Citometria de flujo

CITOMETRIA DE FLUJO

FSC

90º2- 4º

Columna

de muestra

Meeting point

Láser

Amplificación

digitalización

Representación

y Analisis

Flujo

Figura 1) 4.

• Dispersión:

*FSC: Tamaño

*SSC: Complejidad.

• Fluorescencia:

• Uniones AG-AC

• Marcaje con fluorocromos.

• Poblaciones celulares

detectadas simultáneamente.

PARÁMETROS

FLUOROCROMOS

• Absorben luz a una Emiten a otra.

• Espectros de excitación y de emisión.

• Uso Tipo de láser y su long.de onda.

• Corto estado de excitación.

• Fotoestables.

• Alto rendimiento cuántico.

FLUOROCROMO DESCRIPCION

FITC Isotiocianato de Fluoresceína

PE Ficoeritrina

PerCP Proteína Clorofila Peridinina

TRITC Isotiocianato de tetrametil rodamina 540---570

PEC Ficoeritrina cianina

RT Rojo Texas 596----615nm

PC Ficocianina 620---650nm

APC Aloficocianina 650-----660nm

TRICOLOR TRICOLOR 540--------570nm

ALEXA-FLUOR FLUOROCROMO : Molecular Probes

Sistema de flujo

Dispersión de la luz

Fluorescencia

Separación y detección de la luz

Amplificación

Corrección de errores: solapamiento espectral y

formación de dobletes

Digitalización y almacenamiento de la información

SISTEMA DE ABSORCION DE MUESTRA

MUESTRA

AIRE

FLUJO

MUESTRA

CÁMARA

DE FLUJO

FSC

90º

Fluido envolvente

Columna

de muestra

Luz dispersada lateralmente

y luz fluorescente, a = 90º

Luz incidente

Luz dispersada hacia delante, a=2- 4º

Luz dispersada a 90 grados

(Side SCattered light )

Detector FSC

Detector de 90º SSC

Laser

DETECCION DE LUZ DISPERSADA HACIA DELANTE (FORWARD SCATTERED

LIGHT, FSC)

FSC

SSC

El detector de FSC convierte luz dispersada hacia delante en un

pulso de voltaje proporcional al tamaño de la célula/particula

DETECCION DE LUZ DISPERSADA LATERALMENTE (SIDE

SCATTERED LIGHT, SSC)

FSC

SSC

El detector de SSC convierte la luz dispersada lateralmente en un pulso

de voltaje proporcional a l contenido en orgánulos membranosos

(granularidad)

Laser

DETECTORES DE FLUORESCENCIA

Fre

q

Fluorescencia

Detector

Detector de fluorescencia

(PMT3, PMT4 etc.)

Fluorescencia

FSC

FL-1

FL-2

FLUORESCENCIA

• Proceso por el que una molécula absorbe luz, aumenta su energía y

vuelve al estado basal emitiendo un fotón.

• Parte de la energía se pierde en las transiciones entre los distintos

estados por tanto el fotón emitido tiene menos energía (mayor longitud de

onda) que el que fue absorbido.

t (ms)

1<2

1

2

CITOMETROS FLUJO

• Citómetros con 1 láser: 2 D (dispersión) y 3 Fl(fluorescencia)

• Citómetros de 2 láser: 2D y 4 Fl

TIPOS DE LASER

• Láser Violeta 405 nm

• Láser Azul 488 nm (Argón)

• Láser Verde 543 nm

• Láser Rojo 633-635 nm (He-Ne)

• Múltiples marcajes.

• Analizar un elevado numero de

partículas en un corto periodo de

tiempo.

• Cuantificación de la actividad

antigénica.

• Mayor sensibilidad y objetividad.

• Análisis de poblaciones celulares

• Almacenamiento de la información

para análisis posteriores.

VENTAJAS