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AVANCES OBTENIDOS EN LOS ESTUDIOS PARA EL
ÍMANEJO DEL HUANGLONGBING DE LOS CÍTRICOS EN
CAMPECHE MÉXICOCAMPECHE MÉXICO
Alberto Uc VárguezAlberto Uc Várguez
CONACYTCONACYT
AVANCES OBTENIDOS EN LOS ESTUDIOS PARA EL MANEJO DEL HUANGLONGBING DE LOS CÍTRICOS EN
ÉCAMPECHE MÉXICOAlberto Uc Várguez1; Francisco Alberto Sánchez Rebolledo2; Oscar Alberto
Moreno Valenzuela3; Alfonso Pérez Gutiérrez4; Guadalupe López Puc1; Emiliano Loeza Ku5; Angélica Moreno Enriquez3; Yereny Minero García3;Emiliano Loeza Ku5; Angélica Moreno Enriquez3; Yereny Minero García3;
María Luisa-Pitol Cruz2. auc@ciatej.net.mx
1Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco UnidadCentro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco. UnidadSureste. Calle 30 No. 151 x 7 y 7A. Colonia García Ginerés. Mérida Yucatán. Tel y Fax: 01 (999)9202671.2Comité Estatal de Sanidad Vegetal del Estado de Campeche. Calle Argentina s/n entre Tamaulipasy Veracruz, Barrio de Santa Ana. Tel: 01 (981) 8161499.3C t d I ti ió Ci tífi d Y tá C ll 43 N 130 C l i Ch b á d Hid l CP3Centro de Investigación Científica de Yucatán. Calle 43 No. 130, Colonia Chuburná de Hidalgo, CP97200, Mérida, Yucatán, México. Tel: 01 (52) 999 942 83 30-Fax: (52) 999 981 39 00.4Instituto Tecnológico de Conkal Yucatán. Km. 16.3 Antigua Carretera Mérida-Motul. C.P. 97345,Conkal, Yucatán. Tel y Fax: 01 (999) 9124130 y 9124131.5Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias Estación Experimental deg , g y pMococha Yucatán. KM. 25 Carretera Mérida-Motul, Mérida C.P. 97454, Mococha Yucatán Tel: 01(991)-9162215 Y 18.
Rendimiento de lima persa….CONACYTCONACYT
Estado Superficie Ha Rendimiento ton/haton/ha
Veracruz 18 280 17
Tabasco 6 705 NDTabasco 6 705 NDOaxaca 3 333 NDYucatán 890 23Yucatán 890 23 Campeche* 1 069 6.91
Fuente: SIAP, 2008
*Superficie de lima persa se triplicó en los últimos dos años
*El di i t b j l ió t i*El rendimiento es muy bajo con relación a otras regiones
Principales problemas de los cítricosCONACYTCONACYT
Virus
BacteriasBacterias
Viroides
No determinadasNo determinadas
Sagarpa, 2009
HUANGLONGBING (Citrus Greening)Huanglongbing (Dragón amarillo)
CONACYTCONACYT Bacteria gram negativa
Restringida a tubos cribosos
Cl ifi ió t b t i ( lib ib t )
3 especies diferentes:Candidatus Liberibacter asiaticum (C las), (22 a 30 ºC)
Clasificación -- α proteobacterias (genero liberibacter)
( ), ( )Candidatus Liberibacter africanum (C lafr) (22 a 24 ºC)Candidatus Liberibacter americanum (C lam)
Tomado de Hall, 2010
Transmite C.l. africanum
Trioza erytreae
C.l.asiaticum y C.l. americanumDiaphorina citri
Síntomas de HLBCONACYTCONACYT
Clorosis parecida a deficiencias de zinc,muerte progresiva y floración fuera deestaciónestación.
Los cítricos más susceptibles son lasnaranjas y mandarinas. El limónj ymexicano es el más tolerante (Bové2006??)
V ill l i
Síntomas de HLBCONACYTCONACYT Venas amarillas, clorosis
general Enverdecimiento
en los frutos
Fruto pequeño,amargo y nocoloreanapropiadamente
Moteados de hoja por HLB
Bové, 2006; Texeira et al., 2005; Roistacher, 2007
Distribución del HLB y VectorCONACYTCONACYT
Huanglongbing (NAPPO, 2005) Diaphorina citri (EPPO, 2006)
En Asia mató a más de 50 millones de plantasEn Asia mató a más de 50 millones de plantasEn Indonesia mató a más de 30 millonesEn África mató a más de 10 millones de plantas
Roistacher and Manjunath, 2007; Bové, 2006.
Características de transmisión de adultosCONACYTCONACYT
Periodo de adquisición 5 hr
Periodo de incubación 2- 25 días
Periodo de transmisión 15 minutos
1 hora de alimentación 100% de transmisión
Una vez adquirida la capacidad de transmisión ocurre toda la vida del insecto por
Tomado de Hall, 2010
Una vez adquirida la capacidad de transmisión ocurre toda la vida del insecto por multiplicación de la bacteria en el insecto
Hembra
Villalobos et al., 2005; Xu et al., 1998Macho
Manejo del HLB en el mundoCONACYTCONACYT
• Detección y eliminación oportuna de plantas e insectos infectados con elHLB
* Control del vector mediante aplicación de productos químicos de contacto osistémicos, uso de enemigos naturales. Lama et al., 1988; Shui-Chen-Chui et al.,sistémicos, uso de enemigos naturales. Lama et al., 1988; Shui Chen Chui et al.,1988.
* Protección cruzada (CVd III HLB CTV HLB)Protección cruzada (CVd-III-HLB, CTV-HLB)
* Plantas tolerantes o resistentes (Bové, 2006)
* El uso de activadores de la defensa sistémica pueden ser útiles. Park et al.,2007; DebRoy et al., 2004; Ton et al., 2002; Ahn et al., 2005; 2007.
CONACYTCONACYT
1. Detección y eliminación oportuna de plantas e insectosinfectados con el HLB útil solo cuando la incidencia esmenor al 5%. (Bové, 2006, Rocha et al., 2005)
Tomado de Juliano Ayres, 2010
Plataformas utilizadas para búsqueda de síntomas de HLBo ado de Ju a o y es, 0 0
2. Control del vectorCONACYTCONACYT
mediante aplicación de productos químicos de contacto o sistémicos, uso deenemigos naturales. Lama et al., 1988; Shui-Chen-Chui et al., 1988.
DesventajajLa baja población de insectos vectores no justifica la aplicación, además elnumero de aplicaciones necesarias para controlar la población durante todo elcultivo lo hace inviable.
Huevecillo
Ninfa
Adulto
Regmi y Lama, 1998
Inconveniente del control biológico…el hiperparatismoCONACYTCONACYT hiperparatismo
Chen-Chui et al., 1999
La busqueda de entomopatogenos puede ser una alternativa
Plantas tolerantesCONACYTCONACYT
Hasta el momento no se tiene ninguna especie o variedad tolerante oHasta el momento no se tiene ninguna especie o variedad tolerante oresistente, sin embargo se sabe que la lima persa no presentasíntomas severos cuando esta infectada con el HLB.
Por otro lado el uso de activadores de la respuesta sistémica adquiridapueden ser una alternativa para el manejo de esta enfermedad.
Reducen 50 a 70% la infección de Erwinia amilovora y su comportamiento fue similar a las de control químico tradicional (sulfato d t t i i B i t t l 2000)de estreptomicina. Brissete et al. 2000)
CONACYTCONACYT
Activadores de la respuesta se han utilizado para el control de bacterias, hongos e insectos
Qiu et al., 2007 utilizaron activadores de la vía del salicílico para inducir resistencia de arroz a Xanthomonas oryzae y Magnaporte spy y g
Anand et al., 2008. demostraron que plantas de tabaco disminuyeron su susceptibilidad a Agrobacterium por aplicación exógena de Ácido salicílicosusceptibilidad a Agrobacterium por aplicación exógena de Ácido salicílico.
Otros autores han demostrado que la aplicación exógena de ácido salicílico o susanálogos funcionales disparan SAR e inducen resistencia a algunos patógenosanálogos funcionales disparan SAR e inducen resistencia a algunos patógenoscomo Pseudomonas aeruginosa (Prithiviraj et al., 2005), Staphylococcus aureus(Prithiviraj et al., 2005) etc.
Jasmonato y etileno importantes en la inducción de resistencia contrarizobacterias (Ton et al., 2001)
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UFC de A. tumefasciens ,en disco de hoja de tabaco tratadas con AS
Anand et al., 2008
CONACYTCONACYT
Considerando:
La importancia social y económica de la lima persa en Campeche
El bajo rendimiento comparado con otras regiones del país
El peligro que representa el HLB
La falta de estrategias de manejo del vector y del HLB
CONACYTCONACYT
“Selección de ecotipos de lima persa (Citrus latifolia Tanaka) altamente productivos y potencialmente tolerantes al daño por
el Huanglongbing en Campeche México”el Huanglongbing en Campeche México .
Ecotipo. Población local de una especie que presenta características biológicas peculiares, lasp p q p g p ,cuales surgen como respuesta del genotipo a las características ecológicas típicas del ambientelocal (Enríquez, 2002).
CONACYTCONACYT
OBJETIVO GENERAL
Seleccionar en el estado de Campeche, ecotipos de limalt t d ti l t lpersa altamente productivos y evaluar su respuesta a la
infección por Candidatus liberibacter spp en presencia yausencia de un inductor de la respuesta sistémica
OBJETIVO ESPECIFICOCONACYTCONACYT
OBJETIVO ESPECIFICO
1. Determinar en tres ecotipos de lima persa, la eficiencia productiva, asícomo la calidad de los frutos producidos por los árboles de cada ecotipo decomo la calidad de los frutos producidos por los árboles de cada ecotipo delima persa seleccionado.
2. Explorar el 46% de la superficie de lima persa del estado de Campeche enp p p pbusca de árboles sospechosos de estar infectados por el HLB.
3. Monitorear en los diferentes ecotipos de lima persa, los niveles deinfestación de Diaphorina citri en las cuatro estaciones del año y determinarsu relación con la temperatura y humedad relativa.
4 E l l t i t t ló i l l d l dif t4. Evaluar la respuesta sintomatológica y molecular de los diferentesecotipos de Lima persa a la infección por HLB, así como su respuesta a laaplicación de dos diferentes inductores de la respuesta sistémica.
Estrategia experimentalCONACYTCONACYT Selección de 3 ecotipos de lima persa (por su origen)
Una plantación /ecotipo de lima persa Infección de árboles de lima persaFrancisco, Alberto
Alberto1 4
Estandarización de condiciones nutricionales
Volumen de producción
Aplicación de activadores de SAR (Salicílico, Jasmonato y Biotina)
Nivel de expresión de genes marcadores de la
Jesus
Alfonso
Alberto
Volumen de copa
Calidad de la producción (4 etapas de
Nivel de expresión de genes marcadores de la RSA
Evaluación sintomatológica y molecular
Alfonso
Alfonso
Ernesto
Alberto, Ernesto
Exploración de plantaciones de lima persa
p ( pproducción)
Eficiencia productiva
Titulo de HLB en los diferentes tratamientos Lupita
Alberto
Nutan
Muestreo sistemático
Colecta de muestras de árboles sospechosos
RobertoMonitoreo de poblaciones de D. citri
Determinación del nivel de infestación /etapa
Francisco, Alberto, Ron
Francisco, Alberto, Ron
Colecta de muestras de árboles sospechosos
Diagnostico para determinación de HLB en plantas e insectos
Roberto, AlbertoDeterminación del nivel de infestación /etapa ninfal
Registros de temperatura y humedad relativa
Francisco, Alberto, Ron
Oscar, Alberto2 3
Exploración de plantacionesCONACYTCONACYTMuestreo sistemático en cinco de oro, recomendado para enfermedades con
distribución en agregados y aleatoria
Gottwalt, 1995
Colecta de muestras de árboles sospechosos, 10 insectos por árbol sospechoso
E t ió d ADN ét d d CTAB difi d (R d Ak i 2006)Extracción de ADN método de CTAB modificado (Ruangwong and Akarapisan, 2006)
PCR (Meyer et al., 2007) con Cebadores específicos (Li et al., 2007)
Exploración de plantacionesCONACYTCONACYT
1 2 3
Resumen de los resultados obtenidos en la exploración de plantaciones de lima persa en el Edo. de Campeche
Etapa 1 Etapa 2 Etapa 3 TotalSuperficie explorada Ha 290 144 143 577Municipios 7 +1 +2 10Localidades 27 34 25Productores 97 68 48 213Muestras vegetales colectadas y 48 12 15 75Muestras vegetales colectadas y Diagnosticadas por PCR Tiempo real y punto final
48 12 15 75
Muestras de insectos colectados y 7 33 80 120yDiagnosticados por PCR punto final
Numero de positivos 8 * 8 12 20•No confirmado
Municipios explorados para la detección de insectos y árboles infectados con HLB
CONACYTCONACYTy
*Positivos detectados en las localidades de Pioneros del Río y dos Laguna sur ubicados en el municipio de Calakmul
Diagnóstico de HLB por PCR punto finalCONACYTCONACYT
T 1 2 3 4 M
1166 pb
Electroforesis en gel de agarosa al 1% mostrando productos de PCRlifi d ti t iti (T t l ti 1 2 3 4 itiamplificados a partir muestras positivas: (T control negativo, 1. 2, 3 y 4 positivo
a HLB, M marcador de peso molecular).
H004C
C. Las Campeche
CONACYTCONACYTH003C
H005C
H006C
H007CH008C
agua
Neg planta
Grafica de la amplificación por PCR tiempo real de 8 muestras positivas a HLB, mediante la sonda Taqman con oligos específicos para Ca Liberibacter asiaticusmediante la sonda Taqman con oligos específicos para Ca. Liberibacter asiaticus
Monitoreo de la población del vectorCONACYTCONACYT
9 trampas amarrillas por plantación, (3 por lote) (Hall, 2007)
Semanalmente se erifica el n mero de insectos por trampaSemanalmente se verifica el numero de insectos por trampa
Se registra la temperatura y humedad relativa con un datalogger
**Diciembre del 2009**
Se inició el monitoreo de las poblaciones del vector Diaphorina citri Baja población en árboles (0.5 insectos/brote/árbol)
Fluctuación poblacional de D. citri, en tresplantaciones de lima de persa del estado de
CONACYTCONACYTplantaciones de lima de persa del estado deCampeche, muestreados semanalmente mediantetrampas amarillas Agosto-2010-Junio 2011
140
160
rampas
Xcoloche
Oxa
40
60
80
100
120
e Adu
ltos de D. citri en t
Bacabchen0
20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
No. de
Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Enero Febrero Marzo Abril Mayo
*Cada punto, representa la media del número de insectos capturados en 9 trampas amarillas/ por plantación
Fluctuación poblacional de D. citri, en tres plantaciones de lima de persa del estado de Campeche, muestreados
CONACYTCONACYT semanalmente mediante inspección de brotes vegetales
70
80
90
va
30
40
50
60
mpe
ratura y H
umed
ad re
lativ
a
Temperatura °CHumedad relativa %
0
10
20
30
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55
Temp
Bacabchen, 259200
300
e D. c
itri en
s
Semanas de Agosto 2010-Julio 2011
Xcoloche, 0Oxa, 230
100
200
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42. de ad
ulto
s de
brot
es
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42
No
Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre Enero Febrero Marzo Abril Mayo
*Cada punto, representa la media del número de insectos contabilizados en 36 brotes vegetativos por plantación, distribuidos en 9 árboles por plantación.
Presencia de agentes de control biológicoCONACYTCONACYT biológico
Colecta de muestras de insectos momificados (20 muestras de insectos)
Identificación*
Metharhizium anisopliae
Bauveria bassiana
Tomado de Arredondo, 2010)
*Dr. Jairo Cristobal Alejo. Instituto Tecnologico de Conkal
Selección de ecotipos (California, Cuba y España)
CONACYTCONACYTy p )
Una plantación/ Ecotipo
Análisis de macro ymicronutrientes en suelo yfollaje. Estandariza manejo de
Altura de la planta, diámetro de di ió N S O P
p p
Tres lotes/ Plantación
riego y practicas culturas deacuerdo a Curtí et al 2000.
copa en dirección N-S y O-P Nueve árboles/ lote
Formula de Turrel. V= 0. 5236 H. D2) (Quijada et al., 2002).Volumen de copa ) ( j , )Volumen de copa
Cuantificación de la producciónNumero y peso de frutos por planta en mayo-septiembre y abril-octubre
Eficiencia es la relación del volumen de producción/ volumen de copa
Selección de ecotiposCONACYTCONACYT
Colecta en cada ecotipo de lima persa, muestras de suelo y follaje.
3 muestras compuestas (5 submuestras/muestra) de suelo por plantación
3 muestras compuestas (5 submuestras/muestra) de follaje por plantación
Selección de ecotiposCONACYTCONACYT
Se realizaron las correcciones adecuadas para estandarizar el nivel nutricional de los árboles en 3 plantaciones
Se determinó la altura y cobertura de los árboles de cada lote en 3 plantaciones (MC. Alfonso Pérez Gutiérrez)
Características de la producción de tres plantaciones de lima persa del estado de
CONACYTCONACYT Campeche
90
100
60
70
80
30
40
50No. frutosPeso kgD. ecuatorial mmD. polar mm
10
20
30
6.3 ton/ha (Sagarpa 2008) 9 ton/ha en plantaciones
0Bacabchen Xcoloche Oxa Testigo
Diámetro mínimo de limón: 42-49mm (Codex stan 213-2005)
Diámetro mínimo de 47-57 mm en muestras
Características físico-químicas de frutos de lima persa en tres plantaciones del estado
de CampecheCONACYTCONACYT de Campeche
45
50
30
35
40
Rendimiento jugo mL
Acidez titulable
Grosor de cascara mm
15
20
25Grosor de cascara mm
Grados Brix
0
5
10
Contenido mínimo de jugo 42% (Codex stant 213-2005)
Bacabchen Xcoloche Oxa Testigo
Contenido de jugo: 45% en muestras
Contenido de Vitamina C en frutos de lima persa de tres plantaciones del estado de
C hCONACYTCONACYT
0 4
0.45
Campeche
0.3
0.35
0.4gramo
0.2
0.25
os / 1
C2 (vitamina C)
0.05
0.1
0.1500
ml
0 Bacabchen Xcoloche Oxa Testigo
Plantación
45 mg/100 gramos** (Curti et al., 2000)
Respuesta de ecotipos a la infección con HLB y asperjados con activadores de SAR
CONACYTCONACYT
1. Plantas asperjadas antes de la inoculación con Candidatus liberibacter asiaticus (no se realizó)3 Pl t j d d é d l i l ió HLB
Tratamientos
3. Plantas asperjadas después de la inoculación con HLB 4. Plantas asperjadas después de la inoculación con el activador a una dosis mayor. 5. Controles. Plantas sin inocular, inoculadas y sin activador, inoculadas y asperjadas
únicamente con la solución sin activador.
Genes marcadores NPR1
Se determina el nivel de expresión de Genes PR (PR1, PR 2 y PR 10)
Monitoreo de síntomas y Titulo de HLB después de la evaluación RT-PCR tiempo real (Meyer, 2007)p ( y )
En proceso
CONACYTCONACYT Efecto del AS asperjado sobre plantas de lima persa infectados experimentalmente con HLB
100 plantas de lima persa –inoculados mediante injerto de yemas de plantas infectadas (6 Febrero 2011)
Mantenimiento de plantas bajo condiciones de invernadero
Colecta de muestras para confirmar la infección (se realizó la extracción de ADN y diagnóstico mediante PCR Punto final Aun no se detecta a lade ADN y diagnóstico mediante PCR Punto final. Aun no se detecta a la bacteria).
Diagnóstico por PCR Tiempo realDiagnóstico por PCR Tiempo real
En proceso (18-04-2011)
CONACYTCONACYT
Efecto del AS, JA y Gentamicina asperjados en plantas de lima persa infectados con HLB
Tratamiento* Nivel 1 Nivel 2 controlAcido salicilico (200 3 3 3µM)Metil Jasmonato 100 µM 3 3 3Metil Jasmonato 200 µM 3 3 3µGentamicina 4g/Lt 3 3 3Agua 3 3 3
*Tres replicas de cada tratamientoTres replicas de cada tratamientoColecta de muestras antes de la aplicación y cada 8 días aproximadamente.Segunda aplicación 31-05-2010)
En proceso (18-04-2011)
CONACYTCONACYT
Variabilidad de aislados bacterianos en muestras de Hlb colectados en diferentes regiones del pais.
130 muestras de Yucatan, 35 de Campeche, 49 de Quintana Roo y 4 de Nayarit
1166pb de la 16s Porcentaje de identidad del 99%1166pb de la 16s -Porcentaje de identidad del 99%Cambios polimorficos en su mayoría fueron transcisiones: Purina:Purina (C:T), Pirimidina: Pirimidina (A:G) 5 Inserciones y 4 deleciones (Angelica Moreno Enriquez en5 Inserciones y 4 deleciones (Angelica Moreno Enriquez en preparación).
CONACYTCONACYT
Titulo bacteriano y distribución de HLBTitulo bacteriano y distribución de HLB
Variabilidad intraespecie
AGRADECIMIENTOSCONACYTCONACYT AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue realizado con recursos del Proyecto “Selección deecotipos de lima persa (Citrus latifolia Tanaka) altamente productivos ypotencialmente tolerantes al daño por el Huanglongbing en CampecheMéxico”. Fomix Campeche. Clave 46801.
Los autores agradecen la colaboración del Comité Estatal de SanidadLos autores agradecen la colaboración del Comité Estatal de SanidadVegetal del Estado de Campeche (CESAVECAMP) por el apoyo en elmonitoreo y exploración de plantaciones de lima persa en busca deárboles e insectos con HLB. También se agradece al Dr. Ron Brlanskyd l U i id d d Fl id l d ió d l i íde la Universidad de Florida, por la donación de los primers y asesoríapara detección por PCR Tiempo real de la bacteria causal del HLB en losinicios de este trabajo. Al MC. Roberto Canales del INIFAP CampusEdzna en Campeche por su apoyo en el monitoreo de la poblaciones delp p p y pvector en la primera etapa del proyecto. Al Dr. Jesús Arreola Enríquezdel Colegio de Postgraduados Campus Campeche, por sucolaboración en la determinación de las condiciones nutricionales de losárboles en tres plantaciones de lima persaárboles en tres plantaciones de lima persa.
250
Precipitación media mensual registrada en el estado de Campeche en el periodo de Agosto 2010 a Mayo del 2011
CONACYTCONACYT
100
150
200
reci
pita
cion
en
mm
Precipitacion mm
0
50
Agosto
Septie
mbre
Octub
re
Noviem
bre
Diciem
bre
Enero
Febr
ero
Marzo
Abril
Mayo
Pre
S N D
Temperatura media, maxima y minima mensual registrada en el estado de Campeche en el periodo de Agosto 2010 a
30
35
40Mayo del 2011
10
15
20
25Temp media °CTemp Max °CTem min °C
0
5
Agosto
Septie
mbre
Octub
re
Noviem
bre
Diciem
bre
Enero
Febr
ero
Marzo
Abril
Mayo
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