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Clonacindegenes
ClonacindelDNADNAforneo(secuenciaquesedeseaclonar)Vectordeclonacin(vehculo)Organismohusped(E.Coli)Seleccindevectores
Vectorhbrido
http://www.dnatube.com/video/556/Plasmid-Vector-Construction
http://www.dnatube.com/video/4036/PCRCloning
UngenAislamientoapartirdelmRNA (yanotieneintrones):usodelatranscriptasa inversaquehacecDNA apartirdelconjuntodemRNA deltejido(LibreradecDNA)
Fragmentosdelgenomapordigestinconenzimasderestriccin:SeobtieneunaLibreraGenmica,juegocompletodefragmentosclonadosdelgenomadelorganismoFragmentosdePCRamplificadoconpartidoresespecficosparalasecuenciaquesebuscaydesdeelcDNA extradodeltejidoendondeelgenseestexpresando
Obtencindelasecuenciaqueseclona
Libreragenmica
AmplificacindeunfragmentoporPCR
Acta
Luego de 30 ciclos, una copia del fragmento se ha amplificado 109 veces:
230 =1.073.741.824 copias del fragmento de inters
Vectordeclonamiento
Caractersticas generales de un vector de expresin(procaritico)
- promotor fuerte (inducible)
- sitio de clonamiento multiple (MCS)
o policonector (sitio con muchas
secuencias reconocidas por enzimas de
restriccin)- seal de trmino de la transcripcin
- sitio de unin del ribosoma (RBS)
- origen de replicacin
- marcador de seleccin:
Los ms usados son los antibiticos
ClonacinysecuenciacindelDNA 14
FormacindelVectorhbridoFragmentosdedistintasprocedenciasqueseuneninvitrotrascortarseconlamismaenzimaderestriccin.Ligasa sellazonahbrida
VectoresdeclonacinPlsmido(215kb)Fago (Lambda)Csmido
PlsmidohbridooPlsmidorecombinanteoDNArecombinante
Fcildecrecerenmediosdecultivosimples
Tiempoprpidodecrecimiento,condivisincelularentre2030minutos
Sugenticaesconocidamuybien,puessesecuencicompletamentesugenoma
Sepuedeintroducirmaterialgenticoforneoenvectores,plsmidosoADNdefagocomocopiasdematerialextracromosomal
Husped:E.coli
Plsmido:resistenciaaantibiticosSeleccindevectoresrecombinantes
Cmo reconocer qu bacterias incorporaron el plsmido recombinante y cuales no?
Slo crecen las bacterias que tienen la resistencia a la ampicilina (otorgada por el plsmido)
Obtencindelgendeintersapartirdeunagenoteca
Depender del tipo de librera que se utilice (de cDNA o genmica), el tipo de gen que se obtiene: el ADNcopia (cDNA) que ser igual a ARNm, no tiene intrones o el GEN completo, tal como est en ADN y seguramente fragmentado en varias colonias positivas
Propagacincelular
PermiteobtenerlasmximasventajasdegeneseucariotasVectoresdelevaduras:cromosomasartificialesdelevaduras(YACs):Plsmidos+Secuenciareplicadora+centrmerodelevadura+(telmerolevadura)
Puedeincorporarmsde500kbdeDNA
Vectoreseucariticos
OrigendereplicacindelDNAdelevadura(ARS)
Regincentromrica(CEN)
Resistenciaaantibitico(p.e.,ampr)
Origendereplicacinbacteriano(ori)
CEN ARSampr ori TelmeroTelmero
Linealizacin(conendonucleasas)yadicindeextremostelomricos
Caractersticas generales de un vector de expresin(eucaritico)
- promotor fuerte (inducible)
- sitio de clonamiento multiple (MCS)
- seal de trmino de la transcripcin
- seal de poliadenilacin
-sitio de unin del ribosoma (RBS)
- origen de replicacin
- marcador de seleccin en bacterias y en clulas eucariticas
PA
PA
Invitrogen
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