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M Ó N I C A M A C Í A S C O N D E
D E P A R T A M E N T O D E B I O Q U Í M I C A C L Í N I C A
C L Í N I C A U N I V E R S I D A D D E N A V A R R A
Análisis de mutaciones de EGFR en DNA
circulante como biomarcador de seguimiento en
pacientes con cáncer de pulmón
independientemente del tipo de tratamiento.
Congreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
Chan, B.A. et al (2015) Transl Lung Cancer Res.
Cáncer de pulmón
EGFR
Congreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
Epidermal
growth factor
receptor
(EGFR)
ErlotinibGefitinibAfatinib
Sharma, S.V. et al (2007) Nat Rev Cancer
Osimertinib
Congreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
Novello, S. et al (2016) Ann Oncol.
Metastatic non-small-cell lung cancer:
ESMO Clinical Practice Guidelines for
diagnosis, treatment and follow-up.
La biopsia líquidarepresenta una alternativa
válida a la rebiopsia tisular
cfDNA
Congreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
Cobas EGFR Mutation test v2
• Ensayo multiplex basado en la tecnología ARMS (amplificación pot
PCR de alelos específicos)
• 42 mutaciones en exones 18, 19, 20, and 21 de forma simultánea
• Técnica estandarizada y aprobada para uso clínico (FDA)
• Resultados expresados en Plasma Semi-Quantitative Index (SQI)
▫ Una serie de valores aporta información sobre la tendencia en el número de
copias mutadas
▫ Permite un análisis dinámico durante el seguimiento de la terapiaCongreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
ObjetivosCongreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
Analizar las mutaciones en el gen EGFR en DNA circulante en pacientes con NSCLC con mutaciones previamente conocidas en tejido
Valorar la utilidad del kit multi-target Cobas EGFR Mutation Test v2 como una técnica complementaria en el seguimiento de pacientes tratados con TKIs y/o quimioterapia.
Comparar los resultados semicuantitativos obtenidos por cobas con el número de copias mutadas/mL obtenido por digital droplet PCR (ddPCR).Congreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
Material y métodosCongreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
Pacientes
• 19 adenocarcinoma
• 2 carcinoma escamoso
21 pacientes con NSCLC
estadios III-IV
• 13 hombres (58 ± 12 años)
• 8 mujeres (63 ± 11 años) Edad y sexo
• 17 pacientes con del19
• 4 pacientes con p.L858R
• 1 paciente con p.T790M
21/21 con mutaciones en EGFR en tejido
• 52% nunca fumadoresHábito tabáquicoCongreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
Recogida de muestras
Basal
Mejor Respuesta
Progresión
• Todos los pacientes
fueron tratados con
TKIs (20 tratamientos)
y/o quimioterapia
clásica (10
tratamientos).
Congreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
Plasma obtention
• Doublecentrifugation
• 2 mL EDTA-plasma
CfDNAextraction
• Cobas DNA Sample Preparation Kit
• MagMAX Cell-Free DNA Isolation kit
CfDNAquantification
• Qubit 2.0 Fluorometer
CfDNAfragment size
analysis
• Agilent 2100 BioAnalyzer
EGFRmutationanalysis
• Cobas® EGFR Mutation test v2
• 42 mutations in exons 18, 19, 20 and 21
• Digital DropletPCR
• L858R, del19, T790M
Workflow
Congreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
ResultadosCongreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
Concentración y caracterización de
cfDNA
175,2 ± 8,78 bp
Ausencia de DNA
genómico
[cfDNA]= 280 ± 190 µg/L
Congreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
Cobas EGFR Mutation test v2
N e g a t iv e P o s it iv e
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
1 .0
1 .5
2 .0
M u ta t io n in c fD N A a n d c o n c e n tra t io n
cfD
NA
(n
g/u
L)
21 pacientes EGFR
positivos
12 pacientes positivos
(57%)
12/12 concordancia con el patrón observado en
tejido
9 pacientes negativos
Tejido
Sangre
Congreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
SQI durante el tratamiento
B a s a l B e s t
R e s p o n s e
P ro g re s s io n
0
5
1 0
1 5
2 0
S Q I
p < 0 .0 1 p < 0 .0 1
B a s a l
T K I
B .R .
T K I
P ro g re s .
T K I
B a s a l
C h e m o
B .R .
C h e m o
P ro g re s .
C h e m o
0
5
1 0
1 5
2 0
S Q I
p < 0 .0 1 p < 0 .0 1 p < 0 .0 1 p < 0 .0 1
E G F R -T K I C h e m o th e r a p yCongreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
Concentración de cfDNA durante la
terapia
B a s a l B e s t
R e s p o n s e
P r o g e s s io n
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0
c fD N A a n d re s p o n s e
Congreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
p.T790M durante el tratamiento
• 2/21 fue detectada a nivel basal y continuó siéndolo durante la terapia
• 4/21 (21%) negativos a nivel basal pero aparición durante el tratamiento
▫ 3 durante la quimioterapia
▫ 1 en tratamiento con EGFR-TKIs
Congreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
Cobas vs ddPCR
Cualitativa Cuantitativa
d d P C R
P o s it iv e
d d P C R
N e g a t iv e
0
5
1 0
1 5
2 0
Nu
mb
er o
f s
am
ple
s
C o b a s : P o s it iv e
C o b a s : N e g a tive
9
2
6
1 8
R² = 0,1424
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
cop
ies/
mL
SQICongreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
ConclusionesCongreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
Conclusiones1. El análisis del gen EGFR en DNA circulante presenta utilidad en pacientes con
mutaciones previamente conocidas en tejido.
2. El análisis de cfDNA de manera secuencial permite evaluar el estado mutacional
en tiempo real del paciente, monitorizando la eficacia de la terapia así como la
detección temprana de resistencias.
3. Se demuestra la aparición de la mutación de resistencia p.T790M tanto durante el
tratamiento con EGFR-TKIs como en pacientes tratados con quimioterapia
clásica.
4. La medición seriada del SQI presenta utilidad en la monitorización de la terapia ,
sin embargo, no encontramos correlación entre este índice y la cuantificación
absoluta del número de copias mutadas obtenida por ddPCRCongreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
•González, Álvaro•Alegre, Estibaliz•Sendino, Teresa•Mateos, Beatriz
Laboratorio de Bioquímica. Clínica Universidad de Navarra
•Patiño, Ana•Alkorta, Gorka
Unidad de Genómica. CIMA LAB Diagnostics
•Gil-Bazo, Ignacio•Perez-Gracia, Jose Luis•Andueza, Mapi
Departamento de Oncología. Clínica Universidad de Navarra
• Roche Diagnostics España• DIANA
FinanciaciónMuchas Gracias
Congreso Nacional Laboratorio Clínico 2018
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