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Capacidad de detección y caracterización de agentes patógenos por secuenciación de ácidos nucleicos
Dr. Ernesto RamírezBiología Molecular,
InDRE-Salud, Mexico
Caracterización Molecular del virus de la Influenza H7
http://www.patentlens.net/
Publicado por emulenews el 7 Mayo 2009
El genoma del Virus influenza A tiene un tamaño total de 13,588 bases, está contenido en ocho cadenas sencillas (no apareadas) de RNA que codifican diez proteínas:
ESTRUCTURA GENÓMICA
MARCADOR RESULTADOINF A POSH1SW NEGRP NEGH1 NEGH3 NEGH5 NEGH7 POS
MARCADOR INF A CT: 16.3
MARCADOR H7CT: 17.5
Resultado de la muestra procedente de ave
Diagnóstico molecular de influenza por qRT-PCR
http://www.patentlens.net/
38995 H1N1pdm
3665 ed 15 DIC H1N1
39587 H1N1pdm 38713 H1N1pdm
3814
4 H1N
1pdm
1048
9 H1
N1p
dm
1046
6 H
1N1p
dm10
459
H1N
1pdm
1043
7 H1
N1pd
m
A/go
ose/
Hun
gary
/282
3/2/
2007
(H5N
1)H
1gen
M 1
5 se
p
C1
H1N
1sea
s
C2 H1N1seas
C3 H1N1seas
11145 H3N2seas
4773 ed H3N2est
38567 H3N2seas
3244 H3N2seas
H3genM
15 sep
315422537|gb|CY078724.1(H10N59)
3362
8645
0|gb|J
N0870
83.1(
H3N6)
1679
9678
5|gb
|EU3
0125
2.1(
H3N8
)1M e
d
388595406|gb|CY120540.1(H7N3)
386643074|gb|CY116784.1(H2N9)343971741|gb|CY097302.1(H10N1)
340542003|gb|CY094446.1(H1N2)
194310608|gb|CY033423.1(H6N1)
0.005
Árbol Filogenético utilizando secuencias parciales del gen M de los Subtipos H1N1 estacional, H3N2, H1N1pdm y H5N1. El virus Influenza B carece de matriz (genM)
0000
000000
0000
0
H1N1 Estacional
H1N1 PandémicoH5N1
H3N2ORIGEN AVIAR
Gen de Matriz
ANALISIS CON BLASTn DE LA SECUENCIA LA HEMAGLUTININA. RESULTADO : SUBTIPO H7
Genotipificación de Hemaglutinina
H7A NA M13
H7N3 BritishColumbia Chicken 2004 AY650272.1
H7N3 NJ Chicken 1994 AY300950.1
H7N3 Chile chicken 2002 GU053047.1
H7N3 England Turkey 1963 AY207513.1
H7N3 Victoria Chicken 1992 CY025079.1
H7N3 Queensland Chicken 1994 CY022687.1
H7N3 Netherlands Mallard 2000 CY005846.1
H7N3 Pakistan Chicken 1995 FJ577512.1
H5N3 HongKong Duck 1977 CY005591.1
96
7177
95
88
34
29
0.02
Europa - Asia
América
Genotipificación de Neuraminidasa
CONCLUSIONES
HEMAGLUTININA: SUBTIPO H7
NEURAMINIDASA: SUBTIPO N3
MATRIZ: ORIGEN AVIAR
Tiempo de análisis: < 12 horas
Diagnóstico de Patógenos Desconocidos
Metagenómica
Secuenciación y análisis del contenido genómico de una mezcla compleja microbiana a partir de un ambiente
• Cribado de los diferentes microorganismos presentes en una muestra específica
• Sin conocimiento a priori de los mismos
• Sin necesidad de cultivarlos
• Análisis por secuenciación del material genético microbiano extraído directamente
Svraka, S., et al. (2010). Journal of General Virology 91: 2846-2856Edwards R. A. & Rohwer F. (2005).Nature Reviews Microbiology 3:504–510
Secuenciación de DNA: el método de Sanger Dideoxinucleótidos terminadores (ddNTP), marcados con 4 fluoróforos distintos, uno para cada nucleótido
Sanger F, at al. (1977) PNAS. 74:5463-5467
http://images.the-scientist.com/content/figures/
NGS Next Generation Sequencing Tecnologías de secuenciación de siguiente
generación
•Eliminan la necesidad de clonar fragmentos de DNA en bacterias
•Permiten la secuenciación masiva paralela: se generan cientos de miles de reacciones de secuencia en paralelo.
•Existen diversas plataformas para llevar a cabo este proceso.
Palacios, G., et al. New. Engl.J. of Med. 358: 991-98
Método de secuenciación masiva en paralelo
Estudio MetagenEstudio Metagenóómico de Patmico de Patóógenos en genos en Exudado FarExudado Farííngeo Mediante Secuenciacingeo Mediante Secuenciacióón n
Masiva ParalelaMasiva Paralela
PerlasPerlas y y reactivosreactivos de PCR en los de PCR en los microreactoresmicroreactores de de aguaagua y y aceiteaceite. en . en emulsiemulsióónn
EnriquecimientoEnriquecimiento de de perlasperlas..
AmplificaciAmplificacióón Clonaln Clonal
La La amplificaciamplificacióónn clonalclonal ocurreocurre en los en los microreactoresmicroreactores..
AnAnáálisis de lisis de SecuenciasSecuencias
PGM Ion TorrentPGM Ion Torrent
––
Ion Chip 314 Ion Chip 314
10 Mb10 Mb
Perlas de la genotecaPerlas de la genoteca 500, 598500, 598
NNúúmero total de basesmero total de bases 28.58Mpb28.58Mpb
NNúúmero de lecturasmero de lecturas 253,210253,210
Longitud PromedioLongitud Promedio 113pb113pb
Lecturas mLecturas máás largas larga 174pb174pb
Tabla: Resultados de secuenciaciTabla: Resultados de secuenciacióón plataforma Ion Torrentn plataforma Ion Torrent
Ensamble Ensamble de novo de novo BBúúsqueda de identidadsqueda de identidad
Estudio metagenómico de patógenos en líquido cefalorraquídeo de pacientes con meningoencefalitis
Obtención del genoma completo del Virus de Varicela-Zoster genotipo M4 mediante secuenciación masiva
paralela
Gracias
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