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Diversidad del elemento transponible Galileo en especies de
Drosophila (Diptera, Drosophilidae) del grupo repleta
Trabajo de investigación del Master en Genética Avanzada
Curso 2009-2010
Andrea Acurio
Director: Dr. Alfredo Ruiz
Co-director: Dr. Deodoro C. S. G. Oliveira
Facultad de Biociencias
Departamento de Genética y Microbiología
________________ ________________ __________________
Lic. Andrea Acurio Dr. Alfredo Ruiz Dr. Deodoro C.S.G. Oliveira
2
Resumen
Los elementos transponibles (TE) constituyen una porción importante del genoma de
practicamente todos los organismos vivientes, son poderosos facilitadores de evolución
genómica e influyen en la diversidad fenotípica. El elemento transponible Galileo,
descubierto en Drosophila buzzatii, es miembro de la superfamilia P de transposones de
DNA. Este TE ha demostrado tener un papel causal en la generación de inversiones en
poblaciones naturales de Drosophila y su presencia en 6 de las 12 especies secuenciadas de
Drosophila sugiere una contribución importante a la evolución de estos dípteros. Las copias
de Galileo encontradas en el genoma de D. mojavensis fueron clasificadas en cuatro grupos
o subfamilias denominadas C, D, E y F.
Drosophila buzzatii y D. mojavensis pertenecen al grupo de especies repleta, endémico de
regiones áridas y semiáridas del continente americano. Este grupo de especies representa
un excelente modelo biológico para los estudios de evolución debido a su alta diversidad,
cerca de 100 especies descritas. Para estudiar la distribución y diversidad del elemento
transponible Galileo en el grupo repleta se realizó un muestreo representativo de los
subrupos de especie hydei, mercatorum, mulleri y repleta. Se analizaron 98 muestras de 49
especies del grupo repleta, 4 del grupo nannoptera y 1 del grupo virilis. Mediante PCR se
amplificaron las secuencias de la transposasa de Galileo, que luego fueron clonadas y
secuenciadas. La amplificación fue positiva para 51 muestras de 16 especies de Drosophila
del grupo repleta. Con estos datos se construyó una filogenia que se comparó con la
filogenia de las especies. Los datos obtenidos extienden la distribución de Galileo dentro
del grupo repleta y sugieren una diversificación vertical dentro del linaje de repleta.
3
Página
I. INTRODUCCIÓN
1. Los elementos transponibles 4
2. El elemento transponible Galileo 5
3. El grupo de especies repleta 7
4. Objetivos 8
II. MATERIALES Y MÉTODOS
1. Obtención de muestras 9
2. Diseño de cebadores 12
3. Extracción de DNA genómico 13
4. Reacción en cadena de la polimerasa 14
5. Visualización del fragmento obtenido 15
6. Clonación del producto de PCR 15
7. Análisis de las secuencias amplificadas 17
8. Construcción de la filogenia 18
III. RESULTADOS
1. Amplificación por PCR de las copias de Galileo 20
2. Identidad de las secuencias amplificadas 26
3. Relaciones filogenéticas 32
IV. DISCUSIÓN
1. Galileo en el grupo de especies repleta 34
2. Dinámica de Galileo en el grupo repleta 36
3. La transposasa de Galileo 37
4. Inserciones encontradas en Galileo 38
V. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS 39
VI. BIBLIOGRAFÍA 40
VII. AGRADECIMIENTOS 45
4
I. INTRODUCCIÓN
1. Los elementos transponibles
Los elementos transponibles (TE, transposable elements) representan un
componente importante en el genoma de casi todos los organismos. La proporción de
TE en el genoma varía desde un 4% en la levadura Saccharomyces cerevisiae a más del
70% en algunas plantas y anfibios. En el genoma humano la proporción de TE es del
45% (Venner et al. 2009). Se considera que por disfunción génica o pérdida de
regulación, los TE son responsables de alrededor del 1% de enfermedades humanas
(Kazazian 1998).
Los TE son capaces de movilizarse dentro del genoma del hospedador y pueden
insertarse en genes o elementos reguladores, alterar la función de un gen o inducir
reordenaciones cromosomicas (Venner et al. 2009). La mayoría de inserciones de TE
son detrimentales, otras son selectivamente neutrales y unas pocas pueden ser
beneficiosas debido a su capacidad mutagénica, pudiendo contribuir así a la diversidad
del genoma hospedador. En algunos casos los TE han sido "domesticados" actuando
como genes o elementos reguladores de genes por lo que constituyen un recurso de
innovación génica para el organismo (Medstrand et al. 2005, Brandt et al. 2005).
En base a su mecanismo de transposición, los TE pueden ser divididos en dos
clases: La clase I comprende retrotransposones que se mobilizan a través de
mecanismos mediados por RNA (Berg 1989) y los de clase II que se movilizan a través
de mecanismos mediados por DNA y se multiplican usando la maquinaria de
replicación de la célula hospedadora (McDonald 1993). Dependiendo de su habilidad
5
para dirigir su transposición, cada clase de TE puede contener dos tipos de copias:
autónomas y no autónomas.
Los elementos autónomos tienen marcos abiertos de lectura (ORF, open reading
frames) que codifican las proteínas requeridas para la transposición en el genoma del
hospedador. En contraste los elementos no autónomos no codifican proteínas de
tranposición pero pueden transponerse utilizando la maquinaria de las copias
autónomas. La integración de casi todos los TE da como resultado la duplicación de una
secuencia genómica corta del sitio diana (TSD, target site duplications) en el sitio de
inserción. Los tranposones de DNA usualmente tienen una estructura simple con
repeticiones terminales invertidas (TIR, terminal inverted repeats) que flanquean un
sólo gen que codifica la tranposasa.
La transposasa se acopla de manera específica a los extremos de su elemento
codificante (elemento autónomo) y a los extremos de los miembros de las familias no
autónomas (Wessler 2006). Una vez acoplado la transposasa inicia la reacción de corta
y pega en donde el elemento es escindindo del sitio donante (generando un espacio
vacío) y se inserta en un nuevo sitio del genoma.
Uno de los rasgos más sobresalientes de los TE es su capacidad de atravesar los
límites entre especies e insertarse en nuevos genomas. El proceso conocido como
Transferencia Horizontal (TH) se define por la transferencia de material genético entre
especies. La TH ha sido propuesta como un paso escencial en el ciclo de vida de los
transposones de DNA (Silva et al. 2004).
2. El elemento transponible Galileo
Galileo fue descubierto en Drosophila buzzatii, en donde se caracterizaron copias
no autónomas y se clasificó a este elemento como tipo foldback debido a sus largas TIR
6
(Cáceres et al. 2001, Casals et al. 2003). En un estudio posterior (Casals et al. 2005),
copias de Galileo fueron detectadas en varias especies del complejo buzzatii, aunque no
en especies más alejadas como D. mulleri o D. repleta. Más adelante Marzo et al.
(2008) caracterizaron copias completas o casi completas de Galileo en D. buzzatii y en
el genoma de otras 6 especies de Drosophila secuenciadas, D. ananassae, D. willistoni,
D. pseudoobscura, D. persimilis, D. virilis y D. mojavensis (Figura 1). Las copias de
Galileo obtenidas tenían una longitud de 4,4 a 6 kb y codificaban una transposasa de
889-938 aa. En base a la identidad aminoacídica de la transposasa con la de los
elementos P y 1360 de D. melanogaster, Galileo fue re-clasificado como miembro de la
superfamilia P de transposones de DNA que se transpone mediante un mecanismo de
tipo corta-y-pega. Según Marzo et al. (2008), Galileo está (o ha estado recientemente)
activo en el genoma de D. buzzatii y también en otras especies del género Drosophila,
su más reciente evento de transposición fue estimado en alrededor de 0.2 millones de
años.
Figura 1. Galileo en Drosophila. A. Copia de Galileo en el genoma de D.buzzatii.
B. Copias más largas encontradas en los genomas de 6 especies secuenciadas.
Tomado y modificado de Marzo et al. (2008).
7
Las copias de Galileo encontradas en el genoma de D. mojavensis fueron
clasificadas, en base a la identidad de las secuencias de los TIR, en cuatro grupos o
subfamilias, C, D, E y F. La divergencia promedio entre las copias dentro de los grupos
C-F fue estimada en 2,2%, 2,3%, 2,4% y 8,9%, respectivamente, indicando un tiempo
de diversificación de 1,4 a 5,5 millones de años para las subfamilias (Marzo et al.
2008).
Se conoce que Galileo está implicado en la generación de al menos tres inversiones
polimórficas en poblaciones de D. buzzatii mediante recombinación ectópica (Cáceres
et al. 2001, Casals et al. 2003, Delprat et al. 2009). Además Galileo ha sido encontrado
en el genoma de otras especies de Drosophila que son polimórficas para inversiones
cromosómicas, entre ellas están las más polimórficas de todo el género (D. willistoni y
D. persimilis). Esta observación abre la posibilidad de que Galileo esté implicado en la
generación de inversiones cromosómicas en otras especies del género Drosophila.
3. El grupo de especies repleta de Drosophila
El género Drosophila representa un importante organismo modelo no sólo para
entender la evolución genómica sino también para investigaciones experimentales
comparativas, debido a que tiene una filogenia bien establecida y extensa literatura en
Genética, Etología y Ecología. El grupo de especies repleta, endémico de regiones
áridas y semiáridas de Norte y Sudamérica, es uno de los grupos más extensos y
complejos dentro del género Drosophila, con más de 100 especies (Bächli 2010). Está
dividido en seis subgrupos, fasciola, inca, hydei, mercatorum, mulleri y repleta, en base
a inversiones cromosómicas y caracteres morfológicos (Wasserman 1960, 1982, 1992,
Vilela 1983, Rafael & Arcos 1989).
8
El grupo repleta utiliza una amplia variedad de nichos ecológicos que van desde
una alta especificidad, como ciertas especies del subgrupo mulleri que utilizan tejidos
de cactus necrotizados como único sitio de oviposición y cortejo, hasta especies más
generalistas de los subgrupos hydei, mercatorum y repleta (Markow & O’Grady 2006).
4. Objetivos
El objetivo principal de esta investigación es conocer la distribución y la dinámica
evolutiva del elemento transponible Galileo dentro de las especies de Drosophila
del grupo repleta.
Los objetivos específicos son:
1. Determinar en que especies de Drosophila del grupo repleta se encuentra
Galileo para conocer mejor su distribución.
2. Construir una filogenia con las copias de Galileo que pudiesen encontrarse en el
genoma de las especies del grupo repleta para inferir su historia evolutiva.
3. Comparar la filogenia obtenida con la filogenia de las especies del grupo repleta
con la finalidad de detectar posibles casos de transferencia horizontal.
9
II. MATERIALES Y MÉTODOS
1. Obtención de muestras
Se trató de incluir el mayor número de especies posibles para obtener una muestra
representativa del grupo de especies repleta. Se analizaron 92 muestras de los
subgrupos mulleri, hydei, mercatorum y repleta. Además se incluyeron 5 muestras del
grupo nannoptera que comparte el nicho ecológico con especies cactófilas del grupo
repleta y 1 muestra del grupo virilis, el grupo filogenéticamente más cercano a repleta.
En total se analizaron 98 muestras de 49 especies (Tabla 1). La obtención de las
muestras se realizó mediante colectas, donaciones y algunas fueron cepas de stock
centers. Los especímenes de localidades ecuatorianas, se colectaron con trampas
plásticas y cebo de Opuntia ficus-indica con levadura de cerveza Saccharomyces
cerevisiae. La identificación taxonómica de estas muestras se realizó mediante
caracteres morfológicos externos y el análisis de la genitalia de los machos (Figura 2).
Figura 2. Caracteres morfológicos utilizados para la identificación taxonómica: a.
último segmento abdominal, b. arco genital y edeago, c. ovipositor y espermatecas, d.
palpo labial, e. número de ramas de la arista, f. peine sexual, g. venación alar, h. patrón
de coloración del torax, i. patron de coloración del abdomen.
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Tabla1. Datos de colección disponibles de las especies utilizadas en este estudio.
Código Especie Localidad/Pais Colector/ Año
GAL001 D. aldrichi Zuata/Venezuela Fontdevila/1980
GAL002 D. arizonae Tomatlan /Méjico Heed/1981
GAL003 D. arizonae Punta Onah/Méjico Heed/1981
GAL005 D. koepferae Cébila/Argentina Fontdevila et al. /1981
GAL007 D. martensis Guaca/Venezoela Cerda/1984
GAL008 D. mercatorum Comarada/Bolivia Fontdevila et al./1982
GAL009 D. mojavensis Punta Onah/Méjico Heed/1981
GAL010 D. mulleri Panuco/Méjico Richardson/1998
GAL011 D. mayaguana Port Henderson/Jamaica Thomas et al./ 1983
GAL012 D. buzzatii España
GAL015 D. stalkeri St. Petersburg/U.S.A. Bowling G. Stock C/1990
GAL016 D. starmeri Rio Hacha/Colombia Ordoñez/1996
GAL018 D. uniseta Salamanca/Colombia Ordoñez/1990
GAL019 D. virilis ― UMEA Stock C.
GAL020 D. venezolana Los Roques/Venezuela Cerda/1984
GAL021 D. wheeleri Ejido Uruapan/Méjico Heed et al. /1979
GAL023 D. mojavensis Catalina I./U.S.A. 2002
GAL024 D. arizonae Punta Onah/Méjico Etges et al./ 2007
GAL025 D. wheeleri Punta Onah/Méjico Etges et al./ 2007
GAL026 D. arizonae San Quintin/Méjico Etges et al./ 2008
GAL027 D. wheeleri Catalina Island/U.S.A. Counteman/2004
GAL028 D. arizonae Tomatlan/Méjico Heed/1982
GAL029 D. arizonae Vaquerias/Méjico Etges et al./ 1997
GAL030 D. navojoa Chamela/Méjico Etges et al./ 1997
GAL031 D. mojavensis Santiago/Méjico Etges et al./ 1996
GAL032 D. aldrichi Hatulco//Méjico Etges et al./ 2002
GAL033 D. mojavensis Punta Onah/Méjico Etges et al./ 2007
GAL034 D. mojavensis Punta Onah/Méjico Armella et al./ 1996
GAL035 D. mojavensis San Quintin/Méjico Etges et al./ 2008
GAL036 D. aldrichi Zapilote/Méjico Etges et al./ 1998
GAL037 D. mojavensis Providence M./U.S.A. Etges et al./ 1996
GAL038 D. mettleri Sonora/Méjico Dros. Stock Center/1996
GAL039 D. mercatorum Tucson/U.S.A. Dros. Stock Center/2005
GAL040 D. anceps Michoacan /Méjico Dros. Stock Center/1998
GAL041 D. borborema Bahia/Brasil Dros. Stock Center/1974
GAL042 D. fulvimacula Veracruz/Méjico Dros. Stock Center/2002
GAL043 D. longicornis Tucson/U.S.A. Dros. Stock Center/2001
GAL044 D. hydei Sonora/Méjico Dros. Stock Center/2006
11
GAL045 D. richardsoni TortolaIsland Dros. Stock Center
GAL046 D. straubae Sigus Beach/Cuba Dros. Stock Center
GAL047 D. ritae Puebla/Méjico Dros. Stock Center/1991
GAL052 D. hamatofila Superstition /U.S.A. Dros. Stock Center/2005
GAL053 D. hexastigma Puebla/Méjico Dros. Stock Center/1997
GAL054 D. paranaensis Chiapas/Méjico Dros. Stock Center/2002
GAL055 D. peninsularis Bath/Jamaica Dros. Stock Center/1957
GAL056 D. meridiana Canal Zone/Panama Dros. Stock Center/1958
GAL057 D. neorepleta Jalisco/Méjico Dros. Stock Center/2004
GAL058 D. mercatorum Palmira /Colombia Dros. Stock Center
GAL059 D. mercatorum Campo Grande/Brasil Dros. Stock Center
GAL082 D. pachea Las Bocas/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL083 D. pachea Punta Onah/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL084 D. nigrospiracula Las Bocas/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL085 D. eremophila Las Bocas/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL086 D. navojoa Las Bocas/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL088 D. huckinsi Las Bocas/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL089 D. spenceri Las Bocas/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL090 D. mojavensis Punta Onah/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL091 D. mojavensis El Choyudo/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL092 D. hydei Las Bocas/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL093 D. hydei Punta Onah/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL094 D. hydei El Choyudo/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL095 D. arizonae Las Bocas/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL096 D. arizonae El Choyudo/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL097 D. mojavensis Las Bocas/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL098 D. mojavensis Punta Onah/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL099 D. aldrichi Las Bocas/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL100 D. buzzatii Guaritas/Brasil Ruiz et al./ 1995
GAL101 D. buzzatii Trinkey/Australia Barker/1977
GAL102 D. buzzatii Mazán/Argentina Ruiz et al. /1982
GAL103 D. buzzatii Wari/Peru Fontdevila/1980
GAL104 D. buzzatii Quilmes/Argentina Ruiz et al. /1982
GAL105 D. buzzatii Ticucho/Argentina Hasson /1986
GAL106 D. buzzatii Otamendi/Argentina Ruiz et al. /1982
GAL107 D. buzzatii Carboneras/España Fontdevila et al. /1981
GAL108 D. buzzatii Carboneras/España Fontdevila et al. /1981
GAL109 D. buzzatii Sardinia/Italia Gompel/ 2006
GAL110 D. buzzatii Carboneras/España Fontdevila et al. /1981
GAL111 D. buzzatii Carboneras/España Fontdevila et al. /1981
GAL116 D. eremophila Punta Tecolote/Méjico Etges/2000
GAL117 D. pegasa Zapotitlan/Méjico Etges/2002
GAL118 D. fulvimacula Los Tuxtlas/Méjico Etges/2001
12
GAL119 D. desertorum Big Bend NP/U.S.A. Etges/2005
GAL120 D. spenceri Infiernillo/Méjico Etges/1998
GAL121 D. huichole Zapotitlan/Méjico Etges/2002
GAL122 D. bifurca Punta/Méjico Etges/2000
GAL123 D. leonis Ixtlan del Rio/Méjico Etges/2000
GAL124 D. mainlandi Catalina Island/U.S.A. Counteman/2004
GAL125 D. hexastigma Zapotitlan/Méjico Etges/2000
GAL126 D. nigricruria Las Bocas/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL127 D. mettleri El Choyudo/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL128 D. acanthoptera Huatulco/Méjico Etges/2002
GAL129 D. wassermani Infiernillo/Méjico Etges/1998
GAL130 D. nannoptera Joluxtla/Méjico Etges/2000
GAL131 D. racemova El Tecolo/Méjico Etges/2000
GAL135 D. aldrichi Punta Onah/Méjico Ruiz et al./ 2009
GAL137 D. nigrohydei Nayón/Ecuador Acurio et al. 2009
GAL138 D. guayllabambae Nayón /Ecuador Acurio et al. 2009
GAL139 D. longicornis Guayllabamba/Ecuador Acurio et al. 2009
TOTAL 49 especies 98 muestras
2. Diseño de cebadores
Los cebadores, que se denominaron G5 y G6 fueron diseñados a partir del
alineamiento de las secuencias más conservadas de la transposasa en las subfamilias C
y D de Galileo en D. mojavensis. Para esto, se utilizaron las copias casi completas de
Galileo en el genoma de D. mojavensis reportadas por Marzo et al. (2008): la secuencia
BK006357 localizada en el contig 10758.1 (Grupo C) y la secuencia BK006358
localizada en el contig 9930 (Grupo D). Se esperaba que estos cebadores amplifiquen
un fragmento de alrededor de 450bp del ORF que codifica la transposasa (Figura 3,
Tabla 2).
13
Figura 3. Esquema que denota la estructura de Galileo y el fragmento de interés. En
rojo se muestran los cebadores utilizados.
Tabla 2. Cebadores utilizados en este estudio.
Primers Secuencia (5'-3') Longitud (bp)
G5 TGCACCGCATCTWGTWAAATCC 22
G6 AAATAATCACGCATTTCCWGAAG 23
3. Extracción del DNA genómico
La extracción del DNA genómico se realizó a partir de un solo individuo
conservado en etanol. Se utilizó la técnica de extracción con Bromuro de
Hexadeciltrimetilamonio (CTAB). El espécimen fue homogenizado con una varilla
estéril de polipropileno, a este homogenato se agregó 700 µl de buffer CTAB a 60°C y
se incubó durante 1 hora a la misma temperatura. Se agregó 600 µl de
cloroformo/isoamílico y se mezcló por 5 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó
a 13.000 revoluciones por minuto (rpm) durante 5 minutos y se recogió el sobrenadante
al que se le agregó igual volumen de isopropanol frío y se mezcló por inmersión para
la precipitación del DNA. Se recuperó el pellet centrifugando a 13.000 rpm durante 5
minutos y se descartó el líquido. El pellet obtenido se lavó con 300 µl de etanol al 70%
y se centrifugó nuevamente a 13.000 rpm durante 5 minutos, se descartó el etanol y se
14
secó cuidadosamente el pellet al vacío. Finalmente se disolvió el pellet en 50 µl de agua
MQ estéril. Para determinar la cantidad y la calidad del DNA extraído se realizaron dos
reacciones de PCR con los cebadores correspondientes a los genes Cox I y Gapdh. Los
productos de la amplificación se corrieron en un gel de agarosa al 0.7% y tinción de
bromuro de etidio.
4. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La preparación de la mezcla para la reacción de PCR fue realizada con las
cantidades detalladas en la Tabla 3. Se utilizó la Taq Polimerasa de Roche Applied
Science. Las condiciones utilizadas en el termociclador MJ Mini BIO-Rad® de Bio-
Rad Laboratories, Inc. fueron optimizadas para la secuencia de interés (Tabla 4).
Tabla 3. Cantidades utilizadas en cada reacción de PCR.
Cantidades/reacción
H2O 22,2 µl
Buffer 10X 3 µl
dNTPs 2mM 0,6 µl
Primer 5 10 mM 1 µl
Primer 6 10 mM 1 µl
Taq Pol. 5u/µl 0,2 µl
DNA 2 µl
Total 30 µl
Tabla 4. Programa utilizado en el termiclador para la PCR.
Fase Temperatura Tiempo
Denaturación inicial 95 °C 4 minutos
35
ciclos
Denaturación 95°C 30 segundos
Anillamiento 53°C 30 segundos
Extension 72°C 30 segundos
Extensión final 72°C 7 minutos
15
5. Visualización del fragmento obtenido
Se cargaron 10 µl del producto de PCR más 2µl de marcador de peso molecular
(Ladder 1 Kb plus de INVITROGEN®) en un gel de agarosa con una concentración de
0,7%. Para la migración electroforética se utilizó Tampón TAE 1X (Tris Acético 40
mM y EDTA 1mM), el voltaje utilizado varió de 70-90 voltios de acuerdo a la
extensión del gel. Para la tinción, los geles fueron sometidos a una solución de Bromuro
de Etidio a una concentración 0,5 µg/ml y radiación ultravioleta. Fotografías de los
geles fueron captadas utilizando el programa Alpha Digidoc RT©.
El producto de PCR fue purificado con el kit NucleoSpin® Extract II de Clontech
Laboratories, Inc. con tecnogía de columnas con membranas de silice.
6. Clonación del producto de PCR
Para la clonación del fragmento de interés se siguieron los protocolos de:
1. El vector sintético pGEM Easy® de Promega
2. Kit Strataclone® de Stratagene
1. Para la reacción de ligación con el vector pGEM Easy ® se utilizó 5µl de T4 DNA
ligasa, 1µl de pGEM vector (50 ng), 3 µl de producto de PCR y 1 µl T4 DNA
ligasa. Para lograr un mayor número de transformaciones, la reacción fue incubada
durante toda la noche. Las cantidades utilizadas para la preparación de placas LB-
Ampicilina-Xgal-IPTG y medio SOC se encuentran resumidas en la Tabla 5.
Para preparar las células competentes se siguió el protocolo de Sambrook & Russel
(2001). Se colocaron en agitación 50 µl de cultivo de E. coli DHSα F' y 50 µl de medio
16
LB (Tabla 5) durante 4 horas a 37°C de temperatura, luego 10 µl de este cultivo fue
colocado en hielo durante 20 minutos, se centrifugó durante 10 minutos a 4000 RPM a
4°C de temperatura, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el pellet con 2 µl de
0,1 M CaCl2 a 4°C, se volvió a centrifugar durante 10 minutos a 4000 RPM a 4°C,
volvió a eliminar el sobrenadante y se resuspendió el pellet con 0.4µl de 0,1 M CaCl2.
Las células competentes se mantuvieron a 4°C hasta su transformación.
Para la transformación usando el vector pGEM se colocaban 50µl de la reacción de
ligación en las células competentes y luego se sometían a un choque térmico (90
segundos a 42º C) para incorporar el vector con el inserto, se agregaba 950 µl de medio
SOC y se incubaba una hora y media a 37°C, luego se colocaban 150 µl del cultivo
transformado en placas de LB –Ampicilina-IPTG- Xgal se incubaba a 37°C durante
toda la noche.
Tabla 5. Cantidades y componentes usados en la preparación de placas de
incubación y medio SOC.
Placa de incubación (unidad)
Medio SOC 1000 µl
Agar LB 25 µl SOC 970 µl
Ampicilina 50µg/ml 25 µl Mg 2+ 10 µl
X-Gal 20 µg/ml 25 µl Glucosa 10 µl
IPTG 12,5 µl H2O 10 µl
Debido a que este kit permite una diferenciación por color de las células transformadas
se seleccionaron 4-6 colonias blancas de cada placa y se realizó una reamplificación
del fragmento con los primer SP6 y T7. Las condiciones del termociclador se
encuentran detalladas en la Tabla 4.
17
2. Para la ligación con el kit Strataclone de Stratagene® se utilizaron 3µl de Cloning
Buffer, 2µl de producto de PCR, 1 µl de vector Ampicilina/Kanamicina, este kit
viene con células competentes incluidas. Para su transformación las células
competentes eran sometidas a un choque térmico. Se utilizó 1 µl de la reacción de
ligación y se incubaba con medio LB a 37°C durante 1 hora. 100µl de la reacción
de transformación se colocaban en placas de LB-Ampicilina-Xgal y eran incubadas
durante toda la noche a 37°C. Al día siguiente se seleccionaban 4 a 6 colonias
blancas y se realizaba una PCR para reamplificar el fragmento con los cebadores T6
y T7. En el termociclador se utilizaron las condiciones de la Tabla 4.
Para visualizar el fragmento clonado se cargaron 10 µl del producto de PCR
resultado de la clonación más 2 µl de tampón de carga en un gel de agarosa al 0,7%, la
tinción se realizó con bromuro de etidio. Los clones obtenidos de cada muestra tenían el
mismo tamaño por lo que un solo clon fue seleccionado por cada muestra. Luego de ser
limpiado el producto de PCR resultado de la clonación fue enviado al servicio de
secuenciación de Macrogen en Corea del Sur (www.macrogen.com).
7. Análisis de las secuencias amplificadas
Los cromatogramas de las secuencias Galileo fueron editados con el programa
Geneious© V 5.0 (Drummond et al. 2010). Las secuencias de los cebadores y el vector
de clonación fueron eliminadas de las muestras. Para comprobar la identidad de las
secuencias amplificadas se realizó un Megablast (Zhang et al. 2000), que muestra sólo
resultados que alcancen un alto grado de similaridad, contra la colección de nucleótidos
no redundantes (nr) de la base de datos del NCBI. Para la identidad de las secuencias se
18
estableció un umbral de e-30 para el valor E con un porcentaje de identidad nucleotídica
superior al 70%. Las copias incompletas de Galileo C, D y F (BK006358 Contig 10369)
reportadas en el genoma de D. mojavensis (Marzo et al. 2008) fueron utilizadas en la
construcción de la filogenia.
Las secuencias fueron alineadas con el programa MUSCLE 3.5 (Edgar 2004). Este
programa consiguio un alineamiento óptimo y permitio el uso de la información
generada por los gaps originados por la naturaleza de las secuencias. Las inserciones
encontradas en las muestras GAL001/aldrichi, GAL025/wheeleri, GAL135/aldrichi y
GAL033/mojavensis fueron eliminadas antes de ser alineadas para la construcción de la
filogenia.
La secuencia casi-completa de Galileo reportada en D. virilis (Figura 1) por Marzo
et al. (2008) fue utilizada como grupo externo (outgroup) en la filogenia. Esta
secuencia tiene el número de acceso BK006359 en GenBank y está localizada en el
conting 16409.
8. Construcción de la filogenia
Para la construcción de la filogenia se utilizó el método de Inferencia Bayesiana.
Este método nos permitió evaluar la sensibilidad de la topología del árbol filogenético a
los métodos de análisis utilizando el algoritmo Markov-Monte Carlo (MCMC) con el
programa MrBayes 3.0 (Huelsenbeck & Ronquist 2001). Cuatro búsquedas de cadenas
que incluían 1 cadena cold y 3 cadenas hot fueron programadas en el computador, cada
cadena permitía correr 2.000.000 generaciones. Los árboles generados se conservaban
cada 200 generaciones y las primeras 300.000 generaciones eran descartadas para
19
asegurar que se había alcanzado un valor estable de la verosimilitud. Un consenso
estricto de árboles remanentes en este proceso fue computado y la probabilidad a
posteriori para cada nodo fue estimada para tener robustez en cada selección. Los
clados obtenidos fueron considerados robustos cuando alcanzaban un valor de la
probabilidad Bayesiana posterior > 95%.
También se utilizó el método de Maximum Likelihood para elaborar árboles
filogenéticos realizados con PhyML (Guindon et al. 2005) implementado en Geneious
5.0. Las distancias moleculares fueron estimadas por el modelo de sustitución K80 de
Kimura para utilizar la información generada por deleciones/inserciones en las
secuencias. Para conocer el soporte estadístico de cada nodo en el árbol se calcularon
los valores bootstrap basados en 100 replicas con un umbral bootstrap >70%.
20
III. RESULTADOS
1. Amplificación por PCR de las copias de Galileo
Las secuencias de Galileo fueron amplificadas en 51 muestras de 16 especies del
grupo repleta (Tabla 6, Figura 7). No se detectó Galileo en 47 muestras de 35 especies
(Tabla 7). Para la comparación de los datos obtenidos se utilizó la clasificación
taxonómica de las especies del grupo repleta basada en los trabajos de Durando et al.
2000, Moran & Fontdevila 2005, O'Grady et al. 2002, Oliveira et al. 2003, Oliveira et
al. 2005, Ruiz et al. 1990, Spicer & Pitnick 1996, Vilela 1983 y Wasserman 1992.
Dentro del grupo repleta se pudo amplificar Galileo en dos de los cuatro subgrupos
muestreados (mulleri y repleta). En el subgrupo mulleri se obtuvieron resultados
positivos en los 5 complejos de especies, en el complejo buzzatii amplificaron 6
especies (D. borborema, D. buzzatii, D. koepferae, D. richardsoni, D. stalkeri y D.
martensis), en el complejo longicornis 4 especies (D. desertorum, D. longicornis, D.
mainlandi y D. hamatofila), en el complejo mojavensis 2 especies (D. arizonae y D.
mojavensis) y en el complejo mulleri 3 especies (D. aldrichi, D. mulleri y D. wheeleri).
Sólo amplificó una especie del subgrupo repleta, D. fulvimacula, perteneciente al
complejo fulvimacula.
En contraste los subgrupos mercatorum y hydei no dieron resultados positivos en la
amplificación. Tampoco se obtuvo amplificación en las 4 especies del grupo
nannoptera ni en la muestra del grupo virilis. La divergencia de Galileo en D. virilis
pudo haber sido la causa por la que los cebadores no amplificaron esta secuencia por
PCR.
21
En general se puede observar un patrón claramente distinguible de la amplificación de
la transposasa de Galileo dentro de las especies del subgrupo mulleri. En concordancia
con la historia evolutiva de la filogenia de las especies (Figura 7), la invasión de Galileo
en este linaje pudo haber sucedido como un evento único en la especie ancestral del
subgrupo mulleri. La amplificación de dos muestras de D. fulvimacula que pertenece al
subgrupo repleta extienden la distribución de Galileo a este subgrupo, sin embargo
esta secuencia comparte sólo el 77,7% de identidad nucleotídica con las demás
secuencias lo que podría sugerir que se trata de un tipo diferente de Galileo.
Tabla 6. Especies que dieron un resultado positivo para la amplificación de Galileo. El
tamaño de los fragmentos incluye los cebadores G5 y G6. El asterisco indica que el
fragmento tiene un ORF de longitud completa.
Especie Código Tamaño (bp)
Grupo repleta
Subgrupo mulleri
Complejo buzzatii
Cluster buzzatii D. borborema GAL041 378
D. buzzatii GAL012 343
D. buzzatii GAL100 344
D. buzzatii GAL101 340
D. buzzatii GAL102 426*
D. buzzatii GAL103 426*
D. buzzatii GAL104 426*
D. buzzatii GAL105 340
D. buzzatii GAL106 307
D. buzzatii GAL107 426*
D. buzzatii GAL108 426*
D. buzzatii GAL109 426
D. buzzatii GAL110 426*
D. buzzatii GAL111 339
D. koepferae GAL005 369
Cluster martensis D. martensis GAL007 429
Cluster stalkeri D. richardsoni GAL045 426*
D. stalkeri GAL015 420
Complejo longicornis
Cluster ritae D. desertorum GAL119 426
Cluster longicornis D. longicornis GAL043 757
22
D. mainlandi GAL124 423
D. hamatofila GAL052 426*
Complejo mulleri
Cluster mojavensis D. arizonae GAL002 427
D. arizonae GAL003 425
D. arizonae GAL024 426*
D. arizonae GAL026 426*
D. arizonae GAL028 425
D. arizonae GAL029 426*
D. arizonae GAL095 426*
D. arizonae GAL096 427
D. mojavensis GAL009 426*
D. mojavensis GAL023 426*
D. mojavensis GAL031 428
D. mojavensis GAL033 578
D. mojavensis GAL034 426*
D. mojavensis GAL035 426*
D. mojavensis GAL037 434
D. mojavensis GAL090 426*
D. mojavensis GAL091 434
D. mojavensis GAL097 426*
D. mojavensis GAL098 426*
Cluster mulleri D. aldrichi GAL001 722
D. aldrichi GAL032 401
D. aldrichi GAL036 401
D. aldrichi GAL099 401
D. aldrichi GAL135 426
D. mulleri GAL010 741
D. wheeleri GAL025 437
D. wheeleri GAL027 426
Subgrupo repleta
Complejo fulvimacula D. fulvimacula GAL042 426
D. fulvimacula GAL118 426
TOTAL 16 especies 51 muestras
Tabla 7. Especies que no amplificaron Galileo con los cebadores G5 y G6.
Especie Código
Grupo repleta
Subgrupo hydei
Complejo bifurca D. bifurca GAL122
D. nigrohydei GAL137
D. guayllabambae GAL138
Complejo hydei D. hydei GAL044
23
D. hydei GAL092
D. hydei GAL093
D. hydei GAL094
Subgrupo mercatorum
D. mercatorum GAL008
D. mercatorum GAL039
D. mercatorum GAL058
D. mercatorum GAL059
D. paranaensis GAL054
D. peninsularis GAL055
Subgrupo mulleri
Complejo anceps
Cluster anceps D. anceps GAL040
D. leonis GAL123
D. nigrospiracula GAL084
Complejo buzzatii
Cluster martensis D. starmeri GAL016
D. uniseta GAL018
D. venezolana GAL020
Complejo eremophila
Cluster eremophila D. eremophila GAL085
D. eremophila GAL116
Complejo longicornis
Cluster longicornis D. longicornis GAL139
Cluster ritae D. ritae GAL047
Cluster huckinsi D. huckinsi GAL088
D. huichole GAL121
Sin cluster D. hexastigma GAL053
D. hexastigma GAL125
D. spenceri GAL089
D. spenceri GAL120
Complejo meridiana D. meridiana GAL056
D. pegasa GAL117
Complejo mojavensis
Cluster mojavensis D. navojoa GAL030
D. navojoa GAL086
Complejo anceps
Sin cluster D. leonis GAL123
D. nigrospiracula GAL084
Complejo mulleri
24
Subcluster mayaguana D. mayaguana GAL011
D. straubae GAL046
Complejo eremophila D. mettleri GAL038
D. mettleri GAL127
Sin complejo D. nigricruria GAL126
D. racemova GAL131
Subgrupo repleta
Complejo repleta D. repleta GAL022
D. neorepleta GAL057
Grupo nannoptera D. pachea GAL082
D. pachea GAL083
D. nannoptera GAL130
D. acanthoptera GAL128
D. wassermani GAL129
Grupo virilis
Complejo virilis D. virilis GAL019
Total 35 especies 47 muestras
25
Figura 7. Filogenia de las especies de Drosophila del grupo repleta (Oliveira, en
preparación). Las figuras cuadradas indican las especies utilizadas en este estudio, azules
para amplificación positiva y rojas para amplificación negativa. La estrella muestra el
posible punto de invasión de Galileo en el linaje del grupo repleta.
26
2. Identidad de las secuencias amplificadas
Como resultado del Megablast realizado con cada una de las secuencias
amplificadas contra la base de datos del NCBI se obtuvieron valores altamente
significativos de similaridad con las secuencias BK006357 (5989 bp) y BK006358
(6576 bp) correspondientes a copias de Galileo halladas en el genoma de D.
mojavensis (Marzo et al.2008) (Tabla 8). El alineamiento de las secuencias (Figura
4) permitió la localización de fragmentos insertados y evidenció la degradación de
algunas copias que mostraban deleciones y pequeñas duplicaciones.
Encontramos que 20 secuencias tienen un ORF que se puede traducir
completamente a proteína, sin codones stop ni alteraciones del cambio en la pauta
de lectura de la región amplificada de la transposasa de Galileo (Figura 5)
sugiriendo que podrían ser copias autónomas. En cambio 31 secuencias
amplificadas son copias defectivas.
Mediante un alineamiento de las 20 secuencias protéicas y las copias de
Galileo C, D y F reportadas por Marzo et al. (2008) en el genoma de D. mojavensis,
se pudo comprobar que la transposasas amplificadas tiene segmentos altamente
conservados y que los fragmentos de las transposasas amplificadas en este estudio
contienen el aminoácido D677 (Figura 5), que forma parte de la firma molecular de
diferentes tipos de transposasas.
27
Tabla 8. Resultados del mejor alineamiento posible (best hit) encontrado en la base
de datos del NCBI realizado con cada una de las secuencias obtenidas en especies
del grupo repleta de Drosophila.
Muestra E- Value D. mojavensis TE Galileo
Nombre Identidad
GAL001/D. aldrichi 1.32e-105 BK006357 89.0%
GAL002/D. arizonae 3.06e-164 BK006357 95.4%
GAL003/D. arizonae 5.12e-157 BK006357 93.4%
GAL005/D. koepferae 8.23e-60 BK006357 86.0%
GAL007/D. martensis 2.07e-81 BK006357 82.8%
GAL009/D. mojavensis 8.36e-175 BK006358 97.0%
GAL010/D. mulleri 6.84e-136 BK006357 90.6%
GAL012/D. buzzatii 1.18e-63 BK006357 79.2%
GAL015/D. stalkeri 1.63e-88 BK006358 79.4%
GAL023/D. mojavensis 0 BK006357 100.0%
GAL024/D. arizonae 6.51e-171 BK006357 96.5%
GAL025/D. wheeleri 2.89e-112 BK006357 90.3%
GAL026/D. arizonae 8.30e-180 BK006358 97.8%
GAL027/D. wheeleri 4.24e-133 BK006357 88.8%
GAL028/D. arizonae 1.10e-158 BK006357 93.7%
GAL029/D. arizonae 3.86e-178 BK006358 97.6%
GAL031/D. mojavensis 1.10e-168 BK006358 95.1%
GAL032/D. aldrichi 2.42e-95 BK006357 84.7%
GAL033/D. mojavensis 3.17e-31 BK006357 93.8%
GAL034/D. mojavensis 0 BK006358 98.1%
GAL035/D. mojavensis 8.30e-180 BK006358 97.8%
GAL036/D. aldrichi 2.42e-95 BK006357 84.7%
GAL037/D. mojavensis 1.10e-178 BK006358 96.4%
GAL041/D. borborema 4.00e-48 BK006357 78.7%
GAL042/D. fulvimacula 4.32e-98 BK006357 84.7%
GAL043/D. longicornis 3.16e-139 BK006357 90.6%
GAL045/D. richardsoni 3.51e-64 BK006358 79.9%
GAL052/D. hamatofila 1.47e-137 BK006357 90.3%
GAL090/D. mojavensis 8.91e-130 BK006358 89.4%
GAL091/D. mojavensis 2.36e-180 BK006358 96.7%
GAL095/D. arizonae 8.30e-180 BK006359 97.8%
GAL096/D. arizonae 1.81e-171 BK006358 96.5%
GAL097/D. mojavensis 0 BK006358 99.2%
GAL098/D. mojavensis 8.30e-180 BK006358 97.8%
GAL099/D. aldrichi 2.42e-95 BK006357 84.7%
GAL100/D. buzzatii 2.15e-60 BK006357 78.2%
GAL101/D. buzzatii 1.10e-57 BK006357 77.5%
GAL102/D. buzzatii 9.43e-90 BK006358 83.2%
GAL103/D. buzzatii 4.32e-98 BK006358 84.6%
GAL104/D. buzzatii 9.36e-95 BK006358 83.9%
GAL105/D. buzzatii 1.10e-57 BK006357 77.5%
GAL106/D. buzzatii 4.97e-36 BK006357 71.6%
28
GAL107/D. buzzatii 9.43e-90 BK006358 83.2%
GAL108/D. buzzatii 2.00e-101 BK006358 85.0%
GAL109/D. buzzatii 4.32e-98 BK006358 84.5%
GAL110/D. buzzatii 2.01e-96 BK006358 84.3%
GAL111/D. buzzatii 6.90e-54 BK006357 76.8%
GAL118/D. fulvimacula 4.32e-98 BK006357 84.7%
GAL119/D. desertorum 3.27e-114 BK006357 86.8%
GAL124/D. mainlandi 1.94e-116 BK006358 87.2%
GAL135/D. aldrichi 2.29e-114 BK006358 90.2%
TOTAL 51 muestras
29
Figura 4. Parte del alineamiento de las 52 secuencias utilizadas en este estudio. Cambios a nivel nucleotídico e inserciones se
muestran con diferentes colores, las líneas entrecortadas muestran deleciones.
30
Figura 5. Alineamiento proteico de las 20 secuencias amplificadas de la transposasa de Galileo y las secuencias C, D y F. En la
parte superior, se encuentra la secuencia consenso. Los segmentos más conservados están enmarcados en un recuadro de color
negro, la estrella de color rojo indica la localización del aminoácido en el dominio catalítico D677.
31
Cuatro muestras contenían inserciones de tamaño considerable,
GAL001/aldrichi contenía una inserción de 308 nucleótidos, GAL025/wheeleri y
GAL135/aldrichi contenían una inserción de 327 nucleótidos y GAL033/mojavensis
contenía una inserción de 227 nucleótidos (Figura 6). Se utizaron varias
herramientas bioinformáticas como Megablast y Repeat Masker pero no se
obtuvieron resultados significativos que permitan conocer la identidad de estas
secuencias. Sin embargo, los insertos se categorizaron como tipo I en las secuencias
GAL001/aldrichi, GAL025/wheeleri y GAL135/aldrichi por compartir entre ellas
una identidad nucleotídica del 96% y encontrarse en la misma posición dentro de las
secuencias. La inserción en la secuencia GAL033/mojavensis comparte sólo el 47%
de identidad nucleotídica con las otras tres inserciones encontradas por lo que
clasificó como tipo II.
Figura 6. Diagrama que muestra la posición y longitud de las inserciones. En
celeste, las secuencias de Galileo. En verde inserción de tipo I y en violeta la
inserción tipo II.
32
3. Relaciones filogenéticas
Los árboles obtenidos mediante Inferencia Bayesiana y Maximum
Likelihood tienen escencialmente la misma topología. La Figura 8 muestra el árbol
construido con 51 secuencias de Galileo en el grupo repleta, la secuencia de D. virilis
como outgroup y las secuencias C, D y F de D. mojavensis
En general la filogenia concuerda con el árbol filogenético de las especies
del grupo repleta (Figura 7). Por ejemplo se observan grupos monofiléticos a nivel de
complejos de especie como el que forman las muestras de las especies D. buzzatii, D.
borborema, D. stalkeri y D. richarsoni (complejo buzzatii), el grupo monofilético formado
por D. longicornis, D. mainlandi y D. hamatofila (complejo longicornis) y el grupo
monofilético formado por las dos muestras de D. fulvimacula, que pertenece a un subgrupo
diferente de las demás muestras (subgrupo repleta). Algunas discordancias se dan a nivel
de especies como las muestras de Galileo en D. arizonae y D. mojavensis (complejo
mojavensis) que se entremezclan en la filogenia. La especie D. desertorum se situa distante
de su complejo de especies, esto podría ser explicado por discordancias que existen en
torno a su clasificación dentro del complejo longicornis (Oliveira et al. 2005).
En la Figura 7 se puede apreciar también las diferencias intraespecíficas en relación al tipo
de Galileo que se amplificó en el genoma de cada especie, copias de Galileo tipo C y D
fueron encontradas en el genoma de D. mojavensis, otro caso es el de D. fulvimacula que
tiene copias de Galileo más similares a la de D. mojavensis de tipo F. Por la formación de
grupos monofiléticos se pueden distinguir tipos diferentes de Galileo en el genoma de la
misma especie como en D. mojavensis y 3 grupos diferentes en D. buzzatii. Las muestras
que fueron editadas por contener las inserciones de tipo I y II aparecen separadas de los
33
clusters de especie a los que pertenecen y se grupan de acuerdo al tipo de inserción, de tipo
I Gal001/aldrichi, Gal135/aldrichi y Gal025/wheeleri y de tipo II Gal033/mojavensis.
Figura 8. Árbol obtenido mediante Inferencia Bayesiana de las transposasas de Galileo en
el grupo repleta de Drosophila. Los números indican el valor bootstrap de Maximun
likelihood y la probabilidad posterior de un clado asociado. Los colores denotan diferentes
subgrupos de especies.
34
V. DISCUSIÓN
1. Galileo en el grupo de especies repleta
Previamente se había determinado que cuatro subfamilias del elemento
transponible Galileo se encontraban en el genoma de D. mojavensis (C, D, E y F) (Marzo
et al. 2008) y tres subfamilias en el genoma de D. buzzatii (Galileo, Kepler y Newton)
(Casals et al. 2005, Delprat et al. 2009). Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que
Galileo es una familia de elementos transponibles con subfamilias o grupos diferenciados.
Al igual que en la filogenia de las especies del grupo repleta (Durando et al., 2000) y
conclusiones de análisis citológicos (Ruiz & Wasserman, 1993), en la filogenia obtenida
con la transposasa de Galileo, se observa que las 6 especies del complejo buzzatii forman
un grupo monofilético. Las copias amplificadas de Galileo en Drosophila buzzatii forman
grupos monofiléticos diferenciados que muestran una relación filogenética similar a la
encontrada entre Galileo, Kepler y Newton por Casals et al. (2005) con las secuencias de
los TIR. Los elementos Kepler y Newton comparten una identidad nucleotídica del 90%,
sus transposasas no se conocen. Sin embargo la información obtenida en este estudio podría
servir para el diseño de cebadores que ayuden a aclarar la organización estructural de estos
elementos.
El patrón entremezclado observado en las especies D. mojavensis y D. arizonae del
complejo mojavensis es similar al encontrado en filogenias realizadas utilizando genes
mitocondriales y puede deberse a que son especies gemelas de separación reciente que
comparten un polimorfismo ancestral (Reed & Markow 2004, Oliveira et al. 2003). El
tiempo de divergencia estimado entre estas dos especies es de 1,91 a 2,97 millones de años
(Reed et al. 2007). La especie D. desertorum clasificada dentro del cluster ritae del
35
complejo longicornis por similaridades encontradas en caracteres cromosómicos
(Waserman 1992) aparece fuera del complejo en la filogenia obtenida con la transposasa de
Galileo. Este resultado es similar al que muestra la filogenia obtenida por Durando et al.
(2000) en donde esta especie es clasificada fuera del complejo longicornis argumentando
que este no es un complejo monofilético.
La obtención de las secuencias de Galileo en 16 de las 51 especies muestreadas
refleja un patrón observable en la filogenia de las especies, sugiriendo que la adquisición de
Galileo en el genoma de la especie ancestral del subgrupo mulleri fue un evento único.
Posteriormente las secuencias de Galileo han divergido dentro de cada una de las especies,
lo que podría explicar la abundancia de copias que se puede encontrar dentro del genoma
de una especie como fue el caso en D. mojavensis y D. buzzatii. El tiempo mínimo
estimado para la invasión de Galileo en el subgrupo mulleri se puede establecer con el
tiempo de divergencia del subgrupo mulleri, estimado en alrededor de 11 millones de años
(Ruso et al. 1995). La inserción de Galileo en el subgrupo repleta sin embargo no pudo ser
establecida de manera precisa con los datos obtenidos en este estudio. Una hipótesis que se
podría plantear es que la colonización en este subgrupo se llevó a cabo de manera
independiente a la del subgrupo mulleri, lo cual podría explicar las diferencias encontradas
en las secuencias amplificadas de D. fulvimacula.
No se obtuvo amplificación de Galileo en los subgrupos más basales de la filogenia
del grupo repleta como los subgrupos hydei y mercatorum. Dos explicaciones podrían ser
propuestas para estos resultados. En el primer caso la ausencia podría deberse a que la
adquisición de Galileo fue posterior a la divergencia de estos dos subgrupos hace
aproximadamente 22 millones de años (Spicer & Pitnick 1996). En el segundo caso, la
36
ausencia de Galileo podría explicarse por una pérdida estocástica de las copias (Lohe et al.
1995), lo que sería factible si en un período largo de tiempo la tasa de pérdida de
elementos por deriva génica excede la tasa de ganancia de elementos por transposición,
eventualmente no quedarían elementos remanentes en el genoma. La divergencia gradual
en las secuencias ocasionada aleatoriamente por mutaciones podría hacer que los elementos
no puedan ser identificados por PCR o hibridización de ADN. Así, la presencia de Galileo
dentro de las especies del grupo repleta detectada en este estudio podría ser un estimado
conservador tomando en cuenta que un sólo cambio nucleotídico pudo evitar que la
secuencia sea reconocida por los cebadores.
2. Dinámica de Galileo en el grupo repleta
Las relaciones filogenéticas encontradas con la transposasa de Galileo coinciden en
términos amplios con las relaciones filogenéticas obtenidas con las especies del grupo
repleta, lo que nos permite inferir que Galileo tiene una dinámica de diversificación
vertical dentro del linaje del grupo repleta. Esta hipótesis ha sido propuesta para explicar la
la persistencia y emergencia de nuevas especies de elementos L1 en mamíferos (Khan et al.
2006) y la diversificación gradual de elementos Mariner en gramíneas (Feschotte &
Wessler 2002) originados por procesos estocásticos y fundamentados en la teoría neural de
la biodiversidad (Tilman 2004, Venner et al. 2009). Aunque eventos de transferencia
horizontal han sido propuestos como un componente integral del ciclo de vida en los
transposones de clase II como Mariner y Elementos P (Kidwell 1994, Pinsker et al. 2001),
en este estudio no se encontraron evidencias de que Galileo utilice la transferencia
horizontal para su transmisión en el genoma del hospedador.
37
3. La transposasa de Galileo
El alineamiento de las secuencias traducidas mostró la presencia de inserciones,
deleciones y sustituciones que introducen codones de stop o causan cambios en el marco
de lectura. Un 39% de las transposasas amplificadas tenían un ORF de longitud completa.
Así, es probable que en el genoma de las especies del grupo repleta una gran porción de
copias de Galileo contengan transposasas inactivas. Esto ha sido observado también en
transposasas de elementos de clase II como Mariner (Feschotte & Wessler 2002). El
modelo más simple para explicar la abundancia de copias no autónomas se basa en que
podría existir una presión de selección positiva de los elementos inactivos. Esto podría ser
factible gracias a que dichos elementos pueden participar en la regulación del mecanismo
de transposición en al menos dos maneras. Primero, sirviendo como sustrato para la
transposición debido a su necesidad de una transposasa funcional, su multiplicación no
incrementa la cantidad total de transposasa producida (Lohe et al. 1997). Segundo, los
elementos inactivos tienen interferencia directa con la transposasa funcional a través de
competencia por sitios de inserción o por degradación de la transposasa con subunidades
inactivas (Lohe et al. 1996).
Las transposasas de Galileo amplificadas incluyen el primer aminoácido de la firma
molecular DD/E, que se encuentra en diversos tipos de transposasas e intregrasas. Esta
firma consiste en dos residuos de ácido aspártico, típicamente separados por más de 90
aminoácidos, seguida por un residuo de ácido glutámico (Hartl et al. 1997). La firma
molecular DD/E al parecer juega un rol importante en el mecanismo de reacción, que es
parte del sitio activo de la enzima y que sirve como dominio de acoplamiento para el cation
divalente (Mg2 o Mn2) necesario para la catálisis (Richardson et al. 2009). La característica
38
que comparten todas las proteínas que contienen esta firma es su habilidad para realizar
cortes de cadena simple en una molécula duplex de DNA y exponer un extremo 3' hidroxil
que es unido con nucleótidos dispuestos en posición opuesta a las secuencia target que será
reparada por enzimas de la célula hospedadora, creando una duplicación directa,
característica de la inserción de un elemento transponible (Craig 1995).
4. Inserciones encontradas en Galileo
No se pudo determinar con certeza la identidad de las inserciones encontradas en las
secuencias de D. mojavensis, D. aldrichi y D. wheeleri. Sin embargo previamente
elementos ISBu han sido reportados en secuencias de Galileo en D. buzzatii (Casals et al.
2005) y D. mojavensis (Marzo et al. 2008). Los ISBu son Helitrones, un tipo de
transposones de DNA que se replican por un mecanismo de círculo rodante (Kapitonov &
Jurka 2001) y se encuentran ampliamente distribuidos dentro del género Drosophila (Yang
& Barbash 2008). Los helitrones son los únicos transposones conocidos en eucariotas que
se integran en el genoma sin la introducción de TSD. Usualmente la integración de los
helitrones ocurre específicamente entre nucleótidos A y T en la secuencia del hospedador.
Los helitrones no tienen TIR, presentes en otros transposones de DNA, en su lugar han
conservado secuencias TC 5' y CTRR en el extremo 3' (Jurka et al. 2007).
La posición en la filogenia de las muestras GAL001/aldrichi, GAL025/wheeleri,
GAL135/aldrichi y GAL033/mojavensis que contenían insertos podría obedecer a que parte
de la secuencia de Galileo fue delecionada durante el proceso de inserción de una secuencia
exógena.
39
V. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
I. Los resultados obtenidos en este estudio extienden la distribución del elemento
transponible Galileo dentro del grupo de especies repleta de Drosophila. Galileo
está presente en al menos 16 especies de los subgrupos mulleri y repleta.
II. Las relaciones filogenéticas encontradas con la transposasa de Galileo coinciden con
las relaciones filogenéticas obtenidas con las especies del grupo repleta lo que nos
permite inferir que Galileo tiene una dinámica de diversificación vertical dentro del
linaje del grupo repleta.
III. No se obtuvieron evidencias de que Galileo haya utilizado el mecanismo de
Transferencia Horizontal en su distribución dentro del grupo repleta.
El hecho de que Galileo genere inversiones polimórficas por recombinación ectópica
sugiere que este elemento transponible tuvo una contribución importante en la
evolución del género Drosophila. La búsqueda de Galileo en otros grupos de especie
como los grupos willistoni y saltans que tienen un nicho ecológico diferente al grupo
repleta y entre los cuales se encuentran las especies más polimórficas del género
Drosophila es crítica para entender la dinámica y distribución de este elemento
transponible.
40
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45
VII. AGRADECIMIENTOS
Este trabajo no se habría podido realizar sin la colaboración de varias personas que
me han brindado su ayuda, sus conocimientos y su apoyo.
Quiero agradecer en primer lugar a mi familia porque a pesar de la distancia, el
ánimo, apoyo y alegría que me brindan me dan la fortaleza necesaria para seguir adelante.
Quedo especialmente agradecida con mis dos directores de tesis. El Dr. Alfredo
Ruiz que me acogió en su grupo de trabajo y corrigió minuciosamente esta tesina, le
agradezco sinceramente su confianza y todo el apoyo que me ha brindado. Al Dr.
Deodoro Oliveira le agradezco por su paciencia, disponibilidad y generosidad para
compartir sus conocimientos. Sin su ayuda y consejos yo no habría podido realizar este
trabajo.
Mis sinceros agradecimientos para la Dra. Violeta Rafael, la Dra. Laura Arcos
Terán y la Dra. Mar Marzo. Gracias a mis compañeras Nuria Rius y Yolanda Guillen con
quienes compartí gratos momentos durante el trabajo y para la Dra. Alejandra Delprat por
su guía al inicio de este estudio.
Finalmente, quiero agradecer las instituciones que me han apoyado para la
realización de este Máster. A la Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología del Ecuador
SENACYT por haberme concedido la Beca de Fortalecimiento Humano 2009, a la
Universidad Católica del Ecuador y a la Universidad Autónoma de Barcelona.
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