ANTICUERPOS MARCADOS 2012

Prof: Liliana Castro

ANTICUERPOS MARCADOS:

“LOS ANTICUERPOS POR SU EXQUISITA ESPECIFICIDAD PARA DETERMINADOS

ANTÍGENOS HACE QUE SEAN REACTIVOS MUY ÚTILES PARA

DETECTAR, PURIFICAR Y CUANTIFICARAGS”.

ANTICUERPOS MARCADOS:

ANTICUERPOS MARCADOS:

EXISTEN TÉCNICAS BASADAS EN ACSPARA ESTUDIAR PRACTICAMENTE

CUALQUIER TIPO DE MOLÉCULA EN SOLUCIÓN O EN CÉLULAS.

ANTICUERPOS MONOCLONALESO POLICLONALES

Anticuerpos monoclonales:Son aquellos Acs que derivan de un sólo clon de linfocitos B y son específicos para un epítope determinado, constituyendo una población homogénea

Anticuerpos policlonales:Son aquellos que proceden de distintos clones de linfocitos B estimulados.

ANTICUERPOS MARCADOS:

Obtención de Anticuerpos Monoclonales:

1. Inmunización de animalescontra el antígeno para elque se desea producirAnticuerpos (Resp poli)

2. Fusión de los linfocitos Besplénicos(memoria) con células de mieloma formandohibridomas

3. Selección de aquelloshibridomas que seanproductores de lasinmunoglobulinasespecíficas deseadas

4. Clonación

1.- Un linfocito B de un animal previamente inmunizado con el Ag de interés, que aporta la memoria inmune y la capacidad de producir Acs contra el Ag específico.

2.- Una célula tumoral de mieloma no secretora de Acs, deficiente en la enzima hipoxantina- guanina fosforribosil transferasa (HGPRT), útil en el proceso de selección posterior de los hibridomas, que aporta su capacidad de división ilimitada (inmortalidad).

3.- De ésta unión surge un tipo de célula inmortal con lacapacidad virtualmente ilimitada de producción de Acs monoclonales, llamada hibridoma.

Células empleadas para laObtención de Anticuerpos Monoclonales:

Obtención de Anticuerpos Monoclonales:

REACCIONES CONANTICUERPOS MARCADOS:

Son técnicas de INTERACCIÓN PRIMARIA, las cuales son muy sensibles y permiten laidentificación de Ags o Acs.

Existen 3 tipos de técnicas que se basan enla interacción primaria:1.- Los enzimoinmunoensayos (EIA),2.- Los radioinmunoensayos (RIA) y3.- Las técnicas de inmunofluorescencia (IF).

ANTICUERPOS MARCADOS:

Las señales detectadas en las técnicas son:1.- Colorimétricas EIA(enzimoinmunoensayo),2.- Radioactivas RIA(radioinmunoanálisis) o 3.- Fluorescentes IF(inmunofluorescencia),

Se deben a un reactivo denominado:CONJUGADO, que consta de un Ag o un Ac unido a una enzima, a un radioisótopo (en cuyo caso particular se denomina trazador o radioligando) o a un fluorocromo

Son denominados también ELISA defase sólida (enzyme-linked immunosorbent assay):Se cuenta con una fase sólida en la que se inmoviliza uno de los inmunorreactantes.(Ag o Ac)

Enzimoinmunoensayo (EIA):

La inmovilización, también llamada sensibilización, es la unión del Ag o Ac a

la fase sólida.

ELISA de fase sólida:(enzyme-linked immunosorbent assay):

Se usan para detectar y cuantificar anticuerpos y antígenos.

Enzimoinmunoensayos (EIA):

Las enzimas más usadas son:1.- Peroxidasa de rábano (HRPO o horseradish peroxidase)2.- Fosfatasa alcalina (FA)3.- Glucosa Oxidasa4.- Lisozima5.- Glucosa 6-P deshidrogenasa6.- β-Galactosidasa

Enzimoinmunoensayos (EIA):

Substratos correspondientes:

1.- P-nitrofenilfosfato2.- Ortofenilendiamina3.- Ortodianisidina4.- Sustratos incoloros

1.- Métodos no-competitivos

a) EIA con Ag unido a la fase sólida- Métodos directos- Métodos indirectos

b) EIA con Acs unidos a la fase sólida

Enzimoinmunoensayos (EIA o ELISA):

2.- Métodos competitivos

a) EIA con Acs unidos a la fase sólidab) EIA con Ag unido a la fase sólida

3.- ELISPOT

Enzimoinmunoensayos (EIA o ELISA):

LECTOR DE TIRAS ELISA

LAVADOR DE PLACAS

LECTOR DE PLACAS ELISA

PIPETAS

EQUIPOS NECESARIOS

Los ELISA no competitivos:

Pueden ser cuantitativos, semicuantitativos y cualitativos. Existen distintos tipos de “esquemas”:Tipo directo, “sandwich” o indirecto.

Ag + Ac-E Ag-Ac-E

Indica la presencia de Ag en la solución analizada

(ensayo ELISA simple de dos capas)

ELISA directo

RECOMENDACIONES:

1.- Incluir Controles Negativos que serán mxs del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tengala certeza de la ausencia del Ag buscado. 2.- Incluir Controles Positivos (soluciones donde se encuentra el Ag buscado, o bien se le ha añadido).

3.- Pocillo Blanco o de aire

-

ELISA directo :

DESVENTAJAS:1.- Poco empleados

2.- Necesidad de disponer de un conjugado enzimático para cada Ag que pretendamos detectar

El sistema de detección emplea dos Acs:- uno primario contra el Ag, y - uno secundario marcado contra el primario.

ELISA indirecto:

ELISA INDIRECTO

(peroxidasa, fosfatasa alcalina

Leer la D.O. mediante espectrofotometría

ELISA sandwich:

Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el 2do Ac.

La detección tiene > sensibilidad por la amplificación de señal debida a la unión de

2 o más Acs 2rios x cada 1rio.

Ac 1rio

Ac 2rio

(SANDWICH)

ELISPOT:

Es una modificación del ELISA

Permite la detección cuantitativa del Nº de cél en una población que produce Acs específicos contra un Ag determinado (o viceversa)

LECTURA del ELISA:

LECTURA del ELISA:

La señal será siempre proporcional a la [ ] de la molécula incógnita

ELISA: método competitivo:

Se basa en la competencia que se establece entre un Ag marcado enzimáticamente y el mismo Ag sin marcar (muestra objetivo), al ser colocados frente a una cantidad limitada del Ac homólogo fijado a  la fase sólida.

La cantidad de Ag es indirectamente proporcional a la cantidad de producto enzimático formado.

VENTAJAS DEL ELISA

1.- Alta sensibilidad y especificidad2.- Estabilidad de los reactivos3.- Costo accesible4.- Fácil manipulación, rapidez. 5.- No representa riesgos de contaminación

APLICACIÓNES DEL ELISA

1.- DETECCION DE Ac CONTRA AGENTES INFECCIOSOS:Enfermedades Bacterianas: Tifus, brucelosis, salmonelosisEnfermedades Parasitarias: Chagas, toxoplasmosis, amibiasisSchistosomiasis, malaria.Enfermedades Virales: Hep. A,B,C. rubéola, CMV, EBVEnfermedades Micoticas: Candidiasis, aspergilosis, etc

2.- Deteccion de hormonas: ACTH,insulina, TSH, T3,T4, etc

3.- Deteccion Igs

4.- Marcadores tumorales: CEA, alfafetoporteina, CA-19, CA-125, etc

Radioinmunoensayo(RIA):

Una sustancia marcada (radioactiva) seutiliza directa o indirectamente para medir de forma cuantitativa la sustancia no marcada, utilizando para ello Acsespecíficos.

ISÓTOPOS MÁS UTILIZADOS:I125, I131, C14

Radioinmunoensayo:

Se clasifican en:

1.- Directo o competitivos (RIA) y

2.- Indirecto o no competitivos (RBA, IRMA: Inmunoradiometría ).

Radioinmunoensayos:

Directo o competitivos (RIA):

Ags marcados o trazador (Ag*) conisótopos radioactivos reaccionan con Acs específicos, la [ ] de Ac seobtiene midiendo la emisión radioactiva producida por la formación de complejos.

Ensayos competitivos (RIA):

Radioinmunoensayos:

Ac +Ag* Ag*Ac

Ag AgAcAc +

Ag* Ag*Ac

Ag AgAc

Radioinmunoensayos:

2.- Indirecto o no competitivo:(RBA, IRMA)Capacidad de un isótopo de competir conotro Ag marcado ante una cantidad conocida de Ac, de forma que se produzca inhibición de la rx Ag-Ac y se pueda medir la cantidad de material no marcado que se agregó, pudiendo establecerse una proporción entre el Ag marcado y el libre.

RIA:

cpm

Dosis

cpm

Log Dosis

Logit B/ Bo

Log Dosis

Hipérbolas Sigmoideas Rectas

cpm

Dosis

cpm

Dosis

cpm

Log Dosis

Logit B/ Bo

Log Dosis

Hipérbolas Sigmoideas Rectas

cpm

Log Dosis

Logit B/ Bo

Log Dosis

Hipérbolas Sigmoideas Rectas

Una vez separadas las fracciones se mide la radioactividad y se obtienen gráficos de desplazamiento o curvas dosis-respuesta que permite encontrar la [ ] de cualquier de Ag no marcado que sea desconocido.

Radioinmunoanálisis (RIA)Características:

1.- Método de gran sensibilidad2.- No exentos de inconvenientes (empleo deisótopos radiactivos)3.- Gran auge en sus comienzos (década 60´)4.- En la actualidad de empleo mas restringido5.- Muchas aplicaciones han sido sustituidas porotras técnicas que ofrecen mas ventajas6.- Son las más sensibles de las técnicas. 7.- Los equipos que se usan para su mediciónson sumamente sensibles.

Radioinmunoanálisis (RIA)

Aplicaciones:

1.- Detección y cuantificación de Agsy Acs, en labs de Bioquímica

2.- En la Endocrinología para cuantificarhormonas y drogas con exactitud. ([ ] entre pico y femtomolares).

Es un método de lectura que se basa en el principio de emisión luminosa a través de una

reacción (Enzima-Sustrato).

Quimioluminiscencia:

Indicadores o moléculas quimioluminiscentes utilizados:- Luminol - Isoluminol- Éster de acridina-Tioesteres y sulfaminas, y - Ésteres de fenantreno.

Marcadores de enzimas- Fosfatasa alcalina,- Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa,- Peroxidasa del rábano,- La luciferasa de la renilla, y- La xantina oxidasa

La quimioluminiscencia es un métodoAutomatizado, el tiempo de elaboración de la pbaes mucho más corto y mucho menos tedioso. Disminuye el riesgo de efectos operadores enlas determinaciones inmunológicas.

La emisión de luz se produce por una rx espe-cífica química.Se involucran las siguientes sustancias según el sistema automatizado que sea utilizado:-Éster de acridina, peróxido-ácido, hidróxido de sodio, fosfatasa alcalina. En el caso de ésta rx el agente quimioluminis-cente es el éster de acridina que es oxidado por el peróxido-ácido y el hidróxido de sodio.

MECANISMO DE REACCIÓN

Ventajas de la quimioluminiscencia:

1.- Sensibilidad (límites de detección de moles,nanogramos, picogramos)2.-Velocidad (señal generada en unos pocos segsy en algunos casos estable por varias horas)3.- Sin residuos peligrosos, y4.- Procedimientos simples.

Aplicaciones: -En inmunoensayos, -Marcaje de proteínas, -Ensayos en moléculas de DNA.

Inmunofluorescencia

Consiste en inmovilizar células, bacterias u otras partículas naturales sobre un portaobjeto o similar, donde la incógnita puede ser tanto:1.- Ag [se puede realizar una inmuno-fluorescencia directa (IFD)] o2.- Ac [una I indirecta (IFI)].

I. DIRECTA I. INDIRECTA

Inmunofluorescencia

FLUOROCROMOS MAS UTILIZADOS.1.- RODAMINA. (Isotiocianato de tetrame-tilrodamina) 550nm . Rojizo2.- FLUORESCEÍNA: (Isotiocianato de fluo-resceína) 490-495 nm. Amarillo/verdoso3.- NARANJA DE ACRIDINA

FLUOROCROMOS: Sustancias químicas capaces de emitir luz cuando son excitadas por una determinada longitud de onda.

Fluorocromo unido al Ac específico.Empleada para detección de Ags en diferentes muestras. Principal inconveniente: Necesidad de disponer de difs Acs conjugados (uno por cada tipo de Ag que se quiera detectar)

Secuencia de reacción:

Ag + Ac-F Ag-Ac-F

Inmunofluorescencia directa (IFD):Inmunofluorescencia directa (IFD):

INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA

Secuencia de reacción:

Paso 1: Ag + Ac1 Ag-Ac1

Paso 2:

Ag-Ac1 + Ac2-F Ag-Ac1-Ac2-F

- Reacción en 2 pasos- Posibilidad de determinar la clase de Acs, mediante el empleo de conj anti-IgG, anti-IgM oanti-IgA- Pruebas relativamente rápidas

Inmunofluorescencia indirecta (IFI)

Inmunofluorescencia indirecta (IFI)

NEGATIVO POSITIVO

1.-Permite identificar Agespecíficos de patógenosen tejidos, cultivos decélulas y secreciones(IFD o IFI). 2.- Permite identificar Acespecíficos en suero(IFI)

Ventajas:

Inmunofluorescencia

Inmunofluorescencia

Desventajas 1.- Se debe utilizar microscopio UV.2.- Personal capacitado.3.- Infraestructura necesaria.4.- Fundamentalmente Cualitativa5.- Poca reproducibilidad (subjetividad del operador).