Biol 3030 – Lab Desarrollo JA Cardé

Biol 3030 – Lab DesarrolloJA Cardé

Objetivos

-Biotecnología

-Subcloning-Vectores

-3 Modulos1)Ligación : fragmento + vector2)Transformacion de E coli3)Selección por resistencia, crecimiento y ensayo de transfomantes4)Opcional ; Extraccion de DNA Plasmido

El Vector:pUC8, 2700pbSitio para Eco R1 en M13 mp en el fragmento de LacZ

pUC8 – 2665 bp

Contiene parte del gen lac ZCodifica para ß galactosidasaMetabolismo de galactosidosOperon de lactosa α fragment del gene de lacZ

- E coli mutada en lac Z- Su cromosoma tiene el

fragmento Ω de lac Z- Cuando α y Ω interactuen lac

Z sera funcional- α complementation

- Operon de lac- Represores (lac)- Activadores (CAP+ cAMP)- Inductores (IPTG) atrapan al

represor

- Sustratos para ß galactosidasa- Lactosa- X-Gal, hidrolizado se pone azul- PLT transformantes con pUC

donde lacZ sea funcional seran azules!

- ONPG – sustrato para ßgal pero amarillo espectrofoto

MCR/MCS

MCS insertado dentro del lac Z gene pero no interfiereInsertos caeran en el MCS y si interrumpen el lac Z genePLT transformantes con el inserto seran color no azul… blancas

Ligacion:Vector linearizadoT4 DNA ligasaFragmentos de DNAMg+2Enlace fosfodiester 5’-3’37 C vs 4-22 C

RecircularizacionConcatamerizacion

Alk Phosph

Orientacion de la ligacion

Transformacion

Celulas competentes (JM109)-No resistencia-No plasmids-No enzimas de restriccion

Eficiencia de la transformacion-supercoiled > circular > lineal10 ngs es suficiente100 ngs inhibe1/10000 celulas se transforma

Se define 3 de transformantes por µg de DNA

10 ng para 1ml de celulasSalen 100 colonias = 1000 transformantes/ml1000transf/0.01ug = 1x10^5

Screening Blue/White-Resistencia ayuda a seleccionar (Amp)-Pero de las que crecen cuantas tienen el gen?-Azules vs Blancas- Azules lacZ+ ONPG amarillo-Blancas lacZ- ONPG no

Study Questions

Resultados

• Recuerde discutir los resultados objetivo por objetivo.

• Cada objetivo tiene una pregunta de investigación, una hipótesis, alguna tabla o figura que los resume y su discusión y conclusión.

• Al final una conclusión general de todo el ejercicio.