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Aplicaciones de las Técnicas de Detección de
Ácidos Nucléicos en Medicina Transfusional
BIOQ. LILIANA DI TULLIO BUDASSI
FAC. CS .BIOQUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE ROSARIO
lilianadt2003@yahoo.com.ar
HIV: screening y diagnóstico de laboratorio, Breve repaso…
Los métodos de screening se basan principalmente en labúsqueda de anticuerpos anti-HIV (O,1,2). (ELISA o EIA:1°, 2°, 3° generación)
Existe el test de detección del antígeno HIV: detección delAg p24 (ELISA 4° generación)
Ensayos combinados antígeno-anticuerpo.
Al igual que con otros retrovirus, los portadores deanticuerpos son portadores del virus.
Los anticuerpos anti-HIV y ag p24 aparecen de maneratemprana: existe un período de ventana serológico de 21días hasta la seroconversión.
Los anticuerpos permanecen durante toda la vida.
El diagnóstico comprende 2 etapas: tamizaje y confirmaciónpor Inmunoblot (Western Blot)
Screening/ Diagnóstico molecular: NAT: TMA o PCR;CV;genotipificación; test de resistencia
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Recomendaciones de la OMS para ITT en donantes de Sangre (1)
……”Los métodos utilizados para identificar la presencia HIV emplearán los siguientes targets”…
Marcadores Serológicos
1. Anticuerpos anti-HIV-1, incluyendo grupo O, + anti-HIV-2 (EIA, CLIA)
2. Antígeno del HIV p24 (p24 Ag) (EIA, CLIA)
Ácido nucléico viral: HIV RNA.
Fuente:Screening Donated Blood for Transfusion Transmissible Infections. Recommendations. WHO Library Cataloguing-in-Publication Data 2009
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HIVEvolución clínica de la Infección
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Período VentanaModel Testing Data
Fuente: -Busch et al. Transfusion.2005;45(2):254-264.
-Kleinman and Busch. Transfusion. 2006;36:S23-S29
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NAT REACTIVO
Tiempo
Infección
Reactividad Serológica
HIV-1 : 19 días
Virus
Detección más temprana
HIV-1 : 5-6 días
OBJETIVO DE NAT:
Disminución del período de ventana
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Reacción inmunePeríodo Ventana
Eclipse
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Ácidos Nucléicos Definiciones
DNA y RNA son polímeros que almacenan ytransmiten información del código genético
Nucleótidos son subunidades de DNA o RNA queconsisten en un azúcar, un grupo fosfato y unabase A, G, C, T or U
Las Bases se aparean y se mantienen unidas porpuentes de hidrógeno
C se une a GA se une a T (sólo DNA) A se une a U (sólo RNA)
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Ácidos Nucléicos Definiciones
Oligonucleótidos:
Polímeros sintéticos Simple hebra Dos o más nucleótidos De Captura, Cebadores (Primers), o Sondas
(target)
Target
Oligonucleotide
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Ácidos Nucléicos Definiciones
Sondas:
Oligonucleótidos con un molécula detectora acoplada
Detector: molécula de Éster de Acridinio (AE), SYBRGreen, Molecular Beacons , etc.
Sonda de oligonucleótidos
Blanco (Target) Molécula Detectora
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Ácidos Nucléicos Definiciones
Amplicones:
Copia sintética de una secuencia de DNA o RNA
Durante la amplificación, hay un incremento exponencial
del número de copias hecho a partir de un fragmento de
RNA o DNA
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TÉCNICAS BASADAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR
Involucran tres etapas:
1. Extracción o captura del genoma viral
2. Amplificación
3. Detección
Ejemplos:
PCR(Polymerase Chain Reaction)
RT-PCR (Real Time PCR)
NASBA (Nucleic Acid Based on Amplification)
TMA (Transcriptional Mediated Amplification)
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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
PCR es un proceso enzimático en el que unaregión específica del DNA se replica paraproducir muchas copias de una secuenciaparticular. Utiliza ciclos repetidos, cada uno delos cuales consiste de tres pasos:
1. Extracción y purificación de los ácidos nucléicos delmicroorganismo de la muestra biológica.
2. Amplificación de un segmento seleccionado del genomadel microorganismo mediante reacción en cadena de lapolimerasa, es decir, la PCR propiamente dicha.
3. Detección de los fragmentos amplificados en la PCR(amplicones) por electroforesis en gel de agarosa ytinción con bromuro de etidio
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PCR - Conceptos básicos
Especificidad
Generación de un único producto de amplificación
EficienciaMáxima producción de amplificación en función del número de ciclos.
FidelidadNúmero de errores que comete la DNA polimerasa durante la copia.
SensibilidadMínima cantidad de ADN que se necesita para obtener una gran cantidad de copias
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Ciclos de la PCR
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Perfil básico de la PCR
Los ciclos (30-35) comprenden tres etapas:
Desnaturalización
Alineamiento (annealing)
Extensión
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PCR Real Time
Los procesos de amplificación y detección deuna PCR convencional se producen demanera simultánea en un mismo vialcerrado.
Mediante detección por fluorescencia sepuede medir durante la amplificación lacantidad de ADN sintetizado en cadamomento.
La emisión de fluorescencia producida en lareacción es proporcional a la cantidad deADN formado. Esto permite registrar lacinética de la reacción de amplificación.
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PCR Real Time
Los termocicladores para llevar a cabo la PCR atiempo real incorporan un lector de fluorescenciay están diseñados para poder medir, en cualquiermomento, la fluorescencia emitida en cada unode los viales donde se realice la amplificación.
Los sistemas de detección por fluorescenciaempleados en la PCR a tiempo real pueden ser dedos tipos:
agentes intercalantes
sondas específicas marcadas con fluorocromos
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TMA: Transcription Mediated Amplification
El ensayo de TMA comprende tres etapas principales que tienen lugar en un sólo tubo:
1. Preparación de la muestra: capturaselectiva del target
2. Amplificación selectiva del ARN del HIV-1 ydel HCV así como del ADN del HBV poramplificación mediante transcripción (TMA)
3. Detección de los productos de laamplificación (amplicón) por el ensayo deprotección de la hibridación.
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Pasos Principales del Ensayo
Detección
Captura del blancoo diana (target)
Amplificación
Paso de Amplificación- TMA
Transcripción-mediadapor amplificación (TMA):produce amplicones RNA
Transcriptasa Reversahace copias de DNAc delIC y del ácido nucléicoviral
RNA Polimerasa inicia latranscripción paraproducir productos deamplificación(amplicones)
Transcription-mediated amplification (TMA)
Promoter-primer
Target
DNARNA
DNA
Primer 2
DNA TemplatePromoter-
primer
RNAse H activities
RNAse H activities
RNA polymerase
100-1000copies RNA amplicon
Primer 2
(1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(12)
(11)
(10)
IVD Technology. Volume 6, No. 7, Nov/Dec 2000.
Detección - Ensayo de Cinética Dual (DKA)
RLU
(Relative
Light Units)
Interval 25
0/0 1 Sec/25 readings 2 Sec/50 readings
La emisión de luz es capturada y medidaen Relative Light Units (RLU)
TMA:ProcesodeEnsayoe Instrumentación
Amplificación
(TMA)
Rvo. Amp,
Aceite, y
Enzima
Captura
del Blanco
Lisis Viral
Captura del
blanco
Lavados,
Detección
(HPA)
Hibridización de
sondas
Selección
Resultados
(DKA)
Lectura
automática
URL
Pipeteo
wTCR
Calibradores,
Muestras,
Controles
PIPETEOMANUAL
TECAN
BAÑOS DE
AGUA,
SISTEMA DE
CAPTURA DEL
BLANCO
PIPETAS DE
REPETICIÓN,
BAÑOS DE
AGUA
BAÑOS DE
AGUA
LUMINOMETRO
HC+
Semi-Automación
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SEMI-
AUTOMATIZACIÓN
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AUTOMATIZACIÓN
Algoritmo de trabajo para el screening molecular de donantes
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Estudios complementarios para muestras RR HIV-NAT
Si es MP-NAT, abrir pool y resolverindividualmente, luego dHIV-NAT (ensayodiscriminatorio)
Si es ID-NAT ejecutar ensayosdiscriminatorios
Test BM cualitativos
Genotipificación
Test BM cuantitativos (Carga Viral meq/ml oCopias/ml)
Test de Resistencia Viral (TTO)
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Comparación entre el rendimiento de NAT-HIV esperado (gris) vs. observado (blanco) por millón de donaciones testeadas.Laperche et al. Vox Sanguinis (2007) 2, 78-84
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Gracias por su atención!!!
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