media y la desviación estandar. El cociente CD4/CD8 fue significativamente mayor en pacientes con PAI que en pacientes con sospecha de PAI ( P = 0,034). No se encontraron diferencias significativas entre el resto de grupos.
El recuento de linfocitos totales y las frecuencias de células T, T CD4+, T
CD8+ de la mayoría de los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI,
estuvieron dentro de los rangos normales. Las principales alteraciones en las
subpoblaciones linfocitarias consistieron en un descenso en la frecuencia de
linfocitos B (rango normal: 6-25%) y en un incremento de células Nk (rango
normal: 5-26%). En la figura 45 se observa cómo un elevado porcentaje de
pacientes con PAI, presentaron linfocitopenia B (% linfocitos B < 6%) (50%)
218
RESULTADOS
50%
40% 40%
0%
23%15%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
PAI Sospecha PAI PCI
Linfocitopenia B
Aumento NK
Figura 45. Frecuencia de linfocitopenia B (% Linfocitos B < 6%) y de incremento de células NK (% Nk >26%) en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmume. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.
y células Nk aumentadas (% células Nk > 26%) (40%). En el grupo de
sospecha de PAI, la frecuencia de linfocitopenia B fue de un 40%, mientras que
ninguno de los pacientes presento aumento de células Nk. En el grupo de PCI,
se observó la menor frecuencia de linfocitopenia B (23%), mientras que las
células Nk estuvieron aumentadas en un 15% de los pacientes. No se
encontraron diferencias significativas entre los tres grupos de pacientes.
Dado que las células Nk se han encontrado aumentadas en numerosas
enfermedades autoinmunes y podrían desempeñar un papel patogénico, se
analizaron las diferencias en el porcentaje de células Nk en función de la
presencia de afectación extrapancreática, observándose un aumento
significativo de la frecuencia de células Nk en los pacientes con afectación
extrapancreática que en aquellos sin afectación extrapancreática (mediana
(rango intercuartílico): 27% (17-34%) vs 16% (12,25-23%) (P = 0,026))
219
RESULTADOS
4.9. Análisis inmunofenotípico de las subpoblacione s de células B en
pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis c rónica idiopática
Dado que la PAI se caracteriza por la estimulación crónica de las células B,
se ha analizado la distribución de las subpoblaciones de células B en esta
enfermedad.
En la figuras 46-51 se muestra un ejemplo práctico del análisis
inmunofenotípico de las subpoblaciones de las células B en un paciente con
PCI. Se muestra el porcentaje de cada una de las subpoblaciones con respecto
al total de linfocitos B y el análisis de clonalidad de las células plasmáticas
(CD19+ CD38++) mediante el cálculo del cociente entre las cadenas ligeras
intracitoplasmáticas kappa y lambda (ratio k/λ).
CD19 PerCP
CD
27 F
ITC
Plasmaticas 2%
Memoria 84%
Naive + Pre-naive + Transicionales 14%
Figura 46 . Distribución de las subpoblaciones de células B en función de la expresión en superficie de CD19 y CD27. CD19+CD27- (naive, pre-Naive y transicionales) CD19+CD27+ (memoria) y CD19+CD27++ (plasmáticas). Se muestra la frecuencia relativa de cada subpoblación con respecto al porcentaje total de linfocitos B.
220
RESULTADOS
CD38 PerCP
CD
24 P
E
Plasmaticas 2%
Transicionales 2%
CD38 PerCPIg
DP
E
Naive 10% Transicionales 2%Pre-naive 2%
CD
27 F
ITC
IgD PE
Memoria US 18%Memoria S 62%
Plasmaticas 2%
Memoria DN 4%
Naive + Pre-naive + Transicionales 14%
Figura 47 . Distribución de las subpoblaciones de células B en función de la expresión en superficie de CD38 y de CD24. CD24+CD38++ (transicionales) CD24-CD38++ (plasmáticas). Se muestra el porcentaje de la frecuencia de cada subpoblación con respecto al total de linfocitos B.
Figura 48 . Distribución de las subpoblaciones de células B en función de la expresión en superficie de CD38 y de IgD. IgD+CD38+d (naive) IgD+CD38+ (pre-naive) e IgD+CD38++
(transicionales). Se muestra el porcentaje de la frecuencia de cada subpoblación con respecto al total de linfocitos B.
Figura 49 . Distribución de las subpoblaciones de células B en función de la expresión en superficie de IgD y de CD27. IgD+CD27- (naive, pre-Naive y transicionales) IgD+CD27+ (memoria unswitched), IgD-CD27+ (memoria switched), IgD-CD27- (memoria dobles negativas) y IgD-CD27++ (plasmáticas). Se muestra el porcentaje de la frecuencia de cada subpoblación con respecto al total de linfocitos B. US: Unswitched, S: Switched, DN: Dobles negativas.
221
RESULTADOS
CD38 PecCP
CD
138
FIT
C
Plamáticas CD138 + 1%
Plasmáticas CD138 - 1,2%
Figura 50. Distribución de las células plasmáticas (CD19+ CD38++) en función de la expresión en superficie de CD138. CD38++CD138+ (Plasmáticas 138+) y CD38++CD138-
(plasmáticas 138-). Se muestra el porcentaje de la frecuencia de cada subpoblación con respecto al total de linfocitos B.
Figura 51. Análisis de clonalidad de células plasmáticas (CD19+ CD38++). Se muestra el porcentaje de expresión de kappa y lambda y el ratio kappa/lambda. El valor del ratio k/λ indica la presencia de una población monoclonal con resticción Lambda.
222
RESULTADOS
En la tabla 51 se muestran los números absolutos por µl de sangre de las
siguientes subpoblaciones de células B obtenidas según la estrategia de
“gating” en las citometrías comentadas anteriormente:
Transicionales
Pre-Naive
Naive
Memoria
Memoria unswitched
Memoria switched
Memoria dobles negativas
Plasmáticas
Plasmáticas CD 138+
Plasmáticas CD 138-
Los datos se han expresado como media +/- desviación estandar y mediana
(rango intercuatílico) en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. No se han
encontrado diferencias significativas entre los tres grupos de pacientes, en las
frecuencias absolutas para ninguna de las subpoblaciones de linfocitos B
analizadas.
223
RESULTADOS
TABLA 51. Frecuencias absolutas de las subpoblaciones de lin focitos B en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI
Subpoblaciones (rango normal)*
PAI1
(n=10) Sospecha PAI 2
(n=5) PCI3
(n=13)
Transicionales (2-9)
6,4 +/- 5,9
5,2 (1,4-9,5)
4,7 +/- 4
3 (1,6-8,5)
16,6 +/- 17,1
17,1 (3,9-24,6)
Pre-naive (9-47)
9,1 +/- 4,9
9,7 (5,1-12,4)
7,3 +/- 5
9,4 (1,9-11,6)
17,1 +/- 14,2
11,7 (4,9-28,1)
Naive
(63-156) 76,2 +/- 59,6
64 (26,4-121,9)
98,6 +/- 70,9
75,6 (48,8-160)
125,4 +/- 100,3
82,8 (48,8-210)
Memoria (28-68)
93,9+/-125,8
41,4 (31,1-105,6)
40,1+/-25
36,1 (20,3-62)
73,7 +/- 60,7
37,4 (26,7-128,4)
Memoria unswitched
23,4 +/- 21,4
13,6 (5,3-46,2)
14 +/- 4,6
10,8 (4,6-25)
25 +/-21,8
17,9 (11,7-33,4)
Memoria switched 60,6 +/- 115,9
16,5 (12,7-50,4)
20,6 +/- 15
20 (9-32,5)
41,7 +/- 43,3
21,9 (10,4-64,8)
Memoria dobles negativas
12,7 +/- 11
7,5 (4,6-27,9)
5,4 +/- 3,8
5,4 (2,3-8,5)
7 +/- 4,7
6 (3,6-9,6)
Plasmáticas (0,6-2,9)
4,1+/-1,3
3,4 (1,3-6,9)
2 +/- 0,8
1,7 (1,4-2,8)
5,4 +/- 10,7
1,8 (1,3-3,7)
Plasmáticas CD138 +
(0,26-1,25) 2,3+/-2,3
1,5 (0,5-3,8)
1,2 +/- 0,9
0,9 (0,4-2)
1,9 +/ 2,7
0,8 (0,7-1,9)
Plasmáticas CD138 - (0,34-1,65)
1,8+/-2,2
1 (0,4-2,7)
0,9 +/- 0,8
0,6 (0,3-1,7)
3,5 +/- 7,8
1 (0,54-1,8)
* Los rangos de referencia (rango intercuartílico) de las frecuencias absolutas las células B
transicionales, naive, memoria y plasmáticas fueron establecidos por Caraux et al [382]. El rango
de referencia (rango intercuartílico) de las células B pre-naive fueron establecidos por Lee et al
[381].
1,2,3 Resultados expresados como media +/- desviación estandar (parte superior) y Mediana (Rango
intercuartílico) (parte inferior) de la frecuencia absoluta de células/µl. n= número de pacientes. PAI:
Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.
224
RESULTADOS
En la tabla 52 se muestran los porcentajes de la frecuencia de cada una de
las subpoblaciones de linfocitos B, con respecto al total de linfocitos B,
expresados como media +/- desviación estándar y mediana (rango
intercuatílico), en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. Los valores
medios y de la mediana del porcentaje de células B pre-naive y naive
estuvieron dentro del rango normal en pacientes con PAI, sospecha de PAI y
PCI. Los valores medios y de la mediana de células B transicionales en
pacientes con PAI y sospecha de PAI estuvieron dentro del rango normal,
mientras que en pacientes con PCI estuvieron aumentados (6,7% y 6%,
respectivamente). Los valores medios y de la mediana de células B memoria
en pacientes con sospecha de PAI y PCI estuvieron dentro del rango normal,
mientras que en pacientes con PAI estuvieron aumentados (43,5% y 42,5%,
respectivamente). Los valores medios y de la mediana de células B memoria
unswitched estuvieron disminuidos en pacientes con PAI, sospecha de PAI y
PCI (media: 12,6%, 9,6 % y 12,3%, respectivamente; mediana: 10,5%, 8% y
9%, respectivamente. Los valores medios y de la mediana de células B
memoria “switched” en pacientes con sospecha de PAI y PCI estuvieron dentro
del rango normal, mientras que en pacientes con PAI el valor medio estuvo
aumentado (23,3%), aunque el valor de la mediana estuvo dentro del rango
normal. Los valores medios y de la mediana de células B memoria dobles
negativas en pacientes con sospecha de PAI y PCI estuvieron dentro del rango
normal, mientras que en pacientes con PAI el valor medio y de la mediana
estuvieron aumentados (7,9% y 6%, respectivamente). Los valores medios
de células plasmáticas en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI
225
RESULTADOS
estuvieron aumentados (2,8%, 1,6% y 2%, respectivamente); similarmente, el
valor de la mediana también estuvo aumentado (1,8%, 1,8% y 1,6%,
respectivamente). Los valores medios y de la mediana de células plasmáticas
CD138+ en pacientes con sospecha de PAI y PCI estuvieron dentro del rango
normal, mientras que en pacientes con PAI el valor estuvieron aumentados
(1,6% en ambos casos). Los valores medios de células plasmáticas CD138- en
pacientes con PAI sospecha de PAI y PCI estuvieron aumentados (1,2%, 0,8%
y 1,3%, respectivamente). Similarmente, el valor de la mediana estuvo
aumentado en pacientes con PAI y sospecha de PAI (1,2% y 0,7%,
respectivamente), mientras que en pacientes con PCI estuvo dentro del rango
normal. Sin embargo, no se han encontrado diferencias significativas entre los
tres grupos de pacientes en el porcentaje de ninguna de las subpoblaciones de
linfocitos B analizadas.
En la figura 52 se muestran las frecuencias del cociente entre las cadenas
ligeras intracitoplasmáticas kappa y lambda (ratio k/λ) en pacientes con PAI,
sospecha de PAI y PCI. La frecuencia del ratio k/λ fue significativamente mayor
en pacientes con PAI (1,1+/-0,3) que en pacientes con sospecha de PAI (0,6+/-
0,3), mientras que no se encontraron diferencias significativas entre el resto de
los grupos.
226
RESULTADOS
TABLA 52. Frecuencias relativas de las subpoblaciones de linfocitos B en pacie ntes con PAI, sospecha de PAI y PCI
Subpoblaciones (rango normal)*
PAI1
(n=10) Sospecha PAI 2
(n=5) PCI3
(n=13)
Transicionales (1,8-4,5%)
4,5% +/- 5,5
2% (1-5,5%)
3,7% +/- 3,1
4% (0,7-6,5%)
6,7% +/- 4
6% (2,5-11%)
Pre-naive (3-16%)
6,6% +/- 4,2
5% (3-10,5%)
4,6% +/- 3
4% (2-7,5%)
7,2% +/- 3,4
8% (4,5-9%)
Naive
(57-73%) 41,7% +/- 18
47% (21,5-54%)
63% +/- 16,4
64% (47,5-78%)
50,1% +/- 19,9
59% (32-63,5%)
Memoria (22-39%)
43,5% +/- 18,4
42,5% (28,8-54,3%)
26,6% +/- 17,2
23% (14,5-40,5%)
33,8% +/- 21,6
26% (19-48%)
Memoria unswitched (13-21%)
12,6% +/- 9,5
10,5% (4,8-17%)
9,6% +/- 6,3
8% (5,5-14,5%)
12,3% +/- 9
9% (6-18,5%)
Memoria switched (9-19%)
23,3% +/- 20
16% (11-29,5%)
13,6% +/- 11,6
12% (5-23%)
17,9% +/- 16,6
11% (9-17%)
Memoria DN (< 5%)
7,9% +/- 8,1
6% (3-10,5%)
3,4% +/- 2,3
3% (1,5-5,5%)
3,6% +/- 2
3% (2-6%)
Plasmáticas (0,5-1,4%)
2,8% +/- 2,5
1,8% (1,5-3,4%)
1,6% +/- 0,6
1,8% (1-2%)
2% +/- 3
1,6% (0,7-2,1%)
Plasmáticas CD138 +
(0,28-0,8%) 1,6% +/- 1,9
1,1% (0,5-1,8%)
0,7% +/- 0,5
0,6% (0,4-1,2%)
0,78% +/- 0,8
0,54% (0,4-0,9%)
Plasmáticas CD138 - (0,22-0,6%)
1,2% +/- 1%
1,2% (0,1-1,5%)
0,8% +/- 0,7%
0,7% (0,3-1,5%)
1,3% +/- 2,4%
0,6% (0,3-1,3%)
* Los rangos de referencia (rango intercuartílico) de las frecuencias relativas de las células B
transicionales, naive, memoria y plasmáticas fueron establecidos por por Caraux et al [382]. El
rango de referencia (rango intercuartílico) de la frecuencia relativa de las células B pre-naive fueron
establecidos por Lee et al [381].
1,2,3 Resultados expresados como media +/- desviación estandar (parte superior) y mediana (rango
intercuartílico) (parte inferior) de la frecuencia relativa de cada subpoblación con respecto al
porcentaje total de linfocitos B. n= número de pacientes. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI:
Pancreatitis crónica idiopática. DN: Dobles negativas.
227
RESULTADOS
PAI SOSPECHA.PAI PCI
0,50
1,00
1,50
2,00
Rat
io k
/ λ
* P = 0,016
NS
NS
Figura 52. Frecuencia del ratio k/λ en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmume. PCI:Pancreatitis crónica idiopática. NS: No significativo. Las barras representan la media y la desviación estandar. El ratio k/λ fue significativamente mayor en pacientes con PAI que en pacientes con sospecha de PAI (P = 0,016). No se encontraron diferencias significativas entre el resto de grupos.
Se han observado alteraciones en la distribución de las subpoblaciones de
células B en un porcentaje elevado de pacientes con PAI, sospecha de PAI y
PCI. Las principales alteraciones en distribución de las subpoblaciones de
linfocitos B consistieron en un aumento en la frecuencia de células B
transicionales (rango normal: 1,8-4,5%), memoria totales (rango normal: 28-
68%), memoria dobles negativas (valor normal < 5%), plasmaticas totales
(rango normal: 0,5-1,4%), plasmáticas CD138+ (rango normal: 0,28-0,8%) y
plasmáticas CD138- (rango normal: 0,22-0,6%); y en un descenso en la
frecuencia de células B pre-naive (rango normal: 3-16%) y naive (rango normal:
57-73%). Las células B transicionales estuvieron aumentadas en un, 20%,
40% y 62% de pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI
respectivamente; mientras que las células B prenaive estuvieron
228
RESULTADOS
disminuidas en un 10%, 40% y 15%, respectivamente (Figura 53). No se
encontraron diferencias significativas entre los tres grupos de pacientes, ni en
la frecuencia de células B transicionales aumentadas, ni de células B pre-naive
disminuidas. Las células B naive estuvieron disminuidas en un 90%, 40% y
31% de pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente (Figura
54). La frecuencia de células B naive disminuidas fue significativamente mayor
en pacientes con PAI que en pacientes con PCI (P = 0,010), mientras que no
se encontraron diferencias significativas entre el resto de grupos. Las células B
memoria totales estuvieron aumentadas en un 60%, 20% y 23% de pacientes
con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente; mientras que las células B
memoria dobles negativas estuvieron aumentadas en un 40%, 20% y 31%,
respectivamente (Figura 55). No se encontraron diferencias significativas entre
los tres grupos de pacientes, ni en la frecuencia de células B memoria totales
aumentadas, ni de células B memoria dobles negativas aumentadas. Las
células plasmáticas estuvieron aumentadas en un 80%, 80% y 31% de
pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente (Figura 56). No se
encontraron diferencias significativas entre los tres grupos de pacientes en la
frecuencia de células plasmáticas aumentadas. Las células plasmáticas
CD138- estuvieron aumentadas en un 70%, 60% y 54% de pacientes con PAI,
sospecha de PAI y PCI, respectivamente; mientras que las CD138+ estuvieron
aumentadas en un 50%, 40% y 23%; respectivamente. No se encontraron
diferencias significativas entre en la frecuencia de células plasmáticas CD138-
y CD138- aumentadas.
229
RESULTADOS
20%10%
40% 40%
62%
15%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
PAI Sospecha PAI PCI
↑ B-Transicionales↓ B Pre-Naive
Figura 53. Frecuencia del aumento de células B transicionales y del descenso de células B pre-naive en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmume. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.
90%
40%31%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
PAI Sospecha PAI PCI
↓ B-naive
* P = 0,010
Figura 54. Frecuencia del descenso de células B naive en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. Las diferencias fuero significativas entre el grupo de pacientes con PAI y el de PCI.
230
RESULTADOS
60%
40%
20% 20% 23%31%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
PAI Sospecha PAI PCI
↑ B-Memoria Totales
↑ B Memoria DN
Figura 55. Frecuencia del aumento de células B memoria totales y memoria dobles negativas en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.
80%
70%
50%
80%
60%
40%31%
54%
23%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
PAI Sospecha PAI PCI
↑ Plasmáticas
↑ Plasmáticas 138-
↑ Plasmáticas 138+
Figura 56. Frecuencia del aumento de células plasmáticas totales, plasmáticas 138- y plasmáticas 138+ en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmune. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.
Cuando se analizaron las diferencias en el porcentaje de los distintos tipos
de células B y plasmáticas en función de la presencia de afectación
extrapancreática, se observó un aumento significativo de las células B memoria
doble negativas y plasmáticas en los pacientes con afectación extrapancreática
que en aquellos sin afectación extrapancreática (mediana (rango intercuartílico):
6% (3-12%) vs 3% (2-5%) (P = 0,044) y 3% (1,7-9%) vs 1,3% (0,7-1,95%) (P =
0,013), respectivamente) y un descenso significativo de las células naive (23%
(17-43%) vs 58% (44,5-67%) (P = 0,021).
231
RESULTADOS
En la Figura 57 se muestra la frecuencia del ratio k/λ normal (0,5-4) y
disminuido (<0,5) de las células plasmáticas en pacientes con PAI, sospecha
de PAI y PCI. Todos los pacientes con PAI, presentaron un ratio k/λ normal de
las células plasmáticas. Se observó un ratio k/λ disminuido, indicando la
presencia de una población monoclonal con restricción λ, en un 20% y un 31%
de los pacientes con sospecha de PAI y PCI, respectivamente.
100%
0%
80%
20%
69%
31%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
PAI Sospecha PAI PCI
K/λ normal
↓ K/λ
Figura 57. Frecuencia del ratio Kappa/Lambda normal y disminuido de las células plasmáticas en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmume. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.
232
RESULTADOS
4.10. Estudio de cadenas ligeras libres y de los ra tios kappa/lambda en
pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancr eatitis crónica idiopática
Dado que las cadenas ligeras libres pueden incrementarse en las
enfermedades autoinmunes como consecuencia de la estimulación de las
células B, podrán también alterarse en la PAI. Adicionalmente se han estudiado
los ratio κ/λ sFLC, ya que su alteración constituye un marcador temprano de la
presencia de malignidades de células B o de la existencia de de gammapatías
monoclonales.
En la figura 58 se muestran la media, los percentiles (25 y 75) y el rango
intercuartílico de los niveles de sFLC k, sFLC λ y de ratios k/λ sFLC en
muestras de suero al diagnóstico de pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI.
La mediana de los niveles de sFLC k estuvo dentro del rango normal (3,3-19,4)
en pacientes con PAI (16,35) y sospecha de PAI (15,9), mientras que se
encontró ligeramente elevado en pacientes con PCI (19,85). La mediana de los
niveles de sFLC λ estuvo dentro del rango normal (5,7-26,3) en pacientes con
PAI (17,4), sospecha de PAI (15,3) y PCI (17,1). La mediana de los ratios k/λ
sFLC estuvo dentro del rango normal (0,26-1,65) en pacientes con PAI (1,00),
sospecha de PAI (1,02) y PCI (1,01). No se han encontrado diferencias
significativas en los niveles de sFLC k, sFLC λ y en los ratios k/λ sFLC entre
ninguno de los grupos de pacientes analizados.
233
RESULTADOS
Figura 58. Niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda (mg/L) y del cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda en muestras de suero al diagnóstico. Se muestran los valores de la mediana, percentiles (25 y 75) y el rango. En la representación de los ratios k/λ, los círculos indican los valores atípicos. No se muestran los valores atípicos para los niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda. PAI: Pancreatitis autoinmune. S.PAI: Sospecha de PAI. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. sFLC k: Cadenas ligeras libres en suero kappa. sFLC λ: Cadenas ligeras libres en suero lambda. Ratio sFLC: Cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda.
234
RESULTADOS
En la figura 59 se muestran la media, los percentiles (25 Y 75) el rango
intercuartílico de los niveles de sFLC k, sFLC λ y de ratios k/λ sFLC en las
últimas muestras de suero extraídas de cada paciente con PAI, sospecha de
PAI y PCI. La mediana de los niveles de sFLC k se mantuvo dentro del rango
normal en pacientes con sospecha de PAI (19), mientras que se encontró
elevada en pacientes con PAI (25,45) y PCI (21,8). La mediana de los niveles
de sFLC λ se mantuvo dentro del rango normal en pacientes con PAI (16,8),
sospecha de PAI (23,8) y PCI (19,1). La mediana de los ratios k/λ sFLC se
mantuvo dentro del rango normal en pacientes con PAI (1,21), sospecha de
PAI (0,81) y PCI (1,01). No se han encontrado diferencias significativas en los
niveles de sFLC k, sFLC λ y en los ratios k/λ sFLC entre ninguno de los grupos
de pacientes analizados.
235
RESULTADOS
Figura 59. Niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda (mg/L) y del cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda en las últimas muestras de suero disponibles de cada paciente. Se muestran los valores de la mediana, percentiles (25 y 75) y el rango. En la representación de los ratios kappa/lambda, los círculos indican los valores atípicos. No se muestran los valores atípicos ni extremos para los niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda. PAI: Pancreatitis autoinmune. S.PAI: Sospecha de PAI. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. sFLC k: Cadenas ligeras libres en suero kappa. sFLC λ: Cadenas ligeras libres en suero lambda. Ratio sFLC: Cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda.
236
RESULTADOS
En la figura 60 se muestran la media, los percentiles (25 y 75) y el rango
intercuartílico de los niveles de sFLC k, sFLC λ y de ratios k/λ sFLC en
muestras de suero, extraídas durante los tres primeros meses tras el comienzo
del tratamiento esteroideo, de pacientes con PAI. La mediana de los niveles de
sFLC k (15,9), sFLC λ (13,3) y de los ratios k/λ (1,26) se mantuvieron dentro de
los rangos normales.
Figura 60. Niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda (mg/L) y del cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda en las muestras de suero post-tratamiento en pacientes con PAI. Se muestran los valores de la mediana, percentiles (25 y 75) y el rango. No se muestran los valores atípicos, ni extremos para los niveles de cadenas ligeras libres kappa y lambda. PAI: Pancreatitis autoinmune. S.PAI: Sospecha de PAI. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. sFLC k: Cadenas ligeras libres en suero kappa. sFLC λ: Cadenas ligeras libres en suero lambda. Ratio sFLC: Cociente entre cadenas ligeras libres kappa y lambda. 4.10.1. Oscilaciones de los niveles de sFLC y de los ratios k/λ en pacientes
con sospecha de PAI y PCI
Para analizar las oscilaciones en el tiempo de los niveles de sFLC k,
sFLC λ los ratios k/λ sFLC en pacientes con sospecha de PAI y PCI (sin
ningún tratamiento farmacológico), se han comparado estos parámetros
entre las muestras de suero al diagnóstico y las últimas muestras de
suero extraídas (muestras finales). En los pacientes con sospecha de PAI,
237
RESULTADOS
se ha observado un incremento de la mediana de los niveles de sFLC k (16,8
vs 19) y de sFLC λ (15,3 vs 23,8), y un descenso de la mediana del ratio k/λ
(1,2 vs 0,81) en las muestras finales con respecto a las muestras al diagnóstico,
aunque las diferencias no fueron significativas en ninguno de los casos. En los
pacientes con PCI se ha observado un incremento de la mediana de los niveles
de sFLC k (19,85 vs 21,4) y de sFLC λ (17,1 vs 19,1), mientras que la mediana
de los ratios k/λ sFLC se mantuvo prácticamente constante (1,02 vs 1,04) en
las muestras finales con respecto a las muestras al diagnóstico, aunque las
diferencias no fueron significativas en ninguno de los casos.
4.10.2. Influencia del tratamiento esteroideo en los niveles de sFLC y los
ratios k/λ en pacientes con PAI
Para analizar la influencia a corto plazo del tratamiento esteroideo sobre los
niveles de sFLC k, sFLC λ y los ratios k/λ sFLC en pacientes con PAI, se han
comparado estos parámetros en las muestras de suero al diagnóstico y en
muestras extraídas durante los tres primeros meses tras el comienzo del
tratamiento esteroideo (muestras post-tratamiento). Se ha observado un
descenso significativo de los niveles de sFLC k (16,35 vs 15,9) (P = 0,005), de
sFLC λ (17,4 vs 13,3) (P = 0,012) y un incremento no significativo del ratio k/λ
sFLC (1,02 vs 1,26) en las muestras post-tratamiento con respecto a las
muestras al diagnóstico.
Para analizar la influencia a largo plazo del tratamiento esteroideo sobre los
niveles de sFLC k, sFLC λ los ratios k/λ sFLC en pacientes con PAI, se han
comparado estos parámetros entre las muestras de suero al diagnóstico y las
últimas muestras extraídas ( tiempo medio de tratamiento esteroideo
238
RESULTADOS
= 32 meses) (muestras finales). Aunque hemos observado un incremento de
los niveles de sFLC k (25,45 vs 16,35) y de los ratios k/λ sFLC (1 vs 1,21), y
un ligero descenso de los niveles de sFLC λ (17,4 vs 16,8) en las muestras
finales con respecto a las muestras al diagnóstico; las diferencias no fueron
significativas en ninguno de los casos.
4.10.3. Alteraciones al diagnóstico en los niveles de sFLC y de los ratios k/λ
En la figura 61 se muestran los niveles de sFLC k y sFLC λ en muestras al
diagnóstico de pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. Las líneas
punteadas rosas y azules separan las muestras con valores normales (en el
interior) y alterados (en el exterior) de sFLC k (3,3-19,4) y sFLC λ (5,7-26,3),
respectivamente. Adicionalmente, las lineas diagonales verdes separan las
muestras policlonales (en el interior) de las monoclonales (en el exterior), en
función del rango normal de ratio k/λ sFLC (0,26-1,65).
Los niveles de sFLC k al diagnóstico estuvieron aumentados en un 50%,
36% y 22% de los pacientes con PCI, PAI y sospecha de PAI, respectivamente.
Los niveles de sFLC λ al diagnóstico estuvieron aumentados en un 29% y un
19% de los pacientes con PAI y PCI, respectivamente; mientras que ninguno
de los pacientes con sospecha de PAI presentó un aumento de sFLC λ. El ratio
k/λ sFLC al diagnóstico estuvo alterado en un 21%, 13% y 11% de los
pacientes con PAI, PCI y sospecha de PAI, respectivamente (Figura 62). No
se han encontrado diferencias significativas en la frecuencia de la presencia de
niveles aumentados de sFLC k y de sFLC λ, ni de ratios k/λ sFLC alterados en
las muestras al diagnóstico entre ninguno de los grupos de pacientes
analizados.
239
RESULTADOS
Figura 61. Niveles séricos de cadenas ligeras libres kappa y lambda (Log de la concentración (mg/L)) en muestras al diagnóstico en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. Las líneas punteadas en rosa representan el rango de referencia de las cadenas ligeras kappa (3,3-19,4) y las líneas punteadas azules el rango de referencia de las cadenas ligeras lambda (5,7-26,3). Las lineas diagonales verdes separan las muestras policlonales (en el interior) de las monoclonales (en el exterior), en función del rango normal de ratio k/λ (0,26-1,65). PAI: Pancreatitis autoinmune. S.PAI: sospecha de PAI. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. sFLC: Cadenas ligeras libres en suero.
36%
50%
22%29%
19%
0%
21%
13% 11%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
k aumentada λ aumentada κ/λ alterado
PAI
PCI
Sospecha PAI
Figura 62. Frecuencia del aumento de cadenas ligeras libres kappa (> 19,4mg/L) y lambda (> 26,3 mg/L) y de la alteración del ratio k/λ sFLC (< 0,26 o > 1,65) al diagnóstico en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmume. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.
240
RESULTADOS
4.10.4. Alteraciones en el tiempo de los niveles de sFLC y de los ratios k/λ
En la figura 63 se muestran los niveles de sFLC k y sFLC λ en las últimas
muestras de suero extraídas (muestras finales) en los pacientes con PAI,
sospecha de PAI y PCI. Se han representado los valores de referencia de
sFLC k (3,3-19,4) y sFLC λ (5,7-26,3) y de los ratios k/ λ sFLC (0,26-1,65).
Los niveles de sFLC k en las muestras finales estuvieron aumentados en un
50% tanto de los pacientes con PAI como de los pacientes con PCI, y en un
33% de los pacientes con sospecha de PAI. Los niveles de sFLC λ en las
muestras finales estuvieron aumentados en un 29%,19% y 11% de los
pacientes con PAI, PCI, y sospecha de PAI, respectivamente. El ratio k/λ sFLC
en las muestras finales estuvo alterado en un 36%, 25% y 11% de los
pacientes con PAI, PCI y sospecha de PAI, respectivamente (Figura 64). No se
han encontrado diferencias significativas en la frecuencia de la presencia de
niveles aumentados de sFLC k y de sFLC λ, ni de ratios sFLC k/λ alterados en
las muestras finales, entre ninguno de los grupos de pacientes analizados.
Se ha encontrado una correlación positiva entre la presencia ratios sFLC k/λ
alterados y de afectación extrapancreática (coeficiente de contingencia de
Pearson = 0,342, P = 0,023),
241
RESULTADOS
Kappa sFLC
Lam
bda
sFLC
Figura 63. Niveles séricos de cadenas ligeras libres kappa y lambda (Log de la concentración (mg/L)) en las últimas muestras de suero extraídas en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. Las líneas punteadas en rosa representan el rango de referencia de las cadenas ligeras kappa (3,3-19,4) y las líneas punteadas azules el rango de referencia de las cadenas ligeras lambda (5,7-26,3). Las lineas diagonales verdes separan las muestras policlonales (en el interior) de las monoclonales (en el exterior), en función del rango normal de ratio k/λ (0,26-1,65). PAI: Pancreatitis autoinmune. S.PAI: Sospecha de PAI. PCI: Pancreatitis crónica idiopática. sFLC: Cadenas ligeras libres en suero.
50% 50%
33% 29%
19%11%
36%
25%
11%
0%
20%
40%
60%
80%
100%
k aumentada λ aumentada κ/λ alterado
PAI
PCI
Sospecha PAI
Figura 64. Frecuencia del aumento de cadenas ligeras libres kappa (> 19,4mg/L) y lambda (> 26,3 mg/L) y de la alteración del ratio k/λ (< 0,26 o > 1,65) en las últimas muestras de suero extraídas pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. PAI: Pancreatitis autoinmume. PCI: Pancreatitis crónica idiopática.
242
RESULTADOS
Para estudiar la asociación de los niveles séricos de cadenas ligeras libres y
los ratio k/λ con la actividad de la enfermedad, se han comparado los niveles
de las mismas en pacientes sin y con afectación extrapancreática, y su relación
con los niveles de IgG4 en las muestras de suero tomadas al diagnóstico en
pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI.
4.10.5. Cambios en los niveles desFLC y ratios k/λ en función de la
ausencia/presencia de afectación extrapancreática
Los niveles de sFLC k fueron significativamente mayores en pacientes con
afectación extrapancreática que en aquellos sin afectación extrapancreática
(media: 28,6 vs 15,15, P = 0,012), mientras que no se encontraron diferencias
significativas en los niveles de sFLC λ, ni el los ratios k/λ sFLC entre los
pacientes con afectación extrapancreática.
4.10.6. Correlación entre los niveles de IgG4 y los de sFLC o los ratios k/λ
Se ha encontrado una correlación positiva entre los niveles de IgG4 y los de
sFLC k en pacientes con PAI (ρ = 0,710, P = 0,004), mientras que no se ha
encontrado correlación en pacientes con sospecha de PAI (ρ = 0,017,
P= 0,966), y PCI (ρ = 0362, P = 0,162).
No se ha encontrado correlación entre los niveles séricos de IgG4 y los
niveles de sFLC λ en pacientes con PAI (ρ = 0,499, P = 0,069), sospecha de
PAI (ρ = 0,3, P = 0,433) ni PCI (ρ = 0,216, P = 0,421).
Se ha encontrado una correlación positiva entre los niveles de IgG4 y los
ratios k/λ sFLC en pacientes con PAI (ρ = 0,601, P = 0,023), mientras que no
se ha encontrado correlación en pacientes con sospecha de PAI (ρ = -0,134,
P = 0,731) ni PCI (ρ = 0343, P = 0,194).
243
RESULTADOS
4.10.7. Monitorización de los niveles de sFLC y de los ratios k/λ en pacientes
con PAI
En la figura 65 se representa la monitorización de los niveles séricos de
sFLC y de los ratios k/λ en 13 de los 14 pacientes con PAI. En uno de los
pacientes con PAI no se ha realizado el análisis debido a la ausencia de
muestras post-tratamiento.
244
RESULTADOS
245
RESULTADOS
246
RESULTADOS
247
RESULTADOS
Figura 65. Monitorización de los niveles séricos de cadenas ligeras libres Kappa, Lambda y del ratio k/λ sFLC en los pacientes con PAI. Tiempo = 0: Muestra al diagnóstico.
248
RESULTADOS
4.11. Análisis de inmunoglobulinas monoclonales en pacientes con PAI,
sospecha de PAI y PCI
Dado que la estimulación crónica de las células B en la PAI podría conducir
a la producción de proteínas monoclonales en el suero, se ha evaluado su
presencia en estos pacientes.
De los 14 pacientes con PAI, en tres (21%) se detectaron inmunoglobulinas
monoclonales circulantes mediante IFE, de tipo IgG-kappa (ratio sFLC k/λ = 2),
IgA-lambda (ratio sFLC k/λ = 0,14) e IgM-kappa (ratio sFLC k/λ = 1,34),
respectivamente. Uno de los 9 pacientes con sospecha de PAI (11%), presentó
una inmunoglobulina monoclonal de tipo IgA-kappa (ratio sFLC k/λ = 2,04). En
contraste ninguno de los 16 pacientes con PCI presentó inmunoglobulinas
monoclonales circulantes. Sin embargo no se encontraron diferencias
significativas entre los tres grupos de pacientes.
La asociación entre la actividad de la enfermedad con el desarrollo de
inmunoglobulinas monoclonales en suero fue evaluado mediante el estudio la
correlación entre la presencia de afectación extrapancreática (marcador de
actividad) y de inmunoglobulinas monoclonales. En este sentido se ha
encontrado una correlación positiva entre ambos parámetros (coeficiente de
correlación de Peason = 0,355, P = 0,019).
249
RESULTADOS
4.12. Analisis de clonalidad de células B en infilt rados linfoplasmocíticos
en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pa ncreatitis crónica
idiopática
Como la activación persistente de las células B presentes en los infiltrados
linfoplasmocíticos de las lesiones pancreáticas y extrapancreáticas de
pacientes con PAI podría conducir al desarrollo de procesos linfoproliferativos B,
se ha evaluado la presencia de clonalidad mediante el análisis de los
reordenamientos de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas.
En la tabla 53 se muestran los resultados del análisis de los reordenamientos
clonales del gen IgH en las secciones de tejido de las lesiones pancreáticas y
extrapancreáticas junto con el diagnóstico anatomopatológico de cada una de
las mismas; en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. De los 9 pacientes
con PAI analizados, siete presentaron reordenamientos policlonales en todas
las muestras evaluadas, mientras en los 2 restantes fueron monoclonales. En
uno de ellos se observaron reordenamientos monoclonales FR1-JH y FR3-JH
a nivel de las glándulas salivares (sin alteraciones desde el punto de vista
anatomopatológico), y en el otro reordenamientos monoclonales FR1-JH y
FR2-JH a nivel de la papila duodenal, (alteraciones anatomopatológicas:
Inflamación crónica con displasia epitelial).
Los 3 pacientes con sospecha de PAI presentaron reordenamientos
policlonales en todas las muestras analizadas. De los 2 pacientes con PCI, en
uno se observaron reordenamientos policlonales y en el otro se detectó un
reordenamiento biclonal FR1-JH a nivel del estómago (diagnóstico
anatomopatológico: Gastritis crónica).
250
RESULTADOS
TABLA 53 . Analisis de reordenamientos clonales del gen IgH
Px Diagnóstico Muestra: Diagnóstico Anatomopatológico Análisis clonalidad
1 PAI Páncreas: Pancreatitis crónica
Glándulas salivares: Sialoadenitis crónica
Policlonal
Policlonal
2 PAI Páncreas: Pancreatitis crónica
Glanglio cístico: Reactivo
Policlonal
Policlonal
3 PAI Próstata: Prostatitis crónica Policlonal
4 PAI
Vesícula biliar: Colecistitis crónica
Glándulas salivares: Sin alteraciones
Policlonal
Monoclonal FR1-JH Monoclonal FR3-JH
5 PAI Próstata: Prostatitis crónica Policlonal
6 PAI Páncreas: Pancreatitis crónica Policlonal
7 PAI Vesícula biliar: Colecistitis crónica Policlonal
8 PAI Páncreas: Pancreatitis crónica Policlonal
9 PAI Hígado: Adenocarcinoma Policlonal
10 PAI Papila duodenal: Inflamación crónica con displasia epitelial
Monoclonal FR1-JH Monoclonal FR2-JH
11 Sospecha PAI
Vesícula biliar: Colecistitis crónica Policlonal
12 Sospecha PAI
Papila duodenal: Inflamación crónica Policlonal
13 Sospecha PAI
Páncreas: Pancreatitis crónica
Médula ósea: Linfocitosis
Policlonal
Policlonal
14 PCI Vesícula biliar: Colecistitis crónica Policlonal
15 PCI Estómago: Gastritis crónica Biclonal FR1-JH
251
RESULTADOS
4.13. Analisis mutacional de K-ras en páncreas y le siones extrapancreáticas
de pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatiti s crónica idiopática
Como se han descrito casos de PAI asociados con cáncer, se ha evaluado
el riesgo de cáncer páncreas y de otros órganos afectados mediante el
análisis mutacional del oncogén K-ras.
En la figura 66 se muestra un ejemplo gráfico de un paciente con análisis
mutacional de K-ras negativo y en la figura 67 un ejemplo gráfico de un paciente
con análisis mutacional de K-ras positivo.
Figura 66. Ejemplo gráfico de un paciente con análisis mutacional de K-ras negativo.
Figura 67. Ejemplo gráfico de un paciente con análisis mutacional de K-ras positivo.
252
RESULTADOS
En la tabla 54 se muestran los resultados del análisis de mutaciones K-ras
para la detección de siete mutaciones somáticas del oncogén K-ras en las
secciones de tejido de las lesiones pancreáticas y extrapancreáticas junto con
el diagnóstico anatomopatológico de cada una de las mismas en pacientes con
PAI, sospecha de PAI y PCI.
De los 6 pacientes con PAI, en 4 el análisis mutacional de K-ras fue negativo
a nivel de páncreas (diagnóstico anatomopatológico: Pancreatitis crónica, en
los 4 pacientes), y a nivel de vesícula biliar en uno de ellos (diagnóstico
anatomopatológico: Colecistitis crónica). En los 2 pacientes restantes el análisis
mutacional de K-ras fue positivo, en uno de ellos se detectó la mutación
Gly12Ser a nivel del páncreas (diagnóstico anatomopatológico: Pancreatitis
crónica y heteropia pancreática pseudotumoral en la pared duodenal), y en el
otro la mutación Gly12Ser a nivel de páncreas (diagnóstico anatomopatológico:
Adenocarcinoma). En el primero de ellos, diagnosticado con PAI en el 2002 a la
edad de 12 años, el estudio de K-ras fue realizado en una muestra de biopsia
pancreática realizada al diagnóstico. Los niveles de IgG4 fueron siempre
inferiores a 135 mg/dl. A pesar del diagnóstico de PAI, no se instauró el
tratamiento esteroideo por la negativa del paciente. Hasta el momento actual,
no ha desarrollado ninguna neoplasia maligna ni en páncreas ni en ningún
tejido extrapancreático. En el segundo de ellos, diagnosticado con PAI en
enero del 2009 a la edad de 77 años, el estudio de K-ras fue realizado en una
muestra de biopsia pancreática realizada al diagnóstico y en otra tomada 6
meses después del comienzo del tratamiento esteroideo. En este paciente,
los niveles séricos de IgG4 al diagnóstico fueron extremadamente
253
RESULTADOS
TABLA 54 . Analisis mutacional de K-ras
Px Diagnóstico Muestra: Diagnóstico Anatomopatológico Mutaciones K-Ras
1 PAI Páncreas: Pancreatitis crónica Negativo
2 PAI Páncreas: Pancreatitis crónica Negativo
3 PAI Vesícula biliar: Colecistitis crónica
Páncreas: Pancreatitis crónica
Negativo
Negativo
4 PAI Páncreas: Pancreatitis crónica Negativo
5 PAI Páncreas: Pancreatitis crónica 12SER
6 PAI Páncreas al diagnóstico: Pancreatitis crónica
Páncreas post-tratamiento: Adenocarcinoma
Negativo
12ASP
7 Sospecha PAI
Vesícula biliar: Colecistitis crónica Negativo
8 Sospecha PAI
Papila duodenal: Inflamación crónica Negativo
9 Sospecha PAI
Páncreas: Pancreatitis crónica 12VAL
10 PCI Vesícula biliar: Colecistitis crónica 12ASP
11 PCI Páncreas: Pancreatitis crónica Negativo
elevados, de 4500 mg/dl. El tratamiento esteroideo fue instaurado
inmediatamente después de realizar el diagnóstico, conduciendo a remisión
clínica, serológica y radiológica al cabo de un mes. Sin embargo tras 6 meses
de tratamiento, el paciente desarrolló colangitis y las biopsias a nivel de
páncreas y de vesícula biliar demostraron la existencia de adenocarcinoma en
ambos tejidos. El estudio de K-ras fue negativo en la biopsia pancreática al
diagnóstico, sin embargo, fue positivo en la muestra tomada 6 meses después
del comienzo del tratamiento esteroideo.
254
RESULTADOS
De los 3 pacientes con sospecha de PAI, en 2 el análisis mutacional de
K-ras fue negativo a nivel de vesícula biliar (diagnóstico anatomopatológico:
Colecistitis crónica) y papila duodenal (Alteraciones anatomopatológicas:
Inflamación crónica), respectivamente. En el paciente restante, el análisis
mutacional de K-ras fue positivo para 12VAL a nivel del páncreas (diagnóstico
anatomopatológico: Pancreatitis crónica). En este paciente, diagnosticado con
pancreatitis crónica en 1994 y con sospecha alta de PAI, el estudio de K-ras
fue realizado en una muestra de biopsia pancreática realizada en 1998. En
este paciente, los niveles séricos de IgG4 han sido siempre inferiores a135
mg/dl. No se ha instaurado el tratamiento esteroideo debido a la ausencia de
diagnóstico confirmatorio de PAI. Hasta el momento actual, no ha desarrollado
ninguna neoplasia maligna ni en páncreas ni en ningún tejido extrapancreático.
De los 2 pacientes con PCI, en uno de ellos el análisis mutacional de K-ras
fue negativo a nivel de páncreas (diagnóstico anatomopatológico: Pancreatitis
crónica), mientras que en el otro fue positivo para 12ASP a nivel de vesícula
biliar (diagnóstico anatomopatológico: Colecistitis crónica). En este paciente se
diagnostica una colangitis de repetición en el 2000 y una PCI en el 2005. El
estudio de K-ras fue realizado en una muestra de vesícula biliar realizada en
2000. En este paciente los niveles séricos de IgG4 han sido siempre inferiores
a 135 mg/dl. No se ha instaurado el tratamiento esteroide debido a la ausencia
de diagnóstico confirmatorio de PAI. Hasta el momento actual, no ha
desarrollado ninguna neoplasia maligna ni en páncreas ni en ningún tejido
extrapancreático.
255
DDIISSCCUUSSIIÓÓNN
55555555........ DDDDDDDDIIIIIIIISSSSSSSSCCCCCCCCUUUUUUUUSSSSSSSSIIIIIIIIÓÓÓÓÓÓÓÓNNNNNNNN
256
257
DISCUSIÓN
5. DISCUSIÓN
La PAI representa un tipo de enfermedad inflamatoria crónica, con un
diagnóstico diferencial frente a otras enfermedades pancreáticas,
principalmente el cáncer de páncreas, complicado. Esta situación es debida a
la ausencia de una única prueba diagnóstica, al desconocimiento del espectro
clínico completo y a la falta de consenso internacional en los criterios
diagnósticos de la PAI. En consecuencia, el número de pacientes
diagnosticados erróneamente de PAI ,y a la inversa, ha ido incrementando en
los últimos años. Con el fin de minimizar esta situación, uno de los objetivos de
esta tesis ha sido realizar una caracterización lo más detallada posible de los
pacientes desde el punto de vista clínico, histológico y serológico para
establecer una batería de ensayos que permitan llegar al diagnóstico de la PAI
con la mayor precisión posible.
La asociación entre autoinmunidad y linfomagénesis es conocida desde hace
más de 50 años. Se ha encontrado un incremento significativo del riesgo de
linfomas malignos en numerosas enfermedades autoinmunes, principalmente
en el síndrome de Sjögren primario (SSp) [292-293]. En este sentido, se ha
sugerido que los pacientes con expansión clonal de células B a nivel de
glándulas salivares presentan un riesgo elevado de desarrollar linfomas [383-
385]. Aunque el mecanismo de linfomagénesis en pacientes con enfermedades
autoinmunes se desconoce, la inflamación crónica y la activación persistente
de células B autorreactivas se han propuesto como factores de riesgo biológico
claves. Hay hipótesis que sugieren que cada uno de esos dos mecanismos
podría conducir a diferentes tipos de linfomas [313]. La actividad inflamatoria
258
DISCUSIÓN
crónica podría desencadenar linfomas no localizados, como los linfomas de
células B grandes difusos [311]. En contraste, la estimulación a largo plazo de
células B autorreactivas podría ser más relevante en la linfomagénesis en
enfermedades autoinmunes órgano-específicas, como por ejemplo el desarrollo
del linfoma de células B de la zona marginal en glándulas salivares activadas
en el SSp [316, 317]. En la patogénesis de la PAI se han implicado tanto un
componente inflamatorio crónico como la activación persistente de células B
autorreactivas. En consecuencia el desarrollo de linfomas en la PAI podría
ocurrir mediante ambos mecanismos. Para estudiar el riesgo de linfomagénesis
en la PAI, se ha analizado la clonalidad de células B en los infiltrados
linfoplasmociticos presentes en lesiones pancreáticas y extrapancreáticas de
estos pacientes. Adicionalmente como los linfocitos B circulantes además de
presentar una activación policlonal persistente (demostrada por la
producción de autoanticuerpos o la presencia de hipergammaglobulinemia
policlonal), podrían presentar un componente oligoclonal/monoclonal, se ha
evaluado la presencia de inmunoglobulinas monoclonales circulantes en los
pacientes con PAI. La presencia de inmunoglobulinas monoclonales circulantes
ha sido considerada como un estadio intermedio en la transición entre la
autoinmunidad y procesos linfoproliferativos malignos de células B
(principalmente el mieloma múltiple y los linfomas B) [386]. Estos, a su vez,
podrían haber evolucionado a partir de un precursor benigno (la gammapatía
monoclonal de significado incierto y el pseudolinfoma, respectivamente). En
este sentido, es necesario mencionar que la existencia de monoclonalidad no
implica necesariamente el desarrollo de un proceso linfoproliferativo maligno
259
DISCUSIÓN
[387-389]. En consecuencia es importante la caracterización y el seguimiento
de la presencia de inmunoglobulinas monoclonales circulantes, ya que se
puede considerar como un marcador temprano de malignidad [389]. Como en
muchos casos es complicado diferenciar entre un proceso linfoproliferativo
benigno y maligno, los análisis moleculares junto con el cuadro clínico concreto
de cada paciente, podrían ayudar a decidir cuando un proceso linfoproliferativo
benigno en la PAI, una gammapatía monoclonal de significado incierto (MGUS)
o un pseudolinfoma, evolucionará hacia malignidad, un mieloma múltiple o un
linfoma, respectivamente.
El análisis de la distribución de las subpoblaciones de células B periféricas
se ha realizado en numerosas enfermedades autoinmunes sistémicas, como la
AR, el LES y el SSp. Todos los datos sugieren que estas enfermedades,
caracterizadas por la estimulación crónica de las células B, presentan una
distribución única de las subpoblaciones de células B [390-395]. En
consecuencia el repertorio de células B periféricas en cada una de las
enfermedades autoinmunes y en las diferentes situaciones clínicas, podría
constituir un reflejo parcial de la diferenciación, activación, selección, migración
y recirculación de las mismas desde numerosos compartimentos, incluidos los
tejidos diana inflamados [396]. Hasta el momento actual, no se ha realizado
ningún estudio sobre la distribución de las subpoblaciones de células B en la
PAI. Como las células B desempeñan un papel importante en la patogénesis y
evolución de la PAI, hemos estudiado la distribución de las subpoblaciones de
células B periféricas con el fin de evaluar las alteraciones de las mismas en PAI.
260
DISCUSIÓN
En los últimos años se ha descrito el desarrollo de cáncer de páncreas en
pacientes con PAI, de forma simultánea o durante el seguimiento de la
enfermedad [397-399]. Para evaluar el riesgo de cáncer páncreas y de otros
órganos afectados en nuestra serie de pacientes con PAI, hemos realizado el
análisis mutacional del oncogén K-ras en los tejidos pancreáticos y
extrapancreáticos de los pacientes con PAI, ya que las mutaciones en K-ras
se han encontrado en más de un 90% de los adenocarcinomas de páncreas
[400, 401].
5.1. Utilidad diagnóstica de los marcadores serológ icos en la PAI
Actualmente no existe ningún marcador serológico que sea totalmente
específico de la PAI, en consecuencia, el diagnóstico se hace en base a la
presencia de la combinación de una serie de alteraciones clínicas, serológicas
e histopatológicas características de la enfermedad. Sin embargo, el
desconocimiento de su espectro clínico completo y la falta de consenso
internacional en los criterios diagnósticos, ha llevado en muchos casos a
diagnósticos erróneos. En esta tesis doctoral se ha buscado una batería de
ensayos serológicos que permita llegar al diagnóstico de la PAI con la mayor
precisión posible.
Este estudio se ha centrado en el análisis de tres marcadores serológicos,
los niveles séricos elevados de IgG4 (>135 mg/dl), los anticuerpos anti-AC II y
los anticuerpos anti-AMY α en pacientes con PAI y con otras enfermedades
pancreáticas, incluyendo la pancreatitis crónica, pancreatitis crónica idiopática
(PCI), pancreatitis aguda y cáncer de páncreas. La PCI se puede definir como
una forma de pancreatitis crónica de etiología desconocida, donde se han
261
DISCUSIÓN
descartado como agentes causales el alcoholismo, la presencia de piedras o la
autoinmunidad [375, 376]. Los dos primeros marcadores se han empleado
tradicionalmente en el diagnóstico de la PAI, aunque ambos se consideran
marcadores inespecíficos de la enfermedad [32, 204-208, 223, 230, 231].
Mientras que los anticuerpos anti-AMY α han surgido recientemente como los
marcadores serológicos más sensibles de la PAI [33].
En el presente estudio, la prevalencia de los niveles séricos elevados de
IgG4, los anticuerpos anti-AC II y los anticuerpos anti-AMY α fue
significativamente mayor en los pacientes con PAI (58%, 83% y 83%,
respectivamente) que en el resto de grupos de pacientes analizados. Cabe
destacar que un porcentaje apreciable de pacientes con PCI, presentaron estos
tres marcadores (8%, 50% y 31%, respectivamente). Esta situación podría
deberse a que en algunos casos la PCI representaría una forma de PAI oculta,
es decir, una forma de presentación atípica que no se ajusta por completo a los
criterios diagnósticos actuales de la PAI. Se podría establecer un cierto
paralelismo entre este hecho y lo que ocurre en la enfermedad celiaca que se
considera una enfermedad infradiagnosticada debido a la existencia de formas
de presentación atípicas, como la silente, la latente y la potencial; que tampoco
se ajustan con la enfermedad celiaca activa clásica.
Dada la importancia de diferenciar entre la PAI y el cáncer de páncreas, se
ha comparado la presencia de los tres marcadores serológicos entre pacientes
con PAI aislada, PAI con cáncer de páncreas y cáncer de páncreas aislado.
Los tres marcadores estaban presentes en la mayoría de los pacientes con
PAI, especialmente, en aquellos que desarrollaron cáncer durante el
262
DISCUSIÓN
seguimiento de la enfermedad. En pacientes con cáncer de páncreas aislado,
los niveles séricos elevados de IgG4 y los anticuerpos anti-AC II se detectaron
en un 14% y un 29% de los pacientes, respectivamente; mientras que los
anticuerpos anti-AMY α no se encontraron en ninguno de ellos. Como los anti-
AMY α no se detectaron en ninguno de los pacientes con cáncer de páncreas,
podrían constituir una herramienta útil para realizar el diagnóstico diferencial
entre ambas enfermedades. Aunque este hecho no descarta la posibilidad de
desarrollo de cáncer de páncreas en pacientes con PAI, de echo en nuestra
serie de pacientes, un 75% (4 de 14) desarrollaron cáncer de páncreas durante
el curso de la enfermedad. En este sentido, dado que la frecuencia de los tres
marcadores serológicos fue mayor en los pacientes con PAI y cáncer de
páncreas (100%, 100% y 75%, respectivamente) que en aquellos con PAI
aislada (75%, 75% y 55%, respectivamente), la coexistencia de niveles séricos
de IgG4 persistentemente elevados con los anticuerpos anti-AC II y AMY α en
pacientes con PAI podría constituir un factor de riesgo para el desarrollo de
cáncer de páncreas.
En el análisis del valor diagnóstico de cada uno de los marcadores
serológicos, los anticuerpos anti-ACII y los anticuerpos anti AMY α presentaron
la mayor sensibilidad y VPN, aunque los anticuerpos anti AMY α fueron más
específicos, mientras que el VPP fue bastante bajo en ambos. Los niveles
elevados de IgG4 presentaron la mayor especificidad y VPP, aunque con
menor sensibilidad. En el presente estudio, la especificidad de los niveles
elevados de IgG4 fue similar a la obtenida por Hamano et al [113] y Ghazale et
263
DISCUSIÓN
al [204], mientras que sensibilidad fue menor (58% vs 95% y 75%
respectivamente). Una posible explicación de estas discrepancias podría ser
que alguno de nuestros pacientes presentara la PAI tipo 2, en vez de la forma
de presentación típica, la PAI tipo 1; ya que esta forma no se asocia con
niveles elevados de IgG4 en suero [172, 173]. Desgraciadamente en nuestros
pacientes no se realizó el estudio histológico, que se considera el único
parámetro que permite diferenciar entre la PAI tipo 1 y tipo 2. De acuerdo con
los estudios de Hosoda et al [283], se ha obtenido una sensibilidad mayor para
los anticuerpos anti-AC II. Sin embargo mientras que en el presente estudio los
anticuerpos anti-AC II se detectaron en un 29% de los pacientes con cáncer de
páncreas, en el de Hosoda et al [283] no se observaron en ninguno de ellos. En
consecuencia, mientras que estos autores concluyeron que los anticuerpos
anti-AC II constituían una herramienta útil para realizar el diagnóstico
diferencial entre la PAI y el cáncer de páncreas, los resultados del presente
estudio no permiten hacer la misma afirmación. En el presente estudio se ha
obtenido la misma sensibilidad para los anticuerpos anti-AMY α y anti-AC II
(83%), sin embargo la especificidad fue mayor para los anticuerpos anti-AMY α
(89%) que para los anticuerpos anti-AC II (75%). En consecuencia, de acuerdo
con los estudios de Endo et al [33], se ha postulado que los anticuerpos anti-
AMY α podrían constituir un marcador más útil para el diagnóstico de la PAI
que los anticuerpos anti-AC II.
Por último, en el análisis del valor diagnóstico de la combinación de los tres
marcadores serológicos, se ha observado un descenso de la sensibilidad a un
264
DISCUSIÓN
50%, como era de esperar, mientras que la especificidad y el valor predictivo
positivo aumentaron hasta un 99% y un 86%, respectivamente.
En conclusión, los dos marcadores serológicos empleados tradicionalmente
en la PAI, los niveles elevados de IgG4 y los anticuerpos anti-AC II, a pesar de
su buena sensibilidad, no se pueden considerar completamente específicos de
la PAI, ya que se pueden detectar en pacientes con otras enfermedades
pancreáticas y no pancreáticas, esta situación supone un problema importante,
ya que puede llevar a diagnósticos erróneos, principalmente del cáncer de
páncreas como PAI. En este sentido se ha estimado que cerca de un 10% de
pacientes con cáncer de páncreas presentan niveles elevados de IgG4. En
consecuencia es esencial tener en cuenta que los niveles séricos elevados de
IgG4 por sí solos no son suficientes para realizar el diagnóstico de la PAI [193].
Con respecto a los anticuerpos AC II, aunque fueron propuestos por Hosoda et
al [283] como una herramienta útil para diferenciar entre la PAI y el cáncer de
páncreas, nuestros datos no indican lo mismo. Combinado estos dos
marcadores con los anticuerpos anti-AMY α, se consiguió aumentar
notablemente la especificidad (99%), a espensas de una moderada sensibilidad.
Por tanto, en nuestra opinión, la combinación de los tres marcadores
serológicos constituye una herramienta útil para realizar el diagnóstico
diferencial entre la PAI y otras enfermedades pancreáticas, principalmente el
cáncer de páncreas.
265
DISCUSIÓN
5.2. Utilidad de la IgG y la IgG4 en el diagnóstico de la PAI
La IgG y la IgG4 se encuentran elevadas en el suero de un porcentaje
elevado de pacientes con PAI [6, 113]. Sin embargo no existe un consenso
internacional acerca de cuales son valores de punto de corte de los niveles
séricos de la IgG y la IgG4 que deben de emplearse en el diagnóstico de la PAI.
En el presente estudio se ha comparado la sensibilidad y especificidad
diagnóstica de los niveles séricos elevados de la IgG y la IgG4, por encima
de los valores de punto de corte empleados rutinariamente en nuestro
laboratorio (1200 mg/dl y 130 mg/dl, respectivamente), con las obtenidas con
los valores de puntos de corte óptimos calculados mediante un análisis basado
en curvas ROC.
Cuando se empleó el valor de punto de corte rutinario para la IgG (1200
mg/dl), se obtuvo una sensibilidad de un 57% y una especificidad de un 84%,
mientras que con el valor de punto de corte óptimo (1496 mg/dl) se obtuvo una
mayor sensibilidad (96%) e idéntica especificidad. Según los criterios
diagnósticos Japoneses los niveles de IgG deberían de ser superiores a 1800
mg/dl [264], mientras que en un estudio coreano [208] se obtuvo un valor de
punto de corte ligeramente menor (1770 mg/dl). En este caso la sensibilidad y
especificidad fueron de un 57,1% y un 93,7%, respectivamente. Estos datos
contrastan con el valor obtenido en el presente estudio, bastante inferior a los
descritos en la bibliografía (1496 mg/dl). Sin embargo, la especificidad fue la
misma a la obtenida en el estudio coreano [208], mientras que la especificidad
fue mayor. Por tanto debido a la heterogeneidad en los valores de punto de
corte establecidos en las distintas series de pacientes, cada
266
DISCUSIÓN
laboratorio debería de establecer su propio valor de punto de corte para los
niveles de IgG en el diagnóstico de la PAI.
Cuando se empleó el valor de punto de corte rutinario para la IgG4 (130
mg/dl), se obtuvo una sensibilidad de un 64% y una especificidad de un 93%,
mientras que con el valor de punto de corte óptimo (137 mg/dl) se obtuvo una
sensibilidad ligeramente mayor (94%) e idéntica especificidad. El valor de punto
de corte de los niveles séricos de IgG4 comúnmente aceptado es de 135
mg/dl [113, 204, 266]. En la Clínica Mayo [78] emplean un valor de punto de
corte de 140 mg/dl, mientras que en un estudio coreano [208] obtuvieron un
valor ligeramente superior (141 mg/dl). En este caso la sensibilidad y
especificidad fueron de un 73,3% y un 95,1%, respectivamente. En el presente
estudio se ha obtenido un valor intermedio (137 mg/dl), aunque tanto la
sensibilidad como la especificidad fueron inferiores a las obtenidas en el
estudio coreano [208] (64% y 94%, respectivamente). Como todos los valores
de punto de corte se encuentran muy próximos, debería emplearse como valor
de punto de corte para los niveles de IgG4 en el diagnóstico de la PAI, el
aceptado por la mayoría de los grupos (135 mg/dl).
5.3. Niveles séricos de IgG4 y afectación extrapan creática
La afectación extrapancreática es frecuente en los pacientes con PAI,
principalmente del tracto biliar, vesícula biliar, hepática, retroperitoneal, de
nódulos linfoides y de glándulas salivares [63]. Generalmente, tanto el
páncreas como los otros órganos afectados en la PAI presentan una densa
infiltración con numerosas células plasmáticas IgG4+ [6, 152]. Adicionalmente,
la PAI está relacionada con niveles elevados en suero de IgG4. Estos hallazgos
267
DISCUSIÓN
sugieren que la IgG4 podría desempeñar un papel en la patogénesis de la
enfermedad.
En el presente estudio se ha estudiado el grado de afectación
extrapancreática en pacientes con PAI, sospecha de PAI y pancreatitis crónica
idopática (PCI) y se ha correlacionado con los niveles séricos de IgG4, con el
fin de evaluar su posible implicación en la PAI.
Los niveles séricos de IgG4 estuvieron elevados por encima del valor de
punto de corte de nuestro laboratorio (130 mg/dl) en un 64%, 11% y 17% de los
pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente. Mientras que la
afectación extrapancreática se encontró en un 57%, 11% y 8% de los pacientes
con PAI, sospecha de PAI y PCI, respectivamente. Cabe destacar la presencia
tanto de niveles elevados de IgG4 como de afectación extrapancreática en un
subgrupo de pacientes con PCI. Este hecho, apoya la hipótesis planteada
anteriormente, la existencia de una forma de presentación atípica de PAI en un
subgrupo de pacientes con PCI.
Mediante un análisis basado en curvas ROC, los valores de punto de corte
óptimo de los niveles séricos de IgG y de IgG4 para diferenciar entre pacientes
sin y con afectación extrapancreática, fueron de 1600 mg/dl y 190 mg/dl,
respectivamente. En consecuencia, los pacientes con niveles séricos de IgG y
de IgG4 superiores a 1600 mg/dl y a 190 mg/dl, respectivamente son más
propensos a presentar afectación extrapancreática. Todo ello podría indicar
que estos pacientes presentan un estado más activo de la enfermedad que
aquellos con niveles inferiores. En contraste, Kamisawa et al [30], obtuvieron
un valor de punto de corte bastante superior (220 mg/dl) en los niveles
268
DISCUSIÓN
séricos de IgG4, para diferenciar entre pacientes sin y con afectación
extrapancreática. Esta discrepancia podría deberse a que en el estudio de
Kamisawa et al [30] se incluyeron únicamente pacientes con diagnóstico
confirmado de PAI, mientras que en el presente estudio se incluyeron otros
dos grupos, los pacientes con sospecha de PAI y PCI, dentro de los cuales
podría haber pacientes con y sin PAI.
Dentro del grupo de pacientes con PAI, un 50% presentaron niveles de IgG4
superiores al punto de corte establecido para la IgG4 (190 mg/dl), todos ellos
con afectación extrapancreática; mientras que el otro 50% presentaron niveles
inferiores, de los cuales tan sólo un 14% tuvo afectación extrapancreática. No
se encontraron diferencias significativas en edad, sexo y síntomas entre estos
dos subgrupos, mientras que el grado de afectación extrapancreática fue
significativamente mayor en los pacientes con niveles de IgG4 superiores a 190
mg/dl. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Kamisawa et al [30],
que tampoco encontraron diferencias demográficas ni clínicas entre los
pacientes con niveles de IgG4 inferiores y superiores al valor de punto de corte
establecido y que también observaron un aumento significativo de las lesiones
extrapancreáticas en el grupo de pacientes con niveles séricos de IgG4
elevados. En contraste Ghazale et al [204] compararon los pacientes con PAI
con niveles séricos de IgG4 inferiores y superiores a 140 mg/dl, y observaron
que los primeros eran más jóvenes, con más probabilidad de ser mujeres y con
menor tendencia a presentar afectación extrapancreática, aunque no
encontraron diferencias en los síntomas. En base a estos hallazgos estos
autores sugirieron que este grupo de pacientes presentaban la variante
269
DISCUSIÓN
histológica de PAI descrita recientemente, la PAI tipo 2 o pancreatitis idiopática
ductulo-céntrica, ya que suele presentarse en pacientes de menor edad y con
menor propensión a presentar niveles séricos de IgG4 elevados y afectación
extrapancreática [154]. En consecuencia, los resultados del presente estudio
no permiten afirmar lo mismo; ya que no se encontraron diferencias en la edad,
sexo y síntomas entre ambos grupos y tampoco se disponía del estudio
histológico para confirmarlo. Sin embargo, de acuerdo con los estudios de
Kamisawa et al [30] y Ghazale el al [204] se ha encontrado un mayor grado de
afectación extrapancreática. En conclusión, la IgG4 parece guardar una
asociación con la actividad de la PAI, ya que los pacientes con niveles
séricos de IgG4 superiores a 190 mg/dl son más propensos a presentar
afectación extrapancreática y, además, en mayor grado.
5.4. Características clínicas de los pacientes
La PAI se suele presentar en varones de más de 50 años de edad [8, 54]. De
acuerdo con esta afirmación, el valor de la mediana de la edad de nuestra serie
de pacientes con PAI fue de 60,5 años (rango: 16-78 años) y el ratio
masculino:femenino de 12:2. En nuestras serie de pacientes con sospecha de
PAI y con PCI, los valores de la mediana de la edad también estuvieron por
encima de los 50 años; 51 años (rango: 37-84 años) y 61 años (rango: 31-91
años), respectivamente. En contraste, se diagnosticó un mayor número de
mujeres con sospecha de PAI y PCI (ratio masculino:femenino, 5:4 y 17:5,
respectivamente).
Las manifestaciones clínicas de la PAI son diversas, generalmente se
presenta como ictericia obstructiva sin dolor acompañada de aumento difuso
270
DISCUSIÓN
del páncreas, en un 70-80% de los pacientes [7, 56]. Otras manifestaciones
menos comunes son el dolor abdominal, la pérdida de peso o la diabetes
mellitus de establecimiento reciente, en un 10-50% de los pacientes [56]. En
raras ocasiones los pacientes se encuentran asintomáticos al diagnóstico, en
menos de un 10% [56]. La presentación aguda de la PAI con ictericia
obstructiva y agrandamiento del páncreas o con pérdida de peso acompañada
de diabetes mellitus (DM) puede mimetizar la forma de presentación del
cáncer de páncreas [54, 66, 67]. En nuestra serie de pacientes con PAI,
el síntoma de presentación más común fue el dolor abdominal (64%), seguido
de la ictericia obstructiva sin dolor (22%) y de la forma asintomática (14%).
Estos resultados contrastan claramente con los descritos en la bibliografía. En
este sentido, tanto en la serie japonesa [269] como en la de la Clínica Mayo
[204] y la coreana [416], el síntoma de presentación más común fue la ictericia
obstructiva sin dolor (81%, 73% y 65%, respectivamente), seguido de pérdida
de peso (sin datos, 49% y 35%, respectivamente) y dolor abdominal (22%, 33%
y 35%, respectivamente). Esta discrepancia podría ser consecuencia de la
influencia de factores ambientales y genéticos, diferentes en cada área
geográfica, sobre las manifestaciones clínicas de la enfermedad.
Adicionalmente, en nuestras serie de pacientes con sospecha de PAI y con PCI,
el síntoma de presentación más común también fue el dolor abdominal (64% y
95%, respectivamente), mientras que la ictericia obstructiva sin dolor no se
presentó en ninguno de los pacientes de ambos grupos.
La PAI suele asociarse con la presencia de diabetes mellitus (DM), como
consecuencia del desarrollo de alteraciones en el páncreas endocrino [73, 74].
271
DISCUSIÓN
En este sentido, la DM se ha descrito al diagnóstico de la PAI en un
50% de los pacientes [15, 76]. De acuerdo con esta afirmación la DM se
presentó en un 43% de los pacientes con PAI, mientras que en los pacientes
con sospecha de PAI y PCI, la frecuencia de DM fue mucho menor (11% y 21%,
respectivamente).
Como se comentó anteriormente, la PAI suele asociarse con la presencia
lesiones extrapancreáticas. En nuestra serie de pacientes con PAI, la
frecuencia de afectación extrapancreática fue de un 57%. Este dato se
aproxima bastante a los obtenidos en otras series de pacientes con PAI, en la
serie japonesa [30] y en la de la Clínica Mayo [204] la frecuencia de afectación
extrapancreática fue de un 55% y de un 64%, respectivamente. Adicionalmente,
las lesiones extrapancreáticas se pueden presentar en un único órgano o en
entre 2 y 4 órganos [63]. En este sentido, un 38%, 25%, 25% y 12% de los
pacientes con PAI y lesiones extrapancreáticas presentaron 1, 2, 3 y 4 órganos
afectados, respectivamente.
Las manifestaciones extrapancreáticas también son muy diversas y se
pueden presentar simultáneamente a las pancreáticas, precederlas u ocurrir
muchos años después. La afectación extrapancreática más común es la del
tracto biliar (>60%), también puede existir afectación de vesícula biliar (30%),
de glándulas salivares, retroperitoneal, de mesenterio, gastrointestinal, renal,
pulmonar y de próstata, etc [58-65]. Estos datos contrastan con los obtenidos
en el presente estudio, ya que los dos órganos afectados con mayor frecuencia
en nuestra serie de pacientes con PAI y afectación extrapancreática (57% de
los pacientes con PAI), fueron la vesícula biliar y la próstata (62% en ambos
272
DISCUSIÓN
casos), mientras que el tracto biliar estuvo afectado tan sólo en un 25%.
Adicionalmente, en los pacientes con sospecha de PAI el tracto biliar estuvo
afectado en el único paciente con afectación extrapancreática, mientras que en
los pacientes con PCI, dos pacientes presentaron afectación extrapancreática,
uno de vesícula biliar y otro de próstata.
5.5. Niveles de CA 19.9 y anticuerpos anti-CA 19.9 en la PAI
El antígeno carbohidrato CA 19.9 está presente en muchos tejidos fetales,
incluyendo las glándulas lacrimales y salivares, vías respiratorias y tracto
gastrointestinal. En los adultos sigue expresándose en el epitelio de los
conductos pancreáticos y glándulas salivares, mucosa de vesícula biliar y
epitelio del endocérvix. El CA 19.9 es un marcador tumoral empleado en la
detección y seguimiento de tumores gastrointestinales de origen epitelial,
especialmente el adenocarcinoma de páncreas. La especificidad y sensibilidad
del CA 19.9 en la detección del cáncer de páncreas dentro de una población de
alto riesgo es de un 70-90% y un 90% respectivamente [402]. Sin embargo, su
principal limitación es que puede elevarse en pacientes con ictericia obstructiva
no maligna (por ejemplo, por pancreatitis, colelitiasis, colestasis, cirrosis,
hepatitis, etc). Adicionalmente, puede encontrase elevado en ciertas
enfermedades autoinmunes, como la PAI, el SS, el LES, la esclerosis sistémica
y la AR [403-405]. En este sentido, se ha hipotetizado que el CA 19.9 a
través de sus motivos carbohidratos puede actuar como molécula de adhesión
contribuyendo a perpetuar la inflamación y desempeñar un papel patogénico.
Por ejemplo los niveles elevados de CA 19.9 se han correlacionado con la
afectación renal en el LES [406]. En los pacientes con PAI, el CA 19.9
273
DISCUSIÓN
podría elevarse como consecuencia de la presencia de ictericia obstructiva,
como un factor de riesgo de adenocarcinoma de páncreas, o por su posible
papel patogénico en la enfermedad. Con el fin de evaluar estas situaciones, se
han analizado los niveles séricos de CA 19.9 en nuestra serie de pacientes
con PAI.
En la patogénesis de la PAI, se ha postulado que la alteración antigénica en
las células ductales y acinares del páncreas podría desencadenar una reacción
autoinmunitaria, como el desarrollo de los anticuerpos frente a la anhidrasa
carbónica II, expresada en células epiteliales ductales del páncreas [31, 33].
En este sentido, dada la expresión del antígeno CA 19.9 en el epitelio de los
conductos pancreáticos, se ha analizado la existencia de anticuerpos frente al
CA 19.9 en el suero de los pacientes con PAI.
En el presente estudio los niveles de CA 19.9 estuvieron elevados en 4 de
de los 12 pacientes con PAI (33%) y en 4 de los 24 de los pacientes (17%) con
PCI, mientras que ninguno de los pacientes con sospecha de PAI presentaron
niveles aumentados de CA 19.9. La presencia simultánea de cáncer de
páncreas explicaría esta elevación en dos de los pacientes con PAI, mientras
que en los dos restantes la causa podría ser la propia enfermedad autoinmune,
ya que no se encontró una relación significativa entre los niveles aumentados
de CA 19.9 y la presencia de ictericia en los pacientes con PAI. En los
pacientes con PCI, la presencia simultánea de adenocarcinoma gástrico
explicaría esta elevación en uno de ellos, mientras que en los tres restantes la
causa podría ser la presencia de un proceso autoinmune subyacente, ya que
tampoco se encontró una relación significativa entre los niveles aumentados de
274
DISCUSIÓN
CA 19.9 y la presencia de ictericia en los pacientes con PCI. Sin embargo, no
se ha encontrado ninguna relación entre el aumento de los niveles de CA 19.9
con la elevación en suero de la IgG4 (implicada en la patogénesis de la PAI) ni
tampoco con la presencia de afectación extrapancreática (indicador de
enfermedad más activa ). En consecuencia la elevación del CA 19.9 en los
pacientes con PAI y PCI en unos casos sería resultado de la coexistencia de la
enfermedad con un fenómeno tumoral y en otros de su papel patogénico en el
proceso inflamatorio de la PAI, aunque no se ha podido demostrar su relación
con la actividad de la enfermedad.
Con respecto a los anticuerpos anti-CA 19.9, se han encontrado en una
frecuencia elevada en pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI (57%, 43% y
35%, respectivamente). Sin embargo, aunque prácticamente no se han
detectado en individuos sanos, se han observado en un porcentaje alto de
pacientes con otras enfermedades pancreáticas. En este sentido, la
sensibilidad, la especificidad, el VPP y el VPN de la presencia de anticuerpos
anti-CA 19.9 para el diagnóstico de la PAI fue de un 57%, 69%, 14% y 95%,
respectivamente. En conclusión, en el presente estudio se ha estudiado un
posible marcador serológico de la PAI el cual, debido a su baja sensibilidad y
especificidad, tiene una utilidad limitada en el diagnóstico diferencial de la PAI
con otras enfermedades pancreáticas.
5.6. Subpoblaciones linfocitarias en la PAI
En el presente estudio, las principales alteraciones en las subpoblaciones
linfocitarias consistieron en un descenso en la frecuencia de linfocitos B y en un
incremento de células Nk, presentes en un 50% y 40% de los pacientes con
275
DISCUSIÓN
PAI. Adicionalmente, la linfocitopenia B también se observo en pacientes con
sospecha de PAI y PCI (40% y 23%, respectivamente), y el incremento de
células Nk en un 15% de los pacientes con PCI, mientras que ninguno de los
pacientes con sospecha de PAI presentó esta alteración.
En este sentido, la linfocitopenia B también se ha descrito en pacientes con
LES, mientras que no suele presentarse en pacientes con SSp o AR [407, 408].
En contraposición, se ha descrito un descenso en la frecuencia de células
Nk en numerosas enfermedades autoinmunes, como la esclerosis sistémica,
AR, diabetes mellitus tipo 1, SS y miastenia gavis [408-412]. Se ha sugerido
que las células Nk podrían desempeñar un papel patogénico o protector en
función de las condiciones de una misma enfermedad autoinmune [413-416].
En el presente estudio, el porcentaje de células Nk fue significativamente
mayor en los pacientes con afectación extrapancreática (27%) que en aquellos
sin afectación extrapancreática (16%) (P = 0,028). En consecuencia el
incremento de células Nk en los pacientes con PAI podría estar implicado
en la progresión de la enfermedad, ya que la presencia de lesiones
extrapancreáticas estaría indicando una enfermedad más activa.
Adicionalmente, la presencia de ambas alteraciones, tanto en pacientes con
PAI como en pacientes con PCI, continúa confirmando la existencia de una
forma atípica de PAI dentro de este grupo de pacientes con PCI.
5.7. Subpoblaciones de células B en la PAI
En el análisis de la distribución en sangre de las subpoblaciones de células B
en los pacientes con PAI, las células transicionales, pre-naive y naive
estuvieron dentro de los rangos normales, mientras que se observó la
276
DISCUSIÓN
expansión tanto de células B memoria totales (mediana: 42,5%, rango normal:
22-39%) como de células plasmáticas (mediana: 1,8%, rango normal: 0,5-
1,4%). Dentro de las células B memoria, se encontró un descenso de las
células B CD27+IgD+ (unswitched) y un incremento de las CD27-IgD- (dobles
negativas), mientras que las CD27+IgD- (switched) estuvieron dentro del
rango normal. Dentro de las células plasmáticas, se observó un incremento
tanto de las células B 138+ como de las células B 138- . En contraste, en los
pacientes con sospecha de PAI la mayoría de las subpoblaciones de células B
estuvieron dentro de los rangos normales, con excepción de un descenso de
las células B memoria unswitched, de las células plasmáticas y, dentro de
éstas, de las 138-. Similarmente en los pacientes con PCI se observó un
descenso de las células B memoria unswitched y de las células plasmáticas.
Adicionalmente, sólo en este grupo se detectó la expansión de las células B
transicionales.
En el presente estudio, se han observado alteraciones importantes en la
distribución de las subpoblaciones de células B sanguíneas en una frecuencia
elevada de pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI. Las principales
alteraciones se muestran de forma esquemática en la figura 68.
Numerosos modelos animales y humanos han demostrado el papel
patogénico de las células B en las enfermedades autoinmunes, como el LES, el
SSp la AR [417]. Sin embargo, es en el LES donde más se ha estudiado el
papel de las células B en la patogénesis y actividad de la enfermedad, ya que
el LES se caracteriza por la hiperactividad de las células B y la producción de
autoanticuerpos.
277
DISCUSIÓN
TRANSICIONALES PRENAIVE NAIVE
MEMORIA
MEMORIA USWMEMORIA SW
MEMORIA DN
PLASMÁTICAS P 138+
P 138-
Figura 68. Principales alteraciones en la distribución en sangre de las subpoblaciones de células B en la PAI. Las flechas amarillas hacia arriba o hacia abajo, indican un incremento o un descenso de la subpoblación correspondiente. USW: unswitched. SW: switched. DN: dobles negativas. P: plasmáticas.
En los pacientes con LES, la distribución de las células B en sangre está
claramente alterada, ya que se ha encontrado un descenso de células B naive
y un incremento de células transicionales, pre-naive, memoria y plásmáticas
[453-423]. En este sentido, se ha sugerido que el incremento de células B
transicionales, podría ser un reflejo de la linfocitopenia B presente
característicamente en estos pacientes [421], mientras que el incremento de las
células plasmáticas se ha relacionado con la actividad de la enfermedad [424].
Con respecto a las células B memoria en el LES, recientemente se ha
descrito una nueva población carente de la expresión de CD27, las células B
memoria dobles negativas [425]. Diferentes grupos han observado la
expansión de células B memoria switched, generalmente acompañada de
la depleción de células B memoria unswitched, en los pacientes con LES [426].
278
DISCUSIÓN
Adicionalmente, en un estudio reciente se ha observado un incremento de las
células B memoria dobles negativas y su correlación con la actividad de la
enfermedad en pacientes con LES [427]. En este sentido se ha sugerido que el
incremento del pool de células B memoria en el LES podrían explicar la
patogénesis de la enfermedad y la resistencia al tratamiento observada en
algunos pacientes , ya que algunas de ellas muestran una elevada tasa de
hipermutación somática que las hace polireactivas y autoreactivas [428, 429].
Las células B pre-naive, con un fenotipo intermedio entre las células B
transicionales y naive, se han estudiado recientemente en el LES [423]. En este
sentido, se ha descrito el incremento de células B pre-naive y una correlación
entre su expansión y el grado de linfocitopenia B en los pacientes con LES. En
este sentido, se ha sugerido que las células B pre-naive pueden ser
amplificadas específicamente bajo ciertas condiciones que pueden alterar la
homeostasis de las células B [424].
En consecuencia, todas estas alteraciones en la homeostasis de las células B
en el LES, constituyen un reflejo de la pérdida de la tolerancia y de la activación
aberrante de las células B en la enfermedad [423].
En contraste con las observaciones descritas en el LES, en el SSp se ha
observado un incremento de las células B transicionales y naive, y descenso de
las células B memoria, especialmente de las células B memoria unswitched
[430-432]. Cabe destacar la presencia de esta misma distribución en los
pacientes con SIDA [433]. En este sentido, se ha sugerido que estas
alteraciones podrían ser consecuencia del descenso en la respuesta
inmunitaria T dependiente de las células B en sangre, debido a la presencia de
279
DISCUSIÓN
linfocitopenia T CD4+ en ambas patologías [434]. Adicionalmente, se ha
observado la acumulación tanto de las células T CD4+ como de las células B
memoria en los tejidos inflamados de los pacientes con SSp [430-432].
En otras enfermedades autoinmunes, como la AR se han encontrado menos
alteraciones en la distribución de las células B en sangre. En los pacientes con
AR, al igual que en el LES, también se ha encontrado un incremento de las
células B memoria, pero con una frecuencia normal de células B naive [425,
426].
En el presente estudio, al igual que en el LES, se ha observado un descenso
de las células B naive y una expansión de las células B memoria en los
pacientes con PAI, aunque sin alteraciones en el compartimiento de las células
B memoria switched [426, 428, 429]. Similarmente, se ha encontrado un
incremento de las células B memoria dobles negativas y, al igual que en el LES,
se ha correlacionado con la actividad de la enfermedad [427]. En este sentido,
el porcentaje de células B memoria dobles negativas fue significativamente
mayor en los pacientes con afectación extrapancreática que en aquellos sin
Afectación extrapancreática. En consecuencia, el incremento de células B
memoria dobles negativas en los pacientes con PAI podía estar implicado en la
progresión de la enfermedad. Adicionalmente el porcentaje de células B naive
fue significativamente menor en los pacientes con afectación extrapancreática
que en aquellos sin afectación extrapancreática. En contraste en el LES no se
ha encontrado ninguna relación entre el descenso de las células B naive y la
actividad de la enfermedad [420]. En consecuencia, el descenso de células B
280
DISCUSIÓN
naive en los pacientes con PAI, a diferencia del LES, podría estar también
relacionado con la actividad de la enfermedad.
Con respecto a las células B transicionales, al igual que en el LES y el SSp,
también se ha observado un incremento de las mismas en los pacientes con
PAI. Dado que tanto en los pacientes con LES como en los pacientes con PAI,
la linfocitopenia B es frecuente, es probable que esta alteración sea
responsable del incremento de células B transicionales en ambas
enfermedades [421]. Sin embargo, en el SSp los linfocitos B no suelen estar
disminuidos y, sin embargo, también se detecta esta misma alteración. Una
posible explicación, sería un fracaso en los mecanismos de tolerancia que
derivaría en la acumulación de células transicionales autorreactivas y, por tanto,
con un papel patogénico en estas enfermedades autoinmunes. En este sentido
se ha analizado la relación entre el aumento de células B transicionales y la
presencia de lesiones extrapancreáticas en nuestra serie de pacientes, sin
embargo no se ha encontrado ninguna asociación. En consecuencia el
significado clínico del incremento de esta subpoblación en la PAI esta por
determinar.
En lo que se refiere a las células B pre-naive, a diferencia que en el LES, se
ha observado un descenso de las mismas en los pacientes con PAI, junto con
la presencia de linfocitopenia B. En consecuencia, se desconoce el significado
del descenso de las células B pre-naive en nuestra serie de pacientes.
Por último, las células plasmáticas, al igual que en el LES, estuvieron
aumentadas y dicho aumento se corrrelacionó con la actividad de la
enfermedad. En este sentido, el porcentaje de células plasmáticas fue
281
DISCUSIÓN
significativamente mayor en los pacientes con afectación extrapancreática que
en aquellos sin afectación extrapancreática. En consecuencia, el incremento de
células plasmáticas en los pacientes con PAI podía estar implicado en la
actividad de la enfermedad.
Todos estos resultados demuestran la presencia de profundas alteraciones
en la homeostasis de las células B en los pacientes con PAI, muy similares a
las halladas en el LES, indicando que la pérdida de la tolerancia y la activación
aberrante de las células B constituyen dos factores clave en ambas
enfermedad [422].
En el estudio de la clonalidad de las células plasmáticas (CD19+ CD38++) por
citometría de flujo, todos los pacientes con PAI presentaron un ratio k/λ normal,
mientras que se observó un ratio k/λ disminuido, indicando la presencia de una
población monoclonal con restricción λ, en uno y en cuatro de los pacientes con
sospecha de PAI y PCI, respectivamente. Por lo tanto, el riesgo de desarrollar
procesos linfoproliferativos de células B sería teóricamente mayor en los
pacientes con PCI, y en menor medida en los pacientes con sospecha de PAI,
seguido de los pacientes con PAI. Dado que se ha postulado la existencia de
una forma atípica de PAI dentro de la PCI, es posible que esta forma de
presentación atípica predisponga al desarrollo de neoplasias de células B. Una
de las posibles explicaciones sería que los pacientes con PCI no están
sometidos a terapia inmunupresora ya que, en ausencia de tratamiento, tanto la
inflamación crónica como la activación persistente de células B autorreactivas,
se perpetuarían en el tiempo y podrían conducir a la proliferación clonal de las
células B.
282
DISCUSIÓN
5.8. Anticuerpos anti-p53 en la PAI
El gen p53 es un gen supresor de tumores que se encuentra mutado en
más de un 60% de todos los cánceres, como el de páncreas, esófago, pulmón,
ovarios, colorectal, linfomas, etc. Estas mutaciones conducen a la acumulación
de la proteína p53 alterada en las células tumorales. Algunos pacientes,
mediante un mecanismo desconocido, desarrollan anticuerpos frente a la
proteína p53 alterada [435]. La prevalencia de anticuerpos anti-p53 en
pacientes con cáncer descrita en la bibliografía oscila entre un 3% y un 65% y
su presencia se ha relacionado con menor supervivencia [436-443], ya que
refleja la existencia de una mayor carga antigénica en estadíos más avanzados
de la enfermedad [444]. Estos anticuerpos podrían promover el desarrollo
tumoral, bloqueando la eliminación de la proteína p53 alterada por las células
presentadoras de antígeno mediante la formación de inmunocomplejos [445,
446] y mediante la inducción de la secreción de citocinas supresoras de la
respuesta inmunitaria citotóxica frente a la proteína p53 [447]. Son pocos los
estudios que hayan analizado la presencia de anticuerpos anti-p53 en
individuos con estadíos tumorales premalignos [448, 449]. En este sentido,
la presencia de anticuerpos anti-p53 puede preceder en meses e incluso años
al desarrollo de enfermedad maligna [450] y se puede detectar en lesiones
premalignas o en fumadores intensos con riesgo elevado de desarrollar cáncer
de pulmón [448].
Por otro lado, los anticuerpos anti-p53 se han descrito en varias
enfermedades autoinmunes, como el LES, enfermedad de Graves, esclerosis
283
DISCUSIÓN
sistémica, vasculitis o hepatitis autoinmune. Se ha sugerido que su presencia
podría estar relacionada con un mayor riesgo de malignidad, aunque no existe
ningún estudio que demuestre esta hipótesis [451].
En el presente estudio los anticuerpos anti-p53 se han detectado en un
elevado porcentaje de los pacientes con PAI, significativamente mayor que
en pacientes con pancreatitis crónica (19%) y cáncer de páncreas (15%). Estos
datos podrían estar indicando el potencial maligno de la enfermedad, puesto
que los anticuerpos anti-p53 se han asociado con mayor riesgo de cáncer [448-
450]. Adicionalmente se ha encontrado una correlación significativa entre la
presencia de anticuerpos anti-p53 y de afectación extrapancreática. En
consecuencia, la presencia mayoritaria de los anticuerpos anti-p53 en los
pacientes con lesiones extrapancreáticas, podría sugerir que la afectación
sistémica en la PAI se asociaría con un mayor riesgo de cáncer. Una posible
explicación sería que la afectación sistémica en la PAI viene dada por una
mayor actividad inflamatoria, que puede preceder y contribuir al desarrollo
tumoral mediante la inducción de mutaciones oncogénicas, inestabilidad
genómica, crecimiento tumoral y angiogénesis [452]. En contraste, los
anticuerpos anti-p53 se han detectado en una frecuencia mucho menor en
los pacientes con cáncer de páncreas, aunque similar a la descrita en la
bibliografía [435, 443]. Esta discrepancia podría deberse a que la PAI no sólo
se asociaría con el cáncer de páncreas sino también con otras malignidades,
como lo indican los casos clínicos descritos en la bibliografía (cáncer de
páncreas, colon, glándulas salivares ,gastrointestinal y LNH) [164, 370-374,
453-458].
284
DISCUSIÓN
Adicionalmente, los anticuerpos anti-p53 se detectaron en un 22% y 12% de
los pacientes con sospecha de PAI y PCI. Teniendo en cuenta que dentro de
ambos grupos podría haber pacientes con PAI, su significado clínico sería el
mismo.
5.9. Niveles séricos de IL-6 en la PAI
La interleucina 6 (IL-6) es una citocina proinflamatoria con efectos
pleiotrópicos, que regula la proliferación, diferenciación y activación de
numerosos tipos celulares. A nivel de células B, induce su diferenciación a
células plasmáticas secretoras de anticuerpos y la proliferación de las células
plasmáticas. Los niveles séricos de IL-6 aumentan hasta 100 veces en
condiciones inflamatorias, lo que se ha propuesto como un marcador temprano
y sensible, pero inespecífico, de reacciones inflamatorias. Adicionalmente la IL-
6 juega un papel importante en la patogénesis y desarrollo de malignidades. En
este sentido induce el crecimiento de las células tumorales mediante inhibición
de la apoptosis y estimulación de la angiogénesis [459]. Son numerosos los
estudios que sugieren que niveles de IL-6 en suero elevados se correlacionan
con estadíos tumorales más avanzados y con una tasa menor de supervivencia
[460-465]. También es conocido el papel de la IL-6 en la patogénesis de
linfomas de células B y de mielomas, ya que actúa como factor de crecimiento
autocrino y paracrino de las células B neoplásicas [466-470]. Además los
niveles séricos elevados de IL-6 se han relacionado con enfermedades más
activas o con peor pronóstico [471-472].
En el presente estudio, los niveles de IL-6 estuvieron significativamente más
elevados en los pacientes con PAI, sospecha de PAI y PCI que en controles
285
DISCUSIÓN
sanos. En cambio, no se encontraron diferencias significativas con los
pacientes con PC y PCI. En consecuencia, dado que la IL-6 se ha encontrado
aumentada, prácticamente por igual, en pacientes PAI, PC y cáncer de
páncreas, no parece que los niveles de IL-6 en la PAI constituyan un marcador
de malignidad, sino que estarían actuando como un marcador inespecífico de
los procesos inflamatorios que afectan al páncreas.
5.10. Cadenas ligeras libres en suero en la PAI
Las inmunoglobulinas están constituidas por dos cadenas pesadas y dos
cadenas ligeras idénticas entre sí. Existen dos tipos de cadenas ligeras, κ y λ,
de modo que cada molécula de anticuerpo tiene dos cadenas ligeras k o dos λ.
Durante el proceso de síntesis de las inmunoglobulinas, las células plasmáticas
producen exceso de cadenas ligeras con respecto a las cadenas pesadas, de
modo que se pueden detectar en el suero como cadenas ligeras libres (sFLC).
Una relación anormal entre cadenas ligeras libres k y λ en el suero (ratio
κ/λ sFLC) indica un exceso de una de las cadenas ligeras con respecto a la
otra y es interpretado como una expansión clonal de las células plasmáticas.
Las principales aplicaciones clínicas de la mediada de las sFLC son para
pacientes con gammapatías monoclonales (GM). En este sentido un ratio κ/λ
sFLC alterado constituye un fuerte indicador de la presencia de una GM. Las
GM resultan de una expansión clonal de células plasmáticas que secretan
típicamente una inmunoglobulina homogénea (monoclonal) llamada
paraproteína o proteína M, y que expresan un único tipo de cadena ligera
(restricción de cadena ligera). Bajo el término de GM se incluye un amplio
espectro de enfermedades que abarcan desde la GM de significado incierto
286
DISCUSIÓN
(MGUS), la más prevalente y con un pronóstico generalmente benigno, hasta
enfermedades con mayor potencial maligno, como el mieloma múltiple (MM), la
leucemia de células plasmáticas o la amiloidosis primaria entre otras (AL). En
los pacientes con MGUS, un ratio κ/λ sFLC alterado constituye un factor
pronóstico adverso para la transformación en malignidades de células B, como
el MM, linfomas de células B o LLC [473]
En otras malignidades de células B, como la leucemia linfocítica crónica
(LLC) o los linfomas no Hodgkin (LNH) se puede detectar la secreción de una
proteína M [474, 475]. En un estudio realizado en la Clínica Mayo, se ha
detectado ratios κ/λ sFLC alterados en una proporción importante de pacientes
con LLC y LNH. En este sentido, se ha sugerido que el ensayo de sFLC podría
ser útil en la monitorización de estos pacientes [476].
Adicionalmente se ha postulado que la presencia de un ratio κ/λ sFLC
alterado en pacientes asintomáticos podría constituir un marcador temprano de
la presencia de malignidades de células B [474, 476].
Un rasgo común de numerosas enfermedades autoinmunes es la presencia
de hipergammaglobulinemia policlonal, debida a la activación policlonal de las
células B y que se puede traducir en un incremento en los niveles de sFLC, con
ratios κ/λ sFLC normales. Varios autores han mostrado la existencia de una
relación entre los niveles de sFLC y la actividad de la enfermedad en pacientes
con SSp, LES, AR y DM [477-480]. Adicionalmente, en pacientes con AR se ha
observado un rápido descenso de los niveles sFLC con el tratamiento. Estos
datos sugieren que las sFLC podrían constituir un marcador temprano de la
actividad de la enfermedad y de la respuesta al tratamiento [479].
287
DISCUSIÓN
En el presente estudio, un porcentaje elevado de los pacientes con PAI al
diagnóstico presentaron niveles elevados de sFLC κ (36%) y de sFLC λ
(29%). De las dos cadenas ligeras libres (κ y λ), sólo los niveles de sFLC k
estuvieron significativamente correlacionados con los de IgG4. Adicionalmente,
sólo los niveles medios de sFLC k fueron significativamente mayores en
los pacientes con afectación extrapancreática que en aquellos sin afectación
extrapancreática. En este sentido, dado que tanto el aumento en suero de la
IgG4 como la presencia de lesiones extrapancreáticas se han asociado con
una enfermedad más activa, los niveles de sFLC k se pueden considerar un
marcador de la actividad de la enfermedad en los pacientes con PAI. Estos
resultados contrastan en cierto modo con los descritos en la bibliografía, ya
que mientras que en el SSp, LES, AR y Diabetes mellitus, tanto las sFLC k
como las λ se han correlacionado con la actividad de la enfermedad, en la PAI
sólo se ha encontrado correlación para las sFLC k. En consecuencia, las sFLC
k podrían considerarse un marcador más fuerte de la estimulación de las
células B durante el proceso autoinmune que las sFLC λ.
En el presente estudio, también se ha analizado la influencia a corto y a
largo plazo del tratamiento esteroideo sobre los niveles de sFLC κ y λ en los
pacientes con PAI. Dentro de los tres primeros meses del comienzo del
tratamiento esteroideo, se ha observado un descenso significativo de los
niveles de sFLC κ y λ con respecto a los niveles medidos al diagnóstico. Dado
que las sFLC κ se han correlacionado con la actividad de la enfermedad, el
rápido descenso de los niveles de sFLC κ indicaría una respuesta rápida al
tratamiento en los pacientes con PAI. En contraste, a largo plazo, se ha
288
DISCUSIÓN
observado un incremento de los niveles de sFLC κ y un ligero descenso de los
niveles de sFLC λ con respecto a los niveles medidos al diagnóstico. En este
sentido un mayor porcentaje de pacientes con PAI desarrollaron alteraciones
en las concentraciones de sFLC κ a largo plazo, mientras que el
porcentaje de pacientes con alteraciones en los niveles de sFLC λ a largo
plazo, fue el mismo que al diagnóstico. En consecuencia dado que las sFLC κ
se consideran marcadores de la actividad de la PAI, el incremento en sus
niveles podría constituir un reflejo de un reactivación de la enfermedad a largo
plazo, y por tanto, de un mal pronóstico.
De estos resultados se puede concluir que las sFLC κ podrían representar
un biomarcador relevante en la respuesta al tratamiento en los pacientes con
PAI, y que estarían indicando la eficacia del tratamiento esteroideo a corto pero
no a largo plazo en la PAI.
En los pacientes con sospecha de PAI se observaron menos alteraciones al
diagnóstico en los niveles de sFLC que en los pacientes con PAI, ya que las
sFLC κ estuvieron elevadas en un 22% de los pacientes, mientras que ninguno
de ellos presentó alteraciones en las sFLC λ. A largo plazo, se observaron más
alteraciones, ya que un 33% y un 11% de los pacientes presentaron las sFLC κ
y λ aumentadas, respectivamente. Sin embargo, dado que no se encontró una
correlación significativa entre los niveles de ambas y la actividad de la
enfermedad, no parece que estos resultados tengan ningún significado clínico.
En consecuencia, teniendo en cuenta que dentro de este grupo algunos
pacientes podrían tener PAI, es probable que el incremento en el tiempo de las
sFLC k y λ, venga dado por el subgrupo de pacientes con PAI.
289
DISCUSIÓN
En contraste, en los pacientes con PCI se observaron más alteraciones al
diagnóstico en los niveles de sFLC κ que en los pacientes con PAI, ya que las
sFLC κ y λ estuvieron elevadas en un 50% y un 19% de los pacientes,
respectivamente. A largo plazo, se mantuvo el porcentaje de pacientes con
estas alteraciones, a diferencia del incremento detectado en los pacientes con
PAI y PCI. Aunque se observó un incremento en el tiempo de los niveles
medios de sFLC k y λ. Como en este grupo tampoco se encontró una
correlación significativa entre los niveles de sFLC y la actividad de la
enfermedad, no parece que estos resultados tengan ningún significado clínico.
En consecuencia, al igual que en el grupo de sospecha de PAI, los pacientes
con PAI presentes en este grupo serían los responsables del incremento en el
tiempo de las sFLC k y λ.
Por último, se observaron alteraciones al diagnóstico en los ratios sFLC k/λ
en 3 de los 14 pacientes con PAI, de los cuales dos presentaron restricción κ y
uno restricción λ. A largo plazo, dos pacientes más desarrollaron alteraciones
en los ratios sFLC k/λ, uno de ellos con restricción κ y el otro con restricción λ.
Por tanto, un total de 5 pacientes con PAI (36%) presentarían una expansión
clonal de las células plasmáticas, tres al diagnóstico y dos a largo plazo. Estos
datos apoyarían la asociación de la PAI con los procesos linfoproliferativos de
célula B. Adicionalmente, se encontró una correlación significativa entre la
presencia de ratios sFLC k/λ alterados y de afectación extrapancreática. Es
posible que la afectación extrapancreática en la PAI esté relacionada con una
estimulación más intensa de las células B y en consecuencia, con un mayor
riesgo de desarrollo de neoplasias de células B.
290
DISCUSIÓN
En los pacientes con sospecha de PAI y PCI se observaron menos
alteraciones al diagnóstico en los ratios sFLC k/λ que en los pacientes con PAI.
En este sentido, tan solo un paciente con PCI presento sFLC monoclonales k,
mientras que 2 de los 16 pacientes con PCI presentaron ratios sFLC k/λ
alterados ,uno de ellos con restricción κ y otro con restricción λ. A largo plazo
ninguno de los pacientes con sospecha de PAI desarrolló alteraciones en los
ratios sFLC k/λ, mientras que 2 pacientes más con PCI presentaron sFLC
monoclonales, uno de ellos κ y otro λ. Por tanto, un total de 4 pacientes con
PCI (25%) presentarían una expansión clonal de las células plasmáticas, dos al
diagnóstico y dos a largo plazo. Estos resultados continúan apoyando la
hipótesis de la existencia de una forma de PAI atípica dentro del grupo de PCI,
que presentaría al igual que la PAI clásica un riesgo elevado de linfomagénesis
de células B.
5.11. Inmunoglobulinas monoclonales circulantes en la PAI
La existencia de inmunogloblinas monoclonales circulantes indica la presencia
de una población monoclonal de células B detectable, asociada en muchos
casos con neoplasias malignas de células B (MM o Linfomas B) o con sus
precursores potenciales (MGUS o pseudolinfoma). En algunas enfermedades
autoinmunes, principalmente en el SSp, se ha detectado inmunoglobulinas
monoclonales circulantes [386, 388, 481, 482]. En un estudio español, se
observaron inmunoglobulinas monoclonales circulantes en un 20% de los
pacientes con SSp y se relacionaron con lapresencia hipergammaglobulinemia,
crioglobulinemia y neoplasias hematológicas [386]. En este sentido, se ha
sugerido que la presencia de inmunoglobulinas monoclonales circulantes
291
DISCUSIÓN
podría preceder al desarrollo de enfermedades linfoproliferativas de células B
[386, 482]. En el presente estudio, se han detectado inmunoglobulinas
monoclonales circulantes en una en un 21% de los pacientes con PAI (3 de
14), por tanto, en una proporción muy similar a la descrita en el SSp (20%).
Adicionalmente su presencia se ha correlacionado con la existencia de
afectación extrapancreática. En conclusión, al igual que los ratios sFLC k/λ
alterados, la presencia de inmunoglobulinas circulantes en la PAI podría
constituir un marcador temprano de desarrollo de neoplasias de células B,
principalmente en los pacientes con afectación extrapancreática, ya que la
afectación sistémica en la PAI implica una mayor actividad de la enfermedad.
En contraste, tan sólo uno de los 9 pacientes con sospecha de PAI (11%) y
ninguno de los pacientes con PCI presentó inmunoglobulinas monoclonales
circulantes. En consecuencia, el riesgo de desarrollo de enfermedades
linfoproliferativas de células B es mayor en los pacientes con PAI que en los
pacientes con sospecha de PAI y PCI.
5.12. Clonalidad de células B en infiltrados linfop lasmocíticos en la PAI
La clonalidad de células B y células T en infiltrados linfoplasmocíticos se ha
descrito en varias enfermedades autoinmunes, principalmente en el SSp [483-
6]. El marcador histológico característico del SSp, llamado sialadenitis
mioepitelial (MESA), consiste en la presencia de infiltrados glandulares
compuestos por linfocitos T CD4+, linfocitos B y células plasmáticas [394]. Se
ha postulado que el riesgo elevado de desarrollo de linfoma maligno en el
SSp[292, 293], sería consecuencia de la estimulación crónica exógena o
endógena en la MESA que conduciría a la progresión gradual de policlonal a
292
DISCUSIÓN
monoclonal en glándulas salivares y lacrimales [383-385]. Similarmente, el
marcador histológico de la PAI es la densa infiltración tanto de páncreas como
de tejidos extrapancreáticos afectados por células inflamatorias, principalmente
linfocitos T CD4+, linfocitos B y células plasmáticas. En consecuencia la
presencia de clonalidad en estos tejidos podría indicar, al igual que en el SSp,
un riesgo incrementado de linfomagénesis. En este sentido, Esposito et al [374]
han observado la presencia de oligoclonalidad del TCRγ en un pseudotumor
inflamatorio de un paciente con PAI, mientras que Kojima et al [44] han
descrito un patrón policlonal a nivel de las células B y T en las áreas
periductales de pacientes con PAI.
En el presente estudio, dos de los 9 pacientes con PAI (22%) presentaron
reordenamientos monoclonales, a nivel de las glándulas salivares, y a nivel de
la papila duodenal. Adicionalmente, de los 2 pacientes con PCI evaluados, en
uno se detectó un reordenamiento biclonal a nivel del estómago, mientras que
ninguno de los 3 pacientes con sospecha de PAI presentó reordenamientos
policlonales en las muestras analizadas. En conclusión, la presencia de
reordenamientos clonales en los órganos afectados en la PAI podría constituir
un marcador temprano de desarrollo de linfomas localizados, como
consecuencia de la estimulación persistente de las células B autorreactivas y la
inflamación crónica en los órganos diana. Esta hipótesis se apoya en el
diagnóstico anatomopatológico de inflamación crónica de la papila duodenal en
uno de los pacientes con PAI y de gastritis crónica en el paciente con PCI, en
contraste la ausencia de alteraciones de las glándulas salivares del otro
293
DISCUSIÓN
paciente con PAI podría ser un reflejo de la distribución parcheada de las
lesiones inflamatorias en la PAI. En este sentido se ha descrito el
desarrollo de un linfoma MALT de la zona marginal en la glándula
submandibular de un paciente con siladenitis esclerosante cónica [371], de
LNH ocular adnexal en 3 pacientes con dacrioadenitis esclerosante crónica
asociada a IgG4 ( dos de ellos linfomas de tipo marginal extranodal del MALT
y uno linfoma folicular de alto grado), de LNH en 3 pacientes con ISD (dos
de glandulas salivares y otro extranodal) y de LNH de tipo linfocítico de células
pequeñas afectando a nódulos linfoides mesentéricos un paciente con ISD.
5.13. Analisis mutacional de K-ras en lo órganos af ectados en la PAI
La PAI fue definida inicialmente como una forma de pancreatitis crónica que
revertía con la terapia esteroidea [487]. Sin embargo cada vez se encuentran
más casos en la bibliografía de desarrollo de cáncer de páncreas en pacientes
con PAI, de forma simultánea o durante el curso de la enfermedad [397-399].
En este sentido en nuestra serie de pacientes con PAI, 4 de 14 han
desarrollado cáncer de páncreas.
Las mutaciones del oncogén K-ras se han descrito en más de un 90% de los
adenocarcinomas de páncreas [400, 401], 40% de los cánceres de la papila
duodenal [488, 489], 8% de los cánceres de la mucosa gástrica [490] 32-44%
de los cánceres de cólon [491, 492], 20-100% cánceres de conductos biliares
[493] y en un 38-55% de los cánceres de vesícula biliar [494, 495].
Adicionalmente las mutaciones de K-ras se pueden detectar en la mucosa
hiperplásica del páncreas, colón y estómago en condiciones de inflamación
crónica como estadíos tempranos de carcinogénesis [492, 496-499]. En los
294
DISCUSIÓN
pacientes con PAI, Kamisawa et al han encontrado un aumento significativo de
las mutaciones de K-ras en las región pancreatobiliar y en el tracto
gastrointestinal, asociado con la presencia de lesiones fibroinflamatorias,
sugiriendo que la PAI podría constituir un factor de riesgo de desarrollo de
cáncer pancreatobiliar y gastrointestinal [500, 501].
En el presente estudio, 2 de los 6 pacientes con PAI, presentaron
mutaciones en k-ras a nivel de páncreas. Uno de ellos, a pesar de la presencia
de mutaciones en k-ras en la muestra de páncreas tomada al diagnóstico, tras
cuatro años de seguimiento de la enfermedad desde el diagnóstico hasta el
momento actual, no ha desarrollado ninguna neoplasia maligna ni en páncreas
ni en ningún tejido extrapancreático. Cabe destacar la presencia de niveles
séricos de IgG4 siempre dentro de los rangos normales, la ausencia de
afectación extrapancreática y de tratamiento esteroideo en este paciente. En el
otro paciente, el estudio de K-ras fue negativo en la biopsia pancreática al
diagnóstico, sin embargo fue positivo en la muestra de páncreas tomada 6
meses después del comienzo del tratamiento esteroideo. Cabe destacar la
presencia de niveles séricos de IgG4 extremadamente elevados al diagnóstico,
de 4500 mg/dl, la presencia de afectación extrapancreática y la instauración del
tratamiento esteroideo inmediatamente después del diagnóstico de la PAI, que
condujo a remisión clínica, serológica y radiológica al cabo de un mes. Sin
embargo tras 6 meses de tratamiento, el paciente desarrolló colangitis y las
biopsias a nivel de páncreas y de vesícula biliar demostraron la existencia de
adenocarcinoma en ambos tejidos. En consecuencia las mutaciones en k-ras
por sí sólas no incrementan el riesgo de cáncer, como se ha podido observar
295
DISCUSIÓN
en el primero de los pacientes, sino que sería necesarios otros factores
desencadenantes como serían la presencia de niveles elevados de IgG4 y de
afectación extrapancreática, que indicaría una enfermedad más activa y por
tanto mayor inflamación. Adicionalmente parece que en los pacientes con PAI y
afectación extrapancreática, el tratamiento esteroideo a pesar de conducir a
una mejoría aparente de la enfermedad, no evita el desarrollo de malignidades,
probablemente porque no consigue eliminar las células B autorreactivas
productoras de IgG4.
Similarmente, uno de los tres pacientes con sospecha de PAI y uno de los
dos pacientes con PCI, presentaron mutaciones de K-ras en muestras al
diagnóstico de páncreas y de vesícula biliar, respectivamente. Sin embargo,
ninguno de ellos, tras 12 y 10 años de seguimiento desde el diagnóstico hasta
el momento actual, respectivamente; han desarrollado ninguna neoplasia
maligna ni en páncreas ni en ningún tejido extrapancreático. Cabe destacar la
presencia de niveles normales de IgG4, la ausencia de afectación
extrapancreática y de tratamiento esteroideo en ambos pacientes. En
consecuencia, estas observaciones apoyan la hipótesis anterior; ya que parece
que en pacientes sin afectación extrapancreática, las lesiones, a pesar de la
presencia mutaciones en K-ras, no evolucionan a malignidad.
5.14. Analisis global del riesgo de malignidad en l a PAI
En nuestra serie de pacientes con PAI se ha observado un riesgo
incrementado de desarrollo de enfermedades linfoproliferativas de células B,
demostrado por la presencia de ratios k/λ sFLC y k/λ CMF alterados, bandas
monoclonales por IFE, y de reordenamientos clonales IgH en los linfocitos B
296
DISCUSIÓN
presentes en los infiltrados linfoplamocíticos; y de adenocarcinoma de
páncreas y probablemente gastrointestinal y biliar demostrado por la presencia
de cáncer de páncreas y de mutaciones de K-ras. Adicionalmente, la elevada
frecuencia de anticuerpos anti-p53 podría estar indicando el potencial maligno
de la enfermedad. Globalmente, un 71% de los pacientes con PAI presentaría
un riesgo incrementado de malignidad, un 50% de desarrollo de malignidades
de células B y un 29% de adenocarcinoma pancreatobiliar y gastrointestinal.
Cabe destacar la existencia de un mayor riesgo de malignidad en el grupo de
pacientes con afectación extrapancreática que en aquellos sin afectación
extrapancreática (88% vs 50%), tanto de malignidades de células B (63% vs
33%) como de adenocarcinoma pancreatobiliar y gastrointestinal (38% vs 17%)
(Tabla 55). En los pacientes con sospecha de PAI (Tabla 56), el riesgo global
de malignidad, de malignidades de células B de adenocarcinoma
pancreatobiliar y gastrointestinal fue menor, de un 33%, 22% y 11%,
respectivamente; mientras que en los pacientes con PCI (Tabla 57) se encontró
un riesgo de malignidad intermedio entre la PAI y la sospecha de PAI, de un
50%, 50% y 7% respectivamente. En consecuencia dentro de los pacientes con
PCI existiría un subgrupo con una forma de PAI atípica que se asociaría con un
riesgo elevado de malignidad.
297
DDIISSCCUUSSIIÓÓNN
TABLA 55 . Riesgo de malignidad en la PAI
Px Sexo Edad AEP Ratio k/ λ CMF
Ratio k/ λ SFLC IFE+ Reordenamientos
IgH/ órgano p53+
Mutaciones K-Ras
/Cáncer P (órgano)
1 M 67 SI Normal Clonal k NO Policlonal/ páncreas SI NO /NO
(pancreas)
2 M 71 SI Normal Clonal λ Banda IgA-λ
Policlonal /páncreas y GC SI NO /NO
(pancreas )
3 M 76 SI Normal Normal Banda IgM-κ
Policlonal /próstata SI SD/NO
4 M 73 SI Normal Normal NO Policlonal/ próstata SI SD/NO
5 F 77 SI SD Clonal k NO SD SI SD/NO
6 M 66 SI SD Normal NO Policlonal/VB SI SD/SI
7 M 37 SI SD Normal NO Policlonal/ hígado SI SD/SI
8 M 78 SI Normal Clonal k Banda IgG-κ
Monoclonal/ papila duodenal
SI SI/SI (páncreas)
9 M 58 NO Normal Normal NO Policlonal/ páncreas NO SD/NO
10 F 76 NO Normal Normal NO Policlonal/VB
Monoclonal/GS SI
NO/NO (páncreas y
VB)
11 M 52 NO SD Normal NO SD SI SD/NO
12 M 30 NO Normal Clonal λ NO Policlonal/ páncreas SI NO /NO
(páncreas)
13 M 50 NO Normal Normal NO SD NO SD/NO
14 M 16 NO Normal Normal NO Policlonal/ páncreas NO SI/NO
(páncreas)
AEP: Afectación extrapancreática. p53+: Anticuerpos anti-p53 positivos. Cáncer P: Cáncer de páncreas.
Px: Paciente. M:Masculino. F: Femenino. SD: Sin datos. GC: Ganglio cístico. VB: Vesícula biliar.
GS: Glándulas salivares.
298
DDIISSCCUUSSIIÓÓNN
TABLA 56 . Riesgo de malignidad en pacientes con sospecha de PAI
Px Sexo Edad AEP Ratio k/ λ CMF
Ratio k/ λ SFLC IFE+ Reordenamientos
IgH/ órgano p53+
Mutaciones K-Ras
/Cáncer P (órgano)
1 M 45 SI SD NO NO SD SI SD
2 F 75 NO NO NO NO SD NO SD/NO
3 F 39 NO SD NO NO SD NO SD/NO
4 F 59 NO SD NO NO SD NO SD/NO
5 M 43 NO SD NO NO Policlonal/ VB NO NO /NO (VB)
6 M 37 NO SD NO NO SD NO SD
7 F 82 NO NO NO NO Policlonal/ papila duodenal NO NO/NO (papila
duodenal)
8 M 84 NO Clonal λ NO NO SD SI SD
9 M 51 NO NO Clonal κ Banda IgA-κ
Policlonal/ páncreas y MO NO SI/NO
(pancreas)
AEP: Afectación extrapancreática. p53+: Anticuerpos anti-p53 positivos. Cáncer P: Cáncer de páncreas.
Px: Paciente. M:Masculino. F: Femenino. SD: Sin datos. VB: Vesícula biliar. MO: Medula ósea.
299
DDIISSCCUUSSIIÓÓNN
TABLA 57 . Riesgo de malignidad en la PCI
Px Sexo Edad AEP Ratio k/ λ CMF
Ratio k/ λ SFLC IFE+ Reordenamientos
IgH/ órgano p53+
Mutaciones K-Ras
/Cáncer P (órgano)
1 M 64 SI Clonal λ Clonal k NO SD NO NO /NO (pancreas)
2 M 78 SI SD Normal SD SD NO NO /NO (pancreas )
3 M 72 NO SD Normal NO Policlonal /VB NO SD/NO
4 M 59 NO NO Normal NO SD SD NO/NO (páncreas)
5 M 64 NO NO Normal NO Biclonal/ estómago
SI SI/NO (VB)
6 M 78 NO Clonal λ Normal NO SD NO SD/NO
7 M 75 NO SD Clonal k NO SD NO SD/NO
8 M 50 NO SD Normal NO SD NO SD/NO
9 F 83 NO Clonal λ Normal NO SD NO SD/NO
10 M 77 NO Clonal λ Normal NO SD NO SD/NO
11 M 38 NO Normal Normal NO SD NO SD/NO
12 M 34 NO Normal Clonal λ NO SD NO SD/NO
13 F 39 NO Normal Normal NO SD NO SD/NO
14 M 54 NO Normal Normal NO SD NO SD/NO
15 M 44 NO Normal Normal NO SD NO SD/NO
16 M 31 NO Normal Clonal λ NO SD SD SD/NO
AEP: Afectación extrapancreática. p53+: Anticuerpos anti-p53 positivos. Cáncer P: Cáncer de páncreas.
Px: Paciente. M:Masculino. F: Femenino. SD: Sin datos. GC: Ganglio cístico. VB: Vesícula biliar.
GS: Glándulas salivares.
En conclusión en el presente estudio se demuestra la existencia de una
conexión entre la PAI, la linfomagénesis y el desarrollo de tumores sólidos de
origen epitelial (Figura 68).
300
DDIISSCCUUSSIIÓÓNN
Figura 68. Posible modelo de desarrollo de malignidad en la PAI. AEP: Afectación Extrapancreática. Ab anti-p53: anticuerpos anti-p53.
Proteínas monoclonales en suero
Ab anti-p53
Ratios k/λ alterados
PPAANNCCRREEAATTIITTIISS AAUUTTOOIINNMMUUNNEE
AADDEENNOOCCAARRCCIINNOOMMAA NNEEOOPPLLAASSIIAASS CCÉÉLLUULLAASS BB
↑ IgG4 + plasma cells
↑ IgG4 suero
Mutaciones K-ras
↑ IgG4 suero
AEP Reordenamientos Clonales
301
CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS
66666666........ CCCCCCCCOOOOOOOONNNNNNNNCCCCCCCCLLLLLLLLUUUUUUUUSSSSSSSSIIIIIIIIOOOOOOOONNNNNNNNEEEEEEEESSSSSSSS
302
303
CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS
1. La combinación de los niveles séricos elevados de IgG4, los anticuerpos
anti-AC II y los anticuerpos anti-AMY α constituye una herramienta útil
para realizar el diagnóstico diferencial entre la PAI y otras enfermedades
pancreáticas, principalmente el cáncer de páncreas. Adicionalmente, la
coexistencia de niveles séricos de IgG4 persistentemente elevados con
los anticuerpos anti-AC II y AMY α en pacientes con PAI podría constituir
un factor de riesgo para el desarrollo de cáncer de páncreas.
2. Cada laboratorio debe de establecer su propio valor de punto de corte
óptimo para los niveles séricos elevados de IgG (1496 mg/dl en nuestro
grupo), mientras que para los niveles séricos elevados de IgG4 se
podría emplear el aceptado por la mayoría de los grupos, de 135 mg/dl,
en el diagnóstico de la PAI.
3. Los pacientes con niveles séricos de IgG4 superiores a 190 mg/dl son
más propensos a presentar afectación extrapancreática y en mayor
grado y, por tanto, una enfermedad más activa.
4. En nuestra serie de pacientes con PAI, el síntoma de presentación
más común fue el dolor abdominal, seguido de la ictericia obstructiva
sin dolor y de la forma asintomática.
5. La elevación del CA 19.9 en los pacientes con PAI en unos casos
sería consecuencia de la coexistencia de la enfermedad con un
fenómeno tumoral y en otros de su papel patogénico en el proceso
inflamatorio de la PAI, aunque no se ha podido demostrar su relación
con la actividad de la enfermedad. Los anticuerpos anti-CA 19.9 tienen
tienen una escasa utilidad en el diagnóstico diferencial de la PAI con
304
CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS
otras enfermedades pancreáticas debido a su baja sensibilidad y
especificidad.
6. En los pacientes con PAI las principales alteraciones en la distribución
de las subpoblaciones linfocitarias consistieron, en un descenso de
linfocitos B y en un incremento de células Nk. El incremento de células
Nk podría estar implicado en la progresión de la enfermedad.
7. El incremento de células B memoria dobles negativas y plamáticas, y
el descenso de células B naive en los pacientes con PAI podría estar
implicado en la progresión de la enfermedad, ya que fue
significativamente mayor en los pacientes con afectación
extrapancreática.
8. La presencia de anticuerpos anti-p53 en un elevado porcentaje de los
pacientes con PAI podría indicar el potencial maligno de la enfermedad.
Adionalmente, la presencia mayoritaria de los anticuerpos anti-p53 en
los pacientes con lesiones extrapancreáticas, indicaría que la afectación
sistémica en la PAI se asociaría con un mayor riesgo de cáncer.
9. La elevación de los niveles de IL-6 en la PAI constituye
un marcador inespecífico de los procesos inflamatorios que afectan al
páncreas.
10. Los niveles de sFLC k se pueden considerar un marcador de la actividad
de la enfermedad en los pacientes con PAI. Adicionalmente, las sFLC κ
podrían representar un biomarcador relevante de la respuesta al
tratamiento en los pacientes con PAI a corto plazo y del pronóstico de la
enfermedad a largo plazo.
305
CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS
11. La PAI supone un factor de riesgo de desarrollo de procesos
linfoproliferativos de células B y dicho riesgo se incrementa en caso de
presencia de afectación sistémica, dado la elevada frecuencia de ratios
k/λ sFLC alterados y de presencia de inmunoglobluinas monoclonales
circulantes.
12. La presencia de reordenamientos clonales en los órganos afectados en
la PAI podría constituir un marcador temprano de desarrollo de linfomas
localizados.
13. La presencia de mutaciones en K-ras en las lesiones pancreáticas y
extrapancreáticas en los pacientes con PAI pos sí sólas no incrementan
el riesgo de cáncer, sino que sería necesarios otros factores
desencadenantes como serían la presencia de niveles elevados de IgG4
y de afectación extrapancreática.
14. En los pacientes con PAI y afectación extrapancreática el tratamiento
esteroideo a pesar de conducir a una mejoría aparente de la enfermedad,
no evita el desarrollo de malignidades, probablemente porque no
consigue eliminar las células B autorreactivas productoras de IgG4.
15. La presencia de alteraciones similares a las descritas en la PAI en un
subgrupo de pacientes con PCI, indicaría la presencia de una forma
oculta de la PAI, es decir, una forma de presentación atípica que no se
ajustaría por completo a los criterios diagnósticos actuales de la PAI. Es
posible que en esta forma de presentación atípica tanto la inflamación
crónica como la activación persistente de células B autorreactivas, se
306
CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS
perpetuarían en el tiempo y podrían conducir a la proliferación clonal de
las células B.
307
BBIIBBLLIIOOGGRRAAFFÍÍAA
77777777........ BBBBBBBBIIIIIIIIBBBBBBBBLLLLLLLLIIIIIIIIOOOOOOOOGGGGGGGGRRRRRRRRAAAAAAAAFFFFFFFFÍÍÍÍÍÍÍÍAAAAAAAA
308
309
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