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de la columna en la búsqueda de nuevos

Sergio Alonso Orgaz

Doctor en Biología

Aplicaciones MARS Hu-14

biomarcadores de enfermedad Cardiovascular

Carlos Martínez Laborde

Licenciado en Química

Laboratorio de Fisiopatología Vascular (Dra. M.G.Barderas – Hospital Nacional de Parapléjicos)

Introducción Resultados Aplicaciones

Necesidad de nuevos biomarcadores

www.who.int/

Introducción Resultados Aplicaciones

El National Institutes of Health (NIH) estandarizó en 2001 la definición de biomarcador

como “una característica que se mide y evalúa objetivamente como indicador de

procesos biológicos normales, procesos patogénicos o respuestas farmacológicas a

una intervención terapéutica”

Proteínas Metabolitos

¿Qué es un biomarcador?

DNA / RNA

Introducción Resultados Aplicaciones

Desde el punto de vista proteómico, un biomarcador es una proteína o grupo de proteínas

cuya variación de expresión permita establecer un diagnóstico en una fase temprana de las

enfermedades, un pronóstico acerca de su desarrollo y/o una evaluación de la respuesta a un

tratamiento.

Proteínas como biomarcadores de enfermedad

Diagnóstico

Pronóstico Seguimiento

Introducción Resultados Aplicaciones

Para que un biomarcador sea interesante desde un punto de vista clínico tiene que cumplir

los siguientes requisitos:

Coste-efectivo Métodos no invasivos Estable y

fácil de cuantificar

Introducción Resultados Aplicaciones

Cualquier tipo de muestra biológica puede ser utilizada para la búsqueda de nuevos

biomarcadores de enfermedad, pero las más interesantes desde un punto de vista clínico

son:

Suero/Plasma Orina

Introducción Resultados Aplicaciones

Obtención mínimamente invasiva

Mínimo coste.

Fácil toma de muestra y procesado

Procesado (factores a tener en cuenta):

Plasma o Suero?

Modo de obtención (posición del paciente…)

Material de recolección de muestra

Almacenamiento (Tª y tiempo)

Inhibidores de proteasas

Ciclos de descongelación

¿Fuente de biomarcadores?

Reflejo de lo que ocurre en el organismo → MEZCLA

Proteínas en muy variadas concentraciones → dificultad detección biomarcadores

PLASMA

Introducción Resultados Aplicaciones

albumin

IgG transferrin

IgM haptoglobin

Complement C3 α-1-antitrypsin

α-2-macroglobulin IgA

fibrinogen

Composición del Plasma

Introducción Resultados Aplicaciones

From Anderson et al. 2002, Mol. Cell. Prot. 1, 867

Dynamic range is 9 to 10 magnitudes Albumin: 30-50 mg/ml Interleukin-6: 1-5 pg/ml

mg/ml

pg/ml

Rango dinámico de concentraciones proteicas en Plasma

Ac específico

Proteína retenida

Introducción Resultados Aplicaciones

MARS Human 14

97,5% - 99,9% de eliminación de 14 proteínas mayoritarias

Introducción Resultados Aplicaciones

H

H

H H

L

L L

H

L L

L L

L

H

H H H H

H H

H

H

H H

Proteínas minoritarias

Tampón A

Proteínas mayoritarias

Tampón B

20 μl plasma

Diluído 1:3 tampón A

Columna MARS Hu-14

HPLC

Proteínas mayoritarias

Fracción retenida

Proteínas minoritarias

Fracción no retenida

L L

L L

L

H

H H H H

H H

H

H

H H

94% de proteínas

plasmáticas

Potenciales biomarcadores

Proteínas a estudiar

Introducción Resultados Aplicaciones

1-Marcador de peso molecular

2-Suero completo

3-Fraccción de proteínas minoritarias

4-Fracción de proteínas mayoritarias

5-Marcador de peso molecular

6-Plasma completo

7-Fraccción de proteínas minoritarias

8-Fracción de proteínas mayoritarias

Suero

Plasma

Introducción Resultados Aplicaciones

4 7

Plasma completo

Tira IPG 24cm pH 4-7 y 10%SDS-PAGE

SD

S-P

AG

E 1

0%

Plasma deplecionado con MARS HU-14

Tira IPG 24cm pH 4-7 y 10%SDS-PAGE

*Gil-Dones F, et al Journal of Proteomics (2011). En Prensa

MARS Hu-14 Estudio proteómico de plasma en pacientes con Estenosis Aórtica

SD

S-P

AG

E 1

0%

4 7 pH pH

Introducción Resultados Aplicaciones

Plasma completo

Gel 2D-DIGE Plasma deplecionado MARS-14

Gel 2D-DIGE

4 manchas proteicas diferencialmente expresadas

3 aumentadas y 1 disminuídas (p<0.05)

*Gil-Dones F, et al Journal of Proteomics (2011). En Prensa

71 manchas proteicas diferencialmente expresadas

41 aumentadas y 30 disminuídas (p<0.05)

MARS Hu-14

Introducción Resultados Aplicaciones

Proteína 1

Proteína 3

Proteína 2

MARS Hu-14 Validación mediante Western Blot

*Gil-Dones F, et al Journal of Proteomics (2011). En Prensa

Plasma deplecionado MARS-14

pH 5,5 7

pH 5,5 7

Introducción Resultados Aplicaciones

MARS Hu-14 Validación mediante 2D-Western Blot

*Gil-Dones F, et al Journal of Proteomics (2011). En Prensa

Plasma completo

pH 5,5 7

pH 5,5 7

Introducción Resultados Aplicaciones

*Gil-Dones F, et al Journal of Proteomics (2011). En Prensa

MARS Hu-14 Validación mediante 2D-Western Blot

Plasma completo

pH 5,5 7

pH 5,5 7

Plasma deplecionado MARS-14

pH 5,5 7

pH 5,5 7

Introducción Resultados Aplicaciones

• La columna de afinidad MARS Hu-14 reduce la presencia de las 14 proteínas más

abundantes de suero, plasma, LCR y otros fluidos biológicos.

• Elimina ~ 94% del contenido total de proteína del plasma/suero.

• El sistema de eliminación de afinidad múltiple también ofrece la mayor facilidad de uso,

la mayor selectividad y reproducibilidad en comparación a cualquier otro sistema

equivalente de eliminación de proteínas mayoritarias.

• Como se ha podido ver en los resultados mostrados el uso de la columna MARS Hu-14

supone una excelente herramienta en la búsqueda proteínas como nuevos

biomarcadores de enfermedad.

MARS Hu-14 Resumen y conclusiones

Dra. M. G. Barderas

Dr. F. Gil-Dones

Dr. S. Alonso-Orgaz

Dr. F.de la Cuesta

C. M. Laborde

L. Mourino-Álvarez

F. Akerstrom

C. Bermúdez

Laboratorio de Fisiopatología Vascular Hospital Nacional de Parapléjicos (Toledo)

Gracias por la atención

Unidad de Proteómica Hospital Nacional de Parapléjicos (Toledo)

Dra. M. G. Barderas

Dra. V. M. Dardé

G. Barroso

A. Gallardo

Servicio de Cardiología Hospital Virgen de la Salud (Toledo)

Dr. L. R. Padial

Dr. L. F. López-Almodovar

Dr. J. Moreu