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Biotecnología Industrial como
herramienta productiva
BiolatinaBiotecnología en América Latina
Setiembre-Octubre- 2008
Dra. Mary Lopretti
Departamento de Bioprocesos y Biotecnología - LATU
Desarrollo de I+D en Biotecnología
Áreas de desarrollo en
Biotecnología Industrial
Producción de enzimas
de uso industrial
Implementación
Diagnóstico por
Biología Molecular
•Nuevos agentes
extremofilos
•Bioinformática
•Biología Molecular
•Bioprocesos y
Producción a escala:
•Banco
•Laboratorio
•Piloto
•Microencapsulación
TRANSFERENCIA A LA
INDUSTRIA
•Textil
•Papel
•Cuero
•Alimentos
•Bioetanol
•etc.
•Servicios BIOTEC
•Valorización de Cadena Productiva
Áreas de desarrollo de Biotecnología
Biología
Molecular
Microorganismos Recombinantes
Generación de plásmidos de expresión
Análisis de secuencias genómicas y
proteicas
Bioprocesos Avances en Bioetanol
Enzimas de uso industrial
Microencapsulación de agentes
bioquímicos
Extremozimas
Estrategia de trabajo
Plataforma INIA-LATU-I.Pasteur Montevideo (y otros)
Microorganismos extremófilos y
bioinformática
PROYECTOS DE I+D
Áreas básicas de
desarrollo:
Extremozimas
Microencapsulación
Extremófilos
Bioprocesos
Biocombustibles
PROYECTOS DE
TRANSFERENCIA
Eje. Desarrollo de Probióticos
Producción de Bioetanol
Desarrollo de productos
dextranos
Proyectos
Proyectos de Innovación LATU - INIA
Microorganismos extremófilos y bioinformática
Valorización de la cadena productiva
Sevicios Biotec
Desarrollo de organismos extremófilos para detoxificación de efluentes de la industria papelera.
Proyectos de Desarrollo para la Industria
Enzimas de uso industrial
Extremozimas
Biotecnología en textiles (Producción de Microesferas)
Enzimas celulasas para la industria textil
Avances en Bioetanol
Proyecto CIU – LATU
Reactores Escala Piloto – 50 y 200 litros
Reactor Escala Banco
Proyectos Transferencia e
Innovación
Producción de Biogás
Desarrollo de Probióticos
Producción de Bioetanol -
Paysandú
Servicios a la Industria
Escalado
Desarrollo de líneas
productivas
Asesoramientos y
Consultorías
Implementación de una Unidad Genómica
Integrativa que trabaje dentro de la
Plataforma regional INIA-LATU-PASTEUR.
OBJETIVOS
• Integración de genómica y bioinformática.
•Determinación de enzimas de interés industrial de
microorganismos de condiciones extremas para la
producción de glucosidasas, xilanasas, celobiohidrolasas.
• Estudio de la producción de enzimas y su aplicación.
Formación de consorcios recombinantes y recombinantes
microencapsulados
• Aplicación; enzimas para la valorización de biomasa como
fuente de productos químicos y energía
Proyecto: “Desarrollo de una plataforma INIA-LATU-
PASTEUR para la producción de enzimas
recombinantes de interés industrial”
Área: Genómica Integrativa
Plataforma INIA-LATU-PASTEUR
Etapa 1: Extremófilos y Bioinformática
Etapa 2: Extremozimas
Etapa 3: Microcápsulas
Etapa 4: Reingeniería Bioetanol; PS+S+F
Etapa 1: Extremófilos y Bioinformática
Desarrollo de un prototipo para identificación de
extremozimas con aplicaciones en procesos industriales
basados en materiales ligno-celulósicos, integrando
información ambiental, bioquímica y genómica.
• FILOGENIA MOLECULAR Y ANÁLISIS
BIOINFORMÁTICO
• CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y CINÉTICA DE
GENES Y ENZIMAS
• EVALUACIÓN Y OPTIMIZACIÓN DE LA
PRODUCCIÓN ENZIMÁTICA
• PROMOCIÓN DE FORMACIÓN DE RECURSOS
HUMANOS
• TRANSFERENCIA DE RESULTADOS Y
PROCESOS AL SECTOR INDUSTRIAL
Caracterización de extremófilos
Figura 1. A. Morfologia de las
colonias de Penicillium variabile. B.
Microscopio óptico 400x. Preparados con
10% de KOH. Figura 2. A. Morfología de
las colonias de Penicillium citrinum .
Microscopia óptica 400%, preparadas con
KOH al 10%. Figura 3. A. Crecimiento
macroscópico de Penicillium citrinum. B.
Microscopia óptica 400%, preparadas con
KOH al 10%. Figura 4. A. Crecimiento
macroscópico de Penicillium chrysogenum.
B. Microscopio óptico 400x. Preparados
con 10% de KOH. Figura 5. A.
Crecimiento macroscópico de Penicillium
chrysogenum. B. Microscopio óptico 400x.
Preparados con 10% de KOH. Figura 6. A.
Visualización macroscópica de colonias de
Aspergillus ochraceus. B. Conidioforo de
Aspergillus ochraceus. Figura 7. A. y B.
macro y micro de la cepa TU1 aun sin
caracterizar. Figura 8. Visualización
macroscópica de colonias de Trichoderma
longibrachiatum
A.
B.
B.
A.
A. B.
A. B.
Figura 1.
Figura 2.
Figura 3.
Figura 4.
B.A.
A.
B.
A. B.
Figura 5.
Figura 6.
A. B.
Figura 7.
A.
Figura 8.
Laboratorio Tecnológico del Uruguay (LATU) - Laboratorio de Micología. Facultad de Ingeniería (UdelaR)
Muestra Nombre Tiemp
(días)
Temp.
(ºC)
Origen Morfo. Macro Género Especie
1 CR1 1 5 25 Costa Rica1 Colonia verdes Penicillium variabile (Sopp)
2 Lig U1 col
1
5 25 Col. de lignina Colonias verdes y
amarillentas
Penicillium citrinum (Thom)
3 CR1 3 5 25 Costa Rica1 Colonia verdes Penicillium citrinum (Thom)
4 CR1 4 5 25 Costa Rica Colonia verdes Penicillium chrysogenum
(Thom)
5 TU1 7 50 Termas Colonia blancas Aspergillus fumigatus (Fresen)
6 Lig U1
Rosado
5 25 Col. de lignina Colonias
esponjosas
rosadas
Fusarium verticillioides
(Saccardo)
(Nirenberg
7 Lig U1 col
2
5 25 Col. de lignina Colonias verdes
azuladas
Penicillium chrysogenum
(Thom)
8 CR 2 4 25 Costa Rica2 Colonias verdes
amarillentas
Trichoderma longibrachiatum
(reesei) (Rifai)
9 QU 1 5 25 Sustratos
calcáreos y
polisacáridos
Colonias
amarillentas
Aspergillus ochraceus (K.Wilh.)
Bioinformática
Análisis de la diversidad funcional para clones de interés
biotecnológico e industrial a través del tamizado de librerías
metagenómicas establecidas por CIBCM (en coordinación entre esta
Institución y los laboratorios participantes del proyecto).
- http://www.jgi.doe.gov/
-http://www.pasteur.fr/recherche/unites/tcruzi/minoprio/genomics/fungi.htm
- http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/aspergillus_group/MultiHome.html
- http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/aspergillus_group/Links.html
Etapa 2: Extremozimas
Desarrollar un microorganismo recombinantesúperproductor de enzimas o complejos enzimáticos conactividad xilanasa, celulasa y/o ligninolítica, para eltratamiento biológico de procesos realizados porindustrias papeleras nacionales.
Screening de distintos microorganismos productores deenzimas de interés
Inducción y aislamiento del ARNm – Clonación
Transformación del huésped
Purificación y evaluación funcional enzimática
Escalado de la producción
Clonación y expresión de la celobihidrolasa II (cbhII) de Trichoderma reesei en Kluyveromyces lactis
Enzimas Recombinantes de uso industrial
Clonación de la enzima celobiohidrolasa II (cbhII) de
Trichoderma reesei
Expresión en Kluyveromyces lactis
Producción enzimática en escala laboratorio
Caracterización molecular y biológica
Evaluación enzimática
Escalado y uso industrial
Esquema de la enzima celobiohidrolasa II
interactuando con las fibras de celulosa.
El dominio mas grande de la enzima contiene
el sitio catalítico de la misma (derecha),
mientras que el dominio pequeño es el dominio
de unión a las fibras de celulosa (izquierda).
Clonación de la enzima celobiohidrolasa II
(cbhII) de Trichoderma reesei
Se amplificó la secuencia del gen cbhII de Trichoderma reesei a
partir del vector de clonación pTTc9
El producto de la PCR se secuenció y se comprobó que el mismo
corresponde a el gen cbhII de T.reesei. El análisis se llevó a cabo
sobre la base de datos del NCBI (EEUU)
El gen amplificado, se clona en el vector de expresión para
levaduras pKLAC1, el cual contiene un promotor inducible por
galactosa, y le confiere resistencia a la acetamidasa (marcador de
selección positiva)
Evaluación de los clones positivos y posterior expresión y análisis
del producto proteico.
Clonación de la enzima celobiohidrolasa II
(cbhII) de Trichoderma reesei
Sequence 1: 080522-02_F20_MIX3B2-F-
cbhll_F.ab1 844 0 844 ABI
Length = 844 (1 .. 844)
Sequence 2: lcl|65536 T.reesei
cellobiohydrolase gene (CBH II), complete cds
Accesion Number M16190
Length = 2193 (1 .. 2193)
Etapa 3: Microcápsulas
Desarrollo de un sistema de microencapsulación para laintroducción de sustancias de interés en diversossectores Industriales.
Producción de microesferas utilizando diferentespolímeros (poliuretanos, alcohol polivinílico)
Evaluación mediante Microscopía Optica (MO);Microscopía Electrónica de Barrido (MEB)
Estandarización de metodologías de producción
Evaluación de permanencia y estabilidad de la sustanciamicroencapuslada
Resultados
Microscopía óptica - Microesferas de alcohol polivinílico (PVA)
Microscopía óptica
A: 400x B: 200x
A B
Microscopía de barrido - Microesferas de alcohol polivinílico (PVA)
A B C
F
IHG
D E
Microscopía de barrido
(MEB)
A, B y C: x430; x2700;
x7000. Microesferas de
PVA-deshidratadas con N2.,
Tamaño: 2-30μm.
D, E y F: x430; x2700;
x7000. Microesferas PVA;
inclusión de limoneno luego
de producirlas. Tamaño: 2-
25 μm.
G, H y I: x65; x430; x900.
Microesferas de PVA con
limoneno introducido en el
proceso de elaboración de
las mismas. Tamaño: 50-
200μm.
Etapa 4: Reingeniería Bioetanol; PS+S+F
Producción de bioetanol a partir de diferentes sustratos
residuales mediante el desarrollo de actividades en el
área de Biomasa; presacarificaciones por fermentación
semisólida de lignocelulósicos y sacarificaciones
enzimáticas
Optimización de los Procesos de
Sacarificación y Fermentación
utilizando Kluyveromyces marxianus
para la producción de bioetanol.
Deslignificación y presacarificación biológica de los materialesmediante la inoculación selectiva de diversos tipos de hongos depudrición blanca (HPB)
Sacarificación: enzimas microbianas que faciliten ladepolimerización de los polisacáridos estructurales como lacelulosa y las hemicelulosas a azúcares simples.
Fermentación; utilización de Kluyveromyces marxianus para laproducción de bioetanol
Departamento de Bioprocesos y Biotecnología
Integrantes:
Dra. Mary Lopretti
Lic. Bioq. Ana López
Lic. Bioq. Fabiana Rey
Lic. Bioq. Sylvia Vázquez
Lic. Bioq. Agustín Damboriarena
Bach. Carolina Ottati
Bach. Mauricio Tomasso
Msc. Laura Harispe
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