CROMATOGRAFÍA La cromatografía es una técnica que permite separar, aislar e identificar los...

CROMATOGRAFÍACROMATOGRAFÍALa cromatografía es una técnica que permite separar, La cromatografía es una técnica que permite separar, aislar e identificar los componentes de una mezcla. aislar e identificar los componentes de una mezcla.

Debe existir una fase estacionaria y una fase móvil, Debe existir una fase estacionaria y una fase móvil, la muestra se distribuye en ambas fases y sus la muestra se distribuye en ambas fases y sus

componentes son retenidos selectivamente por la componentes son retenidos selectivamente por la fase estacionariafase estacionaria

La fase estacionariaLa fase estacionaria puede ser un sólido poroso, un puede ser un sólido poroso, un líquido en un soporte sólidolíquido en un soporte sólido

Las fases móvilesLas fases móviles pueden ser líquidos o gases pueden ser líquidos o gases y y fluidos supercriticosfluidos supercriticos

CLASIFICACIÓNCLASIFICACIÓNSegún la fase móvil : • Líquida• Gas, • Fluidos supercríticos

Según la técnica: • Papel• Capa fina• Columna

Según la muestra : Preparativa y Analítica

CromatogramaCromatograma

DEFINICIONESDEFINICIONES• Tiempo de retención (tr). • Tiempo muerto (tm)• Tiempo de retención corregido (tr)• Factor de capacidad o retención móvil, es

adimensional y se define como: K• Factor o Coeficiente de distribución o Reparto

(K). Es K = Kx Siendo la relación de fases, = ml de la fase móvil / ml de la fase estacionaria• Número de platos teóricos N = 16(tr/w)2 • Altura equivalente de plato teórico AEPT= L/N

tm

tmtrK

Cromatografía en papelCromatografía en papel

Cromatografía capa finaCromatografía capa fina

CROMATOGRAFIA LIQUIDA CROMATOGRAFIA LIQUIDA ALTA RESOLUCIÓN HPLCALTA RESOLUCIÓN HPLC

FASE MOVILFASE MOVIL• Disponible comercialmente• Pureza y Estabilidad. En la actualidad contamos

con productos de calidad de pureza cromatográfica• Disolver la muestra No degradar la fase

estacionaria y No reaccionar con ella• Miscible con otros solventes para formar mezclas

útiles • Tener baja viscosidad para reducir las caídas de

presión • Ser compatible con el detector utilizado.

FASES MÓVILESFASES MÓVILES

Fase MWBP[°C]

R.I. [nm] UV [nm]Viscos.

[cP]µ[Debye]

Acetonitrile 41 82 1.341 195 .358 3.37

Dioxane 88 101 1.421 215 1.26 0.45

Ethanol 46 78 1.359 205 1.19 1.68

Methanol 32 65 1.326 205 .584 1.66

Isopropanol 60 82 1.375 205 2.39 1.68

Tetrahydrofuran 72 66 1.404 215 2.20 1.70

Water 18 100 1.333 185 1.00 1.84

Métodos de Filtración de Solventes en Métodos de Filtración de Solventes en HPLCHPLC

Filtro a la Entrada del Solvente

Filtración al Vacío

Filtración en Línea

Métodos de Desgasificación de Métodos de Desgasificación de Solventes en HPLCSolventes en HPLC

• Sonificación

• Burbujear Helio

• Desgasificación Electrónica en la Línea del Flujo

Válvula de InyecciónVálvula de Inyección

Loop de inyección en dos posiciones

SISTEMA DE INYECCIONSISTEMA DE INYECCION

Este sistema debe cumplir:• Introducir volúmenes pequeños y

reproducibles de muestra. • Originar la menor dispersión física

posible a fin de evitar ensanchamiento de picos.

• No debe interrumpir el flujo, y no debe variar momentáneamente la presión y el caudal.

SISTEMAS DE BOMBEOSISTEMAS DE BOMBEO

• Debe producir presiones estables hasta 6000 psi.

• Mantener el flujo libre de pulsaciones • Generar intervalos de caudales de flujo

(0,1 a 10 ml/min) • Control y reproducibilidad del flujo de

solvente • Componentes de la bomba resistentes a

la corrosión

Sistemas de BombeoSistemas de Bombeo

Mecánico:

• Reciprocantes (Pistón) generan altas presiones 500 a 5000 psi .

• Desplazamiento continuo

Neumático.

EMPAQUEEMPAQUESS

• Sólido: Sílica Polímero AmorfoPolímero cargadoAzúcares

• Líquido enlazado: ResinaGlicól.

• Quimicamente enlazada: Grupos SilanolesC8, C18, CN, NH.

FORMA DEL EMPAQUE.FORMA DEL EMPAQUE.

Micropartículas Esféricas menores de 10 micras

Macropartículas Esféricas mayores de 10 micras

Películas de Esferas recubiertas de micropartículas

SISTEMA DE DETECCIÓNSISTEMA DE DETECCIÓN• Todas las técnicas instrumentales que

sean compatibles con el sistema cromatográfico, las más utilizadas son:

• UV-VIS• Indice de refracción• Conductimetria• IR• RMN• Fluorescencia

Sistema de RegistroSistema de Registro

• Generalmente proporcionan una carta en función de la señal vs tiempo de elución.

• Además reportan tr área del pico, % del área A total.

• Parámetros a fijar en la carta • Velocidad de la carta• Atenuación• Supresión• Punto inicial de inyección• Marcas de pico.

FenómenosFenómenos

• Adsorción

• Reparto

• Intercambio iónico

• Filtración por tamaños moleculares

Cromatografía LíquidaCromatografía Líquida• Partición normal FM es menos polar que FE

• Partición en fase reversa FM es más polar que FE

• Adsorción. Competencia de las moléculas de la muestra y de la fase móvil por los sitios activos del sólido.

• La actividad superficial del sólido se ve afectada por la retención de ciertas moléculas de alta polaridad.

• Intercambio iónico Aniónica• Catiónica• Cromatografía liq. de exclusión por tamaños.

Cromatografía de permeación o filtración según tamaños de las moléculas

OptimizarOptimizar

• Buena Resolución R cerca de 1,5

• Mínimo cambio de Presión

• Tiempo de Análisis Corto

• Alta eficiencia

Orden para optimizarOrden para optimizar

Cambio de polaridad de la fase móvil

Cambio de flujo

Cambios de pH, salinidad, T, viscosidad

Cambiar columna

Efecto tipo de columnaEfecto tipo de columna