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Caracterización molecular de Mycoplasma gallisepticum y
Mycoplasma synoviae en ponedoras comerciales y
reproductoras pesadas de la zona centro de Colombia
Cesar Enrique Ventura Politte, MVMaestría Salud Animal
Línea de Microbiología y Epidemiologia Aviar
CONTENIDOGeneralidades de la micoplasmosis
Conclusiones y Recomendaciones
Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo
Generalidades de la micoplasmosis
Conclusiones y Recomendaciones
Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo
HISTORIA• 1898 en bovinos pleuroneumonia• En aves en los años 30- Sinusitis de
los pavos en 1938• Años 50, en pollos y pavos-ERC
Nocard y Roux, 1898; Nelson 1935; Dickinson y Hinshaw, 1938; Delaplane y Stuart, 1943;Markham y Wong, 1952; Van Roekel y Olesiuk, 1953
ETIOLOGÍA• Clase Mollicutes (mollis = suave y cutes = pared), • Orden Mycoplasmatales• Familia Mycoplasmataceae • Género Mycoplasma • 23 especies pueden afectar aves• Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma
sinoviae, Mycoplasma meleagris y Mycoplasma iowa
Kleven, 2000Browning & Markhan, 2004
600-1350 kpb, con 23-40 % de G-C, 740 genes. Funciones claras 469 genes.
Papasizi et al., 2003
GENOMA DE MG
EPIDEMIOLOGÍA
OIE, 2004;Kleven, 2006
Problemática de pollos, ponedoras, reproductoras y pavos
Aves silvestres y de traspatio
Distribución mundial
EPIDEMIOLOGÍATransmisión Horizontal y VerticalCondiciones de granja: alimento,
roedores, aguaReservorios y transmisores: Personas,
vehículos, Polvo, Insectos y BiofilmsBioseguridad
Kleven, 1996; Christensen, et al., 1994; Butcher, 2008
PATOGENICIDADCitoadhesinas – Hemaglutininas:
mgc2, vlhA , GapA , PvpA Perfil antigénico variableSon organismos intracelulares "Latencia "
Buyuktanir, et al., 2008; Razin, et al., 1998
DIAGNÓSTICO
Bencina et al., 1987;Bradbury & McClenaghan, 1982; Mardassi et al., 2008
IgM7-10 DPI
IgG15-21 DPI
ConfirmatoriaSerotipificación
Detección del material genético - ADN
Bencina et al., 1987;Bradbury & McClenaghan, 1982; Mardassi et al., 2008
Generalidades de la micoplasmosis
Conclusiones y Recomendaciones
Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo
DISTRIBUCIÓN GEOGRAFICA AVICULTURA NACIONAL
MINISTERIO DE AGRICULTURA Y DESARROLLO RURALDEPARTAMENTO ADMINISTRATIVO NACIONAL DE ESTADÍSTICA-DANEFEDERACIÓN NACIONAL DE AVICULTORES DE COLOMBIA-FENAVIFONDO NACIONAL AVÍCOLA-FONAV
63 Granjas de Ponedoras Comerciales – GPC9,5 % del Censo145 Lotes
30 Granjas de Reproductoras Pesadas- GRP33 % del Censo48 Lotes
ENCUESTA Ubicación geográfica
Tamaño y número de lotes en la granja
Uso de vacunas de MG y MS
Edad – Raza – Granjas Cercanas
Tipo de Explotación y Tipo Instalación
Programa de Bioseguridad
MATERIALES Y MÉTODOS• Enero de 2010 y marzo de 2012. • Hisopos traqueales
MATERIALES Y MÉTODOS• 45 animales por cada uno de los lotes
presentes en las granjas• Un hisopo humedecido en PBS por cada
tres aves.
MATERIALES Y MÉTODOS• Lavado del total de hisopos como un pool. • Conservación en un recipiente estéril a -20 0C • Extracción por un procedimiento no fenólico
Modificado de Hernández et al., 2009;OIE, 2008
Primers Secuencia Gen Producto
MG-FMG-R
5' CGC AAT TTG GTC CTA ATC CCC AAC A 3' 5' TAAACC CAC CTC CAG CTT TAT TTC C 3'
mgc2 237 pb300 pb
MS-F 1MS-R 1
5´ CCA TTG CTC CTG CTG TTA T 3´ 5´ GAT TCT GTT GTA GTT GCT TCA A 3´
vlhA 300 pb
MS-F 2MS-R 2
5´ AGT AAC CGA TCC GCT TAA TGC 3´ 5´ GAT GCG TAA AAT AAA AGG AT 3´
vlhA 450 pb
28S-F28S-R
5´ GGC GAA GCC AGA GGA AAC T 3 5´ GAC GAC CGA TTT GCA CGT C 3´
28S 61 pb
García et al., 2005; Wetzel et al., 2010; Hammond et al., 2009; Suzuki et al., 2009
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
• Estadística descriptiva para las diferentes variables
• Pruebas de correlación de variables chi cuadrado
• Pruebas de regresión logística• Software estadístico Statistix 8.0
Mycoplasma gallisepticum
Cepa F
Cepa 6/85
POS NEG
300 pb
300 pb
Mycoplasma synoviae
POS NEG
POS NEG
300 pbWVU1853
450PbWVU1853
300 pb
450 pb
300 pb
500 pb
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD
Cepa F Cepa 6/85
Cepa WVU1853 Cepa
WVU1853
300 pb
300 pb
200 pb
Alto porcentaje de positividad a MG y MS
0
20
40
60
80
MSMG
51,81
30,05
48,18
69,94
NEG POS
Po
rcen
taje
n : 193
Positividad a MG y MS
GRPGPC
0
20
40
60
80
100
MG
MS
45,8
20,8
77,9
57,2
Po
rce
nta
jeMayor positividad a MS en los dos tipos de
explotación
p<0,05
Variables sin diferencias estadísticasGPC
Ponedoras comerciales
GRPReproductoras
PesadasAltitud 268-2780 m.s.n.m
p>0,051010-2572 m.s.n.m p>0,05
Tamaño de los lotes
1000 – 121380 avesp>0,05
770 – 36300 avesp>0,05
Departamento p>0,05 p>0,05
Tipo de Instalación
p>0,05 p>0,05
BioseguridadCumplimiento de 6 parámetros
61,8 % p>0,05
100 %
Variables con diferencias estadísticasGPC GRP
Raza 5 Razas p<0,05 en MG 20 – 73 %p<0,05 en MS 60 – 91 %
2 razas p<0,05 en MG 4 – 36 %p<0,05 en MS 39 – 52 %
Grupos Etáreos p<0,05 MG 13% al 74 %p<0,05 MS 13 % al 94%
p<0,05 MG 17% al 33 %p<0,05 MS 17% al 100%
Numero de lotes 1 – 10 p>0,05 en MS p<0,05 para MG 40% - 83%
1 - 3 lotes p>0,05
USO de Vacunas MG y MS
35,2 % MG p>0,050% MS
91,7 % MG p>0,050 %
Infecciones Mixtas MG y MS
POS MG y MS0
20
40
60GPC
GRP
8,3
55,2
Po
rce
nta
jeMayor positividad mixta en Ponedoras Comerciales
Generalidades de la micoplasmosis
Conclusiones y Recomendaciones
Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo
Cepas MG Sitios de corte HaeIII en el gen mgc2 de MG Longitud de losFragmentos
Cepa F
TCGCAATTTGGTCCTAATCCCCAACAAAGAATTAATCCACAGGGTTTTGGTGGCCCAATGCCACCTAACCACATGGGGATGCGGCCAGGGTTTAACCAAATGCCGCCACAAATGGGTGGGATGCCACCTAACCACATGGGGATGCGGCCAGGGTTTAACCAAATGCCACCTAACCAAATGGGTGGAATGCCACCAAGACCAAACTTCCCTAACCAAATGCCTAATATGAATCAACCAAGACCAGGTTTCAGACCACAACCTGGTGGTGGGGTCTCGATGGGAAATAAAGCTGGAGGTGGGTTTAAA
31 pb 53 pb 63 pb 157 pb
Cepa 6/85
TCGCAATTTGGTCCTAATCCCCAACAAAGAATTAACCCGCAGGGCTTTGGTGGCCCAATGTCACTTAACCAAATGGGGATGCGACCAGGGTTTAACCAAATAGCCCCCACAAATGGGAGGAATAGCCACCAAGACCAAACTTCCCTAACCAAATAGCCTAATATGAACCAACCAAGACCAGGTTTCAGACCACAACCTGGTGGTGGGGCGCCGATGGGAAATAAAGCTGGAGGTGGG
53 pb 184 pb
Cepa R
CGCAATTTGGTCCTAATCCCCAACAAAGAATTAACCCACAGTGCTTTGGTGGCCCAATGCAACCTAACCAAATGGGAATGCGACCAGGGTTTAACCAAATGCCCCCACAAATGGGAGGAATGCCACCTAACCAAATGGGAATGCGACCAGGGTTTAACCAAATGCCCCCACAAATGGGAGGAATGCCACCAAGACCAAACTTCCCTAACCAAATGCCTAATATGAACCAACCTAGACCAGGTTTCAGACCACAACCTGGTGGTGGGGTGCCGATGGGAAATAAAGCTGGAGGTGGGTTTA
52 pb248 pb
Acceso Genbank AY556230.1; AY556231.1 y AY556228.1
PCR-RFLP para diferenciar cepas de MG
www.insilico.ehu.es
MG 300
157 184
HaeIII 63
53
31
53
MG 237
248
52
CampoCepa F
6/85
Lectura de Patrones de restricción para M. gallisepticum
ROJO: Patrón 1
AMARILLO: Patrón 2
Identificación de patrones RFLP de MG con Tinción de plata
Control Cepa
F
Muestra con
Patrón1
Control Cepa6/85
Muestra con
Patrón1
Muestra con
Patrón2
100pb
40pb
200pb
60pb
300pb
160pb
Patrones RFLP de MG
POS MG0
20
40
60
80Patron 1
Patron 260,2
39,8
Po
rce
nta
jeMayor porcentaje de cepas de campo de
MG
n:93
Sin diferencias estadísticasPatrón 1 Patrón 2
Altura p>0,05 p>0,05
Número de lotes en las granjas
p>0,05 p>0,05
Tamaño de los lotes p>0,05 p>0,05
Departamento p>0,05 p>0,05
Bioseguridad cumplimiento de 6 parámetros
p>0,05 p>0,05
Con diferencias estadísticasPatrón 1 Patrón 2
Raza p<0,05 7 – 40 % GPC
p<0,05 2 – 53 % GPC
Tipo de Instalación
p<0,05 Jaulas 22% - Piso 57%
p<0,05 Jaulas 5-9 %- Piso 86 %
Tipo de Explotación
p<0,05 30% GPC- 90% GRP
p<0,05 70% GPC- 10 % GRP
Generalidades de la micoplasmosis
Conclusiones y Recomendaciones
Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo
Secuenciación de 80 muestras
seleccionadas
MS46 muestras
MG34 muestras
Patrón 222 muestras
Patrón 112 muestras
Única Banda36 muestras
Doble banda10 muestras
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTAcceso Genbank AY556230.1 , HQ591358.1, AY556228.1
Patrón 1 Patrón 2
96-100 % Entre ellas
96-100 % entre ellas
96-99% con la Cepa F
Cepa F control 98% y 100% Eis7C10
96-98 % cepa R de referencia
Similaridad de las secuencias de MG
Nucleotide Substitutions (x100)0
16.6
246810121416
AY556230.1 Strain F.s eqMG189.seqHQ591358.1 Eis7-C-10.seqMG20.seqMG61.seqMG86.seqMG126.seqMG27.seqCepaF.s eqMG13.seqMG7.s eqMG69.seqMG172.seqMG12.seqAY556231.1 Strain 685.seqVacuna 6-85.s eq
Seqman® DNASTAR, Lasergene v.10®Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011 MEGA 5.1
_________________
_________________
__________________________________
Patrón 1 en Muestras de campo
Nucleotide Substitutions (x100)0
23.4
5101520
MG54.seqMG139.seq
MG142.seqMG149.seqMG143.seqMG85.seqMG94.seq
AY556229.1 Strain S6.seqMG186.seqMG22.seqMG29.seqMG46.seqMG190.seq
MG194.seqMG156.seq
AY556228.1 strain R.s eqMG165.seq
MG70.seqMG89.seq
MG72.seqMG75.seq
MG201.seqAY556230.1 Strain F.s eq
AY556231.1 Strain 685.seq
Seqman® DNASTAR, Lasergene v.10®Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011 MEGA 5.1
_________________
Patrón 2 en Muestras de campo
__________________________________
Similaridad de las secuencias de MS
Se escogieron un grupo de cepas con mas alto porcentaje de similaridad en BLAST
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTGenbank HQ326484.1; DQ661614.1; FM164370.1; AB507391.1 ; FJ495803.1
83,2 % - 96,9 % Entre ellas
40-99 % En muestras de doble banda
Similaridad de las secuencias de MS
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLASTGenbank HQ326484.1; DQ661614.1; FM164370.1; AB507391.1 ; FJ495803.1
Cepa WVU1853 : 38,9 % - 43,8 %
Cepa EEA: 82 % - 97 %
Cepa 94011: 89 % - 96 %
Cepa NZMSID181: 82 % – 98 %
Cepa B45/04: 88 % - 95 %
Seqman® DNASTAR, Lasergene v.10®Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011 MEGA 5.1
Nucleotide Substitutions (x100)0
77.7
10203040506070
MS30.seqMS21.seqMS101.seq
MS12.seqMS142.seqMS149.seq
MS87.seqFM164370.1 Strain B45 04.seq
MS51.seqAB507391.1 Strain NZMSID181.seqDQ661614.1 Strain 94011.seq
MS134.seqFJ495803.1 Strain EAA.seq
MS62.seqMS43.seqHQ326484.1 WVU1853.seq_________________
_________________
__________________________________
_________________
Productos de MS de una sola banda
Seqman® DNASTAR, Lasergene v.10®Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar 2011 MEGA 5.1
Nucleotide Substitutions (x100)0
58.1
1020304050
MS28.seqMS190-1.seqMS37.seqMS37-1.seqMS104.seqMS104-.seqMS60-.s eqMS76-1.seqAB507391.1 Strain NZMSID181.seqMS194.seqMS28-1.seqMS76.seqFM164370.1 Strain B45 04.seqFJ495803.1 Strain EAA.seqMS194-1.seqMS52-1.seqDQ661614.1 Strain 94011.seqMS52.seqMS60.seqHQ326484.1 WVU1853.s eq
Productos de MS de dos bandas
_________________
_________________
_________________
_________________
_________________
Generalidades de la micoplasmosis
Conclusiones y Recomendaciones
Análisis molecular de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae
Detección de Mycoplasma gallisepticum y Mycoplasma synoviae mediante la técnica de PCR a partir de hisopos traquealesDiferenciación molecular mediante la técnica de PCR-RFLP de Mycoplasma gallisepticum vacunal y de campo
CONCLUSIONES• Alta presencia de MG y MS de campo
en los dos tipos de explotación en estudio.
• Mayor presencia en granjas multiedad y mayor edad de los lotes
• Posibilidad de Transmisión Vertical
CONCLUSIONES• Infecciones mixtas que afectan el
manejo farmacológico y vacunal de lo agentes a nivel de granja
• Se debe determinar el uso y la importancia del uso de vacunas para el control de la enfermedad en las granjas
RECOMENDACIONES• Estudios que involucren todas las etapas de
producción en los diversos tipos de explotación
• Evaluación de programas vacunales • El mismo tipo de estudio en otras zonas
avícolas del país• Evaluar interacción de micoplasmas con
otros patógenos respiratorios
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