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Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular
Práctica 3 Metodología y aplicaciones de la amplificación de material genético: Introducción a la bioinformática. Curso 1 Medicina (Abril) 2012 BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR HUMANA Mohammed Rafii-El-Idrissi Benhnia Ph.D. Phone: 954559852 Email: rafiim@us.es
1. Familiarizarse con el proceso de amplificación mediante
polimerasas
2. Identificar los parámetros críticos de una PCR y familiarizarse con el fundamento de la electroforesis de ácidos nucleicos
3. Secuenciación de ADN.
4. Identificar en el laboratorio virtual una especie patógena mediante PCR
5. Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
6. Caso práctico: uso de las bases de datos de genes (BLAST) y familiarizarse con la notación
Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular
OBJETIVOS
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OBJETIVOS 1. Familiarizarse con el proceso de amplificación mediante
polimerasas
2. Identificar los parámetros críticos de una PCR y familiarizarse con el fundamento de la electroforesis de ácidos nucleicos
3. Secuenciación de ADN.
4. Identificar en el laboratorio virtual una especie patógena mediante PCR
5. Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
6. Caso práctico: uso de las bases de datos de genes (BLAST) y familiarizarse con la notación
Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular
¿Qué es la PCR?
• PCR: Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, Kary Mullis-1985)
• Amplificación selectiva de un segmento particular de ADN
• El segmento puede representar una parte
pequeña de entre una mezcla heterogénea de AND: e.g. un exón específico de un gen humano
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• Herramienta muy poderosa de amplificar y/o detección de fragmentos de ADN de interés ~2 horas.
• La técnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: Ø Diagnóstico (prenatal, infecciones microbianas,
mutaciones de oncogenes, …etc) Ø Medicina forense Ø Antropología o Arqueología molecular Ø Microbiología ambiental
¿Qué es la PCR?
¿Qué hay en la reacción?
• Molde de ADN • Tampón or “buffer” de la reacción – mantener pH
adecuado para el funcionamiento de ADN polimerasa (Tris, iones amonio, iones magnesio, albúmina bovina sérica)
• 4 nucleótidos trifosfato (dNTPs): dATP, dCTP, dTTP y dGTP
• Cebadores (primers) • ADN polimerasa (normalmente Taq)
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¿Qué hay en la reacción?
Reagent for PCR Volume (µ l) for each (25 µ l total)
Final concentration
Taq DNA polymerase (added last)
0.25 50 U/ml
10x buffer 2.5 1x
dNTPs (10 mM each, combined)
0.5 200 µM
Forward primer 0.5 1.2 µM Reverse primer 0.5 1.2 µM dH2O (nuclease free) 19.75 or 19.25 Template (AND) 1
CONTROLES EN LA REACCIÓN DE PCR
CONTROL NEGATIVO TaqPol, dNTPs, buffer, cebadores
+ H2O FALSOS POSITIVOS
CONTROL POSITIVO TaqPol, dNTPs, buffer, cebadores
+ DNA conocido
CONTROL DE LA AMPLIFICACIÓN
MUESTRA PROBLEMA TaqPol, dNTPs, buffer, cebadores
+ DNA desconocido
DIAGNÓSTICO SEGURO
¿Qué hay en la reacción?
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Termocicladores • Gran variedad de suministradores.
• Gran variedad de formatos.
• Reacciones se llevan a cabo en tubos o en placas de 96.
Cebadores
• Oligonucleótidos deben tener ~20 bases.
• El contenido G/C debe ser del 45–55%.
• La base en el extremo 3´ debe ser G o C.
• Los cebadores no deben ser complementarios entre ellos o formar bucles consigo mismo.
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Cebadores que forman bucles
• 5´-GTTGACTTGATA ||||| T 3´-GAACTCT
Cebadores
• Un cebador puede formar un dímero consigo mismo o con otro cebador.
5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´ |||||||||| 3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´
• Los cebadores pueden ser excelentes, pero no deseados, substratos para la Taq polimerasa.
Cebadores
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1- Desnaturalización “denaturation” 95°C, 30 sec. 2- Alineamiento “Annealing” 55–60°C, 30 sec. 3- Extensión “extension/elongation” 72°C, 45 sec. Tiempo depende del tamaño del producto. 30–35 ciclos
Etapas de un ciclo de PCR
1. Desnaturalización (denaturation)
95º C
Etapas de un ciclo de PCR
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2. Alineamiento o unión de los cebadores (Annealing)
Cebadores (primers)
55º C
5´
5´ 3´
3´
3´ 5´ 5´ 3´
La PCR amplifica una zona de ADN flanqueada entre dos cebadores
Etapas de un ciclo de PCR
Etapas de un ciclo de PCR
3. Extensión (extension/elongation)
Polimerasa Taq
72º C
72º C
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30–35 ciclos: Desnaturalización. Alineamiento. Extensión.
Etapas de un ciclo de PCR
¿Cuántas copias se generan?
• No hay amplificación de la secuencia deseada hasta el tercer ciclo.
• La acumulación no es estrictamente el doble tras cada ciclo en las primeras fases.
• Tras 30 ciclos, hay 1,073,741,764 copias específicas (~1×109).
• Hay también otras 60 copias de ADN.
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www.dnalc.org/shockwave/pcranwhole.html
1. Visita la página web que se indica abajo 2. Entra en el apartado “Amplification” 3. Observa cómo se comportan los parámetros siguientes:
Temperatura, número de ciclos y etapas de PCR Nota cómo en el ciclo 3 hay 8 copias de ADN y 2 copias de la
secuencia diana
Comprueba las etapas de PCR
Video
¿Ha funcionado PCR? Electroforesis de ADN
• Comprobación mediante una electroforesis (densidad eléctrica K)
• http://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/ • ¿Es el tamaño del producto el esperado? • ¿Hay más de una banda? • Quizás haya que optimizar la reacción. Video
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Optimización de PCR
T° de alineamiento • Cebadores tienen una temperatura
de alineamiento de 54°C). • La T debe confirmarse
empíricamente. • Saltos de T de 2°C arriba y abajo. • Uso de cicladores con gradiente.
50 52 54 56 58 60
Concentración de Mg2+ • La fidelidad de la PCR depende
[Mg2+]. • Variaciones de [Mg2+] de 0.5 mM.
1.2 2 2.5 3 3.5 4
Optimización de PCR
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¿Cómo es la longitud del fragmento amplificado?
• Típicamente entre 100-1500 bp.
• Es posible amplificar — >25 kb.
• Requiere modificar el tampón de la reacción, tiempo de extensión y tipo de polimerasa
• Limitación por la integridad del material de partida.
¿Cuántos ciclos? Acerca de la sensibilidad
Saturación: Los reactivos se agotan Los productos se alinean La polimerasa se degrada Los productos no deseables se acumulan.
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¿Son importantes los errores?
• Sí, si quieres clonar el fragmento amplificado de ADN — una molécula individual puede tener varias mutaciones.
• No, si quieres secuenciar el fragmento amplificado o digerirlo con enzimas de restricción.
• Usa un enzima con capacidad correctora.
1. Familiarizarse con el proceso de amplificación mediante
polimerasas
2. Identificar los parámetros críticos de una PCR y familiarizarse con el fundamento de la electroforesis de ácidos nucleicos
3. Secuenciación de ADN.
4. Identificar en el laboratorio virtual una especie patógena mediante PCR
5. Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
6. Caso práctico: uso de las bases de datos de genes (BLAST) y familiarizarse con la notación
Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular
OBJETIVOS
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Método de Sanger para secuenciación de nucleótidos
Método enzimático • El ADN molde. • Un enzima que replique el ADN. • Un cebador o "primer" marcado radiactivamente. • Los cuatro nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dGTP y
dTTP). • Nucleótidos dideoxi (ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP).
Son nucleótidos modificados que han perdido el grupo hidroxilo de la posición 3' de la desoxirribosa.
• Deben realizarse en 4 tubos diferentes, 4 mezclas de reacción. Cada mezcla de reacción contiene 4 nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, de dTTP y dGTP), ADN polimerasa I, un cebador marcado radiactivamente y un nucleótido dideoxi, por ejemplo ddGTP, a una concentración baja.
• El nucleótido dideoxi utilizado (ddGTP) competirá con su homólogo (dGTP) por incorporarse a la cadena de ADN que se está sintetizando, produciendo la terminación de la síntesis en el momento y lugar donde se incorpora.
Método de Sanger para secuenciación de nucleótidos
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- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC -
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACG
3’
3’
3’ 5’
5’
5’
1. Sea un DNA que se desea secuenciar:
2. Disponemos de un oligonucleótido complementario a la secuencia, que se hibrida con el DNA cuya secuencia deseamos conocer, y que vale como cebador de la nueva síntesis. Este oligonucleótido está marcado radioactivamente.
TAGGCACG
Método de Sanger para secuenciación de nucleótidos
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAG*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGG*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCG*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGATG*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCG*
- ATCCGTGCTTCCGTGTAAGCTACGTTAGCTTAGCTTGCAGGGTTTTCCTAAGGCCCTTTTAC --*TAGGCACGAAGGCACATTCGATGCAATCGAATCG*
3’
3’
5’
5’
3
4
12
15
21
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Síntesis en presencia de ddGTP
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G A T C60
50
40
30
20
10
+
- A continuación, las cuatro mezclas se someten a electroforesis en poli- acrilamida-SDS. Este método sepa- ra polinucleótidos en función de su tamaño, de forma que los más cortos se desplazan más rápidamente. Como el cebador está marcado Radioactiva-mente, revelamos la plancha de electroforesis por autorradiografía.
Con esto leemos directamente la secuencia complementaria del poli- nucleótido inicial: 5’-AAGGCACATTCGATGCAAT- CGAATCGAACGTCCCAAAAG- GATTCCGGGAAAATG-3’
SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA DE ADN
Detección al mismo tiempo
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Aplicación de la PCR identificación de bacterias
www.hhmi.org/biointeractive/vlabs/index.html
Entra en “The bacterial identification lab”
Elección del caso práctico
1. Familiarizarse con el proceso de amplificación mediante
polimerasas
2. Identificar los parámetros críticos de una PCR y familiarizarse con el fundamento de la electroforesis de ácidos nucleicos
3. Secuenciación de ADN.
4. Identificar en el laboratorio virtual una especie patógena mediante PCR
5. Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
6. Caso práctico: uso de las bases de datos de genes (BLAST) y familiarizarse con la notación
Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular
OBJETIVOS
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¿Podemos amplificar por PCR ARN?
• No directamente — la ADN polimerasa necesita un molde de ADN y no copia ARN.
• mRNA puede copiarse antes en ADN complementario al ARN (cDNA) usando la transcriptasa inversa.
• cDNA es un molde para la PCR
Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
RT PCR master mixes
Reagent for PCR Volume (µ l) for each (25 µ l total)
Final concentration
Quiagen RT PCR buffer 5x 5 1x One step RT PCR enzyme Mix
1
dNTPs (10 mM each, combined)
1 400 µM each dNTP
Primers A 0.5 0.6 µM Primers B 0.5 0.6 µM dH2O (nuclease free) 5.75
Template (mRNA) 10
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5´ 3´
3´ 5´ 5´
5´ 5´
5´ 5´ PCR
RT
1er paso: retrotranscripción a partir del ARN.
2º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.
.3er paso: PCR estándar.
Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RT-PCR)
exon 1 intron 1 exon 2
7 kB A
B 7 kB
exon 1 intron 1 exon 2 exon 3
A B
600 pb 1200 pb
M
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Trabajando con secuencias…
1. Localiza en la base de datos el gen para óxido nítrico sintasa inducible, iNOS, NM_010927.3
2. Familiarizarse con la notación ¿la secuencia de nt pertenece a ARN o es genómica? ¿Dónde comienza y acaba la proteína?
Entra en la base de datos NCBI para ver el gen de la iNOS murine http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_010927
Caso práctico: BLAST
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• Identifica los cebadores en la secuencia usando BLAST contra el gen (NOS2) www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/wblast2.cgi Seq 1 introduce en GI el número del gen NM_010927.3 Seq 2 introduce (copy-paste) el oligo 5´ y el oligo ´3 Oligo 5´ CAgCTCATCCggTACgCTggCTAC Oligo 3´ ACTTCCTCCAggATgTTgTAgCg • ¿Cuál es el tamaño amplificado tras RT-PCR? 397 pb
Caso práctico: BLAST
Video
Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular
Gracias Thanks
Mohammed Rafii-El-Idrissi Benhnia Ph.D. Scientist Infectious diseases and vaccine discovery
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