Bases moleculares de la tolerancia a disolventes orgánicos en Pseudomonas A. Segura, E. Duque, F....

Bases moleculares de la tolerancia a disolventes orgánicos en Pseudomonas

A. Segura, E. Duque, F. Junker, G. Mosqueda, A. Rojas,

P. Godoy, A. Hurtado, W. Teran, M. T. Gallegos and J.L. Ramos

CSIC-Estación Experimental del ZaidínGranadaESPAÑA

Los microorganismos tolerantes a disolventes orgánicos son útiles para:

Descontaminación de sitios muy contaminados

Biotransformaciones en sistemas de doble fase

Biosensores

*Inoue and Horikoshi, 1991, Nature 338, 264-266Pseudomonas putida, toluene tolerant

*Cruden et al., 1992, Appl. Environ. Microbiol. 58, 2723-2729P. putida , p-xylene tolerant

*Weber et al., 1993, Appl. Environ. Microbiol. 59, 3502-3504P. putida, styrene tolerant

*Ramos et al., 1995, J. Bacteriol. 177, 3911-3916P. putida, toluene tolerant and able to use toluene as the only carbon source

Cepas tolerantes a tolueno

*Pseudomonas putida DOT-T1E (aguas residuales)

*Pseudomonas putida MTB6 (suelo)

*Pseudomonas putida S12

Crecimiento de P. putida DOT-T1E in presencia de disolventes orgánicos a

Disolventes log PowCrecimiento (OD660)

n-Decanon-Octano

n-HeptanoPropilbenzeno

DietilphthalatoCiclohexano

Ethilbenzenop-xilenoEstirenoTolueno

1-HeptanolDimethilphthalato

BenzenoCloroformo

Butanol

5.64.54.13.63.33.23.13.13.02.52.42.32.02.0

0.8

>2.0>2.0>2.0>2.0>2.0>2.0>2.0>2.0>2.0>2.0>1.0>1.0<0.1<0.1<0.1

aCélulas cultivadas en medio LB en presencia de 1% (vol/vol) del disolvente

LB LB+tol(g)

+0.3% tol -0.3% tol-0.3% tol +0.3% tol

10-1 10-3

10-510-7

.... .... .. ...

... ... .... .. ..... ..... .

..

10-1 10-3

10-510-7

.... .... .. ...

... ... .... .. ..... ..... ..

.

10-1 10-3

10-510-7

.... .... .. ...

... ... .... .. ..... ..... .

.

10-1 10-3

10-510-7

.... .... .. ...... ..

. ..... ... .

200 40 600

5

10

Tiempo (min)

Log

UF

C

TOLERANTE

LB LB+tol(g)

+0.3% tol -0.3% tol-0.3% tol +0.3% tol

10-1 10-3

10-510-7

10-1 10-3

10-510-7

10-1 10-3

10-510-7

10-1 10-3

10-510-7

.... .... .. ...

... ... .... .. ..... ..... ..... .... .

. ...... ... .... .

. ..... ..... .

.... .... .. ...

... ... .... .. ..... ..... .

.

.

...

200 40 600

5

10

Tiempo (min)

Log

UF

C

SENSIBLE

200 40 600

5

10

Tiempo (min)

Log

UF

C

200 40 600

5

10

Tiempo (min)L

og U

FC

TOLERANTE SENSIBLE

¿Porqué son Pseudomonas DOT-T1E and MTB6 tolerantes a tolueno?

Barreras bioquímicas que implican el catabolismo de los compuestos Bombas de extrusión Barreras físicas que incrementan la rigidez de

membrana

¿Está el catabolismo de los disolventes orgánicos

implicado en la tolerancia?

Hay cepas tolerantes que no los degradan

Ver si mutantes que no degradan los disolventes y

son igual de tolerantes que la cepa silvestre

CH3

ISPTOL

ISPTOL

(todC1C2)FerredoxinTOL

FerredoxinTOL

(todB)ReductaseTOL

ReductaseTOL

(todA)

NAD+

NADH+H+

O2

CH3

OH

OH

H

H

toluene

cis-toluene dihydrodiol

NAD+

(todD)NADH+H+

CH3

OH

OH

3-Methylcatechol

O2 (todE)

Ring fission

X F C1 C2 B A TSIGED H

Time (minutes)

Log

CF

U

TodC1 mutant

tod

CC118pir pUTkan-phoA DOT-T1E

phoA kamR

Benzoato/Kan/Azules

KanR PhoA

SphI SphI

SphI SphI SphI SphI

SphI SphI

SphI

SphI

SphI SphI

SphISphI SphI

SphI

KanR

SphISphI

SphI

SphI

KanR

NotI SphINotI SphINotIMarcaje con DIG

Crecimiento en presencia de disolventes orgánicos

NingunoEtilbenzenolog Pow 3.5

Octanollog Pow 2.8

Toluenolog Pow 2.5

Silvestre + + + + + + + + + + + +

DOT-T1E-18 + + + + + + + + + --

DOT-T1E42 + + + + + + + + + --

DOT-T1E109 + + + + + + + + + --

¿Porqué son Pseudomonas DOT-T1E and MTB6 tolerantes a tolueno?Barreras bioquímicas que implican el

catabolismo de los compuestos

Otros factores

Barreras físicas que aumentan la rigidez de la

membrana

Bombas de extrusión

Bombas de eflujo

¿Es la tolerancia a disolventes un proceso

dependiente de energía?

*El rendimiento de cultivos crecidos en tolueno

es un 30% del obtenido en ausencia de tolueno

*Cuanto mayor es la polaridad del disolventemenor es el rendimiento del cultivo

Incorporación de 1,2,4-[14C]-triclorobenzeno

en membranas celulares de P. putida cells

Condiciones 14C/mg proteína celular

No-tratadas 20.000

Tratadas con FCCP 300.000

Incorporación de 1,2,4-[14C]-triclorobenzeno en

membranas celulares of P. putida

Condiciones

de cultivo

14C/mg proteína celular

Silvestre DOT-T1E18

LB

LB+ tolueno

66.000

59.000

301.000

124.000

DOT-T1E-18

ttgR ttgA ttgB ttgC

Pertenecen a la familia de las RND (resistencia, nodulación, división

celular)

TtgB tiene una alta homología con MexB de Pseudomonas aeruginosa

La bomba está formada por tres componentes

TtgB

TtgC

TtgA

membrana

externa

Espacio periplásmico

membranainterna

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

?

NH2COOH

A B C

D

Citoplasma

TtgC TolC

ttgR ttgA ttgB ttgC

9

5

10 20 40 40200

log

UF

C m

l-1

Tiempo (min)

X F C1 C2 B A TSIGED H

todS todT ttgF ttgE ttgD

1 Kb

1 Kb

ttgD ttgE ttgF

ttgD ttgE´ ttgE ttgF

1

1

2

2 ttgF´ttgEttgD ttgE

ttgD ttgE´ ´ttgE ttgF

ttgD ttgE´ ´ttgE ttgF

´ttgE´ ´ttgE

ttgF ttgFE´ ´ttgE

14020 00

Cél

ula

s vi

able

(lo

g U

FC

ml-1

)

Tiempo (min)

9

5

DOT-T1E DOT-T1E-1

DOT-T1E-18 DOT-T1E-82

20 40

5

9

1

genDNA

5´ 3´ATG Stop

Inductor

RNAP32

P32

P32

P32

P32

P32

X F C1 C2 B A TSIGED H

todS todT ttgF ttgE ttgD

1 Kb

1 Kb

0

DOT-T1E-82

20 40Cél

ula

s vi

able

s (l

og U

FC

ml-1

)

Tiempo (min)

1

5

9

ttgV ttgG ttgH ttgIttgW

14020 00

Cél

ula

s vi

able

s (l

og U

FC

ml-1

)

Tiempo (min)

9

5

DOT-T1E DOT-T1E-1

DOT-T1E-18 DOT-T1E-28

20 40

5

9

1

ttgV ttgG ttgH ttgIttgW

A C G T -tol +tol

Crecimiento en LB+tol (g)

Tiempo (horas)

log

D.O

660

0,1

0,01

1

10

0 5 1510 20 25

Sustratos TtgABC TtgDEF TtgGHI

Tolueno

Estireno

m-xileno

Propilbenceno

Etilbenceno

Tetraciclina

Ampicilina

Cloramfenicol

Gentamicina

Nalidixíco

Carbenicilina

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

-

+

+

+

-

+

+

+

+

+

-

+

+

Cél

ula

s vi

able

s (l

og U

FC

ml-1

)

Tiempo (min)

9

5

DOT-T1E DOT-T1E-1

40200

DOT-T1E-18 DOT-T1E-28

40200 4020040200

TtgABC TtgDEF TtgGHISilvestre

ttgV ttgG ttgH ttgIttgW

ttgT ttgD ttgE

ttgF

ttgR ttgA ttgB

ttgC

A G T C 1 2 3 4

A C G T -tol +tol

ttgR ttgA ttgB

ttgC

TTGCATGAGGATCCTCGGGTCGCTGGAGCAGGGAGACGCTCAAGAGTAATGGAA

GAGATCTTGATCTGGAAAAAATGCTATCCGGTGGATAAATAGCTTGCTAAGGAA

TATACTTACATTCATGGTTGTTTGTAAATACTGCTGGGTGGTACTCAGGTACAG

CCTCAGCGCTTGATTAGCTTATCCGAGAGGCCCCGGCAGAGGTGCCCCCGGAGC

GTTCCCCGCACGCGCTGCGCGTTCGGGCCAGATGAGGTTGTACTGCCATGGTC

ttgAttgR

C

1

55

109

163

217

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

165bp220bp

SU

PE

RV

IVE

NC

IA (

log

UC

F/m

l)

TIEMPO (min)

8

6

4

2 DOT-T1E

DOT-T1E-18

DOT-T1E-13

DOT-T1E-15

8

6

4

2

Susceptibilidad a antibióticos

Genotipo Cb Cm Nal

DOT-T1E Silvestre 128 64

DOT-T1E-18 ttgB::Tn5 16 32

DOT-T1E-13 ttgR::Km 1024 256

512

Tc

4

8 0,24

256 16

MIC (g ml-1)

ttgV ttgG ttgH ttgIttgW

m-RNA

c-DNA

Transcripción reversa

PCR

A C G T -tol +tol

V-G G-H H-I Controles negativosV-W

ttgV ttgG ttgH ttgIttgW

A

TtgG

C T A CG G T+ +--

TtgV

ttgV ttgG ttgH ttgIttgW

8

6

4

2

SU

PE

RV

IVE

NC

IA (

log

CF

U/m

l)

TIEMPO (min)

DOT-T1E

D8

6

4

2

B

0 30 60 0 30 60

C

TtgV-

TtgW- TtgVW-

ttgHttgVttgG

ttgI

ttgW

aphA

Kam

Kam

DOT-T1E

TtgV-

TtgW-

TtgVW-

Wt PS52 PS61 PS62 0

1000

2000

PttgG

0

1000

2000

PttgV

Wt PS52 PS61 PS62 ttgW- ttgV- ttgvW- ttgW- ttgV- ttgvW-

Un

idad

es M

iller

24293645

66

20

14,2

A

2429

3645

20

14,2

B 1 2 3 1 2 3 4 5 6 7 8

0,50 5 50 0,5 5 50 500 ng DNA no marcado

Específico Inespecífico

nM TtgV50 1501000

TtgV

DNasa

GCGTCAAGAGTATCACATAA

g His-TtgV 0

4.0Frag

men

t Abu

ndan

ce

Strain 0.1% toluene N.I. I

0.3% toluene N.I. I

Toluene tolerance

P. putida DOT-T1E 1 1 10-4-10-5 0,5-1 H

P. putida MTB6 1 1 10-4-10-5 10-1 H

P. putida S12 1 1 10-6 10-2-10-3 M/H

P. putida MTB5 10-4 1 <10-8 10-6 M

P. putida SMO116 10-4-10-5 10-1 <10-8 <10-8 M

P. putida F1 10-4 10-3 <10-8 10-7 M

P. putida 43 10-3-10-4 10-5-10-

6

<10-8 <10-8 M

P. putida JLR11 10-3-10-4 10-4-10-

5

<10-8 <10-8 M

P. putida 2440 10-5 10-6 <10-8 <10-8 S

P. putida OUS82 10-5 10-5 <10-8 <10-8 S

P. mendocina KR1 10-6 10-8 <10-8 <10-8 S

P. aeruginosa SSS1 10-7 10-7 <10-8 <10-8 S

P. aeruginosa 7NSK2 10-6 10-7 <10-8 <10-8 S

P. aeruginosa PAO1162 1 10-4 <10-8 <10-8 M

P. aeruginosa 1162RK 1 10-2 <10-8 <10-8 M

P. fluorescens PF11 1 10-1 10-7 10-7 M

P. fluorescens EEZ23 10-6 10-6 <10-8 <10-8 S

P. stutzeri 10-6 10-4 <10-8 <10-8 S

P. syringae pv. syringae

10-5 10-5 <10-8 <10-8 S

Strains Tolerance ttgABC ttgDEF ttgGHI

P. putida DOT-T1E H +

+ +

P. putida MTB6 H +

+

+

P. putida S12 H + - +

P. putida F1 M + +

-

P. putida MTB5 M + +

-

P. putida SMO116 M + +

-

P. putida 43 M + -

-

P. putida JLR11 M + -

-

P. putida 2440 S + -

-

P. putida OUS82 S + -

-

Reparación de membranas

Composición de los grupos de cabeza de los fosfolípidos

de P. putida DOT-T1E en ausencia y presencia

de disolventes orgánicos

Disolvente orgánico PE PG CLPE

PG+CL

Ninguno 78 10 12 3.5

Tolueno (1% vol/vol) 65 9 26 1.8

Proporción de lípidos insaturados Cis/transde Pseudomonas creciendo enausencia y presencia de 0.5%

(vol/vol) de disolventes orgánicos

None

Heptane

Ethylbenzene

m-Xylene

Toluene

7.5

3.0

1.0

0.9

1.0

Cis/trans

Disolventes

Ácidos grasos

saturados isómero-cis isómero-trans

C14:0C16:1 cisC16:1 transC16:0C17:ciclopropanoC18:2 cis cisC18:1 cis olC18:1 cis vaC18:1 trans vaC18:0

cis/transsaturado/insaturado

LB LB +1%(v/v) tolueno

1.035.45.1

35.01.11.04.0

24.30.0

0.95

11.10.62

1.025.314.333.31.01.03.0

20.03.90.9

2.550.45

actctimetH

182bp

5´-CATAGGAACTACCTTACCTGGTCGGGCGAATATCAGAAGGTGCCGAATCATAACAAA

GCTGCGCGGTTTTTAGGCATGTCGCCCATTTGCATGAAAACTGCTCATGTTG

GGCGGGTGGAGGCAGCGCAAGGCACCCAGGACGACCAGGCAACAAATCGTGA

TGGCTTTCAAGAACCAGGACTTTCCGCACATG-3´

194bp

5´-TGATCGGGTTGGCTGACCTTTCCGAGTACCTTGCGGTCGGAATGGGTG

GGTGGTCTTGATCGATTGCAAAGGGGGCTGCTTTGCAGCCCTTCGCGG

GTGAACCCGCTCCTACAACAGGTACGGCGCTGCTCTGAAGGCTGGCGC

TGGCCTCTGCACTCGATACGGGCCTCAATGCACCGCCAAGCGCAGGGT

ATTCCATG-´3

BglII BglIISphI SphI2.9 kbp 2.4 kbp1.6 kbp

6.9 kbp

BglII BglIIBamHIBamHI BglII

0,57kbp

KpnI

0,8 kbp 1,5 kbp 1,6 kbp

ctiT1

N-terminal region

ctiT1

N-terminal region

DOT-T1E-P4

Ácido grasoCondiciones de crecimiento

LB LB más heptano

C14:0

C16:1,9 cis

C16:1,9 trans

C16:0

C17:ciclopropano

C18:2

C18:1,9 cis ol

C18:1,11 cis vac

C18:1,11 trans vac

C18:0

2

5

0

44

27

1

1

16

0

2

1

10

0

46

4

1

3

26

0

8

0 2 4 6 8 10 12

0.2

0.4

0.6

0.8

Tiempo (horas)

Tur

bide

z (O

D 6

60nm

)

metH ctiT1 phoA

SacI KpnI BamHI HindIIIA

B

0

1

2

2 4 6 8 100

4

8

12

Tu

rbid

ez (

OD

660

nm)

Tiempo (horas)

mp

NP

/min

/Tu

rbid

ez (

OD

660

nm)

TIEMPO (min)

8

6

4

2

SU

PE

RV

IVE

NC

IA (

log

UF

C/m

l)

DOT-T1E DOT-T1E-109

213-222

YTSGSSGVLKYTGGTTGVAKE. coli

P. putida. DOT-T1E

ATP/AMPbinding site 1

ATP/AMP binding site 2

352-357

GYGAGEGYGLTE

NGWLHTGDIAVMDEEGFLRIVDRKKDGYYLTGDLATVDEQGYVFIVDRKK

E. coli

P. putida DOT-T1E

Fatty Acid binding site (FACS signature motif)

TtgJ

434-458

1 565

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

30 90 120

Time (min)

13C

600

1000

2000

3000

4000

30 90 120

Time (min)

13C

60

BA

LB+Tolueno

LB

Silvestre PtgA:lacZ 50 70

  PtgD:lacZ 0 5

  PtgG:lacZ 400 1000

DOT-T1E-109 PtgA:lacZ 50 70

  PtgD:lacZ 225 1600

Cepa Fusion

Unidades Miller

PtgG:lacZ 1100 3750

Sin tolueno Con tolueno

rpfG lysS

rpfA rpfB rpfF

rpfC rpfH prfB rpfD recJ rpfE greA

enoyl-CoA hydratase

rpfA: aconitase

rpfB: long chain fatty acyl CoA ligase

rpfF:

rpfC/rpfG:

rpfH: putative regulator

“two component” sensor regulator pair

Physiological/environmentalinfluences

Lipid biosynthetic orcatabolic pool

Fatty acyl CoA

RpfF

RpfB

FA-X

XGeneregulation

DSFX ?

Funciones inesperadas

1.-Reparación de membranas

2.- Implicación de los flagelos

(c)

(d)

1 2 3 1 2 3

1 2 3240 bp

1

220 bp

240 bp

(c)

(d)

1 2 3

240 bp

325 bp325 bp

240 bp

1 2 3

DOT-T1E DOT-T1E-42

1 2 3240 bp

1

220 bp

2 3

240 bp

DOT-T1E DOT-T1E-PS23

fliK fliL fliM fliN fliO fliP fliR flhBfliQ

1Kb

fliK fliL fliM fliN fliO fliP fliR flhBfliQ(a)

1Kb

orf563

DOT-T1E

DOT-T1E-42

DOT-T1E-PS23

+ + + + +

+

+

+

+

-

+

+

+

+

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

(b) fliK-fliL fliL-fliM fliN-fliO fliO-fliPfliM-fliN fliP-fliQ fliQ-fliR fliR-flhB

+ + + + +

+

+

+

+

-

+

+

+

+

n.d.

n.d.

n.d.

n.d.

+

+

+

(b)-

-

-

BamHI BamHI

8

6

4

2S

UP

ER

VIV

EN

CIA

(lo

g U

FC

/ml)

TIEMPO (min)

A B

D8

6

4

2

C

DOT-T1E

0 30 60 0 30 60

FliP-

FlhB-FliL-

log

CF

U

10

5

00 20 40 60

DOT-T1E (wild-type)

time (minutes)

KT2440

DOT-T1E

16 hs. 48 hs.

1M A E S E S G Q D K T E D P T D KATG GCA GAA AGC GAG AGC GGT CAG GAC AAG ACA GAA GAC CCC ACC GAC AAA

18R K R D A R E K G E I A R S K E LCGC AAG CGC GAT GCG CGT GAA AAA GGA GAG ATT GCC CGT TCA AAA GAG CTG

Q V H C OPA35 CAG GTG CAT TGT TGAN T V V L T L G G A G A L L T F GAAC ACC GTC GTA TTG ACC CTG GGG GGG GCA GGT GCA TTG TTG ACA TTC GGC G R C I V D I R GGC AGG TGC ATT GTT GAC ATT CGG

52G H L A E T L L T L M R M N F S LGGG CAT CTG GCC GAG ACC TTG CTG ACA TTG ATG CGC ATG AAT TTT AGC CTCR A S G R D L A D I D A H E F AMBCGG GCA TCT GGC CGA GAC CTT GCT GAC ATT GAT GCG CAT GAA TTT TAG

69T R D V I V D E R A M G A F L L AACC CGG GAT GTG ATC GTC GAC GAG CGG GCA ATG GGC GCT TTC TTG CTG GCG

86 ... .... 392S ... ... ... G OCHTCT ... ... GGG TAA

LB solid--LB liq. 0,3%tolLB solid--LB liq.l

LB soft--LB liq. 0.3%tolLB soft--LB liq.

10

5

00 20 40 60

Log

CF

U

Time (minutes)

DOT-T1E (2 days)

Time (minutes)

10

5

00 20 40 60

Log

CF

U

DOT-T1E (1 day)

LB--LB

LB--0,3%tol

LB(g)--LB(g)

LB(g)--0,3%tol

10

5

00 20 40 60

Time (minutes)

Log

CF

U

DOT-T1E

10Gs (truncated protein)

11Gs (protein + 1aa)

LB--LB liq. 0,3%tolLB--LB liql

LB--LB liq. 0.3%tolLB--LB liq.

10Gs

11Gs

10

5

00 20 40 60

Log

CF

U

Time (minutes)

FlhB-

FlhB-

Motility Toluene tolerance

DOT-T1E

DOT-T1E

pMCS5-flhB2440

pMCS5-flhBT1E

+ -

--

pMCS5-flhB2440

pMCS5-flhBT1E

+ -

--

ATGGCAGAAAGCGAGAGCGGTCAGGACAAGACAGAAGACCCCACCGAAAAGCGCAAGCGCGACGCCCGCGATGGCAGAAAGCGAGAGCGGTCAGGACAAGACAGAAGACCCCACCGACAAACGCAAGCGCGATGCGCGTG

AGAAGGGCGAGGTCGCCCGCTCCAAGGAGCTGAACAGGGTGGCGGTGACCCTGGCGGGTGCCGGTGGCCTAAAAAGGAGAGATTGCCCGTTCAAAAGAGCTGAACACCGTCGTATTGACCCTGGGGGGGGCAGGTGCATT

CCTGGCGTTCGGCGGCCACGTGGCCGAGACATTGCTTGTTGACATTCGGCGGGCATCTGGCCGAGACCTTGCTG

KT-2440 MAESESGQDK TEDPTEKRKR DAREKGEVAR SKELNTVAVT LAGAGGLLAFMAESESGQDK TEDPTDKRKR DAREKGEIAR SKELNTVVLT LGGAGALLTF

GGHVAETLLA LMRMNFSLTR DIIVDERAMG AFLLASGKMA IWAVQPVLILGGHLAETLLT LMRMNFSLTR DVIVDERAMG AFLLASGKMA IWAVQPVLGL

LFVVSFVAPI ALSGFLFSGS LLQPKFSRMN PLSGIKRMFS MQALTELLKALFVLALIGPV ALGGFLFSGS LLQPKFSRMS PLSGIKRMFS LNSVTELLKA

LAKFFVILVV AVVVLSGDRQ ALLSIANEPL EQAIIHSLQV VGWSALWMSAVAKFFVILVV ALVVLSHDRQ ALLAIANEPL EQAIIHAVQV VGWSALWMAA

GLLLIAAADV PFQLYQTHKK MKMTKQEVRD EYKDSEGKPE VKQRIRQLQRGLLLIAAVDV PFQLWQTQQK LKMTKQEVRD EYKDSEGKPE VKQRIRQLQR

EVSQRRMMAA VPDADVIITN PTHYAVALQY DPEKGGAAPL LLAKGSDFMAEASQRRMMAA VPDADVIITN PTHYAVALQY DPEKGGVAPL LLAKGTDFIA

LKIREIGVEH NIQILESPAL ARAIYYSTEL EQEIPAGLYL AVAQVLAYVFLKIREIGVEH KVQILESPAL ARAIYYSTEI EQEIPAGLYL AVAQVLAYVF

QIRQYRAGKG KRPEPLKDDL PIPPDLRRDSQIRQYRSGKG KRPEPLKDDL PIPPDLRRDS

DOT-T1E