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COMPARACION DE TRES TECNICAS MICROBIOLOGICAS PARA LA IDENTIFICACION Y
DETERMINACION DEL PERFIL DE RESISTENCIA ANTIBIOTICA DE CEPAS DE
STREPTOCOCCUS VIRIDANS AISLADAS DE CAVIDAD ORAL EN EL CENTRO DE
INVESTIGACIONES ODONTOLOGICAS DE LA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA ( CIO
/ PUJ ) DURANTE LOS AÑOS 2011 A 2014
Trabajo de grado presentado como requisito para optar por el título de
Microbióloga Industrial
LAURA FERNANDA RIOS JIMENEZ
DIRECTOR:
HUGO DIEZ, PhD
PROFESOR TITULAR
FACULTAD DE CIENCIAS
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ
1510
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COMPARACION DE TRES TECNICAS MICROBIOLOGICAS PARA LA IDENTIFICACION Y
DETERMINACION DEL PERFIL DE RESISTENCIA ANTIBIOTICA DE CEPAS DE
STREPTOCOCCUS VIRIDANS AISLADAS DE CAVIDAD ORAL EN EL CENTRO DE
INVESTIGACIONES ODONTOLOGICAS DE LA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA ( CIO
/ PUJ ) DURANTE LOS AÑOS 2011 A 2014
_________________________ _________________________
Dr. Hugo Díez, Ph.D Dra. Marcela Franco, PhD
Profesor Titular Directora
Dpto. de Microbiología Carrera Microbiologia Industrial
_________________________ _________________________
Dra. Adriana Rodríguez, M.Sc Dra. Silvia Barrientos, M.Sc
Codirector Jurado de tesis
Dto. De Odontología
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ
1510
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NOTA DE ADVERTENCIA
ARTICULO 23 DE LA RESOLUCION Nº 13 DE JULIO DE 1946
“La Universidad NO se hace responsable por los conceptos emitidos por sus
estudiantes en sus Trabajos de Tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica, y por qué las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo
de buscar la verdad y la justicia”.
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DEDICATORIA
Este trabajo va dedicado a Dios que me dio la posibilidad de vivir y me inspiro
con cada una de las palabras aquí plasmadas, también se lo dedico a cada una
de las personas que me apoyaron durante mi proceso, aquellas que me tuvieron
paciencia, que fueron honestas, que me apoyaron y a pesar de los tropiezos me
dieron su mano de apoyo para seguir adelante. Les dedico este trabajo a mis
padres que por su esfuerzo emocional, económico y físico han permitido que
este trabajo se realice.
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AGRADECIMIENTOS:
.
Agradecimientos y infinitos a Dios primeramente por darme la oportunidad de realizar este
trabajo, por inspirarme y ser tan maravilloso de darme la mejor tesis junto a las mejores
personas. Gracias a el conocí a mi maravilloso director de tesis Hugo Diez con el cual
estoy completamente agradecido porque es un ser humano esencial el cual mediante su
amor y comprensión, hizo posible cada letra y cada palabra proveniente de mi, el me guio
a través de este proceso con su dulzura, tolerancia y amor. Gracias a Adriana Rodríguez
porque gracias a ella pude conseguir este maravilloso tema, ella ha sido uno de los pilares
sobre el cual se formó este trabajo y con apoyo, consejos y experiencia hizo posible el
decir he finalizado con éxito mi tesis.
Gracias a mis padres por permitirme escribir y no dejarme desfachecer ante la presión, la
tristeza, la pereza y todos aquellos obstáculos que se presentan en el momento de
realizar un proyecto.
Gracias a mis compañeros y a todos los que alguna vez me dieron una palabra de aliento
o tuvieron un par de oídos para escuchar mis quejas, también a aquellos que me hicieron
caer en cuenta de mis errores y que con mucho amor me ayudaron a mejorarlos.
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1. RESUMEN
1.1. Introducción: los microorganismos del grupo de los viridans están asociados a infecciones
odontogénicas, su integrante S.mutans, siendo el microorganismo más patógeno de dicho grupo
en gran proporción en la cavidad oral es causante de caries, infecciones orales y endocarditis
bacteriana; siendo estas infecciones tratadas con antibióticos como amoxicilina este
microorganismo ha desarrollado resistencia a dicho antimicrobiano disminuyendo la efectividad
del tratamiento.
1.2. Objetivo: este estudio evalúa la capacidad del método manual, Cristal BD y MicroScan
Dade para identificar cepas de S. viridans provenientes de un centro de investigaciones
odontológicas utilizando el análisis de secuencia del gen 16S rDNA como referencia.
1.3. Métodos: 180 cepas glicerolizadas/congeladas fueron identificadas por las tres
metodologías y determinado el perfil de resistencia antibiótica por panel MicroScan 34 ID y
método manual Kirby Bauer.
1.4. Resultados: 180 cepas viables identificadas por los métodos PCR (Gold Standard Method),
MicroScan, Cristal y manual dieron como resultado S.mutans 106-105-101-122, S.mitis 12-27-11-
10, S.oralis 15-14-14-10, S.salivarius 16-15-15-14, S.sanguis 10-9-8-8, S.milleri 5-0-2-0,
S.intemedius 4-0-0-4, S.constellatus 4-2-0-0, S.anginosus 1-1-1-0 respectivamente.
Las 180 cepas fueron evaluadas a susceptibilidad a la amoxicilina mediante el método MicroScan
y manual proporcionando sensibles 170-172, intermedias 2-0 y resistentes 8-8, siendo las cepas
que presentaron resistencias identificadas como S.mutans.
1.5. Palabras Claves: Resistencia bacteriana, Streptococcus mutans, amoxicilina, 16S rDNA.
2. INTRODUCCION
La clasificación de los Streptococcus se basa fundamentalmente en la reacción hemolítica de
las cepas en Agar Sangre y el grupo serológico determinado por la presencia del Carbohidrato
C, más no existe una correlación directa entre los dos sistemas de clasificación y hay un alto
grado de heterogeneidad en los resultados de las pruebas bioquímicas especialmente para los
Streptococcus no hemolíticos clasificados como grupo viridans que incluye un complejo
número de microorganismos que son muy diferentes en morfología, en reacciones
hemolíticas, en sus procesos fisiológicos de crecimiento y en sus requerimientos nutricionales
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(1). Por dicha razón la identificación manual fue reemplazada por los métodos comerciales
como VITEK-2 (BioMerieux), MICROSCAN WALKAWAY (Dade Behring), BIOMIC®Vision (Giles
Scientific, Inc.), Bactometer® (bioMerieux), BacTrac® (Sy-Lab), Sensititre ARIS®, BD Phoenix™
Automated Microbiology System (Becton-Dickinson) entre otros, los cuales son rápidos y
precisos, reducen errores de identificación y permiten evaluar marcadores específicos de
resistencia antibiótica (2). Sin embargo, los Estreptococos orales del grupo viridans como son
las especies S. mutans, S. sanguis, S. salivarius, S.mitis y S.anginosus pueden presentar
diferentes serotipos, genotipos y algunas cepas como S. mutans presentan ligeras diferencias
bioquímicas en la fermentación de carbohidratos, aspectos que solo son detectables por
pruebas moleculares debido a las diferencias en la composición del DNA y la secuencia
meteoróloga que existe entre cepas (3,4). El diagnóstico molecular incluye técnicas basadas en
el análisis del ADN como PCR, RFLP, qPCR, análisis filogenético entre otras y recientemente
análisis proteómico basado en la espectrofotometría de masas como el MALDI-TOF (5,6).
Adicionalmente a través de estas metodologías comerciales y moleculares se ha evidenciado
que los estreptococos del grupo viridans y principalmente su género más patógeno como es S.
mutans empieza a presentar resistencia a -lactámicos de primera línea usados para
infecciones orales como la Amoxicilina, resistencia que ha ido aumentando progresivamente
(7); razón por la cual es importante realizar una correcta identificación microbiológica y
determinar el perfil de resistencia de estas cepas.
3. JUSTIFICACION
Las infecciones odontogénicas por S. mutans y otros Streptococcus del grupo viridans se tratan
mediante procesos mecánico-quirúrgicos y la antibioticoterapia. El tratamiento antibiótico
incluye el uso de -lactámicos de primera generación como penicilina o amoxicilina. Sin
embargo, la identificación microbiológica y realización de antibiograma del microorganismo no
es una prueba de rutina a nivel odontológico y por eso el tratamiento se da de forma empírica.
Esta práctica ha traído como consecuencia la refractariedad al tratamiento debido entre otros a
la aparición de microorganismos resistentes a los antibióticos (8). La elección del método de
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reconocimiento debe garantizar la correcta identificación del microorganismo y la determinación
de la sensibilidad antibiótica. Aunque los sistemas comerciales de identificación existentes se
consideran fiables se ha demostrado que las pruebas fenotípicas se caracterizan por tener
problemas inherentes como la variabilidad de las cepas dentro de una misma especie, fallas en
la reproducibilidad de resultados con una misma cepa, las bases de datos pueden no incluir
nuevas especies o incluir especies sin todas las pruebas bioquímicas actualizadas, el resultado de
la prueba se basa principalmente en la interpretación y experiencia del profesional (9, 10)
Dado que las aplicaciones de la tecnología en la medicina y el diagnóstico in-vitro son un
importante campo de acción para el microbiológico industrial, y que la seguridad y rapidez en la
identificación bacteriana y estudios de sensibilidad antimicrobiana son esenciales en el manejo
de los pacientes con infecciones odontogénicas, este trabajo pretende determinar el perfil
antibiótica y realizar la identificación de los diferentes géneros y especies presentes en un banco
de cepas aislados de cavidad oral mediante método convencional manual, método de
identificación en miniatura que utiliza substratos convencionales, fluorogénicos y cromogénicos
modificados – Cristal, y método automatizado MicroScan, así como determinar el perfil de
resistencia antibiótica de cada una de ellas, confirmando el resultado mediante antibiograma
manual- Kirby Bauer. Posterior a la identificación se hará una comparación del porcentaje de
identidad para cada uno de los tres métodos y este resultado será definido mediante PCR 16S
rDNA y posterior secuenciación del fragmento amplificado.
4. MARCO REFERENCIAL
4.1. Generalidades
Los estreptococos del grupo viridans son microbiota comensal de la cavidad oral cuya
función es prevenir la colonización de patógenos potenciales y mantener el equilibrio de
la microflora normal. De acuerdo a los postulados de Keyes y Socransky las infecciones
clínicas a nivel oral se dan por procesos multifactoriales que incluyen como factores de
predisposición principalmente los malos hábitos alimenticios como dieta rica en
carbohidratos, presencia de una ecología bacteriana alterada y aparición de superficies
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biológicas que favorecen la colonización y adherencia, los cuales si están acompañados
de una serie de factores de riesgo como lesión en las barreras naturales, la baja defensa
del sistema inmune del huésped, patología de base, el tiempo, defectos en salivación y
otros, contribuyen notablemente a la producción de procesos simples como la caries o
patologías graves como la endocarditis bacteriana entre otros11. Se consideran como
factores de virulencia ligados a los anteriores procesos las proteínas de adherencia
celular, proteínas de superficie de unión a colágeno y adhesina, moléculas para transferir
y degradar sustratos que contribuyen a la conformación del biofilm como
Glucosiltransferasas, y Proteínas Fijadoras de Glucanos, proteínas implicadas tanto en la
producción del proceso cariogénico como en la bacteriemia y endocarditis bacteriana, si
esta llega a alcanzar el torrente sanguíneo tras la realización de un proceso dental de
carácter invasivo y el paciente tiene un factor de riesgo para la enfermedad(12).
Al hablar de los Streptococcus del grupo viridans, se define como un grupo compuesto
por una variedad de microorganismos en los que una de las características que los
identifica es la presencia de hemolisis tipo alfa, produciendo un halo estrecho de
hemolisis verde debido a la destrucción incompleta de los eritrocitos, también carecen de
antígenos de superficie y al no segregar exotoxinas se consideran como bacterias de baja
virulencia13. En cuanto a los requerimientos para su crecimiento óptimo,
nutricionalmente utilizan compuestos variados; algunas especies necesitan para su
crecimiento el compuesto presente en la sangre humana, piridoxal o vitamina B6, por
esta razón, es que algunos medios están suplementados con este. Con respecto al tipo de
atmosfera adecuado es un ambiente de anaerobiosis.
Otra característica esencial, es una serie de factores de virulencia distintivos como la
presencia de ácido lipoteicoico, el cual, favorece la adherencia del microorganismo a las
válvulas cardiacas al momento en el que ocasiona endocarditis infecciosa, otro factor a
distinguir es la producción de polisacáridos extracelulares que intervienen en los
mecanismos de producción de caries14
Debido a que el grupo de los Streptococcus viridans consta de diferentes especies, para
identificar cada una de estas se realizan pruebas bioquímicas que diferencian una especie
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de otra; entre estas pruebas están Voges Proskauer (VP) la cual determina la
fermentación de la glucosa por parte del microorganismo, la hidrolisis de arginina (ARG)
y esculina (ESC), y la fermentación del manitol (MAN) y el sorbitol (SOR).
4.2. Taxonomía
El grupo de los Streptococcus viridans se ha venido clasificando según Kiratisin et al.
(2004) mediante la secuencia del 16S del ADN ribosomal y las reacciones bioquímicas de
cada especie; esto ha permitido su división en cinco grupos llamados Streptococcus mitis,
Streptococcus sanguinis, Streptococcus mutans, Streptococcus anginosus y Streptococcus
salivarius15 El grupo Mitis-Sanguinis según Janda, et al. (2014) está caracterizado por
presentar reacciones variables para la hidrolisis de esculina y la producción de arginina
dihidrolasa, así como la ausencia de actividad ureasa y la producción de acetoina, una
última característica esencial es la no fermentación de manitol y sorbitol16;además
fermenta carbohidratos como la glucosa, lactosa y maltosa. El grupo de los S.mutans
produce ácido láctico, ácido propiónico, ácido acético y ácido fórmico cuando metaboliza
carbohidratos fermentables como la sacarosa, glucosa y fructosa.
4.3. Sistemas de Identificación
Existen diferentes métodos para la identificación de los Streptococcus viridans, la prueba
de sensibilidad a la optoquina con sensidiscos es una de ellas, siendo los microorganismos
de este grupo resistentes. Esta técnica también puede determinar el perfil de resistencia
a la amoxicilina por parte del S. mutans siendo la cepa más patógena del grupo de los
viridans, la cual, ha creado resistencia al antibiótico17. Otra manera de identificar a estos
microorganismos es recurriendo a métodos tradicionales como pruebas bioquímicas,
fisiología, y morfología de las colonias.
Existen también métodos comerciales y moleculares, dentro de los comerciales tenemos
el sistema de identificación multiprueba BBL CRISTAL para la identificación de bacterias
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Gram positivas y el sistema de microbiología para la identificación y susceptibilidad
antimicrobiana de organismos de interés MICROSCAN; En cuanto a métodos moleculares
encontramos el sistema de identificación bacteriana mediante secuenciación del DNAr
16S y además se encuentra el análisis proteómico realizado mediante la
espectrofotometría de masas como el MALDI-TOF.
Con respecto al sistema BBL CRISTAL, este método consta de 29 substratos bioquímicos y
enzimáticos deshidratados los cuales permiten determinar el uso y la degradación de
estos por parte del microorganismo, este método es de fácil lectura, ya que, a que los
substratos fluorogénicos se observan mediante luz ultravioleta y los cromogénicos
seguido a la hidrolisis cambian de color. Una de las desventajas del sistema es que
funciona solo para un grupo taxonómico especifico, la efectiva identificación del
microorganismo está ligada a los medios suministrados para la preparación de los
inóculos es por esto que es recomendable utilizar unos medios en especial, por ejemplo
no se deben utilizar medios que contengan esculina.
Otro de los métodos comerciales utilizados es el MICROSCAN, en el cual se utilizan
compuestos marcados fluorescentes permitiendo dos tipos de reacciones, una
fluorogénica y una fluorometrica, en la primera se presenta una enzima específica en la
suspensión bacteriana y se detectan cambios en el pH como ocurre con la fermentación
de hidratos de carbono18 Una de las incongruencias presentadas por el método
MICROSCAN es que en ocasiones se dan lecturas falsas negativas y por esto se requiere
de un método de respaldo debido a base de datos incompleta.
Con respecto a los métodos moleculares, el ADNr 16S se realiza mediante la amplificación
del gen, la determinación de la secuencia de nucleótidos del amplicon y el análisis de la
secuencia; Rodicio et al. (2004) menciona que el ARN ribosómico (ARNr) 16S es la
macromolécula más ampliamente utilizada en estudios de filogenia y taxonomía
bacterianas. Una de las ventajas es que no es necesario extraer el ADN bacteriano sino
que se puede amplificar directamente de una colonia aislada o cultivo líquido de la
bacteria de interés, si se quisiera realizar una identificación de una bacteria que
raramente sea utilizada en el ámbito clínico se debe recurrir a más de una base de
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datos19. Una desventaja del método en cuanto a la identificación del microorganismo
Streptococcus mutans, es lo mencionado por Ojeda et al. (2013) que como el método
permite la detección bacteriana mediante PCR, al darse un análisis cualitativo esto no
permite la evaluación apropiada de la susceptibilidad a la caries o de la actividad cariosa20
4.4. Clínica oral
La caries es una enfermedad dental, que ataca a todos los grupos de riesgo; esta se ha
definido como un proceso localizado de origen multifactorial que se inicia después de la
erupción dentaria, determinando el reblandecimiento del tejido duro del diente y
evoluciona hasta la formación de una cavidad, debido, a la desmineralización y
remineralización del diente21. Este proceso se produce como “consecuencia de cambios
en el balance natural de la microflora de la placa dental causados por la alteración de las
condiciones ambientales locales (homeostasis microbiana oral)”22. Los microorganismos
pertenecientes al grupo de los Streptococcus viridans son de gran relevancia al tratar
temas relacionados con la cavidad oral, puesto que, estas especies hacen parte de la
microflora de la boca y se ha descubierto que cada una de ellas tiene predilección en
cuanto a la localización de sitios específicos a colonizar, según Ojeda, et al. (2013) “S.
sanguinis y S. mutans preferiblemente colonizan las superficies de dientes y aparatos
prostéticos. S. salivarius está presente en menos proporción en placa y es un colonizador
primario de la boca después del nacimiento, S.mitis no tiene un sitio preferido en cavidad
oral y S. sanguis usualmente no se encuentra sino hasta la erupción de los dientes”23. Este
grupo de microorganismos es de gran interés debido a la similitud que presenta cada una
de las especies que lo integran entre sí, y esto hace difícil la identificación de los mismos.
A nivel odontológico es relevante el estudio de los integrantes del grupo viridans, pero el
microorganismo más importante es la especie más patógena del grupo, S.mutans, ya que
es el mayor agente causante de caries dental y puede ser aislado de la superficie de un
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diente cariado, no siendo este el único lugar en donde se encuentra, ya que, ha sido
aislado de las válvulas dañadas del corazón Marsh et al. (2011)24
Este microorganismo ha sido encontrado en gran número en esta zona debido a que
produce una severa infección conocida como endocarditis bacteriana producida en
pacientes inmunosuprimidos, la cual, es causada por la asociación de alteraciones
morfológicas del corazón y esta proviene de diferentes orígenes, entre ellos el bacteriano
debido a que el origen de la infección misma puede ser bucodental Blanco, 200425,
también puede darse a causa de un procedimiento dental o invasor es por esto que
Taubert et al. (1998) recomienda seguir por las indicaciones AHA las cuales fueron
diseñadas a fin de asistir al uso racional de la profilaxis para la prevención de la
endocarditis bacteriana; aun con el uso de profilaxis antibiótica apropiada la endocarditis
puede darse, es por eso la importancia de la determinación de la resistencia al antibiótico
utilizado para las infecciones orales existentes que comienzan con el proceso cariogénico,
ya que esta es la pauta para la selección del mismo y la dosis a administrar.26
Se dice que el microorganismo llega al torrente sanguíneo cuando la cavidad en el diente
es de tal profundidad para alcanzarlo. El proceso cariogénico afecta el equilibrio en la
cavidad oral, y esta enfermedad se está dando desde etapas tempranas, descubriéndose
como un proceso de transmisión, en el cual las madres desde los primeros años de vida
mediante contacto directo han contribuido a la difusión de esta enfermedad. Es de gran
importancia a nivel odontológico identificar y combatir a S.mutans, que es el mayor
agente patógeno dental, el cual presenta una gran estabilidad en la boca y es causante de
bacteriemia y endocarditis infecciosa; siendo causante de la caries dental, enfermedad
que ha venido afectando a toda la población de una forma exponencial.
4.5. Resistencia antibiótica
Los estreptococos del grupo viridans y su género más patógeno como es S.mutans son
normalmente sensibles a la acción de -lactámicos incluyendo la amoxicilina antibiótico de
primera línea usado para tratar infecciones orales. Sin embargo, a partir de 1949, se notifica de
la existencia de cepas resistentes a la penicilina, y a partir de esa fecha, la frecuencia de
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aislamientos clínicamente significativos resistentes a ß-lactámicos ha ido aumentando
progresivamente. Diferentes estudios In vivo han demostrado que hay diferencias geográficas en
la resistencia que presentan las cepas en general del grupo viridans, mostrando resistencia
antibiótica variable, en virtud de la especie y del origen de su aislamiento. Solo es claro que
existe una relación causa-efecto entre el consumo de antibióticos y el desarrollo de los mismos,
aspecto muy común en el área odontológica dado su uso empírico. Se considera que el grupo
viridans tiene una alta tasa de resistencia a penicilina (10-23%) amoxicilina (13%) y su
importancia radica que muchas infecciones odontogénicas pueden resultar en cuadros clínicos
de diseminación local o a distancia y son complicaciones que requieren terapia antibiótica 27-28.
Otros autores reportan nueva resistencia a eritromicina, clindamicina, tetraciclina29-30-31. En la
medicina actual y con el aumento de resistencia antibiótica que presentan los microorganismos,
resulta difícil para el odontólogo predecir los patrones de resistencia que pueden presentar los
microorganismos en pacientes críticos. Por tal razón la identificación del microorganismo y
antibiograma por métodos automatizados se convierten en una herramienta eficaz dentro de su
trabajo dado que son más rápidos, exactos, detectan el desarrollo bacteriano en micropaneles
que dan las concentraciones adecuadas de antibióticos permitiendo una terapia oportuna,
reducción en los días de hospitalización y reducción en costos totales32
El desarrollo de resistencia a la amoxicilina, clindamicina y eritromicina por parte de los
Streptococcus del grupo viridans ha formado una polémica en cuanto a la solución del problema
como tal, puesto que, al ser utilizados de manera empírica los microorganismos han
desarrollado mecanismos de resistencia, debido, a que el antibiótico se ha administrado por un
tiempo mayor del adecuado, y es así como la bacteria empieza a crear una serie de barreras y
mecanismos los cuales no permiten la acción del antimicrobiano utilizado. Por esta razón se
recomienda el uso de métodos automatizados de estudio a la susceptibilidad y de esta manera
definir cuál es la dosis mínima necesaria para inhibir el desarrollo bacteriano; existen una serie
de antibióticos que son utilizados para combatir los microorganismos del grupo viridans; entre
ellos tenemos la amoxicilina, eritromicina y clindamicina. La amoxicilina es un antibiótico
semisintetico derivado de la penicilina, Westing menciona que la resistencia a la penicilina
presentada en las cepas de S.viridans es causada por las alteraciones en los genes de la proteína
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unión a la penicilina (pbp), además por la habilidad ilimitada que tienen las cepas en los centros
catalíticos para adaptar sus propiedades a nuevas situaciones o condiciones33-34
Con respecto a la eritromicina y la clindamicina, el primero es un macrólido (grupo compuesto
por una serie de antibióticos que se caracterizan por tener un anillo macrociclico de lactona), el
segundo es una lincosamida de origen semisintético, derivada de la lincomicina; estos
antibióticos son utilizados en pacientes que son alérgicos a la penicilina; también ha sido
utilizada para combatir cepas de S.viridans que han sido identificadas como resistentes a la
penicilina. Existen dos mecanismos principales de resistencia a los macrolidos, lincosamidas y
estreptograminas B (MLSB), estos son según Campelo, et al. (2007), “el primer mecanismo es
mediado por la metilación del sitio ribosomal que es codificado por los genes ribosoma
eritromicina metilasa (erm) y expresada como fenotipo MLSB. También encontramos una bomba
de expulsión, codificada por los genes mef(A/E) y expresada como fenotipo M.”35Este gen según
Cerdá, et al. (2003) es el responsable del desarrollo de resistencia a compuestos macrólidos de
14 y 15 miembros36.
La adquisición de resistencias en bacterias se da en gran medida por todo el intercambio
horizontal de material genético que realizan estos microorganismos al convivir entre ellos, en la
cavidad oral y las vías respiratorias se encuentran gran diversidad de ellos y cada uno posee y
adquiere unas características específicas.
La infección odontogénica es la tercera causa de consumo de antibiótico y genera
aproximadamente el 10-12% del total de las prescripciones de estos fármacos en la comunidad.
Es por ello que la aparición de resistencias antimicrobianas a nivel odontológico crea un
problema clínico, epidemiológico y de salud pública, puesto que disminuye la efectividad del
tratamiento antibiótico, conlleva un impacto ecológico sobre la microbiota oral humana y
repercute en un aumento del costo sanitario37. En Colombia no se conoce el tipo de cepa
circulante ni el perfil de resistencia que presenta, razón por la cual es necesario realizar una
caracterización de las cepas en aquellos pacientes que son portadores y pueden estar expuestos
a riesgos clínicos graves tipo Endocarditis bacteriana como son los pacientes odontológicos. Para
dar validez a los datos es necesario determinar el método microbiológico que identifique con
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mayor precisión cada especie del grupo viridans y permita conocer el perfil de resistencia
antibiótica.
5. OBJETIVOS
5.1. OBJETIVO GENERAL
5.1.1. Realizar la comparación de tres técnicas microbiológicas para la identificación y perfil de
resistencia de cepas de S. viridans aisladas de cavidad oral en el CIO /PUJ durante los años 2011
a 2014.
5.2. OBJETIVO ESPECIFICO
5.2.1. Verificar la viabilidad de las cepas congeladas y glicerolizadas de un Banco de Cepas de S.
viridans del CIO / PUJ.
5.2.2. Realizar la identificación bioquímica de las cepas congeladas y glicerolizadas de un Banco
de Cepas de S. viridans del CIO / PUJ por tres métodos microbiológicos.
5.2.3. Determinar el porcentaje de resistencia a la amoxicilina de las cepas congeladas y
glicerolizadas de un Banco de Cepas de S. viridans del CIO / PUJ.
5.2.4. Comparar los resultados obtenidos de las tres metodologías de identificación MicroScan,
Cristal, Manual y el método de difusión según NCCLS .
6. METODOLOGÍA
6.1. ESTUDIO
6.1.1. TIPO DE ESTUDIO: Es un modelo que correspondió a un estudio observacional, con un
diseño factorial experimental confirmatorio.
6.1.2. DISEÑO: Descripción de los géneros y especies de S. viridans y del número de cepas
resistentes a un antibiótico en particular.
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6.2. POBLACIÓN ESTUDIO:
6.2.1. MUESTRA: Correspondió a las cepas de S.viridans congeladas y glicerolizadas conservadas
en el Banco de Cepas del Centro de investigaciones odontológicas durante el año 2011 a 2014.
6.2.2. TAMAÑO DE LA MUESTRA: El tamaño de la muestra fue el número de cepas disponibles
que correspondió a 180.
6.3. CRITERIOS DEL ESTUDIO
6.3.1. CRITERIOS DE INCLUSIÓN: En el estudio solo se incluyeron aquellas muestras que
presentaron una óptima recuperación y presenten un 100% de Viabilidad.
6.3.2. CRITERIOS DE EXCLUSIÓN: Se excluyó todas aquellas muestras que no pertenecían al grupo
de estudio o aquellas muestras que no presentaron viabilidad ante el proceso de recuperación.
6.3.3. CONFLICTO DE INTERESES: fue una investigación sin riesgo, y parte de manejó directo de
las cepas cedidas por la institución. Aunque las cepas ya habían sido previamente identificadas
por el laboratorio de microbiología institucional a los estudiantes no se les informo el resultado
de las mismas dado que uno de los requisitos dados por el aval institucional era garantizar la
confidencialidad de la Institución y de los pacientes implicados en la investigación por parte de
los investigadores, así como la de los profesionales de la salud (artículo 11 de la Resolución 8430
de 1993).
6.4. PROCEDIMIENTOS
6.4.1. VIABILIDAD Y RECUPERACION: Para cumplir con el primer objetivo específico se realizó la
descongelación, recuperación y viabilidad de las muestras según protocolo Daryousb (2010)38
6.4.1.1. Descongelación: Las muestras fueron recibidas en medio de transporte
enriquecido para Stafilococos/Streptococos de cavidad oral (BHI con 30 % de glicerol y
suplementado con oxacilina). A partir de los viales recibidos se sometieron a un proceso de
descongelación gradual colocándolas inicialmente en nevera a 15-20ºC por 30 minutos y
posteriormente a temperatura ambiente por 30 minutos.
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6.4.1.2. Recuperación: una vez descongeladas se homogenizaron mediante vortex simple y
una alícuota de ellas fue sembrada en BHI y tioglicolato prereducido y se incubo de 24-48 horas
a 37ªC.
6.4.1.3. Viabilidad: a partir del tioglicolato y BHI se realizó una coloración de Gram para
observar morfología característica y fueron sembradas en Agar Sangre suplementado para
observar pureza y las características morfológicas y de crecimiento características del género y
especie.
6.4.2. IDENTIFICACIÓN MICROBIOLÓGICA PRESUNTIVA: Para cumplir con el segundo objetivo
específico se realizó una identificación del género y especie del microorganismo:
6.4.2.1. Aquellas cepas que presentaron viabilidad del 100% y cuyas colonias tuvieron
características morfológicas y tintoriales (Coloración de Gram) del Género Streptococcos,
catalasa negativa se identificaron por tres métodos microbiológicos a saber: identificación
manual por fermentación de azucares, sistema Cristal, sistema MicroScanSystem de la casa
Dade/ MicroScan Pos ID PC34 para Gram positivos.
6.4.2.2. En el método manual se utilizaron pruebas convencionales sugeridas por Bantar,
199039 como Hemólisis en agar sangre, optoquina, hidrólisis de esculina, acetoína, manitol,
sorbitol, ureasa, Inulina, Rafinosa, catalasa.
6.4.2.3. El método BBL™ Crystal™ Identification Systems incluyo 29 tests para la
fermentación, oxidación, degradación e hidrólisis de diversos sustratos unidos a un cromógeno
para detectar las enzimas utilizadas por las bacterias y conformado por L-histidina-AMC FHI,
4MU-α-D-manósido FAM, L-serina-AMC FSE, L-isoleucina-AMC FIS, 4MU-β-D-manósido FBM,
Glicina-AMC FGL, L-alanina-AMC FAL, 4MU-N-acetil-β-D-galactosaminida FGA, L-ácido
piroglutámico-AMC FPY, L-lisina-AMC FLY, L-metionina-AMC FME, 4MU-β-D-celobiopiranósido
FCE, 4MU-β-D-xilosida FXY, 4F L-fenilalanina-AMC FPH, L-leucina-AMC FLE, Escosilo FSC,
Disacárido DIS, Furanosa FUR, Piranosa PYO, p-nitrofenil-α-D-galactósido AGA, p-nitrofenil-β-D-
galactósido NPG, p-nitrofenil-fosfato PHO, p-nitrofenil-α-D-glucósido AGL, p-nitrofenil-N-acetil-
glucosaminida NAG, L-prolina-p-nitroanílida PRO, p-nitrofenil-α-L-fucósido AFU, p-nitrofenil-β-D-
glucósido BGL, L-alanil-L-alanina-p-nitroanílida ALA
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6.4.2.4. En MicroScan el fenotipo se determinó mediante un panel de 32 pozos reactivos
de sustratos para reacción bioquímica conformado por CV Cristal violeta – MS Micrococcus
screen – NIT Nitritos – NOV Novobiacina – PGR B-d glucoronidasa – IDX Indol fosfatasa – VP
Voges proskawer – OPT Optoquina – PHD fosfatasa – BE Bilis esculina – PYR Pirridolina – ARG
Arginina – PGT Galactosidasa – URE urea – MAN Manitol – LAC lactosa – TRE Trehalosa – MNS
Manosa – NaCl Cloruro de sodio – SOR Sorbitol – ARA Arabinosa – RBS Ribosa – INU Inulina –
RAF Rafinosa – BAC Bacitracina – PRV Piruvato, y 6 pozos internos de control.
6.4.2.5. Aquellas colonias que fue necesario confirmar sus características macroscópicas se
sembraron en agar tripticasa soya y agar mitis salivarius.
6.4.3. ENSAYOS DE SENSIBILIDAD.
6.4.3.1. Para cumplir con el tercer objetivo se determinó la resistencia a Amoxicilina se
utilizó el mismo Panel MicroScan 34 siguiendo las normas del Clinical and Laboratory Standards
Institute y las instrucciones dadas por la casa manufacturadora empleándose el mismo panel de
identificación el cual incluyo un set de pozos con antibióticos marcadores para Gram positivos
como Aug Amoxicilina/ clavulónico 4/2 ug – AM ampicilina 8 ug – A/S ampicilina sulbactan
16/8ug – CfxS Cefoxitin 4 ug – Cax Ceftriaxone 32 ug – Cp Ciprofloxacina 2 ug – Cd Clindamicina 4
ug– Dap Daptomicina 4 ug– E Eritromicina 4 ug – Gm gentamicina 8 ug – GmS gentamicina
synercid 500 ug – Icd Clindamicina inducible 4/0.5 ug – Lvx Levofloxacin 4 ug – Lzd Linezolid 4 ug
– Mxf Moxifloxacina 4 ug – Fd Nitrofurantoina 64 ug – Ox Oxacilina 2 ug – P Penicilina 8ug – Rif
Rifampicina 2 ug – StS Estreptomicina synercid 1000ug – Syn Synercid 2 ug – Te Tetraciclina 8 ug
– T/S trimetropin sulfa 2/38 µg - Va Vancomicina 16 ug (CLSI, 2012)40. Los puntos de corte e
interpretación según concentración se explicaron en la tabla 1.
6.4.3.2. A aquellas cepas que presentaron Resistencia a Amoxicilina se les realizó
confirmación por el método de difusión en agar con discos, según las normas del Clinical and
Laboratory Standards Institute. El antibiótico utilizado fue amoxicilina en sensidisco de 6 µg/mL
incubándose a 35 grados C por 24 h.
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Tabla 1. Puntos de corte establecidos para el sistema MicroScan para cada antibiótico.
Nombre del antibiótico Código Puntos de corte en
g/ml
Amoxicilina/ Ácido
clavulánico
AMC S<=4 R>=8
Ampicilina AMP S<=.25 R>=.5
Ampicilina/ Sulbactam SAM S<=8 R>=32
Cefazolina CZO S<=8 R>=32
Ciprofloxacina CIP S<=1 R>=4
Clindamicina CLI S<=.5 R>=4
Daptomicina DAP S<=1
Eritromicina ERY S<=.5 R>=8
Gentamicina GEN S<=4 R>=16
Levofloxacina LVX S<=1 R>=4
Linezolid LNZ S<=4 R>=8
Moxifloxacina MFX S<=.5 R>=2
Oxacilina OXA S<=2 R>=4
Penicilina G PEN S<=.125 R>=.25
Quinupristina/
Dalfopristina
QDA S<=1 R>=4
Rifampicina RIF S<=1 R>=4
Tetraciclina TCY S<=4 R>=16
Trimetoprima/
Sulfametoxazol
SXT S<=2 R>=4
Vancomicina VAN S<=4 R>=32
6.4.4. COMPARACION de METODOLOGÍAS:
6.4.4.1. Para cumplir con el cuarto objetivo en la identificación bioquímica se realizó una
comparación de los resultados obtenidos de las tres metodologías de identificación MicroScan,
API, Manual y en el antibiograma se comparó el método de difusión Kirby Bauer según NCCLS
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contra el resultado de MicroScan presentándose para las dos variables los % de Identificación y
resistencia para cada método.
6.4.4.2. A todas las cepas extrajo ADN según protocolo del kit comercial QIAamp DNA
Blood Mini Kit (Qiagen) y para la PCR se utilizó una mezcla de reacción compuesta por Buffer
0,5X, DNTPs 200M, primers 16s rDNA 0,5M, MgCl2 2M, Taq 0,45U a un volumen final de
20L bajo las siguientes condiciones: 94°C por 5 segundos, luego 35 ciclos así: 94°C por 30
segundos, 55°C por 30 segundos y 72°C por 1 minuto, extensión 72°C por 7 minutos.
6.4.4.3. Los productos de amplificación obtenidos fueron enviados a un servicio técnico de
secuenciación en Macrogen Korea.
6.5. Presentación de resultados:
6.5.1. Recuperación y viabilidad cepas: los resultados se presentaron en porcentajes mediante
tablas.
6.5.2. Identificación de S.viridans: los resultados se presentaron en porcentajes mediante tablas.
6.5.3. Perfil de Resistencia: se presentaron en tablas descriptivas del porcentaje de resistencia
del microorganismo para cada antibiótico.
6.5.4. Comparación de métodos: se presentaron en tablas descriptivas del porcentaje de
identidad para cada método y cálculo de índices Kappa para análisis de concordancia entre los
métodos. Para las incongruencias se analizó BLAST n de la secuenciación de las cepas que así lo
requirieron.
7. RESULTADOS:
7.1. Recuperación y viabilidad cepas: para cumplir con el primer objetivo se verificó la
viabilidad de las cepas congeladas y glicerolizadas y se encontró un 100% de viabilidad y
recuperación en las mismas.
7.2. Identificación Bioquímica de las cepas; para cumplir con el segundo objetivo específico
180 cepas que presentaron viabilidad del 100% y cuyas colonias tenían características
morfológicas y tintoriales (Coloración de Gram) del Género Streptococcus, y reacción
negativa ante la prueba de catalasa, se identificaron por tres métodos microbiológicos a
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saber: identificación manual por fermentación de azucares, identificación por BBL™
Crystal™ Identification Systems, e identificación por sistema MicroScanSystem de la casa
Dade/ MicroScan Pos ID PC34 para Gram positivos. Los resultados se distribuyeron
siguiendo la metodología propuesta por Won-Young et al.(2011) la cual se divide en 4
grupos a saber41:
a. Cepas correctamente identificadas tanto a nivel de género como de especie
b. Cepas correctamente identificadas a nivel de género pero no de especie
c. Cepas incorrectamente identificadas (ni género ni especie)
d. Cepas no identificadas
Tabla 1. Cepas viables identificadas y distribuidas según la metodología propuesta por Won-Young de identificación manual, BBL cristal
y MicroScan y los resultados obtenidos divididos en 4 grupos a saber.
Metodología
Cepas
procesadas
Identificación
correcta de
género y
especie
Identificación
correcta de
género no
especie
Identificación
incorrecta
No
identificadas
Número % Número % Número % Número %
Manual 180 153 85 171 95 5 2,77 5 2,7
BBL Crystal 180 155 86,11 172 95,5 24 13,33 2 1,1
MIcroScan 180 161 89,44 174 96,6 14 7,77 2 1,1
7.3. Discrepancia y resolución final de identificación: ADN de las cepas fue extraido para
realizar una PCR l6S y posterior secuenciación siendo esta la base para analizar las
discrepancias entre los resultados presentados.
7.4. Perfil de Resistencia: para cumplir con el tercer objetivo consistente en determinar el perfil
de resistencia antibiótica que presentan las cepas congeladas y glicerolizadas se
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analizaron los datos a partir del método MicroScan y se realizó confirmación manual por
Kirby Bauer. Los resultados fueron agrupados en torno a la amoxicilina en 3 grupos:
cepas Sensibles, Intermedias, y cepas de S.viridans resistentes. Encontrándose los
resultados que ilustra la tabla 2:
Tabla 2. Numero de cepas evaluadas con amoxicilina y distribuidas entre sensible, intermedias y resistentes dependiendo del
resultado obtenido en cada uno de los métodos utilizados.
AMOXICILINA MicroScan (%) Manual (%)
Sensible 170 (94,4) 172 (95,55)
Intermedia 2 (1,1) 0
Resistente 8 (4,4) 8 (4,4)
El 94.4% de las cepas catalogadas como sensibles mostraron como característico el siguiente
antibiograma:
Tabla 2.1. Concentración mínima inhibitoria para S.viridans correspondiente al 94,4% de las cepas
ANTIBIOTICO MIC INTERPRETACION AMOXIL/CLAVULANICO <=0,5/.25 SENSIBLE
AMOXICILINA <=0.06 SENSIBLE
AZITROMICINA <=0.2 SENSIBLE
CEFACLOR <=0.5 SENSIBLE
CEFEPIMA <=0.25 SENSIBLE
CEFOTAXIMA <=0.25 SENSIBLE
CEFTRIAXONE <=0.25 SENSIBLE
CEFUROXIMA <=0.25 SENSIBLE
CLINDAMICINA <=0.06 SENSIBLE
CLORANFENICOL <=1.0 SENSIBLE
ERITROMICINA <=0.06 SENSIBLE
LEVOFLOXACINA <=0.25 SENSIBLE
MEROPENEM <=0.06 SENSIBLE
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PENICILINA <=0.03 SENSIBLE
TETRACICLINA <=0.5 SENSIBLE
TRIMETROPIN/SULFA <=0.25/4.7 SENSIBLE
VANCOMICINA <=0.12 SENSIBLE
El 4,5% de las cepas catalogadas como resistentes mostraron como característico el siguiente
antibiograma:
Tabla 2.2. Concentración mínima inhibitoria para S.mutans resistentes a la amoxicilina
ANTIBIOTICO MIC INTERPRETACION AMOXIL/CLAVULANICO <=0,5/.25 SENSIBLE
AMOXICILINA >=8.0 RESISTENTE
AZITROMICINA <=0.2 SENSIBLE
CEFACLOR <=0.5 SENSIBLE
CEFEPIMA <=0.25 SENSIBLE
CEFOTAXIMA <=0.25 SENSIBLE
CEFTRIAXONE <=0.25 SENSIBLE
CEFUROXIMA <=0.25 SENSIBLE
CLINDAMICINA <=0.06 SENSIBLE
CLORANFENICOL <=1.0 SENSIBLE
ERITROMICINA <=0.06 SENSIBLE
LEVOFLOXACINA <=0.25 SENSIBLE
MEROPENEM <=0.06 SENSIBLE
PENICILINA <=0.03 SENSIBLE
TETRACICLINA <=0.5 SENSIBLE
TRIMETROPIN/SULFA <=0.25/4.7 SENSIBLE
VANCOMICINA <=0.12 SENSIBLE
El 1,1% de las cepas catalogadas como intermedias mostraron como característico el siguiente
antibiograma:
Tabla 2.3. Concentración mínima inhibitoria para S.mutans que presente resistencia intermedia a la amoxicilina
ANTIBIOTICO MIC INTERPRETACION AMOXIL/CLAVULANICO <=0,5/.25 SENSIBLE
AMOXICILINA Entre 1-2 INTERMEDIO
AZITROMICINA <=0.2 SENSIBLE
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CEFACLOR <=0.5 SENSIBLE
CEFEPIMA <=0.25 SENSIBLE
CEFOTAXIMA <=0.25 SENSIBLE
CEFTRIAXONE <=0.25 SENSIBLE
CEFUROXIMA <=0.25 SENSIBLE
CLINDAMICINA <=0.06 SENSIBLE
CLORANFENICOL <=1.0 SENSIBLE
ERITROMICINA <=0.06 SENSIBLE
LEVOFLOXACINA <=0.25 SENSIBLE
MEROPENEM <=0.06 SENSIBLE
PENICILINA <=0.03 SENSIBLE
TETRACICLINA <=0.5 SENSIBLE
TRIMETROPIN/SULFA <=0.25/4.7 SENSIBLE
VANCOMICINA <=0.12 SENSIBLE
7.5 Concordancia entre los resultados del antibiograma por el sistema MicroScan y el método
disco-placa CLSI en el grupo de cepas estudiadas: realizada la comparación se observó que no
habían discrepancias entre los resultados sensibles de ambos métodos ni entre los resultados
resistentes de los dos métodos pero que a nivel de Resistencia intermedia a la amoxicilina se
observó discrepancia en 2 cepas (1,1%). Dichas cepas ante el MicroScan mostraron una MIC de
1 y de 2.0 UG/ml pero al ser testeadas manualmente con disco de AML 10 ug/ml resultaron
sensibles. De acuerdo a las normas CLSI dichas cepas deben ser reportadas como sensibles. La
tabla 2.1 ilustra la concordancia observada entre las dos metodologías para los diferentes
antibióticos:
Tabla 2.4. Porcentaje de concordancia entre dos metodologías para los diferentes antibióticos
ANTIBIOTICO % concordancia
AMOXIL/CLAVULANICO 100
AMOXICILINA 98,9%
AZITROMICINA 100
CEFACLOR 100
CEFEPIMA 100
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CEFOTAXIMA 100
CEFTRIAXONE 100
CEFUROXIMA 100
CLINDAMICINA 100
CLORANFENICOL 100
ERITROMICINA 100
LEVOFLOXACINA 100
MEROPENEM 100
PENICILINA 100
TETRACICLINA 100
TRIMETROPIN/SULFA 100
VANCOMICINA 100
7.6 Comparación de métodos: para cumplir con el cuarto objetivo se compararon los
resultados obtenidos de las tres metodologías de identificación respecto a la
secuenciación de la PCR 16S presentados en la tabla 3.
Tabla 3. Resultados tabulados mediante especies y métodos utilizados para la identificación de las mismas en base al Gold estándar
method (PCR)
Microorganismo PCR MicroScan CRISTAL MANUAL
No de cepas (%)
S.mutans 106 (58,88) 105 (58,33) 101 (56,11) 122 (67,77)
S.mitis 12 (6,66) 27 (15) 11 (6,11) 10 (5,55)
S. oralis 15 (8,33) 14 (7,77) 14 (7,77) 10 (5,55)
S.salivarius 16 (8,88) 15 (8,33) 15 (8,33) 14 (7,77)
S.sanguis 10 (5,55) 9 (5) 8 (4,44) 8 (4,44)
S.mobilliforme 5 (2,77) 0 3 (1,66) 0
S.milleri 5 (2,77) 0 2 (1,11) 0
S. intermedius 4 (2,22) 0 0 4 (2,22)
S.constellatus 4 (2,22) 2 (1,11) 0 0
S.anginosus 1 (0,55) 1 (0,55) 1 (0,55) 0
S.equinus 1 (0,55) 1 (0,55) 1 (0,55) 1 (0,55)
S. bovis 1 (0,55) 1 (0,55) 1 (0,55) 1 (0,55)
Streptococcus spp 0 0 8 (4,44) 0
Streptococcus viridans 0 0 6 (3,33) 0
E. faecalis 0 1 (0,55) 0 3 (1,66)
Enterococcus spp 0 0 1 (0,55) 0
Micrococcus spp 0 1 (0,55) 4 (2,22) 0
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Micrococcus luteus 0 1 (0,55) 2 (1,11) 0
Lactococcus lactis 0 0 0 2 (1,11)
NI 0 2 (1,11) 2 (1,11) 5 (2,77)
Total 180 (100) 180 (100) 180 (100) 180 (100)
La tabla 4 ilustra el análisis de concordancia observadas en cada uno de los métodos
dependiendo del microorganismo y en la tabla 5 la interpretación para cada intervalo.
Tabla 4. Análisis de concordancia para S.mutans, S.mitis, S.oralis, S.salivarius y S.sanguis
Kappa
S. mutans S.mitis S.oralis S.salivarius S.sanguis
PCR vs MicroScan 0,99 0,59 0,96 0,96 0,94
PCR vs Cristal 0,94 0,86 0,96 0,96 0,65
PCR vs Manual 0,76 0,9 0,87 0,93 0,88
MicroScan vs cristal 0,95 0,54 1 1 0,69
MicroScan vs manual 0,76 0,5 0,82 0,96 0,94
Cristal vs manual 0,79 0,95 0,82 0,96 0,74
Tabla 5. Interpretación de los valores obtenido mediante el índice Kappa
Fuerza de concordancia
Menor 0,2 Pobre
0,21-0,4 Débil
0,41-0,6 Moderada
0,61-0,8 Buena
0,81-1 Muy buena
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7.7Control de calidad técnico: La cepa Streptococcus mutans ATCC 25175 fue testeada para el
sistema Manual, Cristal y MicroScan obteniendo una identificación correcta por cada uno de
los métodos. Los resultados en las diferentes técnicas fueron evaluados contra la
secuenciación de un fragmento de 382pb producto de la PCR 16S cuya secuencia base era:
1 gttagttgcc atcattaagt tgggcactct agcgagactg ccggtaataa accggaggaa
61 ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat
121 ggtcggtaca acgagttgcg agccggtgac ggcaagctaa tctctgaaag ccgatctcag
181 ttcggattgg aggctgcaac tcgcctccat gaagtcggaa tcgctagtaa tcgcgnatca
241 gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt
301 ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggggcc ngccgcctaa ggtgggatgg
361 atgattgggg tgaagtcgta acaaggtagc cg
8. DISCUSION:
El género Streptococcus viridans está compuesto por diferentes especies las cuales difieren unas
de otras, se puede observar que el número de cepas muestreadas y evaluadas presentaron 100%
de viabilidad; esto quiere decir que se pueden utilizar para ser identificadas a nivel de género o
especie mediante los diversos métodos, y de esta manera corroborar cuáles de ellos son más
sensibles y exactos para identificar los microorganismos pertenecientes al grupo viridans. Lo
mencionado anteriormente se puede evidenciar en la tabla 1, la cual, muestra las 180 cepas
viables identificadas por los métodos Manual, Cristal y MicroScan; aquí se puede observar que
métodos identificaron de forma correcta los microorganismos a nivel de especie teniendo al
MicroScan como el más efectivo de todos, seguido por Cristal y Manual. Así mismo se observa
cuales métodos no lograron la identificación siendo el Manual el que mayor valor presento, que
fue proporcional a 5 cepas; una posible razón por la cual se dio esto, es que con el método Manual
se tiene una mayor manipulación por parte del investigador que puede influir negativamente en el
resultado obtenido. La tabla también presenta que método logro una identificación pero solo
hasta nivel de género, Wiltrud et al. (1996) comenta que en la base de datos de BBL Cristal no se
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encuentran diversos microorganismos, razón por la cual, en muchas ocasiones no es posible llegar
a nivel de especie42, y siendo un método automatizado obtuvo casi el mismo valor del manual. Al
analizar la tabla se puede observar que el método más apropiado para la identificación de los
viridans es el MicroScan, ya que presento el mayor porcentaje de cepas identificadas a nivel de
especie (89,44%) y género (96,6%) y un menor valor para las cepas no identificadas (1,1%).
El rol de S.mutans en los procesos cariogénicos y su correcta identificación es de gran importancia,
un estudio realizado por estudiantes de la universidad de Antioquia explica que este
microorganismo está directamente implicado en la iniciación de la caries debido a su gran
potencial acidúrico y acidógeno, también se menciona la importancia del control en Colombia de
la caries en niños, debido a la prevalencia en serotipos del microorganismo; siendo este el posible
causante de la iniciación de este proceso en dientes, es de gran importancia la pertinente
identificación del S.mutans y de esta manera realizar el tratamiento antibiótico con amoxicilina
en la correcta proporción para tratar infecciones odontogénicas de las cuales la caries es el
comienzo, y así evitar que el microorganismo empiece a crear resistencia. Estudios previos han
reportado el aumento de la resistencia a la amoxicilina que ha impedido el tratamiento antibiótico
efectivo en pacientes que lo requieren; al observar los resultados se puede evidenciar en la tabla 2
que de las 180 cepas muestreadas 8 de ellas correspondientes a S.mutans son resistentes a la
amoxicilina, aunque el porcentaje de cepas resistentes es del 4,4% se puede afirmar el desarrollo
de resistencia al fármaco por parte de las cepas; esto se puede argumentar con lo mencionado por
Bilavsky et al. (2008) en su estudio en el que se evalúa la susceptibilidad de S.mutans a la
penicilina y se señala que la resistencia a este es directamente proporcional a la exposición del
microorganismo al tratamiento antibiotico43; lo mencionado por Bilavsky conlleva al origen de las
cepas, ya que las 180 provenían de dos clases de pacientes, en una de ellas estaban bajo
tratamiento antibiótico con amoxicilina durante un periodo mayor de 3 semanas, los demás
provenían de pacientes sanos los cuales no estaban expuestos a dicha sustancia. Lo anteriormente
discutido puede ser la razón por la cual el número de S.mutans resistentes a la amoxicilina no fue
alto, debido a que la población muestreada no utilizada dicho antibiótico en su totalidad.
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Aunque la resistencia por parte de S.mitis a la penicilina es de las más reportadas ya que Westling
et al. (2006) en su estudio en el hospital universitario suizo comenta que S.mitis es uno de los
microrganismos que tiene más alto grado de insensibilidad a la penicilina; no obstante en el
presente estudio ninguna cepa de S.mitis presento un resultado diferente a sensible.44 La tabla 2
también muestra los resultados arrojados por los dos métodos utilizados para la evaluación de la
susceptibilidad a la amoxicilina por parte de las cepas evaluadas, las cepas intermedias fueron dos,
y en estas se presentó discrepancia entre los métodos y el microorganismo con dicho resultado
fue S.mutans; los resultados intermedios correspondieron en ambos casos a lo evaluado con el
sistema MicroScan. Un estudio realizado por Lee et al. (2015) en el cual también fue utilizado el
método MicroScan para la determinación de susceptibilidad en el caso específico fue a el
ertapenem, reporto que al utilizar el sistema de MicroScan este presento resultados similares con
respecto a la dilución en caldo, ya que hubo mayores discrepancias entre microscan y Vitek2 el
cual fue otro método utilizado en dicho estudio45, se utilizó también el método de difusión con
discos, el cual presento sensibilidad del 50% siendo el menor valor reportado; además este fue el
método que más resultados sensibles otorgo. Relacionando lo mencionado por Lee se puede
evidenciar que los resultados obtenidos mediante el antibiograma de las 2 cepas que presentaron
resistencia intermedia en MicroScan fueron susceptibles con el método de disco-placa
confirmando la poca sensibilidad discutida por Lee. Otros autores consultados como Rittenhouse
et al. (1996) utilizan el método de microdilución en caldo y difusión en disco para corroborar los
resultados obtenidos mediante métodos automatizados como MicroScan y Vitek2; en dicha
investigación se presentaron mayores discrepancias entre los métodos de confirmación y el
MicroScan en comparación de los métodos de confirmación y el Vitek2, llegando a la conclusión
que el mejor método para determinar la susceptibilidad fue el Vitek2.46
En las tabla 3 se puede evidenciar la inclusión del método molecular PCR, el cual fue escogido
como el Gold Standard. Este método fue seleccionado debido a la especificidad que tiene y a los
resultados otorgados, los cuales siempre fueron a nivel de especie; López et al. (2013) confirma lo
mencionado anteriormente, proponiendo que el mejor método de identificación de los
microorganismos del grupo de los viridans es el análisis de secuencia del gen sodA, ya que es una
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técnica efectiva para la tipificación a nivel de especie,47 y aunque no se amplió este gen en
específico se observó el fragmento 16s el cual permitió la identificación requerida. Esta tabla
muestra los resultados obtenidos mediante los diferentes métodos y cuál fue el porcentaje de
identificación para cada microorganismo dependiendo del sistema utilizado.
Los métodos Manual, Cristal y MicroScan con respecto a el método molecular difieren en la
medida en la que existe un criterio personal al realizarse una lectura con base a los colores
proporcionados, mediante la reacción del microorganismo al entrar en contacto con el compuesto
a evaluar; por el contrario la PCR solo necesita de la correcta extracción del ADN y hacer correr el
gel, seguido a esto todo el proceso depende de un programa el cual proporciona resultados según
la base de datos que posee, esta es una de las razones por la cual el método molecular es más
específico en la identificación. Sin embargo S.mutans y S.mitis al tener un alto grado de similitud,
influyen en la obtención de resultados incongruentes mediante métodos como la PCR, Alcaide
explica que estos dos microorganismos junto con S. sanguis tienden a ser parecidos por la
capacidad de producir dextranos extracelulares que actúan como mediadores en los mecanismos
de fijación.48 Consultando la bibliografía y observando los resultados discutidos, se puede
corroborar lo mencionado por Arevalo et al. (2014)49 el cual dice que se ha encontrado una gran
similitud entre la secuencia del 16S rRNA entre S. mutans, S.mitis y S. parasanguinis, lo cual indica
que el método molecular tampoco es el mejor debido a que no es tan especifico. Janda confirma el
alto grado de similitud fisiológico y genético entre los microorganismos pertenecientes al grupo
Mitis-Sanguinis, y menciona que este método de secuenciación está siendo utilizado para
establecer relaciones entre las especies pertenecientes al grupo de los Streptococcus viridans.51
Drancourt et al. (2003) señala que la secuenciación de genes mediante dicho método, ha sido
descrita con limitada capacidad de discriminación entre especies y esto se evidencia mediante la
afirmación, que la secuencia del gen 16S rRNA ha mostrado tener mayor del 99% de similitud
entre microorganismos como S. mitis y S. oralis.50
Con respecto a los métodos convencionales y fenotípicos, Janda comenta, que estos no son
recomendables de utilizar para la identificación de los microorganismos del grupo viridans, desde
que se descubrió que las reacciones a los sustratos utilizados en estos métodos tienen resultados
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casi idénticos, en dicha investigación se menciona también que todas las especies en el grupo
Mitis-Sanguinis fermentan glucosa, maltosa y lactosa; además tienen características variables
dependiendo de las otras reacciones para la fermentación de carbohidratos.51 Es por esta razón
que se puede observar que el método manual presenta muchas incongruencias frente al
molecular, con respecto a la identificación de S.mitis, S.oralis y S.sanguis al no lograr identificar en
su totalidad el número de cepas que la PCR tipifico. También se puede observar que esta técnica
presenta un porcentaje mayor de identificación para S.mutans que los demás métodos. Westling
indica que las bioquímicas no son un buen método para identificar microorganismos
pertenecientes al grupo de los viridans ya que presentan muchos resultados erróneos en la
identificación de los mismos.52
En la tabla también se puede evidenciar que la mayor congruencia entre resultados se dio entre el
método de PCR y MicroScan, aunque este es el método que mejor identificación presenta después
del Gold Standard se evidencia la dificultad para identificar microorganismos pertenecientes al
grupo viridans; Snyder et al. (2008) soporta la idea aclarando que sistemas como Phoenix o
MicroScan identifican incorrectamente debido a que muchos de los aislamientos no están
incluidos en su software de bases de datos53. La bibliografía consultada, menciona que los
métodos que tienen su base de datos actualizada debido al avance tecnológico que poseen con
respecto a la identificación de los viridans son: manuales API Rapid Strep and ID32 Strep
[bioMérieux, Durham, NC]) y automatizados Vitek 2 [bioMérieux] y Phoenix [BDMS, Cockeysville,
MD]) ya que los otros sistemas no tienen las nuevas especies incluidas en sus bases de datos y es
por esto que en ocasiones no se da la identificación54
Se realizó un análisis de concordancia, en el cual se halló el índice kappa comparando los
resultados obtenidos para S.mutans, S.mitis, S.oralis, S.salivarius y S.sanguis mediante los
diferentes métodos; no se realizó este análisis de todos los microorganismos identificados debido
a que los anteriormente mencionados se encontraban en mayor proporción y son miembros del
grupo de los viridans. Los resultados obtenidos en este análisis se observan en la tabla 4 y para la
respectiva interpretación de los valores obtenidos mediante el índice Kappa, la fuerza de
concordancia se encuentra en la tabla 5. Microorganismos como S.salivarius, S.sanguis y S.oralis
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presentan una fuerza de concordancia entre buena y muy buena indicando que todos los métodos
utilizados son pertinentes para la identificación de los mismos.
Con respecto a los demás microorganismos, para el caso de S.mitis, MicroScan es el sistema que
presenta fuerza de concordancia más baja con respecto a PCR, Cristal y Manual; siendo esta
moderada y presentando mayor número de incongruencias entre dichos métodos, evidenciándose
en la tabla anterior, que S.mitis es un microorganismo el cual ha sido identificado por MicroScan
en mayor proporción de lo que se encuentra.
S.mutans presenta una fuerza de concordancia muy buena entre PCR y MicroScan lo cual se
demuestra en la tabla anterior presentando que por el método de MicroScan solo una cepa no fue
identificada como S.mutans. Al analizar los valores más bajos del índice kappa estos corresponden
a la comparación entre el método manual con la PCR, el MicroScan y el cristal respectivamente, y
se obtienen fuerzas de concordancia buenas, pero se evidencia que mediante este método el
número de cepas identificadas como S.mutans es mayor; esto es de gran importancia en la medida
en la que este es el método comúnmente utilizado para la identificación de dicho microorganismo
y los resultados demuestran que mediante esta técnica se obtienen falsos positivos.
Epidemiológicamente esto es de suma importancia, puesto que, la identificación de este
microorganismo en gran proporción en la boca es indicio de susceptibilidad a la caries por parte
del paciente y como el sistema más utilizado para la identificación de este en clínicas es el método
manual se puede corroborar que este arroja falsos positivos con respecto a S.mutans; esto
conlleva a el mal diagnóstico y tratamiento del pacientes debido a que se podrá catalogar como
susceptible a la caries pero no ser precisamente así, ya que el método otorgo una proporción
mayor de S.mutans que la que en realidad tenía la persona en cuestión. Otro punto a tratar que
está ligado a la identificación correcta de S.mutans es la resistencia que este presenta a la
amoxicilina; siendo este el antibiótico más utilizado a nivel clínico y su administración es
directamente proporcional a la cantidad de colonias de S.mutans presentes en cavidad oral, al
haber una mala identificación del mismo cada paciente podría estar recibiendo la dosis incorrecta
de este compuesto y de esta manera es que el microorganismo ha venido creando una resistencia
debido a la no necesidad del antibiótico pero aun así a su constante exposición al mismo.
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9. CONCLUSIONES:
Basado en los resultados obtenidos el método más indicado para la identificación de los
microorganismos pertenecientes al grupo de los viridans es la PCR, seguido por el MicroScan. El
método manual no permite la identificación correcta de S.mutans ya que no logra llegar a nivel
de especie y presenta falsos positivos en sus resultados; la resistencia a la amoxicilina se llega a
ver influenciada por la inapropiada identificación de la población de S.mutans en la cavidad oral
y de esta manera el antibiótico es suministrado en mayor proporción de lo requerido y debido a
la constante exposición del microorganismo al compuesto este ha creado resistencia al mismo.
10. SUGERENCIAS:
Realizar una evaluación de la susceptibilidad a algún antibiótico es recomendable utilizar el
método de difusión con discos solo para confirmar los resultados obtenidos mediante los
diversos métodos automáticos utilizados; es decir es aconsejable utilizar más de un método
automatizado para la determinación de la susceptibilidad.
Aunque se presentaron mayores concordancias en algunas cepas que en otras no se puede
hablar que hubo un 100% de congruencia entre los métodos, se podría observar que ninguno de
los métodos utilizados fue con exactitud el más adecuado para la identificación de este grupo de
microorganismos; debido al gran número de discrepancias encontradas, como sugerencia se
podría utilizar el método molecular de referencia pero otros métodos automatizados más
reportados para la identificación de los viridans, por ejemplo el Vitek, el Phoenix y el MicroScan.
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