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Cinética Enzimática e Inhibición

Dr. José Luis Cárdenas LópezEnzimas de Productos Marinos

Semestre 2014-1

¿Qué medimos en una rx enzimática?

E + S ES E+P

enzimática?

[Producto] vs tiempo

O… desaparición de reactante

El steady state (eq. dinámico)E + S ES E+P

Equilibrio dinámico

0][][ =−=

dt

ESd

dt

ESd

En términos de tiempo…

Usando el enfoque de steady state

][][ ESdESd

E+ S ES E+Pk1

k-1

k2

0][][ =−=

dt

ESd

dt

ESd

0=[E][S]k1 -[ES](k-1+k2)

Requisitos:

1) Cantidades catalíticas de E ( [S]>>[E] )

2) Solo la velocidad inicial (t casi 0), por lo

que P es casi nulo, k-2 es despreciable

3) Steady state (equilibrio dinámico)

0 =[E][S]k1 -[ES](k-1+k2)

ET= [E]+[ES]

[E]=ET-[ES]

0 =[ET-[ES]][S]k1 -[ES](k-1+k2)

[ET-[ES]][S]k1 =[ES](k-1+k2)

ET [S]k1 -[ES][S]k1 =[ES](k-1+k2)

ET [S]k1 =[ES](k-1+k2)+ [ES][S]k1

E [S]k =[ES](k +k +[S]k )ET [S]k1 =[ES](k-1+k2+[S]k1)

ET [S]k1 =[ES]

(k-1+k2+k1[S])

])[(

][][

121

1

Skkk

kSEES T

++=

−

][][

21 kk

SEES T

++

=− ][)(

1

21 Sk

kk+

+−

][)(

][][

1

21

22

Sk

kk

SEkESk T

++

=−

][)(

][][

1

21

22

Sk

kk

SEkESk T

++

=−

k2 ET= Vmax

k [ES]= vk2[ES]= v

][

]max[

SKm

SVv

+=

1

21

k

kkKm

+= −

][

]max[

SKm

SVv

+=

ecuación Henri -Michaelis- Menten

1][

max

+=

S

Km

Vv

1][

1

max +=

S

KmV

v

Victor Henri , francés de padres rusos(6 Junio 1872 – 21 Junio 1940)

1903

Leonor Michaelis , alemán(Enero 16, 1875 – Octubre 8, 1949)

Maud Leonora Menten , canadiense (Marzo 20, 1879 – Julio 26, 1960)

Biochemische Zeitschrift (1913;49:333–369)

Michaelis-MentenV

eloc

idad

(mm

ol/m

l/seg

)

60

80

100 Velocidad maxima (Vmax)

[Substrato] mmol/ml

0 50 100 150 200 250

Vel

ocid

ad(m

mol

/ml/s

eg)

0

20

40

Km=1/2 Vmax

Transformación de Lineweaver Burk

][

]max[

SKm

SVv

+=

Invirtiendo:Invirtiendo:

max

1

][

1*

max

1

VSV

Km

v+=

Lineweaver-Burk

1/V

eloc

idad

(m

mol

/ml/s

ec)

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

1/Vmax

1/[Substrato] mmol/ml

-0.10 -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25

1/V

eloc

idad

(m

mol

/ml/s

ec)

0.1

0.2

-1/Km

1/Vmax

Gráfica Eddie Hoffste

][

]max[

SKm

SVv

+=

]max[])[( SVvSKm =+ ]max[])[( SVvSKm =+

][max

]max[][

S

vKmVv

KmvSVSv

−=

−=

Vmax1

Vmax2-Km1

2 enzimas?

Vo/[S]o

Vo-Km2

Parámetros importantes

• Vmax= velocidad máxima• Km= Constante de Michaelis Menten

(afinidad con el sustrato)• Vmax/Km=eficiencia fisiológica• Vmax/Km=eficiencia fisiológica• Turnover number (o kcat)= “numero de

recambio” es la cantidad en mol de sustrato (S) que seran convertidos a producto (P) por segundo

• Velocidad = conc de enzima (inicio de la rx)

Molecularidad

• Cúantas moléculas hay en ambos lados de la reacción

• A� P 1 reactante, 1 producto (UNI-UNI)• A+B� P BI-UNI• A+B� P BI-UNI• A+B+C� P+Q TRI-BI • Etc.

Velocidad (Tasa)

• Cantidad (en concentración en un momento dado)

• A+B � 2P

dt

Bd

dt

Adv

][][ −≅−≅

dt

Pdv

][≅

Desaparición de reactivo

aparición de producto

En: concentración/tiempo = M seg -1

Orden de la reacciónMichaelis-Menten

Vel

ocid

ad(m

mol

/ml/s

eg)

60

80

100 Orden “cero”

[Substrato] mmol/ml

0 50 100 150 200 250

Vel

ocid

ad(m

mol

/ml/s

eg)

0

20

40

60

1er orden

Orden mixto

Orden de la reacción

• Relación entre velocidad y concentración• A+B� P

nAv ][∝ nAv ][∝mBv ][∝

mn BAv ][][∝mn BAkv ][][= k= constante de la tasa (rate constant)

Representa la proporcionalidad

Orden de la reacción

• Indican la relación de la velocidad de aparición de producto o desaparición de reactantes y las concentraciones de reactantes a un tiempo determinadoreactantes a un tiempo determinado

• Integrando ecuaciones diferenciales se llega a ecuaciones que nos pueden decir la relación a cualquier tiempo de la reacción

Orden 0

• La aparición de producto o desaparición de reactantes (según se mida la actividad) es independiente de la [reactantes]

dPdAPA

k

→dt

dPk

dt

dA ==−

Gráficamente

[pro

du

cto

] (M

)

Tiempo (seg)

Pendiente = k = 0.22 M seg-1

1 er Orden

• La aparición de producto o desaparición de reactantes (según se mida la actividad) depende de la [reactantes]

PAk

→dt

dPkA

dt

dA ==−

Integrando: ktPA

A =− )()(

)(log3.2

0

0

Donde Ao es la concentración inicial de reactante y P es la concentración de producto a tiempo t

Para calcular kTiempo (seg) So-P = S (mM) P (mM) So/S ln So/S

0 9.00 0 -

300 8.55 0.45 1.052 0.0506600 8.12 0.88 1.108 0.1025900 7.71 1.29 1.167 0.1544900 7.71 1.29 1.167 0.1544

1200 7.32 1.68 1.229 0.20621500 6.95 2.05 1.294 0.25771800 6.60 2.40 1.363 0.3096

Gráficamente

Ln (

So/

S) 0.10

0.12

0.14

0.16

Tiempo (seg)

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000

Ln (

So/

S)

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

Pendiente = k= 1.7 x 10-4 seg-1

OJO: Unidades

Reacciones multisustrato

• Nomenclatura Cleland (U Wisconsin)

E + S ES E+P

E

S P

EES EP

2 sustratos 2 productosE+A+B E+P+Q

VARIAS POSIBILIDADES

1)primera

E

A P

EEAB EPQ

Q

EA EQ

B

Dos entran, dos salen, 2 sustratos, 2 productos (Bi-Bi)A entra primero, P sale primero “BI-BI ORDENADO”

E

A

EEAB EPQ

EA

B

EB

P

EQ

Q

EP

2)

B A Q P

El orden de entrar salir es aleatorioBI-BI ALEATORIO

E

A P

EFP F FB

Q

EA EQ

B

3) Tercera posibilidad

E EFP F FBEA EQ

La Enzima se convierte (F) durante la rxLos sustratos no se unen al mismo tiempo, un producto sale antes de que el segundo entreBI-BI PING-PONG

¿Cómo distinguirlas?

• Union secuencial – Ordenada– Aleatoria– Ping-Pong– Ping-Pong

• Graficar 1/v vs 1/A a varios niveles de B

Secuenciales

1/vB

1/[A]

1/v B

Ping-Pong

1/[A]

Inhibición

• Irreversible• Reversible

– Competitiva– No competitiva– No competitiva– Acompetitiva– Parcial

• Competitiva• No competitiva

– Mezclada• 3 Tipos (β=0, β=0 y α=β)

Inhibición Competitiva

Et = E+ES+EI

)][

1(´

Ki

I

Km

Km +=

max

1

][

1*)

][1(

max

1

VSKi

I

V

Km

v++=

Inhibición no competitiva

Et = E+ES+EI+EIS

)][

1(_

_

Ki

I

opendiente

inhpendiente +=

Grafica Dixon

)][

1(max

1

][

1*)

][1(

max

1

Ki

I

VSKi

I

V

Km

v+++=

Grafica Dixon

Inhibición acompetitiva

E + S ES E+P

+ I

Et = E+ES+ESI

ESI

1/Vo

control

[I]1

[I]2

>[I]1/Vmax (1+[I]/Ki)

1/[S]

1/Vmax

-1/Km

)][

1(max

1

][

1*

max

1

Ki

I

VSV

Km

v++=

Inhibición parcial

• Competitiva

E + S ES E+P

+ I+ I

Ks][

]][[

ES

SEKs =

]][[ IEKi =

Et=E+EI+ES+ESI

ESI

+ I+ I

EI +S EI+PαKs

Ki αKi

][

]][[

ESI

SEIKs =α

][

]][[

ESI

IESKi =α

][

]][[

EI

IEKi =

Parcial competitiva

• El sustrato y el inhibidor se unen en diferentes sitios activos, ES, EI y ESI

• El sustrato se une mejor a la enzima sola que a la EIque a la EI

• Tanto ES como ESI van a producto…

Gráfica diagnóstica

1/vI

[I]=∞ pendiente α Ks/Vmax

[I]=Ki

1/[S]

[I]=0 pendiente Ks/Vmax

[I]=Ki

-1/Ks

-1/αKs

Ki

I

Ks

SKsKi

IS

Ks

S

V

v

][][1

]][[][

max ++

+= α

][

][

max I

S

V

v =

][

)][

1(

)][

1(max

S

Ki

IKi

I

Ks

V

++

+=

α][

][

max SKs

S

V

v

aparente +=

Inhibición parcial

• No Competitiva

E + S ES E+P

+ I+ I

Ks

Et=E+EI+ES+ESI

kp

ESI

+ I+ I

EI +S EI+PKs

Ki Ki

βkp

Parcial no competitiva

• El sustrato y el inhibidor se unen en diferentes sitios activos, ES, EI y ESI

• El ESI va a producto pero no tan efectivamente como ESefectivamente como ES

Gráfica diagnóstica

1/vI

[I]=∞ pendiente Ks/βVmax

[I]=Ki

1/[S]

[I]=0 pendiente Ks/Vmax

[I]=Ki

-1/Ks

)][

1(

)][

1(

][

)][

1(

)][

1(

][

max

Ki

IKi

I

S

Ki

IKi

I

Ks

S

V

v

ββ +

++

+

+=

KiKi

][

][

max SKs

S

V

v

+=

El resto

• No es tan complicado…como parece…• Consultar capítulo 4 del libro

– Enzyme Kinetics. Segel, I (1975) Wiley Int.

• Si alguien gusta consultarla, yo tengo una • Si alguien gusta consultarla, yo tengo una copia del libro, o buscarla en la biblioteca

Inhibición irreversible

Inhibición irreversible

• No específicos– Modificación química, son importantes para detectar

los grupos que están presentes en el sitio activo:– Lys DNFB (dinitrofluorobenceno), Cys iodoacetato,

bromo, MMTS (sulfonato de metilmetanotiol)• Etiquetadores de “afinidad” o reactivos dirigidos • Etiquetadores de “afinidad” o reactivos dirigidos

al sitio activo– Reactivos que tienen afinidad por el sitio activo– TPCK, glicidolfosfato, FSBA (benzoil-adenosina de

fluorosulfonilo)

• Etiquetadores de fotoafinidad (activados con UV)– 8 azida ATP, 5 azida UTP

• Reactivos suicidas (se activan con la catálisis)• Reactivos suicidas (se activan con la catálisis)– Anhidrido isatoico, ciclopropil benzilamina– También se les llama “basados en el mecanismo”

Algunos ejemplos de modificaciones químicas

Clase/grupo Rx reactivo Propósito

nucleófilonucleófilo

Lys –NH2 Sustitución nucleofílica

O-metilsoureaDinitrofluorobenceno(DTNB)

Bloquear -NH2

(DTNB)

Cys-SH alquilación IodoacetatoIodoacetamidabromo

No específicas para Cys, sino para nuc:

His imidazol acilación dietilpirocarbonato Lys, Tyr

Arg guanidino Adición a carbonilos 2,3 butano diona

electrófiloelectrófilo

Asp, Glu Formación de amida Amina + carbodiimida

aromáticos Yodinación I2, I3-, ICl His, SH,

Algunos ejemplos de etiquetas de afinidad

Etiqueta de afinidad Enzima Cadena lateral modificada

Tosilfenilalaninaclorocetona(TPCK)

Serinaproteasas

Serina del sitio activo

Glicidol fosfato Triosafosfatoisomerasa,

Etiqueta nucleófilos o bases generales en el sitio activoisomerasa,

enolasagenerales en el sitio activo

Fluorosulfonilboenzoiladenosina(FSBA)

deshidrogenasas

NAD(P)H del sitio activo

Algunos ejemplos de etiquetas de foto-afinidad

Etiqueta de afinidad Enzima Cadena lateral modificada

8 azido ATP recA proteina tirosina

8 azido cAMP Ribonucleasa A pancreática bovina

treonina

bovina

5 azido UTP UTP glucosa pirofosforilasa

Algunos ejemplos de reactivos suicidas

Reactivo suicida Enzima Cadena lateral modificada

Anhidrido isatoico quimiotripsina Serina del sitio activo

Ciclopropil benzilamina Monoamina oxidasa flavina

Adenosina 2,3, riboepóxido5 trifosfato

β galactosidasa metionina

Cooperatividad y alosterismo

Alostería

Bajo [S] Alto [S]Cambio de conformación

Se presenta en enzimas multisubunidades los sitios activos se comunicanLas enzimas cambian de forma, cambian su reactividad

Alo (otro) Steria (forma)

Kd1Kd2

Kd1 > Kd2 S adicional favorece los cuadros, que se unen mejorpor lo que sera cooperatividad positiva

Kd1 < Kd2 S adicional favorece los cuadros, que se unen peorpor lo que será cooperatividad negativa

¿Como medirla?

max1.0_][

max9.0_][

VVaqueproduzcS

VVaqueproduzcSRs

===

Rs = Factor de cooperatividad

max1.0_][ VVaqueproduzcS =

Cooperatividad positiva Rs < 81Cooperatividad negativa Rs > 81Comportamiento MMenten Rs 81

Demostrar esto

Ejercicio:

Michaelis Menten

][

][9.0

max

max9.0

SKm

S

V

v

Vv

=++

==

=

][1.0][1.0

][

][1.0

max

max1.0

SKmS

SKm

S

V

v

Vv

=++

==

=

][9

][1.09.0

][9.0][9.0

SKm

SKm

SKmS

==

=+

][9

1

][9.01.0

][1.0][1.0

SKm

SKm

SKmS

=

==+

81

9

1

9 ==Km

KmRs

Otra forma de determinar el Ki

• El Ki es sumamente importante• Es análogo al Km, concentración de

inhibidor tal que da la mitad de la inhibición (mitad de la velocidad máxima)inhibición (mitad de la velocidad máxima)

• Si es una droga nueva ¿qué se buscará con respecto al Ki?

• Ki>Km…?• Dixon buscó maneras gráficas de

determinarla

Inhibición competitivaVariar la [I], manteniendo fijas las [S] (en varios niveles)

Inhibición no competitiva

IC50

• El IC50 es una medida muy usada en diseño de drogas

• Corresponde a capacidad inhibitoria al 50% (mide potencia del inhibidor)50% (mide potencia del inhibidor)

• que tanta cantidad del inhibidor es necesaria para reducir a la mitad el proceso (Rx enzimática, aunque es más amplia su aplicación)

• Tiene relación con el Ki

Para los diferentes casos de inhibición

competitiva

No competitiva

acompetitiva

pIC50

• A veces se usa un valor p análogo al pH o al pKa, es:

• pIC50 = -log10 (IC50)• Se usa para expresar la potencia de la • Se usa para expresar la potencia de la

droga en valores exponenciales y generalmente es en M (molar)

Inhibición por sustrato

• A [S] altas se inhibe la rx enzimática• La gráfica de HMM, no da una hipérbola

sino una campana• La gráfica de LB por lo tanto no da una • La gráfica de LB por lo tanto no da una

recta

v

[S]

1/v

1/[S]

Explicaciones posibles

1. La Enzima puede tener 2 sitios de unión para el mismo S– El sitio catalítico y el sitio de inhibición

2. Hay dos configuraciones reversibles 2. Hay dos configuraciones reversibles entre sí– Activa (Ea) e Inactiva (Ei)

Mecanismo

Ea Ei+ +

< S > S

EaS EiS XEa + P

ejemplo

Glucosa 6 fosfato +ADP Glucosa +ATPhexoquinasa

Si la G6P está en alta concentración, se inhibe la rx