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DIAGNÓSTICO TEMPRANO DE LA DIAGNÓSTICO TEMPRANO DE LA INFECCIÓN POR EL VIH EN EL INFECCIÓN POR EL VIH EN EL
RECIÉN NACIDORECIÉN NACIDO
Lic. Melvi Pérez
INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN
El Recién Nacido adquiere la infección a traves de la madre VIH+ durante Embarazo, Parto ó Lactancia.
33
Método utilizado
Para el
Diagnóstico Temprano
de la
Infección por el VIH-1
en el
Recién Nacido
METODO ADNMETODO ADN--PCRPCR
Amplificación del ADN proviral mediante reacción en cadena de la polimerasa.
44
ADN PROVIRALADN PROVIRAL
Partícula que contiene la información genética necesaria para la replicación de los virus. Se encuentra en el interior de la célula CD4 hasta que se transforma en ADN vírico y sale de la célula ya convertida en virus activo.
REACCIÓN EN CADENA DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)POLIMERASA (PCR)
Conocida como PCR por sus siglas en Inglés(Polimerase Chain Reaction) es una técnica deBiología Molecular (descrita en 1985, por KaryMullis) cuyo objetivo es obtener un gran númerode copias de un fragmento de ADN.
Tras la amplificación, resulta mucho mássencillo identificar con una alta probabilidadVirus y/o Bacterias causante de una enfermedad.
55
¿CÓMO LLEGAMOS DE LA TÉCNICA DE PCR
AL MÉTODO USADO PARA
EL DIAGNÓSTICO TEMPRANO DE LA
INFECCIÓN POR EL VIH-1 EN EL
RECIÉN NACIDO?
66
EnsayoEnsayo Roche Roche AmplicorAmplicor VIHVIH--1 DNA (v 1.5) 1 DNA (v 1.5) AdaptadoAdaptado Para Discos De Sangre Para Discos De Sangre SecaSeca (DBS)(DBS)
77
DISCOS DE SANGRE SECA (DBS)DISCOS DE SANGRE SECA (DBS)
88
DBS por sus siglas en Inglés (Dried Blood Spot) es sangre seca en un papel filtro.
VENTAJAS DE LA MUESTRA DE VENTAJAS DE LA MUESTRA DE SANGRE SECA (DBS)SANGRE SECA (DBS)
Sólo requiere una pequeña cantidad de sangre.
Es termoestable.
Fácil de almacenar y transportar.
99
Objetivo Objetivo EnsayoEnsayo Roche Roche AmplicorAmplicorVIHVIH--1 DNA (v 1.5)1 DNA (v 1.5)
AdaptadoAdaptado Para Discos De Sangre Para Discos De Sangre SecaSeca(DBS)(DBS)
Detectar el ADN proviral del VIH-1 en niños nacidos de madres seropositivas; en una muestra de sangre total colectada en un papel filtro.
1010
Principio Del Principio Del EnsayoEnsayo Roche Roche AmplicorAmplicorHIVHIV--1 DNA (v 1.5)1 DNA (v 1.5)
AdaptadoAdaptado Para Discos De Sangre Para Discos De Sangre SecaSeca(DBS)(DBS)
Es un ensayo cualitativo In Vitro para la detección del ADN proviral de VIH-1 en sangre humana. Esta técnica utiliza la amplificación de ADN mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la hibridación de ácido nucleído para la detección de VIH-1 ADN en sangre humana colectada en un papel filtro.
1111
TOMA DE MUESTRA PARA PRUEBA TOMA DE MUESTRA PARA PRUEBA DE ADNDE ADN--PCR PCR
Sangre seca en un papel filtro (DBS).
A hijos de madres VIH positivo.
Se toma a partir de las ocho semanas de nacido.
Se obtiene de una punción y no de una flebotomía.
1212
MATERIALES NECESARIOS PARA TOMAR MATERIALES NECESARIOS PARA TOMAR UNA MUESTRA PARA UN ADNUNA MUESTRA PARA UN ADN--PCRPCR
Guantes (sin polvo).
Tarjetas de Papel Filtro.
Lanceta.
Alcohol.
Algodón.
Estante para secar las muestras.
1313
INFORMACIÓN QUE DEBE CONTENER EL INFORMACIÓN QUE DEBE CONTENER EL FORMULARIO Y LA TARJETA DE PAPEL FORMULARIO Y LA TARJETA DE PAPEL
FILTROFILTRO
Antes de tomar la muestra llene el formulario y la tarjeta y escriba claramente:
Los nombres y apellidos del niño.
Fecha de nacimiento.
Nombre de la madre.
Fecha de recolección.
1414
DEDE DONDE TOMAR LA MUESTRADONDE TOMAR LA MUESTRA
1515
• Niños 6 semnas – 4 meses: talón
• Niños 4m - 10m: dedo grande pie
• Niños >10m o >10 kg: pulgar
COMO TOMAR UNA MUESTRA COMO TOMAR UNA MUESTRA DEL TALÓNDEL TALÓN
1616
1717
CALIENTE EL ÁREACALIENTE EL ÁREA
1818
LÁVESE LAS MANOS Y PÓNGASE LÁVESE LAS MANOS Y PÓNGASE GUANTESGUANTES
1919
POSICIONE EL BEBE CON EL PIE POSICIONE EL BEBE CON EL PIE HACIA ABAJO HACIA ABAJO
2020
LIMPIE EL ÁREA, SÉQUELA Y LIMPIE EL ÁREA, SÉQUELA Y ESPERE ESPERE 3030 SEGUNDOS SEGUNDOS
2121
PRESIONE CON LA LANCETA PRESIONE CON LA LANCETA CONTRA EL PIE, HASTA QUE SE CONTRA EL PIE, HASTA QUE SE
HAGA UNA PERFORACIÓNHAGA UNA PERFORACIÓN
2222
LIMPIE LA PRIMERA GOTA DE LIMPIE LA PRIMERA GOTA DE SANGRESANGRE
2323
ESPERE HASTA QUE SE ACUMULÉ ESPERE HASTA QUE SE ACUMULÉ UNA GOTA GRANDE UNA GOTA GRANDE
2424
TOQUE LA GOTA CONTRA EL PAPEL TOQUE LA GOTA CONTRA EL PAPEL
FILTRO Y LLENE EL CIRCULOFILTRO Y LLENE EL CIRCULO
2525
MANTENGA EL PIE PRESIONADOMANTENGA EL PIE PRESIONADO
2626
LLENE UN MLLENE UN MÍÍNIMO DE TRES NIMO DE TRES CCÍÍRCULOSRCULOS
2727
LIMPIE EL PIELIMPIE EL PIE
UN TRABAJO BIEN HECHO UN TRABAJO BIEN HECHO
2828
COMO TOMAR UNA MUESTRA DEL COMO TOMAR UNA MUESTRA DEL DEDO GRANDE DEL PIEDEDO GRANDE DEL PIE
2929
3030
CALIENTE EL ÁREA CALIENTE EL ÁREA
3131
LLÁVESE LAS MANOS Y PÓNGASE ÁVESE LAS MANOS Y PÓNGASE
GUANTESGUANTES
3232
POSICIONE EL BEBE CON EL PIE POSICIONE EL BEBE CON EL PIE HACIA ABAJO HACIA ABAJO
3333
LIMPIE EL ÁREA, SÉQUELA Y LIMPIE EL ÁREA, SÉQUELA Y
ESPEREESPERE30 30 SEGUNDOS SEGUNDOS
3434
PRESIONE CON LA LANCETA CONTRA PRESIONE CON LA LANCETA CONTRA
EL PIE, HASTA QUE SE HAGA UNA EL PIE, HASTA QUE SE HAGA UNA PERFORACIÓNPERFORACIÓN
3535
LIMPIE LA PRIMERA GOTA DE LIMPIE LA PRIMERA GOTA DE
SANGRESANGRE
3636
ESPERE HASTA QUE SE ACUMULE ESPERE HASTA QUE SE ACUMULE
UNA UNA GOTA GRANDE GOTA GRANDE
3737
TOQUE LA GOTA CONTRA EL PAPEL TOQUE LA GOTA CONTRA EL PAPEL
FILTROFILTRO
3838
MANTENGA EL PIE PRESIONADOMANTENGA EL PIE PRESIONADO
3939
LLENE UN MLLENE UN MÍÍNIMO DE TRES NIMO DE TRES CÍRCULOSCÍRCULOS
4040
LIMPIE EL PIELIMPIE EL PIE
COMO SECAR LAS MUESTRASCOMO SECAR LAS MUESTRAS
No toque la muestra.
Coloque las muestras en posición horizontal.
Espere un mínimo de tres horas para que la
muestra se seque.
No exponga las muestras al sol, polvo u otros contaminantes.
No caliente las muestras.
No colocar una muestra encima de otra.
No dejar que la muestra se ponga en contacto con ningún objeto (incluso otros PCRs) mientras se esté secando.
4141
MANTENER LAS MEDIDAS DE MANTENER LAS MEDIDAS DE BIOSEGURIDADBIOSEGURIDAD
4242
QUE NO QUE NO SESE DEBE HACER AL TOMAR DEBE HACER AL TOMAR LA MUESTRALA MUESTRA
4343
No se debe presionar el dedo. Las gotas de sangre son muy
pequeñas.
MUESTRAS VALIDASMUESTRAS VALIDAS
4444
Círculos completamente
llenos de sangre
Claramete Idntificada
Círculos no estan
llenos completamete
pero es suficiente para
un disco de 6mm y
repeticiones
Claramente Identificada
3 Buenos discos de sangre
Claramente Identificada
MUESTRAS INVALIDASMUESTRAS INVALIDAS
4545
Toma de muestra incorrecta.
No hay suficiente sangre
para un disco de 6 mm.
Círculos con halo de alcohol.
El alcohol usado para
desinfectar interfiere en la
toma de muestra.
Muestra no fue secada
correctamente antes de ser enviada.
Muestra parece estar muy saturada .
Quizás fue mojada por los dos lados.
Quizás la sangre fue aplicada con
una jeringuilla.
Sangre coagulada.
Quizás múltiple gotas fueron
aplicadas una encima de otra.
Sangre coagulada.
Probablemente llenada con sangre de una
jeringuilla.
MUESTRAS CONDICIONALESMUESTRAS CONDICIONALES
4646
Información Incompleta
Contactar remitente
para clarificación
Rechazar si no se
clarifica la identficación
Muestra no Identificada
Información no clara
Contactar remitente
para clarificación
Rechazar si no se
clarifica la identficación
EMBALAJE Y LOGÍSTICA DE EMBALAJE Y LOGÍSTICA DE TRANSPORTETRANSPORTE
4747
COMO EMPACAR LAS MUESTRASCOMO EMPACAR LAS MUESTRAS
4848
Sólo un papel filtro debe ir dentro del sobre de papel de cera.
Coloque hasta 5 sobres dentro de
la funda plástica
COMO EMPACAR LAS MUESTRASCOMO EMPACAR LAS MUESTRAS
4949
5 desecantes por cada
muestra .
1tarjeta para medir la humedad
por funda.
presione la funda para sacar todo el
aire y ciérrela. Asegúrese que la funda
este bien cerrada.
COMO ALMACENAR LAS COMO ALMACENAR LAS MUESTRAS MUESTRAS
Mantenga las muestras en la funda plástica cerrada. en un lugar fresco y seco hasta ser enviadas al laboratorio.
Refrigerarlas (4°c) si va almacenarlo por más de una semana.
Evite dejarlo en el carro porque el sol las dañará.
5050
COMO ENVIAR LAS MUESTRAS AL COMO ENVIAR LAS MUESTRAS AL LABORATORIOLABORATORIO
Coloque la funda que contiene las muestras dentro de un sobre protector para evitar sufra maltrato en el envío.
Coloque los formularios en el sobre.grape el sobre para que se mantenga cerrado.
5151
IMPORTANTE RECORDARIMPORTANTE RECORDAR
Para la toma y almacenaje de la muestra, sólo use los insumos contenidos en el kit.
Los insumos sólo deben ser utilizados para la toma de muestras de ADN-PCR.
La lata con los secantes y tarjetas de humedad siempre debe estar cerrada.
Almacene los insumos en un lugar fresco y seco.
5252
RESPONSABILIDAD DEL RESPONSABILIDAD DEL LABORATORIOLABORATORIO
Coordinar con la persona responsable de citar los niños el día y la horaen que se tomarán las muestras.
Llevar el control de las muestras enviadas y recibidas.
Guardar en archivo los resultados para cuando el medico los necesite.
Llevar una relación de los materiales e insumos y gestionar suadquisicion.
Contactar la persona que va hacer el envío de las muestras al Laboratorio Nacional Dr. Defilló en Santo Domingo, para coordinar el envío de las mismas.
Gestionar los resultados cuando sea pertinente.
5353
ESTA TÉCNICA SE REALIZA ENESTA TÉCNICA SE REALIZA ENTRES PASOS:TRES PASOS:
5454
1- Obtención del Disco de Sangre Seca y
Extracción de ADN.
2- Amplificación por Reacción en Cadena de
la Polimerasa del ADN.
3- Detección de productos de PCR en placa
(ELISA).
OBTENCIÓN DEL DISCO DE OBTENCIÓN DEL DISCO DE SANGRE SECA.SANGRE SECA.
5555
Usar un perforador limpio para cada
muestra (6mm o ¼ pulgadas).
Por cada tirada agreagar: CONTROLES EXTERNOS POSITIVO y
NEGATIVO de DBS.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.
5656
Lavados de los Discos de Sangre Seca.
CONTROL DE CALIDAD INTERNOCONTROL DE CALIDAD INTERNO
A cada muestra se adiciona un Control Interno (Clamidia Tracomati) provisto en el Kit de reactivos, el cual determina la presencia de Inhibidores de la PCR y a la vez permite evaluar el desempeño del técnico y la calidad de los procedimientos de Extracción y Amplificación del material genético.
5757
EXTRACCIÓN DEL AND DEL VIHEXTRACCIÓN DEL AND DEL VIH--1 Y 1 Y DEL CONTROL INTERNO.DEL CONTROL INTERNO.
5858
AMPLIFICACIÓN DEL ADN AMPLIFICACIÓN DEL ADN EXTRAÍDO DE VIHEXTRAÍDO DE VIH--1 Y 1 Y
CONTROL INTERNOCONTROL INTERNO
5959
DETECCIÓN DE LOS AMPLICONES DETECCIÓN DE LOS AMPLICONES EN PLACAEN PLACA.
6060
EJEMPLO DE UNA PLACA DE EJEMPLO DE UNA PLACA DE ELISAELISA
6161
1 HIV 2 CT 3 HIV 4 CT 5 HIV 6 CT 7 HIV 8 CT 9 HIV 10 CT 11 H IV 12 CT
ARoche
(-)
Roche
(-)5 5
B Roche
(+)
Roche
(+)6 6
C CDC
(NC)
CDC
(NC)7 7
D CDC
(PC)
CDC
(PC)8 8
E 1 1 9 9
F 2 2 10 10
G 3 3 11 11
H
4 4 12 12
RESULTADOS ESPERADOSRESULTADOS ESPERADOS
6262
++
CT*
+++
VIH*
++
CT*
-
VIH*
Muestra HIV-1 NEG Muestra HIV-1 POS
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOSINTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
6363
VIH-1 A450 CI A450 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
< 0.2 ≥ 0.2 ADN de VIH-1 NO DETECTADO.
Muestra presumiblemente negativa para ADN de VIH-1
< 0.2 < 0.2 Muestra con inhibición.
Si ADN de VIH-1 esta presente, no puede ser detectado.
Procesar una nueva alícuota de la muestra y repetir el test.
Si no hay muestra, solicitar una nueva toma.
≥ 0.8 cualquiera ADN de VIH-1 detectado.
Muestra positiva para la presencia deADN de VIH-1
+/+ => AND detectado
+/- => resultado discordante, repetir en duplicado
0.2 ≤ A < 0.8 cualquiera Indeterminado o equivoco.
Resultados no definitivos para ADN de VIH-1. Repetir el ensayo en
duplicado con alícuotas de la muestra original.
VENTAJAS DE LA PRUEBA VENTAJAS DE LA PRUEBA ADNADN--PCRPCR
6464
Aumenta captación temprana de casos de
transmisión vertical.
Presenta 100% de sensibilidad y especificidad
para la detección del ADN proviral del VIH-1.
Se realiza a un menor costo que una carga
viral.
DESVENTAJAS DE LA PRUEBA DESVENTAJAS DE LA PRUEBA ADNADN--PCR PCR
Es una técnica manual y muy extensa.
(8-10 horas) si se trabaja en un día, pero generalmente la hacemos en dos días.
Por esta razón está siendo desplazada por la PCR en tiempo Real.
6565
PROGRAMA DE CONTROL DE PROGRAMA DE CONTROL DE CALIDAD EXTERNO CALIDAD EXTERNO
CDC ofrece y recomienda un programa de prueba de proeficiencia para DBS.
– Voluntario y sin costo.
– 3 veces al año.
– 10 muestras DBS codificadas.
– Controles negativos y positivos de DBS del CDC.
– Informar los resultados en 4 semanas.
– Análisis de todos los informes y envío de reporte final a cada laboratorio.
– Identificación de problemas y medidas correctivas en colaboración con CDC.
6666
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