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ELECTROFORESISELECTROFORESIS
ELECTROFORESISELECTROFORESIS
Definición: Método de análisis basado en la migración diferencial de sustancias en solución cargadas eléctricamente, por efecto de la aplicación de un campo eléctrico.
Aplicación aAplicación a: :
Proteínas en general Proteínas en general ADN y ARN ADN y ARN NucleótidosNucleótidos AminoácidosAminoácidos PolisacáridosPolisacáridos Fosfolípidos.Fosfolípidos.
CLASIFICACION:CLASIFICACION:
a) a) Según el soporteSegún el soporte::
Geles de poliacrilamidaGeles de poliacrilamida Geles de agarosaGeles de agarosa Tiras de acetato de celulosaTiras de acetato de celulosa Geles de almidónGeles de almidón Papel de filtro Papel de filtro
b) b) Según las características de la moléculas a separarSegún las características de la moléculas a separar::
* * CCargaarga * * Peso molecular (P.M.)Peso molecular (P.M.) * * Punto isoeléctrico (p.I)Punto isoeléctrico (p.I) * Combinaciones de las anteriores* Combinaciones de las anteriores
TEORIATEORIA Una partícula cargada eléctricamente con la carga Una partícula cargada eléctricamente con la carga qq colocada en un medio determinado y bajo la acción de un colocada en un medio determinado y bajo la acción de un campo eléctrico se verá sometida a dos fuerzas: campo eléctrico se verá sometida a dos fuerzas:
A) la A) la fuerza de atracciónfuerza de atracción o o fuerza propulsorafuerza propulsora, llamada , llamada fuerza eléctrica ( fuerza eléctrica (FeFe) )
B) la B) la fuerza resistentefuerza resistente, llamada resistencia viscosa (, llamada resistencia viscosa (FsFs).). A) Fuerza eléctrica: (1) Fe = E . qA) Fuerza eléctrica: (1) Fe = E . q
FeFe V V E : campo eléctrico E : campo eléctrico
EE = ---- = ------ = ---- = ------ V : diferencia de potencial aplicada sobre la longitud ( l )V : diferencia de potencial aplicada sobre la longitud ( l )
qq I I qq : carga de la partícula : carga de la partícula
B)B) Resistencia viscosaResistencia viscosa: ( 2 ) : ( 2 ) FsFs = = 66rr vv = viscosidad del medio = viscosidad del medior = radio de la partícular = radio de la partículavv = velocidad de la partícula = velocidad de la partícula
La partícula es empujada por la La partícula es empujada por la FeFe y su velocidad ( y su velocidad (vv) ) aumenta hasta un valor tal que ambas fuerzas se aumenta hasta un valor tal que ambas fuerzas se equilibran: equilibran: EE . . qq = = 66 r v r v
qqDespejando la velocidad tenemos: (3) Despejando la velocidad tenemos: (3) vv = = EE . ----- . ----- 66 r r
Fe = Fs
Según (3) la velocidad será: v = E . , v = V/l . La velocidad de la partícula (v) en una electroforesis es proporcional al campo aplicado (E) y a su Movilidad Electroforética ().
q qq qEn cambio, el factor ----- depende del medio ( En cambio, el factor ----- depende del medio ( ) y de la partícula ---- ) y de la partícula ---- 6 6 r r r r q qEsta relación: ---- , se llama Esta relación: ---- , se llama Movilidad ElectroforéticaMovilidad Electroforética 6 6 r r
q q y se representa por la letra y se representa por la letra 66 r r
Electroforesis en tiras de Electroforesis en tiras de acetato de celulosaacetato de celulosa
Siembra
- +
AnodoCátodo
SiembraSiembra
- +-+
Fuente de Poder (V)
Cátodo Anodo
++
+-
SiembraSiembra
- +-
+
Fuente de Poder (V)
Cátodo Anodo
++
+-
SiembraSiembra
- +-
+
Fuente de Poder (V)
Cátodo Anodo
++
+-
SiembraSiembra
- +-
+
Fuente de Poder (V)
Cátodo Anodo
++
+-
SiembraSiembra
- +-
+
Fuente de Poder (V)
Cátodo Anodo
++
+-
SiembraSiembra
- +-
+
Fuente de Poder (V)
Cátodo Anodo
++
+-
Carga de aminoácidos en función del Carga de aminoácidos en función del pHpH
COOH
H3N+ C H
H
Glicina
Carga de aminoácidos en función del Carga de aminoácidos en función del pHpH
COOH
H3N+ C H
H
Glicina
COO-
H3N+ C H
H
NaOH
pHpK1: 2.34
+ + -
Carga de aminoácidos en función del Carga de aminoácidos en función del pHpH
COOH
H3N+ C H
H
Glicina
COO-
H3N+ C H
H
NaOH
pHpK1: 2.34
+ + -
H2N C H
COO-
H
-pK2: 9.6
pI: 5.97
Ejercicio:Ejercicio:
Para separar una mezcla de proteínas se realizó una electroforesis con
un buffer pH= 4.5. De acuerdo a la siguiente tabla de datos, conteste:
Proteína pI
a....................2.3
b....................4.5
c..................10.5
d....................9.2
e.....................3.8
A. La proteína e migró al cátodo.
B. Las proteínas a y d migraron al cátodo.
C. La proteína a está más alejada que la e del lugar de siembra.
D. La proteína e está más alejada que la a del lugar de siembra.
EjercicioEjercicioCuál es el mejor buffer para separar estas cuatro proteínas:
Proteína pI a..............5.2 b..............7.4 c..............8.5 d..............3.4
Buffer pH 1.............9.2 2.............8.5 3.............5.2 4.............3.0
Electroforesis de ProteínasElectroforesis de Proteínas
1)1) SDS-PAGESDS-PAGE
2) Enfoque iso-eléctrico Enfoque iso-eléctrico (Iso-electric focusing)(Iso-electric focusing)
3)3)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)
2-Mercaptoetanol ?
SDS - PAGESDS - PAGEGeles de poliacrilamidaGeles de poliacrilamida
El dodecil sulfato de sodio (SDS) es un detergente aniónico que desnaturaliza proteínas “envolviendo” el esqueleto polipeptídico y les confiere carga negativa.
1. Armado del soporte
2. Formación del gel
3. Siembra de la muestra
4. Corrida
5. Fijación y Coloración
6. Desteñido
7. Secado
8. Análisis
PROCEDIMIENTOPROCEDIMIENTO
Siembra-
+
Determinación de Pesos Moleculares por SDS-PAGEDeterminación de Pesos Moleculares por SDS-PAGE
66000
4500034700
19000
10000
St. (PM)Muestra
Banda 1Banda 2
Curva de Calibración de proteínas por SDS-PAGE al 12 %
y = -73873x + 67578R2 = 0,9569
0
1000020000
30000
40000
5000060000
70000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Rf (cm)
PM
Rf=Distancia Recorrida por Proteína.
Movilidad relativa de una Proteína (Rf). También llamado relación al frente.
B1=5.43 cmB2=5.55 cm
D.R.Col = 9.4 cm.Calcular el Rf y el PMpara cada muestra.
Azul de Bromofenol
Distancia Recorrida por Colorante.
Electroforesis de ProteínasElectroforesis de Proteínas
1)1) SDS-PAGESDS-PAGE
2) Enfoque iso-eléctrico Enfoque iso-eléctrico (Iso-electric focusing)(Iso-electric focusing)
3)3)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)
Enfoque iso-eléctrico Enfoque iso-eléctrico (Iso-electric focusing) (Iso-electric focusing)
NaOH
H3PO4
pH10
3
Dos corridas:1) Enfoque de anfolitos, gradiente de pH.2) Enfoque de proteínas.
Electroforesis de ProteínasElectroforesis de Proteínas
1)1) SDS-PAGESDS-PAGE
2) Enfoque iso-eléctrico Enfoque iso-eléctrico (Iso-electric focusing)(Iso-electric focusing)
3)3)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)2-D PAGE (PAGE Bidimensional)
2-D PAGE 2-D PAGE (PAGE Bidimensional)(PAGE Bidimensional) Electroenfoque
SDS-PAGE
(Separación por pI)
(Separación por Peso Molecular)
ELECTROFORESISELECTROFORESIS
Uso en la profesión veterinaria, fundamentalmente en la separación e identificación de sustancias de componentes biológicos, especialmente líquidos como: suero, orina, líquido cefaloraquídeo, líquido de punciones, leche, etc.
Separar e identificar las fracciones de caseínas
bovinas y caprinas por SDS-PAGE.
Análisis de proteínas lácteas por Análisis de proteínas lácteas por electroforesiselectroforesis
Las proteínas de la leche se dividen en dos grupos:A) Caseínas son las que precipitan a pH 4.6 a 20ºC. Están compuestas
por las fracciones s1, s2, y corresponden al 80 % del total de
proteínas lácteas.B) Proteínas del suero: -lactalbúmina y -lactoglobulina.
Las caseínas son muy importantes por su valor nutritivo y también por su influencia sobre los derivados lácteos. Hay alta correlación entre contenido de caseínas y rendimiento quesero; también influyen sobre características tales como el sabor, textura, etc.
Objetivo 1:
ResultadosResultados
Caseínas CaprinasCaseínasCaseínas BovinasBovinas
C.S. C.T.-CnC.B. C.B.C.B.S. C.B.S.
s2s1
s1 y
s2
SDS-PAGE
St. St. St.
C.B.: Muestras individuales bovinasC.B.S.: St. de Caseína Bovina (Sigma)-Cn.: St. de beta-caseína (Sigma).
C.B.S.: St. de Caseína Bovina (Sigma)C.S.: St. de Caseína Caprina (Sigma).C.T.: Muestra de Caseína Caprina de la raza Toggenburg.
St.M M M
Objetivo 2:Objetivo 2:
Estudiar la actividad proteolítica de la enzima Pepsina porcina sobre la
B.S.A. (Albúmina Sérica Bovina)
ResultadoResultado
Pocillos:1: St (PM): 14.3, 18.4, 24, 34.7, 45, 66 KD.2: (BSA) a tiempo “0” con Pepsina.3: Idem 2 pero a t: “10” minutos.4: a “20” min.5: a “30” min.6: a “45” min7: a “60” min.8: St igual que en pocillo 1
Tiempo en minutos en degradación de BSA por Pepsina porcina. BSA 0 10 20 30 45 60 (min)
St. 0 10 20 30 45 60 St.
P: 1 2 3 4 5 6 7 8 9
HemoglobinaHemoglobinaHemoglobina (PM=64500): formada por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas (141 aa) y dos cadenas (146 aa).Cada subunidad tiene un grupo Hemo con un átomo de Hierro en estado ferroso (Fe2+) que son los que convierten a la Hb en una proteína cromogénica.
Evaluar el comportamiento de la Hemoglobina
corrida por SDS-PAGE, bajo condiciones
desnaturalizantes.
Objetivo 3:
ResultadosResultados
SDS-PAGE aplicado a Hemoglobina (Hb)SDS-PAGE aplicado a Hemoglobina (Hb)
SDS-PAGE (12%)Tinción con Azul de
Coomasie
(BSA) SUEROHb
PM aprox.
64.500
34.000
17.00014.000
SDS-PAGE aplicado a Hemoglobina (Hb)SDS-PAGE aplicado a Hemoglobina (Hb)
SDS-PAGE (12%)Tinción con Azul de
Coomasie SDS-PAGE (15%) Sin tinción
(BSA) SUEROHb
Hb en diferentes concentraciones
PM aprox.
64.500
34.000
17.00014.000
17.00014.000
PM aprox.
EjerciciosEjercicios11) Se realiza una electroforesis en un buffer pH 7.6, de una mezcla de tres proteínas (a, b y c) cuyos pI son: pI (a) = 4.3 pI (b) = 5.6 pI (c) = 8.3 De acuerdo con estos datos:A a) las proteínas (a) y (b) migrarán al ánodo.B b) las proteínas (b) y (c) migrarán al ánodo.C c) las proteínas (a) y (b) migrarán al cátodo.
d) la proteína (b) migrará al cátodo.
e Se desea separar por electroforesis una mezcla de tres proteínas (I, II, y III) utilizando un buffer pH 5.2. Teniendo en cuenta los siguientes datos: pI P.M. I ………...4.7……..110.000 II ..……...4.0………60.000 III ..……...6.9……..150.000 Puede predecirse que: Aa) la proteína I se dirigirá al ánodo, y las proteínas II y III al cátodo.Bb) II estará más alejada que I del lugar de siembra.Cc) III estará más cerca del ánodo que I y II.Dd) I estará más alejada que II del lugar de siembra.
2)
3) Se realizó la electroforesis bidimensional de una muestra de suero normal canino. A partir de los siguientes datos identifique las proteínas. PROTEINAS PM pI Albúmina 69000 4.9 1-globulina 195000 2.7 2-globulina 820000 5.4 -globulina 143000 5.6 -globulina 160000 7.3
pH 2 pH 9
3) Se realizó la electroforesis bidimensional de una muestra de suero normal canino. A partir de los siguientes datos identifique las proteínas. PROTEINAS PM pI Albúmina 69.000 4.9 1-globulina 195.000 2.7 2-globulina 820.000 5.4 -globulina 143.000 5.6 -globulina 160.000 7.3
pH 2 pH 9Electroenfoque
SDS-PAGE
•1,2 y 3.) Proceso de Purificación.•4.) Proteína Purificada•5.) El material purificado (banda C) con tres marcadores de peso molecular A, B y D.
4) La figura adjunta muestra un gel SDS-PAGE. Las proteínas han sido teñidas con azul de coomassie. Se han aplicado 5 muestras distintas:
¿Cuál es el peso molecular de la proteína pura?
D
St. P.M.A......100.000B........40.000D.........4.000
Curva de calibración de estándares de P.M. por SDS-PAGE.
y = -134904x + 118644R2 = 0,9992
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1Rf
P.M
.
A
B
D
5) La protein-kinasa dependiente de cAMP de mamíferos muestra un peso molecular en condiciones nativas de 178.000. En SDS-PAGE esta proteína da lugar a una banda de 39000 y otra de 50000.
¿Cómo se explican estos resultados?
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