Anteproyecto Practica Empresarial procedimientos de pcr-gds

8/19/2019 Anteproyecto Practica Empresarial procedimientos de pcr-gds

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FORMATO DE ANTEPROYETO DE LA PRACTICA EMPRESARIAL

INSTITUCIÓN O EMPRESA:

INSTITUTO DEPARTAMENTAL DE SALUD DEL CAQUETA (LABORATORIO DE

ALIMENTOS)

NOMBRE DEL ANTE-PROYECTO:

Determinación de Salmonella spp.  Por PCR-TR aimento! c"rnico! de con!#moam$#ante en e m#nici%io de &orencia - Ca'#et"

PRACTICANTE:

 UANDA*ID LATORRE TORRES

+ SEMESTRE DE IN, DE ALIMENTOS

COD ./0/./..12

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FORMATO DE ANTEPROYETO DE LA PRACTICA EMPRESARIAL

OBJETIVOS:

  General

Determinar Salmonella spp. %or %cr-tr aimento! c"rnico! (em$#tido!) decon!#mo am$#ante identi3cando o! acance! 4 e5ecti6idad de a!cam%a7a! de !a#$ridad en e m#nici%io de &orencia Ca'#et"

Espec!c"s

• Ind#cción en mane8o 4 contro en m#e!tra! en %roce!o de identi3caciónde Salmonella spp. en e e'#i%o PCR-TR

• Identi3cación de !ectore! de ma4or incidencia de con!#mo de aimento!en 6enta! am$#ante! en e m#nici%io de &orencia Ca'#et"

• Reai9ar #n m#e!treo re%re!entati6o de o! %rod#cto! c"rnico! de ma4orcon!#mo

• Detección de Salmonella spp. Por m:todo e;tracción de ADN 4 an"i!i!

con e PCR-TR•  Ta$#ar 4 anai9ar dato! %ara tomar o! correcti6o! nece!ario! %ara #na

ma4or %re6ención de contaminación de Salmonella spp.  en aimento! de6enta am$#ante

IMPACTO # JUSTI$ICACIÓN:

Las bacterias pertenecientes al género Salmonella, familia Enterobacteriaceae, se caracterizan por ser bacilos gram negativos, anaerobios facultativos, utilizan citrato como única fuente de carbonoy poseen metabolismo de tipo oxidativo y fermentativo.(Méndez !"#"$

En zoonosis, la salmonelosis es el de mayor distribuci%n en el mundo, siendo la  samonella spp. su

causante, provocando pe&ue'os brotes siendo entre el " y el )" * casos espor+dicos(+nez !"")$.

Se -an -ec-o grandes esfuerzos en materia de prevenci%n para el control de las enfermedadestrasmitidas por alimentos por parte de las industrias y de las entidades encargadas del control.Muc-os pases, como Estados /nidos, 0anad+ y 0olombia, tienen establecido dentro de sulegislaci%n 1cero tolerancia2 para este pat%geno. tomando en referencia la gran importancia &ue -atomado La identificaci%n y aseguramiento de La inocuidad de los alimentos de estemicroorganismo, es importante realizar los procedimientos &ue permitan tener los resultadosinmediatos, al contrario de los procedimientos microbiol%gicos convencionales &ue se demoran-asta los das para arro3as los resultados. (+nez !"")$

Entre las técnicas moleculares aplicables a la detecci%n de pat%genos como Salmonella spp enalimentos, encontramos4 5eacci%n en 0adena de la 6olimerasa (605$, 5eacci%n en 0adena de la6olimerasa en tiempo real (&605$, pirosecuenciaci%n, amplificaci%n basada en la secuencia del+cido nucleico (78S98$, :ibridaci%n de 8;7 con sondas y microensayos, entre otras. La m+sutilizada es la 605, cuyo ob3etivo principal es la multiplicaci%n in <itro de uno o variossegmentos de 8;7, por acci%n una enzima 8;7 polimerasa, 8;7 dependiente termoestable.6ara esto, el 8;7 bicatenario debe estar desnaturalizado para formar cadenas lineales en presencia de altas concentraciones de oligonucle%tidos y cloruro de Magnesio, entonces dos

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cadenas nuevas del dúplex original deben ser formadas. Esta técnica es simple, reproducible,r+pida y flexible. ;esde entonces se presentan muc-as variantes de este método como la 605 múltiple y la 605 en =iempo 5eal (&605$ adem+s se -a implementado 3unto con técnicas como,

la -ibridaci%n de 8;7, el uso de bioc-ips y de enzimas de restricci%n, entre otras, &ue facilitan eldiagn%stico microbiol%gico molecular de pat%genos en diferentes matrices. ;esde #>>! muc-asinvestigaciones est+n encaminadas al diagn%stico molecular de Salmonella a través de la técnicade 605 empleando diversos sets de oligonucle%tidos, en las &ue se -a evaluado la selectividad, laespecificidad y la sensibilidad de estos frente a la prueba microbiol%gica, considerada como la prueba de oro (tabla n? #$ (@onz+lez !"#A$.

  =abla 7?# técnicas microbiol%gicas tradicionales

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METODOLOG%A:

6rocedimiento 60B=5. 6ara la extracci%n del 8;7 se pesaron !C g de cada muestra y seinocularon en !!C ml de agua con peptona, la cual se incubo a D ?0 durante !A -oras. 8 partir de

este, se transfirieron C" Fl de cada muestra a los tubos de microcentrifuga &ue contenan lasoluci%n de extracci%n y de lisis ($. 6osteriormente, se colocaron en ba'o de mara por #Cminutos a ) ?0 y se de3aron enfriar durante un minuto a #) ?0 luego se centrifugaron a )."""rpm durante un minuto para recuperar el 8;7 purificado.

;espués de extrado el 8;7 bacteriano directamente del alimento, se tomaron C Fl delsobrenadante y se le adicionaron #C Fl del 605 mix compuesto por #D Fl de master mix sondas:ybprobe mas 8;7 de salmonella mas control interno especifico para Salmonella, # Fl desolucion de enzima, # Fl control interno, la mezcla del 8;7 y 605 mix se centrifugo a D.""" rpmdurante D segundos. Los resultados de la amplificacion se compararon con un control positivorepresentado por un est+ndar de Salmonella incluido en el kit y un control negativo en el cual el

8;7 de la muestra fue reemplazado por C Fl de agua esteril. La técnica de 605 en tiempo real sellevo a cabo según el protocolo kit , el cual consistio en A ciclos compuestos por tres pasos,desnaturalizaci%n (>C o0 por ! minutos$, anillamiento (A" o0 por D" segundos$ y amplificaci%n(! o0 por DC segundos$ en el e&uipo (el proceso puede variar dependiendo del e&uipo utilizado$.

BIBLIOGRA$IA:

- Méndez G 9adillo 0 6arra @ Haccini I. 0aracterizaci%n microbiol%gica de Salmonella enalimentos de venta calle3era en un sector  universitario de 9ogot+, 0olombia. Julio aoctubre de !"#" revista de los estudiantes de medicina de la universidad industrial deSantander. 9K@K=8 ;0. !"#".

- anez E Mattar S. ;urango 8. ;eterminaci%n de Salmonella spp. por 605 en tiempo real

y método convencional en canales de bovinos y en alimentos de la va pública deMontera, 0%rdoba /niversidad de 0%rdoba, Gnstituto de Gnvestigaciones 9iol%gicas del=r%pico, Hacultad de Medicina <eterinaria y ootecnia. <olumen #! 7o A B ;iciembre de!"").

- @onz+lez J. 6ereira 7. Soto . :ern+ndez E. <illareal J. 8islamiento microbiol%gico deSalmonella spp. y -erramientas moleculares para su detecci%n. 5evista de Salud/7G7K5=E. 9arran&uilla (0ol.$ !"#A

Cronograma de actividades

CRONOGRAMACONCEPTO Per&"'" ( Per&"'" ) Per&"'" * Per&"'" +

OBJETIVO GENERAL:  DeterminarSalmonella spp.  %or%cr-tr aimento!c"rnico! identi3caro! acance! 4

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e5ecti6idad de a!cam%a7a! de!a#$ridad en e

m#nici%io de&orencia Ca'#et"

OBJETIVOESPEC%$ICO (:ind#cción mane8oPCR-TRMETA (e!t#dio 4 mane8o

Acti6idad/e!t#dioteórico

+ +

Acti6idad< e!t#dio%ractico

+ +

META ): Acti6idadCorre!%ondiente ACrono=rama DeLa$oratorio 

Acti6idad/acti6idaddiaria

+ + + +

OBJETIVOESPEC%$ICO ):

Identi3cación de!ectore! decon!#mo deaimento!am$#ante! en&orencia Ca'#et"

META (: $>!'#edade dato! o$tenido!

%or e a$oratorio %arae!t#dio

corre!%ondienteActi6idad/ca!i3car

%#nto! de6enta!am$#ante!

+ +

META ):  Acti6idadCorre!%ondiente ACrono=rama DeLa$oratorio

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Acti6idad/acti6idaddiaria

+ + + +

OBJETIVOESPEC%$ICO *:Reai9ar #nm#e!treore%re!entati6o deo! %rod#cto!c"rnico! de ma4orcon!#mo

META (: recoecciónde m#e!tra!

Acti6idad/identi3carm#e!tra!m"!re%re!entati6a!

+ +

Acti6idad<adec#ación de am#e!tra

+ +

META ): %re%araciónde a m#e!tra

Acti6idad/c#ti6ode a!m#e!tra!

OBJETIVOESPECI$ICO +:Detección deSalmonella spp.  Porm:todo e;tracciónde ADN 4 an"i!i!con e PCR-TR META (:  e;tracción

de ADNActi6idad/e;tracciónde ADN deo!c#ti6o!reai9ado!

+ +

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META ): an"i!i! %orPCR-TR

Acti6idad/ an"i!i!

de ADN%orm:todo dedetecciónen PCR-TR

+ +

OBJETIVOESPESI$ICO ,:

 Ta$#ar 4 anai9ardato!? acti6idade!de ca%acitación en%re6ención

META (: ta$#ardato!

Acti6idad/ ordenar4 =enerardato!co@erente! %arae!t#dio

; ;

Mea ): ca%acitaciónen BPM! ($#ena!%r"ctica! deman#5act#ra)

Acti6idad/ca%acitación

; ; ; ;