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CASOS C1INICOS
Anticuerpos Dna como Ayudo en elDiagnóstico de Lupus EritematosoDiseminado y otros EnfermedadesInflamatorios o NeoplósicasDr. Alvaro Gutiérrez D. *Dra. Ana Abigail Porras M. **Dr. Ricardo Castro D. ***
La determinación de anticuerpos DNA dedoble hélice, ha sido utilizada en eldiagnóstico de Lupus Eritematoso Diseminado, sin embargo, los anticuerpos de hélice simple, más fáciles de determinar en ellaboratorio, no han sido evaluados ampli;Jmente para el diagnóstico de Lupus Eritematoso y Artritis Reumatoidea. En el presenteestudio, fue utilizada la técnica de cuantifi·cación de los anticuerpos DNA de hélicesimple, por absorción y contraelectroforesis.
Pacientes con LED mostraron títuloselevados de anticuerpos DNA en formaconstante mientras que la AR, fueronvariables.
Se concluye que esta prueba, asociada aotros parámetros, es de gran ayuda diagnóstica.
J\.fATERIALES y METODOS
Nos basamos que éste trabajo en el es·tudio de 500 pacientes internados en elHospital San Juan de Dios con diversas pa·tologías. Ciento tres pacientes en estudiofueron diagnosticados con los criterios clí·nicos y de laboratorio usuales, como LED oArtritis Reumatoidea (AR). Los criterios
*Universidad de Costa Rica, Facultad de Microbiología, Depto. de Análisis Clínicos.
**Hospital San Juan de Dios, Laboratorio Clínico,Sección de Hematología.
***Hospital San Juan de Dios, Sección Ortopedia.
Clínicos en que nos basamos para la clasifi·cación como AR o LED fueron los siguientes:
AR: poliatralgias con flogosis articular, pre·senci;J de rigidez o deformid;Jdes articulares,nódulos subcutáneos.
LED: erupción cutánea eritematosa en cara,cuello o extremidades. Artritis o polioartri·Lis. pleuresía. Síndrome de Raynaud onefritis. Para LEO. la presencia de célulasLE en el transcurso de la enfermedad fue unfactor indispensable en el diagnóstico.
Pacientes en que el diagnóstico de certezano pudo establecerse, no fueron considerados en el análisis de los datos, en los quese incluyó únicamente, lupus eritematoso di·seminado o AR bien definidos. Otro grupode pacientes con diversas patologías en lasque se incluyen trastornos renales, cardíacos,problemas hematológicos, colelitiasis,colecistitis y algunas virosis fueron estudiados pero no incluidos en este reporte. Seincluye en el estudio, 100 sueros de personasaparentemente normales.
E st os sueros fueron analizados hastadonde fue posible el mismo día de la extracción o fueron guardados en congelación,por un período no mayor de 48 horas antesde ser procesados.
Después de analizados fueron guardadosen congelación a -20"C: un porcentaje de
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ellos, (20%) fueron estudiados nuevamentepor anticuerpos después de 4-6 meses paraobservar si la congelación afectaba de algunamanera los títulos obtenidos. Los anticuerpos que son de hélice simple, se midieron siguiendo la modificación de Arquembourg que brevemente se describe de la siguiente manera:
1° Fase de absorción del anticuerpo
Se utiliza placas de microtitulación en U(Cooke Engineerie Ca). En cada huequecillose coloca 0.025 mI. de búffer Tris pH .8. Enel huequecillo 1°, se coloca 0.025 mI. deDNA* con una concentración de 5.12 mg/mlpreparado en búffer Tris, desnaturalizadopor calentamiento en baño de agua a ebu-.llición por 10 minutos. Se hace dilucionesdobles seriadas hasta el huequecillo número 6 para obtener concentraciones de DNAde 2.56 mg/dl a 0.8 mg/dl. Posteriormente seagrega 0.025 mI de suero a cada uno de loshuequecillos, se mezcla y se incuba a 37"Cpara su absorción, durante una hora. *(CalfThymus, tipo V. Sigma Chemical Ca.)
2° Fase de contraelectroforésis (CEP)
Se preparan placas de vidrio de 31/4x x 4pulgadas (Kodak proyector slide) recubiertascon Ionagar al 0.80'0 (Ionagar NO'2 Oxoid) enbúffer Tris 6.8.
Se perforan hileras pares de huequecillosse'parados 5mm entre sí, con 2mm de diámetro. Se practica una CEP a 50 voltios, por30 minutos en el suero absorvido, contra unasolución de DNA 0.2 mg/ml desnaturalizadopor calor.
Posteriormente se tiñen, con una soluciónde Pyronina Y al 0.05 %; para identificar laslíneas de precipitación. Consideramos queno era necesario hacer titulaciones intermedias entre las escogidas por lo que mantuvimos los títulos de 80, 160, 320, 640,1280, 2560 como las diluciones de trabajoen todo estudio. En todos los sueros estudiados, se practicó la determinación de células LE, RA y anticuerpos antinucleares enlátex y titulación de complemento.
RESULTADOS y DISCUSION
De los 600 sueros analizados, 22 corres-
pondían a pacientes con LED, 81 con AR,100 a personas aparentemente sanas y elresto a diversas patologías.
Los cuadros 1 y II corresponden a la distribución de frecuencias de los títulos deanticuerpos DNA en LED y AR respec
'tivamente.Para LED, observamos que los títulos
oscilaron entre 640 y 2560 con una mayorincidencia en los títulos de 2560; en ningunode los casos analizados, se obtuvo nivelesmenores a 640. Todos los casos de LED,excepto uno, pertenecían al sexo femenino.
Com¡nrativamente encontramos en AR,una diversidad en los niveles de anticuerposque oscilaron desde los más altos en 2560hasta negativas; predominaron en esta enfer·medad, los títulos de 640 que representaronun 31 % de la muestra. Estos hallazgos vienena corroborar lo descrito en la literatura sobreel aparecimiento de anticuerpos DNA enotras enfermedades del tejido conectivocomo son la AR y la AR juvenil (16, 19).Una distribución de los resultados anteriorespor sexo, no mostró una diferencia significativa.
Las tablas III y IV nos muestran unadistribución de los títulos de anticuerposencontrados en estas dos enfermedades citadas por edades. Del análisis del cuadro sedesprende que la edad no tiene relacióndirecta con niveles de anticuerpos.
Durante la Fase aguda y mientras elpaciente no recibió tratamiento se observaron títulos de anti DNA altos, con nivelesbajos de complemento que oscilaron entre Oy 80 unidades de complemento 50% (CH50).Esto concuerda con los resultados de variosinvestigadores (20, 21, 22) con anti DNA dedoble hélice.
Por espacio de un alío tuvimos oportunidad de obtener muestras seriadas de 5pacientes con LED, que se presentaron a laConsulta Externa del Hospital San Juan deDios para recibir atención en forma periódica; logramos observar que durante eltiempo en que se mantuvo el tratamiento,los títulos de anti DNA bajaron y los nivelesde complemento aumentaban hasta recuperar sus valores normales.
La titulación de complemento en AR nomostró cambios significativos en las muestrasde los pacientes examinados oscilando los
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valores entre 80-45 u CH50 como se anotaen la tabla V. Tanto a los pacientes con LEDcomo a los de AR, se les practicó determinaciones de anticuerpos antinucleares yprueba para AR en látex.
Los pacientes con LED fueron positivosen un 47% para la prueba de AA (látex) y un6% para AR (Látex). Por otra parte lospacientes con Artritis Reumatoidea fueronpositivos en un 60% para la prueba de AR(látex) y todos negativos para AA (látex).
Como puede observarse en la tabla VI, enlos pacientes con AR no encontramos unarelación directa entre los títulos de anti DNAy los títulos de RA (Látex). Los títulos deanti DNA obtenidos para otras patologías sonmuy variados, encontrándose muy elevadas,al igual que en LED, únicamente en pacientescon hepatitis viral y algunos linfomas (Gutiérrez y col. en preparación).
La tabla # 7 muestra una distribución enpo b la ción aparentemente normal observándose que el 96% de los pacientes muestran títulos menores de ] 280 sin encontrarsediferencias significativas por edad.
Con el fin de demostrar la estabilidad delanticuerpo DNA, en los sueros analizados, sepracticaron determinaciones a 100 muestrasde diferentes títulos luego de permanecer encongelación por espacio de 4-6 meses; no seobservaron cambios significativos en los títulos originalmente obtenidos.
CONCLUSIONES
No existen pruebas de laboratorio de
verdadero valor diagnóstico de artritis reumatoidea.
Las pruebas de Látex para AA y AR, noson parámetros confiables en el diagnósticode estas dos entidades clínicas dado elimportante número de falsos negativos quese observan en las pruebas.
La determinación de anticuerpos DNA esmás específico para el diagnóstico de LEDya que todos los pacientes mostraron tenertítulos altos, mientras que aquellos con ARpresentaron títulos variables. Es importanterealizar determinaciones del complementosérico con las de anticuerpos DNA ya que laasociación de títulos altos de anti-DNA conniveles bajos de complemento sérico es lacaracterística más comúnmente encontradoen pacientes con LED.
La disminución importante de los títulosde anti-DNA en pacientes con LED sometidos a tratamiento médico, nos permiterecomendar esta técnica como valioso indicador de la respuesta del paciente al tratamiento médico.
AGRADECIMIENTO
Este proyecto fue financiado parcialmente con fondos de la Vicerrectoría dcInvestigación de la Universidad de CostaRica bajo el proyecto 002-007 -038.
Los autores agradecen a los DoctoresJorge Collado y Rafael (armona por su asistencia técnica y al Dr, Víctor MI. Villa rejosen la revisión del manuscrito y sus valiosasobservaciones sobre el proyecto original.
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Tabla # 3
mSTRIBUCION POR EDADES DE TITULOS DE ANTI-DNA
EN LUPUS ERITEMATOSO OJSEMINADO
TITULOS DE ANTI DNA
Grupo deedades O 80 160 320 640 1280 2560 r
10-19 O O O O 1 O O 1/120--29 O O O O 1 2 2 5/5
30-39 O O O O O 1 3 4/4
40-49 O O O· O O 1 2 3/3
50--59 O O O O O O O O
60- + () O O O 1 1 O 2/2
dese. O O O O O 2 5 7/7
TOTAL O O O O 3 7 12 22/22
Tabla # 4
DISTRIBUCION POR EDADES DE TITULOS OE
ANTI-DNA EN ARTRITIS REUMATOIDEA
TlTULOS DE ANTI DNA
Grupo deedades O 80 160 320 640 1280 2560 r
10-19 2 O 1 O 4 1 O 6/8
20-29 3 O 1 2 2 1 1 7/10
30-39 2 O O O 3 O O 3/5
40-49 1 O 1 2 5 1 1 10/11
50-59 1 O 2 O 1 3 O 6/760- + 2 O 1 1 2 1 1 6/8
dese- 2 O 5 3 5 8 6 27/29
TOTAL 13 O 11 9 25 15 9 65/80
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Tabla # S
NIVELES DE COMPLEMENTO (CHSO) y ANTI DNA
EN PACIENTES CON ARTR ITlS REUMATOIDEA
PACIENTE
O.N.C.W.F.AA.F.B.H.P.B.R.R.V.J.N.B.M.J.M.J.D.M.E.J.N.M.S.M.D.M.P.M.B.M.J.M.A.M.G.G.M.C.H.C.M.H.C.M.Ch.
NIVELES DE C'
8097
100120122125130130150150170170180230235295315
NIVELES DE ANTI DNA
Neg.640640
12801280640640640
12801280640640160Neg.
1280640320
Tabla # 6
RELACION ENTRE TITULOS DE ANTI DNA
Y RA TEST EN ARTRITIS REUMATOIDEA
TITULOS DE ANTI DNA
TITULaSDE RA o 80 160 320 640 1280 2560 r
320 o O o o 1 2 o 3/3160 1 o o o O 2 o 2/380 O O 1 o O 3 o 4/440 o o 1 O o o o 1/120 3 o 3 1 4 2 o 10/1310 O O O O 1 O O 1/1
Neg. 4 O O 5 10 3 1 19/23
TOTALES 8 O 5 6 16 12 40/48
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Tabla # 7
DETERMINACION DE ANTICUERPOS DNA EN POBLACION NORMAL
TITULOS DE ANTI DJ."IJA
Grupo de N° examinadoedad -5 20 40 80 160 320
lO-14 7 4 1 l O O l
15-19 23 l8 1 O 3 l O
20-29 24 20 O 2 2 O O
30-39 20 15 O l 2 2 O
40- + 26 20 O 4 2 O O
TOTAL lOO 77 2 8 9 3
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o ó
E9 '?12
11
10
9
8
en 7¡,¡f-<Z¡,¡
O 6..:o.'1l:
5
4
CUADRO I
DlSTRIBUCION DE FRECUENCIAS POR TITULOS DE
ANTI-DNA EN LUPUS ERITEMATOSO DISEMINADO
O 80 160 320
TITULOS DE ANTI-DNA
640 1280 2560
Act. Méd. Costo - Vol. 22 - No. 2, 1979 - 199-207 205
28
26
24
22
20
18
'".(z16O
'"~¡¡J
"" 14~
12
10
8
6
4
2
CUADRO JI
DISTRIBUCION DE FRECUENCIAS POR TITULOS DE
ANTI DNA EN ARTRITIS REUMATOIDEA
Dó~o
O 80 160 320 1280 1280 2560
TITULOS DE ANTl DNA
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