View
10
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
NU
RA
N A
YSU
L (SE
LE
K)
İSTA
NB
UL
ÜNİV
ER
SİTE
Sİ SAĞ
. BİL
. EN
ST.
D
OK
TOR
A T
EZİ
İST
AN
BU
L-2006
DOKTORA TEZİ
NURAN AYSUL (SELEK)
2006
T.C. İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
DANIŞMAN PROF. DR. AYŞEN GARGILI
PARAZİTOLOJİ ANABİLİM DALI
İSTANBUL-2006
NURAN AYSUL (SELEK)
İSTANBUL İLİ KÖPEKLERİNDE BULUNAN BABESİA
TÜRLERİNİN TEŞHİSİNDE MİKROSKOBİK VE PCR-RLB
BULGULARININ KARŞILAŞTIRILMASI
DOKTORA TEZİ
ii
TEZ ONAYI
Aşağıda tanıtımı yapılan tez, jüri tarafından başarılı bulunarak Yüksek lisans / Doktora. Tezi olarak kabul edilmiştir.
/ / Prof.Dr.Emine Kökoğlu Enstitü Müdürü
Kurum : İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Program Adı : Programın seviyesi: Yüksek Lisans ( ) Doktora (X ) Anabilim Dalı : Parazitoloji ABD Tez Sahibi : Nuran AYSUL (Selek) Tez Başlığı : İstanbul İli Köpeklerinde Bulunan Babesia Türlerinin Teşhisinde
Mikroskobik ve PCR-RLB Bulgularının Karşılaştırılması.
Sınav Yeri : Veteriner Fakültesi Parazitoloji ABD. Sınav Tarihi :
Tez Sınav Jürisi 1."Ünvanı Adı Soyadı" 2."Ünvanı Adı Soyadı" 3."Ünvanı Adı Soyadı" 4."Ünvanı Adı Soyadı" 5."Ünvanı Adı Soyadı"
iii
BEYAN
Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlanmasından yazımına
kadar bütün safhalarda etik dışı davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün bilgileri
akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tez çalışmayla elde edilmeyen bütün
bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları da kaynaklar listesine
aldığımı, yine bu tezin çalışılması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal edici
bir davranışımın olmadığı beyan ederim.
NURAN AYSUL (Selek)
iv
İTHAF
Anneme, Babama ve Eşime sevgi ve teşekkürlerimle……
v
TEŞEKKÜR
Doktora eğitimim süresince evinin kapılarını açarak huzurlu bir çalışma ortamı sağladığı, bu tezin her kelimesinde emeği olduğu için, içinden çıkamadığım her sorumu pratik zekası ve sevgisiyle çözdüğü için, en zor anımda, her ‘artık bitti bu tez olmaz’ dediğimde yanımda olduğu için, beni her zaman yüreklendirdiği için, doktora eğitiminin sadece bilimsel çalışma etiğini değil aynı zamanda hayatta karşılaşılan zorluklarla mücadelenin yollarını da öğrettiğini gösterdiği için, öğrenmenin ve bilmenin yarın için en büyük birikim olduğunu öğrettiği için ve hepsinden önemlisi hem gerçek bir abla hem de profesyonel bir hoca olup bana katlandığı için yaşamsal ve bilimsel anlamda bana öğrettikleri için Doktora Danışmanım Prof. Dr. Ayşen GARGILI’ya hocam ve ablam olduğu için teşekkür ederim.
Bu tezin yapılmasında moleküler biyoloji çalışmanın zevkini öğrettiği, bunu uygulama fırsatı verdiği, bilimsel yardımları, imkansızlıklar içinde A.D.Ü Veteriner Fakültesi Parazitoloji A.B.D’da kurduğu Moleküler Biyoloji laboratuarında çalışmama izin verdiği için, paylaşılan başarının önemini öğrettiği için ve dostluğu için sevgili arkadaşım ve II. Tez Danışmanım Doç. Dr. Tülin KARAGENÇ’ e,
Tezimin proje olarak desteklenmesinde ve laboratuar çalışmalarımı yapmamda beni desteklediği için, laboratuar cihaz ve malzemelerini kullanmama izin verdiği için, İstanbul Üniversitesi’nde Doktora yapma ayrıcalığını yaşattığı için Sayın Prof. Dr. Hasan EREN’e
Tez çalışmam süresince bilgi ve tecrübelerini benimle paylaşan laboratuar aşamasını yerinde izleyerek beni onurlandıran Sayın Prof.Dr. Müfit TOPARLAK’a,
Tez izleme komitemde yer alıp, önerileriyle beni yönlendiren Doç.Dr.Mustafa HASÖKSÜZ’e,
Tez çalışmalarım sırasında sıklıkla yapmak zorunda kaldığım şehirlerarası yolculuklarda, izin taleplerimde bana destek olan, iyi niyeti, anlayışlılığı ve alçakgönüllülüğü ile her zaman işlerimi kolaylaştıran İ.Ü. Veteriner Fakültesi Dekanı Sayın Prof.Dr. Muammer Uğur’a,
Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji A.B.D laboratuarlarında çalışma fırsatı verdiği ve bana güvendiği için Sayın Prof.Dr.Kemal ALTAŞ’a,
Değişen ve gelişen dünyayı bir yerinden yakalamam için beni yönlendiren ve moleküler parazitoloji konusunda çalışmam için yüreklendiren Sayın Prof.Dr. Erkut TÜZER’e,
Tezimin istatiksel analizlerinin yapılmasındaki yardımları için Prof. Dr. Halil GÜNEŞ’e,
Tez çalışmalarım süresince rutin laboratuar işlerimdeki yardımları için Dr. Handan ÇETİNKAYA’ya, saha çalışmalarım sırasındaki yardımları için Doç. Dr. Cem VURUŞANER’e ve İ.Ü. Veteriner Fakültesi Parazitoloji A.B.D öğretim elemanlarına,
Materyal topladığım barınaklarda görevli meslektaşlarıma,
Laboratuar çalışmalarımda ve bu tezin oluşmasında verdikleri destek için ADÜ Veteriner Fakültesi Parazitoloji A.B.D elemanları, sevgili arkadaşlarım Serkan BAKIRCI, Murat HOŞGÖR, Hüseyin Bilgin BİLGİÇ, Gülcan KIRLI ve Hakkı ÜNLÜ’ye,
İstanbul’daki Doktora eğitimim boyunca beni evinde ağırlayan, kendi çocuklarından ayırmayarak beni koşulsuz ve karşılıksız seven çok özel insan ve en iyi arkadaşım, kızkardeşim Şule ERGEN’e,
Tez çalışmam süresince fedakarlık yapıp benimle çalışan, ümit ve cesaretiyle beni yüreklendiren sevgili eşim Tbp.Yzb. Dr.Cüneyt AYSUL’a teşekkür ederim.
Bu çalışma Adnan Menderes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından VTF-05016 no’lu proje olarak desteklenmiştir
vi
İÇİNDEKİLER
TEZ ONAYI .................................................................................................................... İİ
BEYAN...........................................................................................................................İİİ
İTHAF............................................................................................................................ İV
TEŞEKKÜR.....................................................................................................................V
İÇİNDEKİLER .............................................................................................................. Vİ
TABLOLAR LİSTESİ................................................................................................... İX
ŞEKİLLER LİSTESİ .......................................................................................................X
SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ ................................................................ Xİ
ÖZET ............................................................................................................................ Xİİ
ABSTRACT.................................................................................................................Xİİİ
1.GİRİŞ VE AMAÇ..........................................................................................................1
2.GENEL BİLGİLER .......................................................................................................4
2.1.Tanım ........................................................................................................................4
2.2.Etyoloji......................................................................................................................4
2.3.Sınıflandırma.............................................................................................................7
2.4.Morfoloji ...................................................................................................................7
2.5.Tarihçe ......................................................................................................................8
2.6.Yaşam Çemberi.........................................................................................................9
2.7.Epizootiyoloj:..........................................................................................................12
2.8.Klinik ve Laboratuar Bulguları ...............................................................................13
2.9.Patogenez ................................................................................................................16
2.9.1.Köpek Babesiosisinin Komplikasyonları...........................................................17
2.9.1.1.Cerebral Babesiosis.......................................................................................17
2.9.1.2.Pıhtılaşma Bozuklukları ................................................................................17
2.9.1.3.Sarılık ve Karaciğer bozuklukları .................................................................18
2.9.1.4.Bağışıklığa bağlı Hemolitik Anemi (IMHA) ................................................18
2.9.1.5.Perakut Babesiosis ........................................................................................18
2.9.1.6.Pulmoner Ödem ............................................................................................18
2.9.1.7.Hemokonsantrasyon (Kırmızı Safra) ............................................................18
2.9.1.8.Şok.................................................................................................................19
vii
2.9.1.9.Organ Yetmezlikleri......................................................................................19
2.10.Bağışıklık ..............................................................................................................19
2.11.Tanı .......................................................................................................................20
2.11.1.Mikroskobik Tanı.............................................................................................21
2.11.2.Serolojik Testler...............................................................................................22
2.11.3.Moleküler Tanı Yöntemleri .............................................................................23
2.11.3.1.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)...........................................................23
2.11.3.2.Hydroethidine-Flow Cytometry (HE-FC)...................................................24
2.11.3.3.PCR-RFLP ..................................................................................................24
2.11.3.4.RLB.............................................................................................................24
2.12.Tedavi ...................................................................................................................28
2.13.Korunma ...............................................................................................................29
3.GEREÇ VE YÖNTEM................................................................................................30
3.1.Saha Çalışması ........................................................................................................30
3.2.Laboratuar Çalışmaları............................................................................................31
3.2.1.Mikroskobik inceleme........................................................................................31
3.2.2.Kan örneklerinin PCR-RLB için hazırlanması ve saklanması...........................31
3.2.3.DNA Ekstraksiyonu ...........................................................................................31
3.2.4.PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu)..................................................................32
3.2.5.PCR Ürünlerinin Görüntülenmesi......................................................................34
3.2.6.Reverse Line Blot Hibridizasyonu:....................................................................35
3.2.6.1.Membranın Hazırlanması ve Sentetik Oligonükleotidlerin Membrana Bağlanması:...............................................................................................................35
3.2.6.2.PCR Ürünlerinin Membrandaki Oligonükleotidlerle Hibridizasyonu: .........36
3.3. Gereç ve Yöntemde kullanılan malzemelerin listesi .............................................39
3.4. İstatistik Analiz ......................................................................................................43
4.BULGULAR................................................................................................................44
4.1.Mikroskobik Bulgular:............................................................................................44
4.2.Theileria / Babesia cinsleri PCR bulguları .............................................................45
4.3.Reverse Line Blot hibridizasyonunundan elde edilen bulgular ..............................47
4.3.1.Laboratuvarda hazırlanan membranın sonucu ...................................................47
4.3.2.TBD-RLB Kit hazır membranından elde edilen sonuçlar: ................................49
5.TARTIŞMA .................................................................................................................53
viii
KAYNAKLAR ...............................................................................................................58
ETİK KURUL KARARI ................................................................................................70
ÖZGEÇMİŞ ....................................................................................................................71
ix
TABLOLAR LİSTESİ
Tablo 3-1. ………………………………………………………………………30
Tablo 3-2. ………………………………………………………………………34
Tablo 3-3. ………………………………………………………………………36
Tablo 3-4. ………………………………………………………………………37
Tablo 4-1………………………………………………………………………..44
Tablo 4-2. ………………………………………………………………………45
Tablo 4-3. ………………………………………………………………………47
Tablo 4-4. ………………………………………………………………………50
Tablo 4-5. ………………………………………………………………………51
Tablo 4-6. ………………………………………………………………………51
x
ŞEKİLLER LİSTESİ
Şekil 2-1. ……………………………………………………………………… ..6
Şekil 2-2. ……………………………………………………………………….11
Şekil 2-6………………………………………………………………………...25
Şekil 2-7………………………………………………………………………...26
Şekil 2-8………………………………………………………………………...27
Şekil 3-3. ……………………………………………………………………….35
Şekil 3-4. ………………………………………….............................................38
Şekil 3-5. ……………………………………………………………………….39
Şekil 4-1. ……………………………………………………………………….45
Şekil 4-2………………………………………………………………………...46
Şekil 4-3. …………………………………………………………….…………46
Şekil 4-4A. ……………………………………………………………………..48
Şekil 4-4B. ……………………………………………………………………..48
Şekil 4-5. ……………………………………………………………………….49
xi
SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ
ALT : Alaninamino Transferaz
ARF : Akut Renal Failure
DIC : Dissemine Intravascular Koagulapathie
DNA : Deoksiribonucleic Acid
dNTP : Deoksinucleotidtrifosphat
ECL : Chemileluminecent, Detection Agent.
ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay
HE-FC: Hydroethidine-Flow Cytometry
IFAT : Indirect Floresan Antibody Test
IMHA : Immun Mediated Hemolitic Anemia
ITS : Internal Transcribed Spacers
PCR : Polymerase Chain Reaction
rDNA : Ribozomal Deoksiribonucleic Acid
RNA : Ribonucleic Acid
RLB : Reverse Line Blotting
RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism
SDS : Sodium Dodecyl Sulphate
SPA : Soluble Parasite Antigen
SSPE : Standard Sodiumfosfat EDTA
ssrRNA: Small Subunit Ribosomal RNA
TAE : Tris-acetate\EDTA
UV : Ultraviolet
xii
ÖZET
Aysul N. İstanbul İli Köpeklerinde Bulunan Babesia Türlerinin Teşhisinde
Mikroskobik ve PCR-RLB Bulgularının Karşılaştırılması. İstanbul Üniversitesi Sağlık
Bilimleri Enstitüsü, Parasitoloji ABD. Doktora Tezi. İstanbul. 2006.
Bu çalışma, İstanbul İli köpeklerinde bulunan Babesia etkenlerinin tür ve alt
türlerinin tespit edilmesi amacıyla yapılmıştır. Bu amaçla 11 farklı barınaktaki ve
Veteriner Fakültesi Kliniklerine getirilen toplam 493 köpekten, Aralık 2004-Haziran
2005 tarihleri arasında kan örnekleri toplandı. Örnekler mikroskobik bakı ve PCR-RLB
yöntemleri ile incelendi.
Mikroskobik inceleme amacıyla her bir hayvandan sürme preparatlar hazırlandı,
Giemsa yöntemi ile boyandı ve x1000 büyütmede incelendi. Mikroskobik inceleme
sonucu 493 örnekten 2 (% 0,4)’ si pozitif bulundu. PCR-RLB yöntemi için kan
örneklerinden DNA izolasyonu yapıldı ve Theileria ve Babesia cinslerinde spesifik olan
bir bölgeyi çoğaltan primerler ile PCR yapıldı. Bu aşama sonucunda 493 örnekten 11
(% 2,2) tanesi pozitif bulundu. RLB aşamasında iki farklı membran kullanıldı. İlk
membran Babesia canis canis, Babesia canis vogeli, Babesia canis rossi ve Babesia
gibsoni spesifik oligonükleotidleri kullanılarak Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner
Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı laboratuarında hazırlandı. Hazırlanan membranla
493 örneğin PCR ürünleri hibridize edildi ve 19 adet (% 3,9) pozitif örnek saptandı.
İkinci olarak, hazır blotlu olan ve ek olarak B.equi olgonükleotidi olan ticari membran
hibridizasyon için kullanıldı ve örnekler tekrar konfirme edildi. Her iki membranla da
yapılan RLB sonucunda 19 adet (% 3,9) pozitif örnek saptandı ve etkenlerin B.canis
vogeli olduğu saptandı. Ek olarak, PCR sonucuna göre negatif olan 8 örnek de RLB ile
pozitif bulundu etkenlerin B. canis vogeli olduğu saptandı.
Sonuç olarak, İstanbul’da kan örneği alınan 493 köpekte % 3,9 oranında B. canis
bulunduğu, alt türünün B. canis vogeli olduğu bulundu. İstanbul’da ilk kez köpeklerde
Babesia taraması yapıldı. Mikroskobik bakı, PCR ve RLB yöntemleri içinde ise
RLB’nin en duyarlı yöntem olduğu saptandı.
Anahtar Kelimeler : Babesia, Köpek, İstanbul, PCR, RLB
Bu çalışma Adnan Menderes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından VTF-05016 no’lu proje olarak desteklenmiştir.
xiii
ABSTRACT
Aysul N. Comparison of microscobic and PCR-RLB findings in detection of
Babesia species of dogs in Istanbul. Istanbul University, Institute of Health Science,
Parasitology Department. PhD Thesis. Istanbul. 2006.
This study was carried out to detect Babesia species and subspecies in Istanbul
dogs. For this aim, a total of 493 blood samples were collected between December
2004-June 2005 from 11 dog shelters and Clinics of Veterinary Faculty. Blood samples
were examined microscopically and with PCR-RLB (Polimerase Chain Reaction,
Reverse Line Blot) assays. For microscobic evaluation thin blood slides prepared from
each dog, stained with Giemsa and examined with x1000 magnification. Two out of the
493 (0.4 %) samples were found to be positive in microscobic evaluation. For PCR-
RLB assay, DNA was extracted from individual samples and initially PCR performed
with the Theileria/Babesia specific primers. According the results of this step, 11
(2.2 %) samples were found to be positive out of 493 samples. For the evaluation of the
samples with RLB, 2 different membranes were used. First membrane was prepared in
Adnan Menderes University Veterinary Faculty Department of Parasitology laboratory
and blotted with Babesia canis canis, Babesia canis vogeli, Babesia canis rossi and
Babesia gibsoni specific oligonucleotides. As a result of hibridization of this membrane
with the PCR products of 493 samples, 19 (3.8 %) of them were found to be positive.
Secondly a commercial membrane, which has already been blotted and have additional
B.equi oligonucleotide, was used for the hybridization and the samples were confirmed.
According to the results of both RLB, 19 (3.8 %) of them were found to be positive for
B.canis vogeli subspecies. Additionally, 8 samples which have been detected as
negative according to the PCR results were found to infected with B.canis vogeli.
Consequently, in this study, Babesia species were screened in İstanbul dogs, out
of 493 samples collected from dogs 19 (3.8 %) were infected with B.canis vogeli.
Among the Microscobic, PCR, RLB techniques RLB was found to be the most
sensitive.
Key Words: Babesia, Dog, Istanbul, PCR, RLB
This study was supported by The Research Support Unit of Adnan Menderes University as the project no VTF-05016.
1. GİRİŞ VE AMAÇ
Evcil hayvanlar içinde insanla ilişkisi en yakın canlılar olan köpeklerin kan
parazitleri, bu hayvanların önemli protozoonlarındandır. Babesia cinsinde bulunan
parazitler, Apikompleksa şubesinde yer ve İxodidae ailesine bağlı keneler tarafından
nakledilirler. Bu cinse bağlı bilinen 100’den fazla Babesia türü vardır. Bunlardan
Babesia canis (büyük Babesia) ve Babesia gibsoni (küçük Babesia) köpeklerde
enfeksiyon oluşturmaktadır (63). Babesia canis’in, B. canis canis, B. canis rossi ve
B. canis vogeli olmak üzere üç alt türü bulunmaktadır (90, 109). Köpeklerde
babesiosisin özellikle tropik, subtropik ve ılıman iklim kuşağında yer alan bölgelerde
yaygın olduğu bilinmektedir. Yapılan literatür taramalarında (40, 45, 57, 87, 110)
Türkiye’de köpeklerde babesiosisin bulunduğu saptanmış, ancak yaygınlığı ile ilgili
kapsamlı bir çalışma bilinmemektedir. Fakat vektörlüğünü yapan kenelerin (özellikle
Rhipicephalus sanguineus) Türkiye’de yaygın olarak bulunması (80), ülkemiz
köpeklerinde babesiosisin özellikle kenelerle karşılaşma riski daha yüksek olan kırsal
alanlarda ve kontrolsüz, sahipsiz köpeklerde yaygın olabileceğini düşündürmektedir.
İstanbul İlinde de babesiosisin köpeklerde yaygınlığı konusunda herhangi bir çalışmaya
rastlanmamıştır.
Babesiosis köpeklerde ateş, hemolitik anemi, hemoglobinuri, trombositopeni,
ikterus ve organlarda fonksiyon bozuklukları ile seyreder (7, 70, 92). Ancak çoğu
zaman kliniklere anemi, ateş ve ikterus belirtileri ile getirilen köpeklerde babesiosis
etkenlerinin kan frotilerinde görülme oranının düşük olması nedeniyle hastaya tanı
koymak mümkün olmamaktadır (3). Köpeklerde farklı Babesia türlerinin oluşturduğu
enfeksiyonların şiddeti, prognozu ve antibabesial ilaçlara verilen cevapların farklı
olmasından dolayı türlerin ve alt türlerinin identifikasyonu önemlidir (9, 74). Alt
türlerin tespit edilmesi gelecekte köpek babesiosisine karşı yapılacak aşı çalışmalarının
geliştirilmesi için de önem arz etmektedir ( 21, 100).
Köpeklerde babesiosisin mikroskobik tanısı, etkenlerin kan frotilerinde görülme
oranının az olması nedeniyle duyarlılığı düşük bir yöntemdir (3). Serolojik tanıda ise
etkenlerin çapraz reaksiyon vermesi ya da yanlış negatif ve pozitif sonuçların alınması
olasılığından dolayı, serolojik yöntemin duyarlılık ve özgünlüğüne göre sonuçlar farklı
2
olabilmektedir (35, 115). Son yıllarda dünyada köpeklerde babesiosis ile ilgili yapılan
çalışmalarda, parazitin DNA’sını bulmayı hedefleyen moleküler tekniklerin kullanımı
artmaktadır (10, 74). Böylece mikroskobik tanıda gözden kaçan olgular ve serolojik
yöntemlerdeki karışıklıkların önüne geçilebilmektedir. Bu amaçla en yaygın kullanılan
tanı yöntemi Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) dur. Ancak miks enfeksiyonlarda, her
etkenin DNA’sı için spesifik primerlerle tekrarlı deneyler yapmak gerekmektedir (41 ).
Bilinen klasik PCR yöntemlerinden sonra araştırıcılar özellikle kene kökenli
hastalıkların hepsini birden aynı anda tespit etmeye yönelmişlerdir (31). Keneler, diğer
artropod vektörler ile kıyaslandığında hastalık etkenlerinin naklinde önemli bir yer
tutmakta ve vektörlüğünü yaptıkları hastalıklar çok geniş bir yelpaze oluşturmaktadır.
Kene kökenli protozoal hastalıklar (babesiosis ve theileriosis) dünya üzerindeki evcil
hayvanlar, insanlar ve diğer yabani hayvanları etkilemektedir. PCR uygulamaları
sayesinde kene kökenli birçok patojenin tespiti yapılabilmesine karşın, birden fazla
patojenin aynı kene tarafından nakledilebilmesi ve bu etkenlerin de aynı anda tek bir
konakta bulunması, hastalık oluşturan tüm bu protozoal etkenlerinin aynı anda teşhisini
ve ayrımını yapabilen yeni ve üniversal bir teste ihtiyaç doğurmuştur. Reverse Line
Blotting (RLB) çok sayıda örneği eş zamanlı olarak birçok oligonükleotid kullanarak
tespit edebilmektedir. RLB ile, farklı türler (Theileria/Babesia sp.’lerin) eş zamanlı
olarak PCR ile amplifiye edilir ve daha sonra da her bir tür için spesifik
oligonükleotidler kullanılarak line-blotterda ayırt edilirler. Bu sebeple RLB, PCR ile
amplifikasyonu takip eden hibridizasyon basamağından oluşmakta ve PCR’ın tek başına
kullanılmasından elde edilen sonuçlarla karşılaştırıldığında 1000 kat daha fazla
sensitiviteye sahiptir. Diğer yandan sonuçların görüntülenmesi için radyoaktif maddeler
yerine kemilüminesans kullanılması da testi yapan insanlar için herhangi bir zararlı etki
oluşturmadığından bu yöntemi daha cazip hale getirmektedir. Aynı zamanda
oligonükleotidleri içeren blotun en az 20 kez tekrar kullanılabilir olması da
kullanıcılarına ekonomik olarak katkıda bulunmaktadır (41, 43).
RLB, ilk defa Streptococci serotiplerinin identifikasyonu için 1994 yılında
Kaufhold ve ark. (55) tarafından uygulanmıştır. RLB ile kenelerle nakledilen Borrelia
spiroketlerinin tanısı ve identifikasyonu ise Rijpkema ve ark. (95) tarafından 1995
yılında yapılmıştır. Bu metot, sığırlarda bilinen bütün Theileria ve Babesia türlerinin
tespiti ve identifikasyonunda, Gubbels ve ark. (43) tarafından 1999 yılında başarılı bir
3
şekilde uygulanmıştır. Daha sonraki yıllarda Ehrlichia/Anaplasma ve Theileria/Babesia
cinsine bağlı 36 adet türün tespit ve ayırımını yapabilen kitler geliştirilmiştir. Georges
ve ark. (41) 2001 yılında aynı anda çok sayıda kan parazitinin sığır kanında varlığını
göstermek amacıyla RLB tekniğini kullanmışlardır.
Theileria/Babesia soyuna bağlı “catchall” PCR aşamasında pozitif olup, tür ve
alt türlere ait spesifik oligolarla hibridize olmayan etkenlerin analizleri ile yeni bir tür ya
da aynı türe ait farklı bir alt türün tespiti açısından öneme sahiptir (43).
RLB, pek çok laboratuarda tanı ve epidemiyolojik çalışmalarda kullanılan
standart bir test halini almıştır. Centeno-Lima ve ark. (21), RLB ile insandaki bir
Babesia divergens vakasınının tespitini yapmış, Nijhof ve ark. (85) RLB ile farklı
Theileria ve Babesia türlerini bulmuştur.
RLB’nin köpeklerde Babesia canis’in alt türlerini ayırt etmede kullanılması ise
ilk kez Matjila ve ark. (75) tarafından 2004 yılında olmuştur.
Bu çalışma ile İstanbul ili köpeklerinde Babesia cinsine ait parazitlerin
varlığının saptanması, tür ve alt türlerinin ayırt edilerek enfekte köpeklerde yayılışının
ortaya konması amaçlanmıştır. Ayrıca çalışmada mikroskobik tanı ile PCR-RLB
testinin hastalığın teşhisindeki duyarlılıkları karşılaştırılacak ve halen dünyada
tartışmaları devam eden (24, 118) köpeklerde diğer küçük piroplazmların (B. equi ve
T. annae) varlığı RLB yönteminin sağladığı avantajla araştırılacaktır.
4
2. GENEL BİLGİLER
2.1.Tanım
Babesiosis, etkeni Babesia cinsindeki protozoonlar olan, evcil ve yabani
omurgalı hayvanlarda görülen, yüksek ateş, intravasküler hemoliz, anemi,
hemoglobinuri ve hemoglobinemi ile karakterize protozoal bir hastalıktır. Bulaşmasında
İxodidae ailesine bağlı keneler rol oynar (12). Köpeklerde babesiosis, Babesia cinsine
ait kan prootozoonlarının neden olduğu kenelerle bulaşan bir hastalıktır (15).
Vektörlerinin yayılışına bağlı olarak tüm dünyada yaygın olarak görülmektedir (92).
Evcil ve yabani köpekgillerde de Babesia cinsine ait türler, bu hayvanların önemli kan
protozoonlarıdır (52).
2.2.Etyoloji
Babesia cinsindeki protozoonlar Apikompleksa şubesinde bulunur. Omurgalı
konaklarında eritrositlerin içine yerleşirler. Morfolojik yapıları ve büyüklükleri diğer
kan parazitlerinden ayrımlarını kolaylaştırır (63). Evcil ve yabani hayvanlarda bilinen
100’den fazla Babesia türünden, B. canis ve B. gibsoni köpeklerde enfeksiyon
oluşturmaktadır (11, 50, 90). Bazı yazarlar B. canis vogeli’yi B. vogeli olarak
köpeklerde babesiosis’e neden olan üçüncü bir tür olarak ele almışlardır (102). Babesia
türleri ışık mikroskobunda görülen yapılarının büyüklüğüne göre sınıflandırılırlar.
Büyüklüğü 1,0µm ile 2,5µm arasında olanlar küçük Babesia’lar, 2,5 µm ile 5,0 µm
arasında olanlar ise büyük Babesia’lar olarak isimlendirilirler (17, 62). Buna göre,
mikroskopta eritrosit içinde görülen 3,0 µm-5,0 µm büyüklüğündeki piroplasmlar son
yıllara kadar B. canis tanısı için yeterli görülmüştür (10). Ancak B. canis’in morfolojik
yapıları aynı olmasına rağmen coğrafik, patojenite, antijenik ve vektör farklılıkları
B. canis canis, B. canis vogeli ve B. canis rossi olmak üzere üç alt türünün olduğunu
göstermiştir (70, 108, 109). Daha sonra moleküler düzeyde yapılan çalışmalar (17, 19,
25, 117), B. canis’in genetik olarak farklı üç alt türü olduğunu göstermiştir.
Patojenitelerinin de farklı olmasının ötesinde B. canis canis ve B. canis rossi’nin in vivo
ve in vitro şartlarda da farklı davrandıkları görülmüştür (101, 109). Yakın zamanda
yapılan bir çalışmada, bir köpekte yeni bir büyük Babesia etkeni bulunmuştur. Bu tür
hem mikroskopta büyük Babesia etkenlerine benzemekte hem de genotip olarak büyük
Babesia’lar grubunda yer almaktadır. Bu veriden sonra araştırmacılar yeni bir
5
sınıflandırma gereğini ortaya atmışlardır (şekil 2-1) (10). Moleküler biyolojideki
ilerlemeler özellikle PCR ile morfolojik olarak ayrımları yapılamayan parazitlerin
genetik olarak ayrılabileceğini göstermiştir. Örneğin yapılan morfolojik ve filogenetik
çalışmalar (59, 60, 117) B. gibsoni’nin köpeklerin tek küçük piroplasmı olmadığını
ortaya koymuştur. Bu çalışmaların sonunda köpeklerin küçük piroplasmlarının da
yeniden sınıflandırılması gereği ortaya çıkmıştır. Sonuç olarak, Asya, İspanya ve
ABD-Kaliforniya eyaleti orijinli köpeklerden elde edilen küçük piroplasmlar ile yapılan
moleküler filogenetik analizlerde (9, 59, 83, 117) küçük Babesia türlerinin genetik
olarak en az üç farklı formunun olduğu, bunların ise üç farklı taksonomik grup içinde
yer aldığı tespit edilmiştir (Şekil 2-1). Bunlar içinde B. gibsoni’nin Asya genotipi ve
ABD-Kaliforniya genotipi Kuzey Amerika’da tespit edilmiştir. Küçük Babesia’lardan
biri de Avrupa’da ilk olarak rapor edilen ve Theileria annae olarak isimlendirilen
İspanya isolatıdır (9, 18, 117). İspanya ve Kaliforniya’da bulunan küçük piroplasmların
epidemiyolojik ve klinik bulgularının farklı olmasından dolayı bu parazitlerden
Kaliforniya’da bulunan tür B. conradae olarak isimlendirilmiştir (58, 59). Ayrıca
İspanya’da bir köpekte B. equi bulunmuştur (25) ancak; bu bulgunun laboratuardaki bir
kontaminasyondan kaynaklanmış olabileceği yazarlar tarafından da ifade edildiği için
varlığı tartışmalıdır.
6
Şekil 2-1: Moleküler filogenetik analiz sonuçlarına göre köpek piroplasmlarının, Theileria/Babesia cinslerindeki sınıflandırılması (10).
7
2.3.Sınıflandırma
Babesia cinsindeki parazitler günümüzde geçerli olan sınıflandırma şekliyle
Apikompleksa şubesinde yer almaktadır (61, 96, 102).
Alem: Animalia
Alt Alem: Protozoa
Şube: Apicomplexa
Sınıf: Sporozoa
Sınıf Altı: Piroplasmia
Takım: Piroplasmida
Aile: Babesiidae
Cins: Babesia
Tür: Babesia canis
Alt Tür: B.c.canis, B.c.vogeli, B.c.rossi
Tür: Babesia gibsoni
2.4.Morfoloji
Babesia cinsindeki protozoonlar büyük babesialar ve küçük babesialar olmak
üzere iki gruba ayrılmaktadır. Köpekleri enfekte eden babesialardan B. canis 4-5 µm
büyüklüğünde olup, büyük grup içerisinde yer alır (62, 63). Sitoplazması vakuollüdür,
tekli piriform (armut şekli) veya merozoitlerin ikiye bölünmesiyle oluşan, 4-5 µm
büyüklüğündeki ikili piriformları veya 2-4 µm büyüklüğündeki ameboid formları vardır
(17, 64, 75). İkili armut formunda parazitler arasında açı vardır. Ameboid formları veya
yüzük formları da görülebilir. Bir eritrosit içerisinde on altı kadar B. canis’e
rastlanabilir (17, 92). Babesia gibsoni ise 1,0 ile 2,5 µm büyüklüğünde olup küçük
Babesia’lardandır. Pleomorfik yapıda, trofozoitleri halka, oval, yüzük formlarda
görülebilir. Parazitin uzun formları da vardır. Bunlar bazen eritrositi baştan sona kuşatır
görüntüdedir (100). Ayrıca B. gibsoni’ de malta haçı formu görülür (60). Babesia
gibsoni’nin ikili armut formu görülmez ve eritrosit içinde genellikle tek olarak bulunur
(22, 64, 115). Trofozoitlerin çoğalması ikiye bölünme ile çiftlerin oluşması veya
şizogoni ile dörde bölünme şeklindedir (62). Yapı ve büyüklüklerindeki farklara dayalı
8
olarak B. canis ve B. gibsoni birbirinden morfolojik olarak ayrılabilirler (8, 22).
Parazitlere bazen akciğer ve karaciğer endotelial hücreleri ile makrofajlar içinde de
rastlanabilir. Bu durum parazitli eritrositlerin fagosite edilmeleri ile
ilişkilendirilmektedir (102). Babesia canis ve B. gibsoni arasındaki önemli farklılıklara
rağmen B. canis’in alt türleri morfolojik olarak birbirlerinden ayırt edilemezler, ayırıcı
tanıları moleküler metotlara dayandırılmak zorundadır. Babesia canis’in üç alt türü
tanımlanmıştır, bunlar, B. canis canis, B. canis vogeli ve B. canis rossi’dir. (8, 24, 59).
2.5.Tarihçe
Babesia cinsindeki protozoonlar ilk kez 1888 yılında Romanya’da Babes
tarafından sığır kanlarında görülmüştür. 1893 yılında Smith ve Kilborne tarafından
Amerika’da sığırlarda Texas Sığır Humması’nın etkeni olarak tanımlanmış ve
Pyrosoma bigenium ismi verilmiş, Boophylus annulatus ile taşındığı ortaya konmuştur.
Bu, aynı zamanda bir protozoonun bir artropod vektör tarafından bulaştırıldığına dair ilk
bulgudur (96, 107).
Dermacentor, Rhipicephalus veya Haemaphysalis keneleri ile bulaşan,
köpeklerin büyük Babesia’ları olan B. canis, ilk kez 1895 yılında İtalya’da Piana ve
Gali-Valerio tarafından Pyrosoma bigenium var. canis adı ile bildirilmiştir. Uilenberg
ve ark. (109)’na göre 1930’lu yıllarda çeşitli araştırıcılar tarafından Avrupa’da
Dermacentor, tropik ve subtropik bölgelerde Rhipicephalus sanguineus ve Afrika’da
Haemaphysalis keneleri ile bulaşan türler arasında çapraz bağışıklık bulunmadığı,
vektörlerinin ve patojenitelerinin farklı olduğu bildirilmiştir. Bunlara bağlı olarak,
R. sanguineus ile bulaşanlar Avrupa’da Dermacentor ile bulaşanlardan ayrı bir tür
olarak gruplandırılmış ve Rhipicephalus ile bulaşan türlerin biraz daha büyük olduğu
öne sürülmüştür (109). Büyük köpek Babesia’ ları B. major olarak adlandırılmış, daha
sonra B. vogeli olarak değiştirilmiştir. Ancak B. vogeli ismi zaman içinde unutulmuş ve
genel kullanıma dahil edilmemiştir (108). Uilenberg ve ark. (109)’na göre 1947 yılında
Neitz ve Steyn, B. canis ve B. rossi arasında belirgin bir farklılık olmadığını, aynı tür
veya alttürler altında bulunmaları gerektiğini bildirmişlerdir. Bu etkenlerin morfolojik
açıdan benzerlik göstermelerine rağmen aralarındaki genetik, antijenik, vektör ve
enzimatik farklılıklara, klinik semptomlarının farklı olmasına, patojenite ve lokalize
oldukları coğrafi dağılım farklılıklarına, kros reaksiyon vermelerine dayanarak,
taksonomik düzeyde B. canis’in trinominal sistemde üç alt türe ayrılması gerektiği
9
önerilmiştir (109). Günümüzde B. canis’in sınıflandırılmasında geçerli olan bu
sistemde, B. canis canis, B. canis rossi, B. canis vogeli alt türleri kullanılmaktadır.
Coğrafik yayılış, patojenite, antijenik yapıları, vektör spesifiteleri ile yapılan çalışmalar
da (46, 47, 67, 101) bu sınıflandırmayı desteklemektedir. Daha sonra yapılan moleküler
düzeydeki çalışmalarla da (17, 19, 24, 116), alt türlerin genetik yapılarının farklı olduğu
ortaya konmuştur. Babesia gibsoni ilk kez 1910 yılında Patton (11) tarafından
Hindistan’da önce tazılarda daha sonra çakallarda bulunmuştur. Son yıllardaki
moleküler çalışmalarda (9, 59, 83, 117) küçük Babesia türlerinin genetik olarak en az üç
farklı formunun olduğu bildirilmiştir Bu formlardan biri Avrupa’da ilk olarak rapor
edilen ve Theileria annae olarak isimlendirilen İspanya isolatıdır (9, 18, 117).
Kaliforniya’da bulunan küçük piroplasmların epidemiyolojik ve klinik bulgularının
farklı olmasının yanında genetik yapılarının da farklı olmasından dolayı bu
parazitlerden Kaliforniya’da bulunan küçük piroplasmlar B. conradae olarak
isimlendirilmiştir (58, 59).
2.6.Yaşam Çemberi
Babesia cinsindeki parazitlerin yaşam çemberi genel olarak birbirine benzer
(Şekil 2-2.). Vektörleri İxodidae ailesindeki kenelerdir. Omurgalı konaktan kan emen
keneler enfekte eritrositle birlikte parazitin merozoitlerini alır. Eritrositler kenenin
barsağında sindirilir ve merozoitler serbest kalır. Serbest kalan merozoitlerin çoğu
barsakta sindirilir ve kalan dayanıklı merozoitler barsak lümeninde uzantılı çıkıntıları
bulunan sert yapılı ray cisimciklerini oluştururlar (77). Bu yapılardan makro ve
mikrogametler oluşur (Babesia türlerinde makro ve mikrogametler birbirine benzer).
Kene kan emdikten sonra gömlek değiştirirken (14-18 gün sonra) gametlerin
birleşmesiyle zigot oluşur. Zigot hareketli olup barsak epitel hücrelerine girer ve kineti
oluşturur. Kinet çoklu bölünerek sporokinetleri oluşturur. Sporokinetler dağılarak
barsak lümenine dökülür. Sporokinetler tekrar epitel hücrelerine girip çoğalmaya devam
edebileceği gibi hemolenf yoluyla tükrük bezi, malpigi kanalları, kas hücreleri ve dişi
kenelerde ovaryumlara gelebilir. Hemolenf ile tükrük bezlerine gelen sporokinetler asini
hücrelerinin içine girer, polimorfik bir yapı alarak, hücrenin ve çekirdeğinin
büyümesine neden olurlar. Kenedeki gelişim çevre sıcaklığına bağlı olup, 28°C’de
gelişimi çok hızlıdır. Enfekte kene kan emerken tükrük bezi asini hücrelerinde bulunan
sporokinetler konağın vücut ısısının etkisiyle 2-3 gün içinde aktive olarak önce
10
sporoblastları daha sonra sporogoniyle ortalama 2µm büyüklüğündeki küresel veya oval
yapıdaki yaklaşık 100,000 adet sporozoiti oluştururlar. Omurgalı konak için enfektif
form sporozoitlerdir (78).
Sporokinetlerin kenenin vücudundaki yayılışı sırasında ovaryuma gelenler
yumurtaları da enfekte ederek yeni neslin enfekte olmasını sağlar. Buna transovarial
geçiş denir ve genellikle tek konaklı kenelerde görülür. İki veya üç konaklı kenelerde
ise transstadial geçiş görülür. Yani kene bir gelişme döneminde aldığı etkeni diğer
gelişme döneminde konağa verir. Örneğin iki konaklı kene larva aşamasında konağa
tutunduğunda, hayvan enfekte ise merozoitleri alarak kene de enfekte olur ve erişkin
safhada tutunduğu ikinci konağa sporozoitleri verir.
Omurgalı konakta sporozoitler direkt olarak eritrositlere giderler. Eritrosit
membranını apikal kompleks organellerinin salgıları ile delen sporozoitler hızla
eritrosite girer. Sporozoit eritrosite girdiğinde, eritrosite ait bir parça ile kaplanmıştır.
Eritrosit içinde önce parazitik vakuolden kurtulur ve sitoplazmada yuvarlak trofozoit
formuna dönüşür. Daha sonra ameboid forma dönüşür ve ikiye bölünerek merozoitleri
(piriform) oluşturur. Oluşan yeni merozoitler eritrositleri parçalayarak serbest kalır ve
yeni eritrositleri enfekte eder. Bu dönemde eritrosit içinde birden fazla merozoit
görülebilir. Bu formlara ikili piriform veya malta haçı denir. Bu durum eritrositin birden
fazla parazitle enfekte olmasından ziyade, arka arkaya oluşan ikiye bölünmenin
sonucudur.
Eritrositlerdeki bu döngü konak tedavi edilene kadar veya ölene kadar süresiz
olarak devam eder. Eritrositik dönemin sayısı dirençli hayvanlarda azalmıştır yada yeni
eritrositlerin enfeksiyonu şekillenmez. Enfeksiyonun bu döneminde parazitler kan nakli
ile başka konaklara geçebilir. Eritrositlerdeki bazı parazitler daha fazla çoğalmazlar ve
kene tarafından alındıklarında gametositleri oluşturmak üzere kalırlar (96, 102).
11
Şekil 2-2: Babesia canis’in yaşam çemberi (77) 1:Kenenin tükrük bezindeki sporozoitler, 2-5: Omurgalı konak eritrositlerindeki merozoitlerin aseksüel olarak çoğalması, (5.1): Kene kan emerken merozoitli eritrositleri de alır, (5.2): Merozoitli eritrositler kene barsağında sindirilir, 6: Eritrosit içinde oluşan gamontlar 7: Kene barsağında oluşan ray cisimcikleri, 8-14: Zigotun oluşumu, 15-18: Kinet (sporokinet) oluşumu, 19-21: Tükrük bezindeki sporokinetler . YS, ES: Çok çekirdekli sporont, SP: Küçük sporontlar, CY, DE: Sindirilmiş eritrositler, DK: Kinetin gelişimi, E: Eritrosit, ES: Sporontun büyümesi, GP: Parazitin büyümesi, HC, NH: Konak hücre çekirdeği, IV: İç vakuol, N: Çekirdek, R: Ray cisimcikleri, SP,T: Dikenimsi çıkıntı.
12
2.7.Epizootiyoloji
Köpeklerde babesiosis vektör kenelerin yayılışına bağlı olarak dünyada tropik,
subtropik ve ılıman iklim kuşağında yaygın olarak görülmektedir (70, 92). Bulundukları
bölgelere göre köpeklerde babesiosisin öneminin değişkenlik göstermesinin sebebi,
Babesia türlerinin ve çevrenin ekolojik durumunun farklı olmasındandır (91).
Babesia canis özellikle ılıman iklim bölgelerinde yaygın olup Avrupa, Amerika,
Asya, Afrika ve Avustralya’da görülmektedir. Babesia canis’in vektörü esas olarak
Rhipicephalus sanguineus’tur. Bu kene Hindistan, Almanya, Fransa, Güney Afrika,
Amerika ve Brezilya’da B. canis enfeksiyonlarını taşımaktadır. Fransa’da B. canis, ek
olarak Dermacentor marginatus, D. reticulatus ve D. venustus tarafından da
taşınmaktadır. Rusya’da ise B. canis, Dermacentor marginatus, D. reticulatus ve
Hyalomma plumbeum plumbeum tarafından taşınmaktadır (71, 102).
Babesia canis’in alt türlerinden B. canis canis Avrupa’da yayılış gösterir ve
Dermacentor reticulatus ile bulaşır (70, 92). Babesia canis vogeli tropik ve subtropik
bölgelerde, Kuzey Afrika, Kuzey Amerika’da ve Güney Afrika ve Avustralya’da
görülür ve R. sanguineus ile bulaşır (52, 75). Babesia canis rossi ise Güney Afrika’da
görülür ve Haemaphysalis leachii ile bulaşır (94, 104, 109).
Babesia gibsoni daha sınırlı bir coğrafik alanda yayılır ve Avrupa, Kuzey
Amerika, Asya ve Afrika’nın büyük bir alanında görülür (9, 20, 70, 92). Babesia
gibsoni’nin vektörü R. sanguineus ve Haemaphysalis bispinosa’dır (70, 92). Ancak
Haemaphysalis longicornis ile de bulaşabilir (22, 50, 51).
Son yıllarda köpek babesiosisi ile tür ve alt tür düzeyinde yapılan moleküler
çalışmalar artmaktadır. Japonya’da yapılan bir çalışmada 80 köpekten 5 tanesi (%6.3)
B. canis vogeli, 7 tanesi (%8.8) B. gibsoni ile enfekte bulunmuştur (51). Macaristan’da
44 köpekten 39’unda (%88.6) B. canis canis bulunmuştur (32). Hollanda’da 23
köpekten 18’inde (%78.2) B. canis canis (74), Avrupa’da B. canis canis ve B. canis
vogeli (17), Slovenya’da 238 köpekten 11’inde B. canis canis, 3 tanesinde B. canis
vogeli (27), Güney Afrika’da ise 326 köpekten 31’inde B. canis rossi (%9,5), 13’ünde
B. canis vogeli (%3,9) (75), Rusya’da 21 semptomlu köpekte B. canis canis (93),
Amerika’da 150 köpekten 144’ünde B. gibsoni (%96) (11), Almanya’da 5 semptomlu
köpekte B. canis (97), Japonya’da 115 köpekten 35 tanesinde (%30.4) B. gibsoni (82),
13
Sudan’da 78 köpekten 5 tanesinde B. canis rossi (%6.4), 2 tanesinde B. canis vogeli
(%2.5) (86), Avustralya’da 55 köpekten 22 tanesinde B. canis vogeli (%40) (72),
İspanya’da 62 semptomlu köpekte T. annae (39), Amerika’da yeni bir büyük piroplasm
(10), Brezilya’da 10 köpekte B. canis vogeli saptanmıştır (88). Ayrıca İspanya’da
yapılan bir çalışmada B. equi asemptomatik köpeklerde saptanmıştır (24). Aynı
çalışmada atlarda da B. canis canis bulunmuş, ancak araştırmada laboratuardan
kaynaklanan kontaminasyonlar göz önünde tutulması ve tekrarlanması gerektiği
belirtilmiştir.
Türkiye’de köpeklerde babesiosisle ilgili yapılan ilk çalışmada Merdivenci’ye
(40, kaynak:78 p.28) göre İç Anadolu Bölgesinde Ankara’da Piroplasma canis
bulunmuştur. Daha sonra Ankara’da bir köpekte Babesia canis’in varlığı mikroskobik
olarak bildirilmiştir (87). Aydın ilinde klinik olarak babesiosis semptomları bulunan 7
köpekte B. canis PCR ile saptanmıştır (110). Ege bölgesinde yapılan tarama
çalışmasında, 383 köpekten 40’ında (57) (%10.44) B. canis vogeli bulunmuştur.
İstanbul’ da 3 köpeğin kan preparatlarında mikroskobik olarak görülen Babesia türleri,
PCR-RFLP yöntemi ile B. canis vogeli alt türü olarak tanımlanmıştır (45).
Hastalığın yayılışı köpeklerde özellikle kene enfestasyonunun yaygın olduğu
yerlerde fazladır. Ancak hastalığın klinik olarak ortaya çıkması daha nadirdir ve klinik
tablonun şiddeti köpeğin yaşı, bağışıklık durumu ve parazitin türüne göre değişir (92).
Babesia canis köpek, kurt, tilki ve çakallarda, B. gibsoni ise ayrıca yaban gelinciği ve
porsuk gibi yabani karnivorlarda enfeksiyon oluşturur (70, 102). Kronik veya gizli
enfeksiyon taşıyan evcil ve yabani hayvanlar hastalığın rezervuarlığını yapar (70).
Yakın zamana kadar kabul gören vektör spesifikliğine göre etkenlerin bölgesel dağılımı
fikri artık geçerliliğini kaybetmiştir. Çünkü son yıllarda köpeklerde seyahat olguları
artmıştır ve bu durum da türlerin yayılışını etkilemektedir (17, 42).
2.8.Klinik ve Laboratuar Bulguları
Babesiosisin klinik bulguları hastalığın sporadik görüldüğü yerler ile endemik
olduğu bölgeler arasında farklılıklar göstermektedir. Endemik bölgelerde yetişen
köpeklerde hastalık kronik formda seyreder ve hastalığın şiddeti hafif ya da
semptomsuzdur. Ancak hastalığın nadir görüldüğü bölgelerdeki genç köpeklerde ve
parazitle ilk kez karşılaşan erişkin köpeklerde parazit çok patojendir. Prepatent süre 10-
14
21 gündür (102). Köpeklerde klinik bulguların şiddetini bireysel özellikler, parazitin
türü, hayvanın yaşı, bağışıklık durumu, enfeksiyona karşı oluşan cevap, enfeksiyonun
safhası, parasiteminin şiddeti, Ehlichiosis gibi diğer hastalıklarla eş zamanlı oluşması
gibi faktörler de etkiler (70). Çoğunlukla klinik bulguların şiddeti parazitin konak
eritrositleri içinde çoğalması sonucu oluşan hücre erimesine bağlıdır (94). Hastalığın
şiddeti multiorgan disfonksiyonu ile birlikte seyreden hemolitik anemi ya da hipotensif
şok gelişmesine bağlıdır (53).
Köpeklerde babesiosis hiperakut, akut ve kronik formda seyreder. Endemik
bölgelerde pek çok köpek hastalığı latent olarak bulundurur ve hayvan strese girdiğinde
ortaya çıkar. Subklinik enfeksiyonlarda hastalık belirgin olmayıp, klinik bulgu
görülmeyebilir (76). Hiperakut form çok yaygın görülmez, ani oluşan hipotansif şok ve
hızlı ölüm ile karakterizedir. Bu hayvanlarda hemoglobinuri görülür ve 24 saat içinde
koma hali gelişir. Ağır kene enfestasyonu da gözlenebilir. Hemoglobinuri eritrosit
yıkımlanmasındaki artışa bağlı olarak oluşur. Bu safhada köpeklerin çoğunda diğer
komplikasyonlar gelişir. Bu komplikasyonlar yavru köpeklerde daha sık görülür (70,
102). Akut formda eritrositlerin intravasküler hemolizi veya fagosite edilmeleri sonucu
hemolitik anemi, sarılık ve hemoglobinuri görülür. Aneminin şiddeti değişken olup,
hemoglobinemi ve bilirubinemi ile birliktedir. Dalak büyümesi, karaciğer loplarında yağ
dejenerasyonu, safra kanallarında genişleme ve nefritis şekillenir. Hasta köpeklerde
uyuşukluk, iştahsızlık ve ateş gibi klinik bulgular oluşur. Hastalık sıklıkla öldürücüdür
(48, 70, 92). Kronik formda ise iştah azalması, düzensiz ateş ve halsizlik görülür (70,
92).
Babesia canis, B. gibsoni’den daha akut ve hızlı hemolize neden olur (114).
Babesia gibsoni enfeksiyonlarında klinik bulgular daha azdır. Enfeksiyon daha kronik
seyirlidir. Hemoglobinuri ve sarılık seyrek olarak görülür. Babesia gibsoni daha çok 4
aylıktan büyük köpeklerde enfeksiyon oluşturur. Klinik olarak uyuşukluk, iştahsızlık ve
hemolitik anemi, düzensiz ateş ve trombositopeni görülür. Dalak ve karaciğer belirgin
olarak büyümüştür (30, 61, 102, 104, 113). Babesia gibsoni enfeksiyonlarında da
şiddetli parasitemi ve anemi görülebilir. Ancak bu devrede hayvanlar çok hasta
görünümde değildirler. Klinik bulgular her zaman parasitemi yoğunluğu ile paralel
olmayabilir (70). Babesia gibsoni enfeksiyonlarında şiddetli ateş gelişebilir ancak vücut
15
ısısı B. canis enfeksiyonundaki kadar yükselmez (49). Ölüm haftalar veya aylar sonra
gelişebilir ( 102).
Babesia canis’in alt türlerinin coğrafik yayılış, antjenik özellikleri ve
vektörlerinin farklı olmalarının yanında klinik belirtileri de farklıdır (46, 101, 109).
Babesia canis rossi, anemi ve trombositopeniye neden olarak, hasta köpeklerde
halsizlik, iştahsızlık, ateş, sarılık, gibi klinik semptomlara yol açar ve tedavi edildiği
durumlarda bile sıklıkla öldürücü enfeksiyonlar oluşturur. İmmuniteye bağlı hemolitik
anemi veya çok şiddetli akut yangısal reaksiyon oluşturması nedeniyle yüksek
patojeniteye sahiptir (94). Babesia canis vogeli klinik olarak semptom göstermeyen
hafif şiddette enfeksiyona yol açarken (17), Babesia canis canis anemi ve
trombositopeniye neden olup halsizlik, iştahsızlık, ateş ve sarılık gibi klinik
semptomlara yol açar. Ancak hastalık tablosu B. canis rossi’den daha hafiftir (10, 116).
Babesia canis canis enfeksiyonlarında parasitemi (enfekte eritrosit oranı) geçici ve
%1’in altındadır. İç organlarda kanamalar oluşabilir (101).
Köpek babesiosisinde anemi ve trombositopeni yaygın olarak görülen kan
tablosu bozukluklarıdır. Anemi başlangıçta hafif şiddette, normositic ve normokromik
iken daha sonra makrositik, hipokromik olur. Hastalığın devamında ise regeneratif hal
alır. Babesia canis canis ile oluşturulan deneysel enfeksiyonlarda trombositopeni
görüldüğü ancak çok şiddetli olmadığı bildirilmiştir (111). Babesia canis’in alt
türleriyle oluşan bütün enfeksiyonlarda şiddetli trombositopeninin ortak bulgu olduğu
bildirilmiştir (56).
Lökosit tablosunda bazen değişiklikler oluşabilir. Lökositozis, lökopeni,
nötrofili, nötropeni, lenfositozis ve eozinofili görülebilir (38, 111). Lökositozis
hastalığın her zaman oluşan ortak bir bulgusu değildir (44).
Babesia canis enfeksiyonlarında biyokimyasal değişiklikler hastalığın şiddeti ve
hipoksi ile bağlantılı olarak oluşur. Serumda Aspartate aminotransferase (AST), alanin
aminotransferase (ALT) artışı, hiperbilirubinemi, hiperalbubinemi, elektrolit ve asit-baz
değişiklikleri daha çok hipokalemi, hiperkloremi ve metabolik asidozis ile ilgili olarak
görülmektedir (70, 111).
Babesiosisde klinik bulgular direk anemi ile ilgili ise komplikasyonsuz olarak
isimlendirilir. Komplikasyonsuz babesiosisde anemi hafif veya orta şiddette ise hafif
babesiosis, anemi yaşamı tehdit edici derecede ise şiddetli babesiosis olarak
16
isimlendirilir. Komplikasyonlu olgular direk akut hemoliz ile ilgili değildir. Daha çok
akut böbrek yetmezliği, perakut babesiosis, pulmoner ödem, hemokonsantrasyon
(kırmızı safra) ve şok gibi organ yetmezliği tabloları gelişebilir (53).
Eğer hayvan enfeksiyonu atlatarak iyileşirse hastalığa karşı bağışıklık kazanır ve
preimmunisyondan dolayı daha sonraki enfeksiyonlara karşı korunur. Preimmunisyon;
parazit ile konak arasında klinik semptom oluşturmayacak kadar hassas bir dengenin
oluştuğu durum olarak kabul edilir (8). Kronik olarak enfekte köpekler hastalığın
taşıyıcılarıdır. Uzun süre antikor seviyeleri yüksek kalır (15). Klinik semptomlar genç
köpeklerde hastalığı atlatarak iyileşen ancak taşıyıcı olan hayvanlara göre daha
şiddetlidir (71, 83). Dalağı çıkarılmış köpekler daha şiddetli etkilenirler. Enfekte
annelerden doğan yavrularda yüksek parasitemi gözlemlendiği için transplesantal geçiş
olduğu bilinmektedir (16, 30, 61).
2.9.Patogenez
Babesiosis enfeksiyonlarında anemi ve organ komplikasyonları patogenezde
önemlidir. Anemi önemli bir klinik bulgu olmasına rağmen patogenezi tam olarak
anlaşılamamıştır. Hastalığın erken dönemleri hariç bütün dönemlerinde şiddetli
rejenerasyon olması, kemik iliğinin baskılanmaması aneminin eritrosit yıkımlanmasına
bağlı geliştiğini gösterir. Eritrositlerin parazitler tarafından fiziksel olarak parçalanması,
dalak ve karaciğerde fagosite edilmeleri eritrositlerin yeniden üretilmesinde önemli bir
faktördür. Intravasküler hemoliz ve eritrositlerin fagosite edilmesi sarılık,
hemoglobinuri ve böbreklerin koyu kahverengi renk almasına neden olur. Ancak yine
de intravasküler hemolizin nedeni tam olarak açıklanamamıştır (54). Hemoglobin
intratubuluslarda birikir. Böbrek yetmezliği ve dalak büyümesi oluşur. Şiddetli enfekte
olan bazı köpeklerde anemi oluşmadan ölüm görülebilir. Bu hayvanlarda serumda
bulunan kallikrein enzimi aktive olur. Bu aktivasyon kandaki şekilli elemanların
azalmasına yol açar ve akut dolaşım bozukluğuna bağlı olarak pulmoner ödem ve iç
organlarda kanama görülür. Nekroskobik olarak hemoraji ve yaygın intravaskuler
pıhtılaşma görülür (62). Babesia gibsoni enfeksiyonlarında hastalık tablosu veya
hemoglobinuri olmadan belirgin anemi ve parasitemi oluşur. Ayrıca eritrosit
yıkımlanması retikuloendoteliyal sistemde oluşur (92). Babesia canis enfeksiyonlarında
düşük parasitemiye rağmen şiddetli anemi olması olaya başka faktörlerin de karıştığını
göstermektedir. Babesia gibsoni enfeksiyonlarında serumda hemolitik aktivite tespit
17
edilmiş ve B. canis enfeksiyonlarında anemiye neden olan soluble antijenler
bulunmuştur (54). Parazitli eritrositlerin kapillar damarlarda birikmesi veya
parçalanması dolaşımdaki eritrosit sayısının azalmasına neden olabilir. Parazitli ve
parazitsiz eritrositlerin immunglobulin ve complemente bağlı yıkımlanması aneminin
oluşmasında önemlidir. Babesia gibsoni enfeksiyonunda anemi ve anti-eritrosit antikor
arasında ilişki olduğu bulunmuştur. Eritrosit yıkımlanmasındaki immun mekanizmanın
katkısı, sekonder immun aracılı hemolitik anemi ile karıştırılmamalıdır (54).
2.9.1.Köpek Babesiosisinin Komplikasyonları
Akut Böbrek Yetmezliği (ARF); Belirtileri yeterince su alınmasına rağmen
gelişen anuri ve oligüridir. ARF genellikle yaşlı köpeklerde oluşur. Genç ve poliürik
köpeklerde prognozu daha iyidir. ARF çok yaygın bir komplikasyon değildir.
Köpeklerde intravasküler hemoliz ARF’ye neden olabilir. Hemoglobinin ARF’deki
etkisi bilinmemektedir (54).
2.9.1.1.Cerebral Babesiosis
Köpeklerde serebral babesiosis beyindeki küçük damarlarda parazitli
eritrositlerin yığılması ve sinirsel bulguların ortak kombinasyonu olarak tanımlanmıştır.
Serebral babesiosis oluşan köpeklerde, hareketlerde uyumsuzluk, vücudun arka
kısmında felç, kaslarda kasılmalar, nistagmus, anizokori, aralıklı bilinç kaybı, nöbet,
sersemlik ve koma hali görülür. Akut serebral babesisois ani ölümle karakterizedir (54,
102). Patolojik olarak beyinde kanama, makroskobik ve mikroskobik hemoraji ve
histolojik kesitlerde kapillar damarlarda eritrosit yığınları görülür. Parazit içeren
eritrositlerin çoğu beyindeki damar endotellerine yapışarak tıkanmalara neden olur.
Ancak bu yapışmanın mekanizması tam olarak bilinmemektedir (54, 102).
2.9.1.2.Pıhtılaşma Bozuklukları
Babesiosisde sürekli ve belirgin şekilde oluşan, hem komplikasyonlu hem de
komplikasyonsuz vakalarda görülen anormallik trombositopenidir. Babesiosiste gelişen
hemoliz, damar endotelyumlarının hasarı, asidozis, hipoksi, dolaşımda durgunluk, şok
ve endotoksemi hasta hayvanlarda yaygın pıhtılaşma bozukluğu sendromunun (DIC)
gelişmesine yol açar. Yaygın pıhtılaşma bozukluğu, pıhtılaşma mekanizmalarının
18
bozulmasına bağlı oluşan sistemik bir reaksiyondur ve sekonder olarak ortaya çıkar
fakat oluşturduğu tablo babesisosisde baskın hale gelebilir (54).
2.9.1.3.Sarılık ve Karaciğer bozuklukları
Köpeklerde babesiosisin ilerlemesi durumunda sarılık oluşur. Sarılığın şiddeti
ölüm oranını artırır. Sarılık tek başına ölüm nedeni olmayıp, diğer komplikasyonlarla
birlikte görülür. Babesiosisde hemoliz tek başına sarılığa neden olmaz. Sarılığın
oluşmasında karaciğer yetersizliğinin önemli rolü olduğu düşünülmektedir (54).
2.9.1.4.Bağışıklığa bağlı Hemolitik Anemi (IMHA)
Bağışıklığa bağlı hemoliz, eritrosit membranı ile ilişkili antikorların eritrositleri
yıkılmaması sonucu oluşur. Parazitli eritrositlerin membranı hasar gördüğü için yabancı
olarak algılanır ve antikor- komplement aktivasyonu yoluyla yıkımlanır. IMHA’nın en
tehlikeli sonucu, tedaviye rağmen süren hemolize neden olabilmesidir. Babesiosisde
nadir görülen bir komplikasyondur (54).
2.9.1.5.Perakut Babesiosis
Perakut olgular, klinik bulguların 24 saatten kısa sürdüğü, hasta hayvanın
kollaps durumunda olduğu durumlarda görülür ve şiddetli intravasküler hemolize yol
açar. Özellikle genç köpeklerde yüksek parasitemi görülebilir. Perakut babesiosiste
diğer komplikasyonlar da gelişebilir. Özellikle serebral babesiosis ile perakut babesiosis
arasındaki fark belirsizdir. Bu komplikasyon genellikle hasta hayvanların ölümü ile
sonuçlanır (54).
2.9.1.6.Pulmoner Ödem
Babesiosisde pulmoner ödem (akciğer şoku) çoğunlukla ölümle sonuçlanan bir
komplikasyondur. Klinik bulgusu ani gelişen zor ve sık solunumdur. Solunum güçlüğü,
öksürük ve kanlı burun akıntısı ilerleyen ödemin belirtileridir. Pulmoner ödemin
mekanizması alveoler permeabilitenin artması veya hidrostatik basıncın artması ile
açıklansa da, babesiosisde nasıl geliştiği henüz tam olarak bilinmemektedir (54).
2.9.1.7.Hemokonsantrasyon (Kırmızı Safra)
Babesiosisde hemokonsantrasyon kan volümünün azalması sonucu oluşur. Bu
olaya plazmanın önemli bir miktarının damar dışına çıkması yol açar. Mekanizmasında
19
serebral babesiosis, yaygın damariçi pıhtılaşma bozukluğu, ARF ve pulmoner ödem gibi
diğer komplikasyonlar rol oynar (54).
2.9.1.8.Şok
Babesiosisli köpek koma durumunda olsa bile şokun klasik klinik belirtileri
görülmeyebilir. Babesiosisden ileri gelen şok, endotoksemik sok olgularındaki
hiperdinamik dönemle başlar, hipotensif şokla devam eder. Babesia canis
enfeksiyonlarında oluştuğu düşünülmektedir. Ancak bunu tanımlayan sadece bir yayın
vardır (33).
2.9.1.9.Organ Yetmezlikleri
Köpek babesiosis’inde diğer organlarda görülen bozukluklar hastalığa çok
spesifik olmayıp, diğer sistemik hastalıklarla karışabilir (54).
2.10.Bağışıklık
Köpeklerde babesiosise karşı bağışıklık gelişmesinde, konak özgüllüğü, yaş ve
spesifik olmayan bazı etkenler rol oynayabilir. Kazanılmış bağışıklığın gelişmesiyle,
tedavi edilen veya edilmeden hastalığın akut dönemini atlatan hayvanlar, parazitin
taşıyıcısı olurlar ve enfeksiyonun kaynağını oluştururlar. Ayrıca bu hayvanlarda
enfeksiyonun tekrarlama riski her zaman vardır (30, 62, 113). Babesia canis ile
B. gibsoni arasında çapraz bağışıklık gelişmez. Babesia canis enfeksiyonunu atlatan
köpeklerde endemik bölgelerde reenfeksiyonlar oluştuğu sürece klinik olarak
enfeksiyon görülmez. Ancak reenfeksiyon oluşmazsa parazitler bir yıl içinde kaybolur
(102). Hayvan klinik dönemi atlatır ve bağışık olursa parazitler kanda çok az görünür.
Klinik tablonun genç köpeklerde şiddetli olması immun sistemlerinin gelişmemiş
olmasından kaynaklanabilir (92). Klinik olarak kronik enfekte köpekler hastalığın
rezervuarlığını yaparlar ve antikor seviyeleri uzun süre yüksek kalır (15). Babesia canis
antikoru taşıyan hayvanlar bir yıl süre ile hastalığın klinik bulgularını göstermezler. Bu,
immun sistemin koruyucu etkisindendir. Ancak klinik olarak enfekte, ancak antikor
sentezlemeyen ya da tedavi ile enfeksiyonun temizlendiği durumlarda enfeksiyon
senede iki kere tekrarlanabilir (66, 73). Babesia canis enfeksiyonlarında parazitin
kandan tamamen yok edilmesi ile bağışıklık süresi kısalır. Antikor seviyesi
enfeksiyondan sonra 3-5 ayda yavaş yavaş azalır. Türe spesifik bağışıklık 5-8 aydan
20
daha uzun sürmez ve bu süre sonunda hayvan reenfeksiyonlara karşı duyarlı hale gelir
(13, 112). Enfeksiyondan sonra kanda kalan düşük seviyedeki antikor daha sonra
oluşacak enfeksiyonlara karşı hayvanın korunmasında uzun süreli bağışıklık sağlar (66,
89).
Köpeklerde babesiosisde cinsiyet ve ırk hastalığa karşı duyarlı olmayı etkilemez.
Beagle, fox terrier, porcelain, teckel ve bazı kırma ırklar daha dirençli, spaniel, cocker,
griffon, yorkshire terrier, doberman ve pekinese gibi bazı ırklar ise daha duyarlıdır.
Ancak hiçbir ırk tam olarak dirençli değildir. Endemik bölgede yaşayan köpekler
hastalığın klinik semptomu görülmeden de yüksek derecede antikor sentezleyebilir (73).
Evcil hayvanlarda Babesiosise karşı oluşan bağışıklık uzun sürelidir. Ancak Afrikada’ki
B. canis enfeksiyonlarında daha sonra oluşan şiddetli enfeksiyonlarda bağışıklık zayıftır
(103).
Babesia canis’in bir suşudan hazırlanan soluble parazit antijeni (SPA) ile
aşılanan köpeklerde, deneysel olarak farklı bir B. canis suşunun tekrar verilmesi ile
çapraz-korunma gözlenmemiştir (99). Bu da B. canis’in alt türleri arasındaki antijenik
varyasyonun olduğunu göstermektedir. Antijenik yapılarının farklı olması türler
arasında çapraz bağışıklık olmamasını açıklayabilir. Bu düşünceden yola çıkılarak
Avrupa suşuna ait SPA ile Afrika suşuna ait SPA’nın karıştırılarak kullanıldığında
B. canis enfeksiyonuna karşı korunma sağlandığı görülmüştür (99). Babesiosise karşı
oluşan immun yanıt, sadece parazitin trofozoitlerine karşı değil kenelere karşı da oluşur
(70).
2.11.Tanı
Babesiosiste tanı, hastanın geçmişi, klinik bulgular ve laboratuar sonuçlarına
dayanır. Hastanın endemik bir bölgede yaşaması, daha önce endemik bir bölgeye
seyahat öyküsü, kene enfestasyonu ve stres durumu tanıyı destekleyici bulgulardır.
Babesiosiste klinik bulgular spesifik olmadığı için, kesin tanıda yeterli değildir. Oysa
enfeksiyon etkenine tam olarak tanı konması tedavi ve hastalığın ilerleyişi açısından
önemlidir. Hemolitik anemi, hemoglobinuri ve sarılık önemli bulgular olmasına
rağmen, kesin tanı için parazitlerin tespit edilmesi gerekir (70, 94, 103). Bunun için
kanın mikroskobik olarak incelenmesi, serolojik testler, dalağı çıkarılmış köpeğe
şüpheli kan inokulasyonu ve son yıllarda gelişen PCR gibi moleküler yöntemler
kullanılır (61, 92, 102).
21
2.11.1.Mikroskobik Tanı
Mikroskobik tanı, kan preparatlarındaki eritrositlerin içindeki parazitlerin
morfolojik olarak belirlenmesi ile yapılır (115). Parazitlerin görülmesi ve tanınması için
Romanowsky, Giemsa, Wright’s, Field’s ve Diff-Quik gibi boyalar kullanılır. Babesia
trofozoitlerinin kan preparatlarında görülmesi, kronik ve hafif enfeksiyonlarda
paraziteminin değişken olması ve pek çok durumda parazitlerin dolaşım kanında az
miktarda bulunması nedeniyle zordur (37). Mikroskobik inceleme için kan, büyük
venalar yerine kapillar damarlardan alınmalıdır. Çünkü parazitli eritrositler kapillar
damarlarda toplanmaya eğilimlidir. Tırnak ucu veya kulak ucu, kapillar damarların
yoğunluğundan dolayı kan almak için uygundur (30). Mikroskobik tanıda parazitlerin
boya lekeleri ile karıştırılmaması için çok iyi boyanmış kan preparatları gereklidir.
İnceleme en az 20-30 dk. sürmeli ve daha çok preparatın uç kısımlarında parazitler
aranmalıdır çünkü parazitli eritrositler daha çok preparatın uç kısımlarında saçaklı
alanlarda bulunurlar. Parazit içeren eritrositler santrifüj edilen antikoagulanlı kan
örneklerinde buffy coat (kan santrüfüj edildiğinde plasma ile eritrosit birikintisi arasında
kalan kısım) tabakasının altında toplanır. Bu tabakanın alt kısmından hazırlanan
preparatların incelenmesi paraziti görme şansını artırır. Kemik iliği aspiratından
hazırlanan frotilerde de parazitlere rastlanabilir. Preparatlar incelenirken eritrosit
üzerindeki trombositlerin parazitlerle karıştırılmamasına dikkat edilmelidir. Ölüm
sonrası histolojik kesitlerde dalak, karaciğer, kemik iliği, akciğerler, böbrek, meningsler
ve sindirim kanalının kapillar damarlarından hazırlanan kan preparatları incelendiğinde
babesialara rastlanabilir (61, 92, 102). Kan preparatlarında, tecrübeli kimselerce 105
veya 106 eritrosit içindeki bir parazitin bile görülebildiği bildirilmiştir. Ancak bu
durum, klinik olarak babesiosis şüpheli hayvanların kan preparatlarının tecrübeli
kimselerce incelenmesi ile ancak mümkündür (14). Babesia gibsoni küçük olduğu ve
diğer küçük piroplasmalardan ayırt edilemediği için mikroskopik incelemede çok daha
dikkatli olmak gerekir (52, 91). Mikroskobik inceleme ile tür ve alt türlerin ayrımı
yapılamaz (9). Köpek babesiosisinin endemik olmadığı bölgelerde laboratuar bulguları
başka hastalıklarla karışabilir. Bu bölgelerde şüpheli hayvanlarda kan preparatları
babesiosis yönünden dikkatle incelenmelidir (22).
22
2.11.2.Serolojik Testler
Babesialar kanda az sayıda bulundukları için parazite karşı oluşan antikorlar
serolojik yöntemlerle aranabilir (30). Ancak serolojik tanıda, B. canis ve B. gibsoni
arasındaki çapraz reaksiyonlar nedeni ile kesin tanı için bu iki paraziti morfolojik
olarak ayırt etmek gerekir (92). Ticari olarak üretilen serolojik testler anti-Babesia
antikorlarını tespit etmede kullanılmaktadırlar. Ancak Babesia enfeksiyonlarında parazit
konaktan temizlendikten sonra da antikor miktarı belli bir seviyede kaldığı için,
enfeksiyonun devam eden veya geçirilmiş olduğu anlaşılamamaktadır. Ayrıca
enfeksiyonun erken safhalarında antikor titresi düşük olduğu için endemik bölgelerde
kullanıldığında negatif sonuç verir (7, 104). Ayrıca babesiosisin serolojik yöntemlerle
tanısında türler arasında olduğu gibi, parazit ile eritrositler arasında da çapraz
reaksiyonlar oluşabilir (1, 20). Serolojik testler kronik enfeksiyonların tanısında
kullanışlı değildir (19). Büyük babesiaların alt türleri antijenik farklılıklariçerir. Fakat
her alt türe özgü antijenik materyal bulunmadığı için serolojik testler alt tür ayrımında
geniş kullanım alanı bulamazlar (116). Standardize edilmiş serolojik testlerin yokluğu,
antikorlar arasındaki çapraz reaksiyonlar, son zamanlarda türlerin coğrafik
yayılışlarındaki değişiklikler, babesiaların tanısını zorlaştırmaktadır (9).
Çeşitli serolojik testler bulunmasına rağmen, bunlardan IFA (Indirect Floresan
Antibody) testi B. gibsoni ve B. canis’in tanısında yaygın olarak kullanılmaktadır. Genç
köpeklerde hastalığın erken dönemlerinde ve immunitesi baskılanmış hayvanlarda
yanlış negatif sonuçlar yaygındır (2, 65, 92). IFA testi kronik olarak enfekte hayvanların
kanında parazit olmadığı ya da çok az olduğu durumlarda kullanışlıdır. Genellikle bu
test Babesia etkenleri için yüksek duyarlılık gösterirken, türler arasındaki antijenik
yakınlıktan dolayı oluşan çapraz reaksiyonlar nedeni ile orta derecede özgünlük gösterir
(2, 68). IFA testi, köpeklerdeki Babesia türleri arasında çok fazla çapraz reaksiyon
oluştuğu için tür ayrımında kullanışlı değildir (5). Babesia gibsoni’nin tanısında IFA
testinin güvenilirliğini araştırmak için vektör kenelerin bulunmadığı bölgede sağlıklı ve
parazitsiz köpekler üzerinde yapılan çalışmada yanlış pozitif sonuçlar alınmıştır. Ayrıca
sığır ve köpek Babesiaları arasında çapraz reaksiyonlar bildirilmiştir (61, 115). Babesia
gibsoni ile doğal enfekte, klinik semptom gösteren ve parasitemili köpeklerde, homolog
antijenlere karşı gelişen antikor titrelerinin birbirinden farklı olabildiği görülmüştür.
IFA testinin uygulanmasında kullanılan cut-off değeri de sonuçlar arasında farklılık
23
oluşturmaktadır. Her laboratuarda, parazit izolatları, teknik ve kullanılan kimyasallar
farklı olabildiğinden, kendi testleri için geçerli cut-off değerlerinin saptanması gerekir
(115).
Serojik tanı amacıyla kullanılan bir diğer test ELISA (Enzim-Linked
Immunosorbent Assay)’dır. ELISA testi de IFA testi gibi yüksek duyarlılığa sahiptir.
Ancak Babesia türleri arasındaki çapraz reaksiyonlardan dolayı orta derecede özgünlük
gösterir (37, 115). Japonya’da yapılan bir çalışmada (82) Babesia gibsoni’nin
epidemiyolojisinin belirlenmesinde PCR ve ELISA testi kullanılmıştır. PCR için 18S
rRNA geninden seçilen spesifik primerler, ELISA için P50 immunodominant antijeni
kullanılmıştır. PCR ile 115 köpekten 29’u pozitif, bulunurken, ELISA ile 27 köpek
pozitif bulunmuştur.
2.11.3.Moleküler Tanı Yöntemleri
Mikroskobik ve serolojik tanıdaki yetersizlik ve dezavantajlar nedeni ile
Babesiaların kesin tanısı yapılamayabilir. Bu nedenle son yıllarda PCR’ında içinde
bulunduğu moleküler yöntemler ile yapılan tanı metotları tercih edilmektedir.
Mikroskobik tanı, akut babesiosis’in tanısında laboratuarda pratik olarak
uygulanmasından dolayı hala en iyi, ekonomik ve uygun metottur. Ancak, özellikle
parasiteminin düşük olduğu durumlarda preparatı inceleyen kişinin tecrübesi önemlidir
(14). Günümüzde PCR ve DNA’ ya dayalı diğer testler, Babesiaların tanısında yüksek
duyarlılık ve özgünlüklerinden dolayı geniş kullanım alanı bulmaktadır (9, 19, 22, 23).
Babesiaların farklı vektör spesifiteleri, antijenik yapıları ve patojeniteleri tür ve alt tür
ayrımlarının yapılmasında yeterli olmadığı için, moleküler teknikler tanı ve
sınıflandırmada güvenilir şekilde kullanılabilir (19, 117).
2.11.3.1. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR)
PCR, Babesiaların tanısında, türlerin ve alt türlerin ayrımında özgün olarak
kullanılır. Mikroskobik bakı ve serolojik testlerden daha özgün bir tanı metotudur (9).
Bu metot son yıllarda köpeklerde Babesiaların tanı ve ayrımlarında yaygın olarak
kullanılmaktadır (32, 51). PCR ile yapılan bir çalışmada B. gibsoni 0,000002 %
parazitemili kanda belirlenmiştir. Aynı çalışmada incelenen 28 kan örneğinin 3’ü IFAT,
2’si mikroskobik incelemede negatif iken, bu örnekler PCR ile pozitif bulunmuştur (37).
24
Piroplasmların konak spesifikliğinin zannedilenden daha düşük olduğunu
bildirilmiştir (84). Bu düşünce daha sonra kedilerde PCR yöntemi ile köpeklere ait iki
piroplasmın (B. canis canis ve T. annae) saptanması ile doğrulanmıştır (26). İsrail’de
yapılan bir çalışmada (6), evcil kedilerde tespit edilen Babesiaların morfolojik ve klinik
açıdan incelenmesi ve genetik karakterizasyonunun yapılması amaçlanmıştır. Bu
çalışma sonucunda kedilerdeki etken, B. canis subspecies presentii olarak
isimlendirilmiştir.
2.11.3.2.Hydroethidine-Flow Cytometry (HE-FC)
HE-FC, B. gibsoni’nin tanısında deneysel olarak kullanılmıştır (34). Bu
yöntemin temeli, canlı hücre tarafından alınan ve hücredeki metabolizma sonucu
DNA’ya bağlanan bir boya olan ethidium bromide dönüşen hydroethidinin
kullanılmasına dayanır. Çok hızlı sonuç verir ve kısa zamanda çok sayıda örnek
incelenir. Ancak özel bir cihaz gerektiği için pahalı bir metottur (7).
2.11.3.3.PCR-RFLP
PCR-RFLP ile, Babesia tür ve alt türler arasındaki ayrım basit, hızlı ve duyarlı
şekilde belirlenebilir. RFLP, çabuk tanı sağlamasının yanında serolojik testlere göre
daha duyarlıdır. Parasiteminin % 0,01’e kadar düşük olduğu durumlarda bile
kullanışlıdır. Serolojik testlere göre eş zamanlı enfeksiyonların tanısında daha
duyarlıdır. Epidemiyolojik çalışmalarda köpeklerde Babesiaların belirlenmesinde
kolaylık sağlar (19). PCR-RFLP ile köpeklerin büyük Babesialarının antijenik ,coğrafik,
vektör ve patojeniteleri farklı olan alt türlerin ayrımları çabuk olarak yapılabilmektedir
(116).
2.11.3.4.RLB
Farklı cins ve türlere ait etkenlerin eş zamanlı olarak tanı ve ayrımları için
geliştirilen bir tekniktir. Köpeklerde bulunan Babesia cinsindeki parazitlerin tür ve alt
türlerin tanısında da duyarlı ve özgün bir metot olarak kullanılmıştır (74).
Kaufhold ve ark. (55) tarafından 1994 yılında ilk kez uygulanan teknik, bakteri
ve parazitlerin tanı ve identifikasyonunda giderek daha yaygın kullanılmaktadır.
Tekniğin avantajı çok sayıda etkenin eş zamanlı olarak yine çok sayıda örnekte
aranmasını sağlamasıdır. Bu tekniğin kullanımı özellikle keneler ile bulaşan
25
hastalıkların tanı ve identifikasyonunda yer bulmuştur. Keneler tarafından bulaştırılan
Borrelia türlerinin tanısı ve identifikasyonu amacıyla Rijpkema ve ark. (95) tarafından
1995 yılında uygulanmıştır. Gubbels ve ark. (43) tarafından 1999 yılında bilinen bütün
Theileria ve Babesia türlerinin tespiti ve identifikasyonunda başarılı bir şekilde
kullanılmıştır. Daha sonraki yıllarda Theileria/Babesia ve Ehrlichia/Anaplasma
cinslerine bağlı 36 adet türün tespit ve ayırımını yapabilen kitler geliştirilerek kullanım
alanı daha da genişlemiştir. Sığırlarda Theileria/Babesia tanısında (41, 43), insandaki
Babesia divergens olgusunun tanısında (21) kullanılmıştır. Tekniğin, sadece PCR
metoduna dayalı olanlardan önemli bir farkı da aynı grup içinde bulunabilecek yeni
türlere rastlama ve tanıma şansının olmasıdır. Tekniğin uygulanışı ve aşamaları şekil
2-6, şekil 2-7 ve şekil 2-8’de görülmektedir.
Köpeklerde RLB, ilk kez 2004 yılında Matjila ve ark. tarafından Babesia
canis’in alt türlerini ayırt etmede kullanılmıştır (75) .
Şekil 2-6: DNA ekstraksiyonu ve catchall PCR aşaması (105)
26
Şeki
l 2-7
: PC
R ü
rünl
erin
in g
örün
tüle
nmes
i ve
sent
etik
olig
onük
leot
idle
rin
mem
bran
a tu
ttur
ulm
ası (
105)
27
Şeki
l 2-8
: Örn
ekle
rin
yükl
enm
esi,
hibr
idiz
asyo
n ol
uşm
ası v
e si
nyal
leri
n gö
rünt
ülen
mes
i (10
5)
28
2.12.Tedavi
Düşük patojeniteli Babesia türleri ile enfekte olan hayvanlar genellikle tedavi
edilmeksizin iyileşir (92). Hastalığın tedavisinde; Diminazene aceturate, Phenamidine
isethionate, İmidocarb, Clindamycine, Trypan Blue, Acaprin tedavide en çok kullanılan
etken maddelerdir (15, 79, 113). Genel olarak babesial ilaçlar B. canis’e karşı daha
etkilidir. Babesia gibsoni enfeksiyonlarında tedavi sonrası relapslar görülebilir (78).
Diminazene aceturate’ın yan etkilerinden dolayı hiperakut babesiosisli köpeklerde bu
ilaç kullanılmamalıdır. Enfeksiyonu yok etmek için Diminazenden sonra İmidocarb
gerekebilir (61). Babesia gibsoni enfeksiyonlarında Diminazene aceturate tedavisi
klinik olarak etkili olsa bile enfeksiyonu temizlemez (92). Imidocarb diproprionate
Babesia gibsoni enfeksiyonun şiddetini azaltsa bile hastalığı yok edici spesifik bir
tedavi değildir (8). Trypan Blue Babesia canis enfeksiyonlarında etkili olup B. gibsoni
enfeksiyonlarında etkisi yoktur (70). Phenamidine isethionate Babesia canis ve
B. gibsoni enfeksiyonlarında etkilidir (92, 102, 114).
Semptomatik ve destekleyici olarak sıvı sağaltımı, kemoterapi ve asidozise karşı
sodyum bikarbonat uygulaması yapılır. Şiddetli enfekte hayvanlarda asidozis ve şok
gelişmiş ise sıvı tedavisi gerekebilir. Ayrıca şiddetli anemik hayvanlara kan
transfüzyonu yapılabilir (92). Tedavi süresince hayvan iyileşme durumu açısından
gözetim altında tutulmalıdır. (70) Babesiosisde tedavi ile veya kendiliğinden iyileşme
sonrası parazitler konaktan tamamen kaybolmazlar. Konak taşıyıcı olarak kalır ve
enfeksiyon daha sonra tekrarlayabilir Tedavide parazite karşı tedavi ile birlikte
destekleyici tedavi gerekebilir. Destekleyici tedavide hipoksiyi önlemek için kan veya
sentetik hemoglobin gerekebilir. Intravasküler volum artırılmalıdır. Bazı hastalarda
oksijen tedavisi gerekebilir (4, 11, 16). Steroidler, immuniteye bağlı anemi,
trombositopeni veya şok tedavisinde faydalı olsalar da enfeksiyondaki kullanımları
tartışmalıdır. Steroidlerin kullanılması durumunda, hayvan gözetim altıda tutulmalıdır.
Çünkü immuniteyi baskılamak parasitemiyi kötüleştirebilir (70). Tedavi gören hayvan
daha sonraki enfeksiyondan tamamen kurtulamaz, ancak yeniden enfekte olursa klinik
belirtiler daha hafif seyreder (111). Köpeğin bulunduğu bölgeye göre risk altında
bulunması göz önünde tutularak profilaktik tedavi uygun olabilir (61).
29
2.13.Korunma
Babesiosis enfeksiyonlarından sonra oluşan kronik, semptomsuz taşıyıcılık
durumu daha sonra oluşacak enfeksiyonlara karşı köpeği dirençli hale getirir (15).
Korunma, kenelerin kontrol altına alınması ve yok edilmesi ile taşıyıcıların
bilinmesi ve gözetim altında tutulmasını içerir (70, 104). Korunmada hem hayvanın
hem de çevrenin kontrol altında tutulması, vektör kene Rhipicephalus sanguineus’un
yaşam çemberinden dolayı önemlidir. Köpeğin kanında mikroskobik veya serolojik
olarak B. canis veya B. gibsoni’den herhangi biri bulunmuşsa, bu köpek kan verici
olarak kullanılmamalıdır. Kan verici olarak kullanılacak hayvan mutlaka splenoktomi
uygulanarak iki hafta gözetim altında tutularak durumu netleştirilmelidir. Korunmada
uygulanacak diğer bir yöntem aşılamadır. Doku kültüründen elde edilen, B. canis’in
avirulent suşundan hazırlanan Pirodox isimli bir ticari preparat vardır. Ancak bu aşı
yalnızca Fransa’da bulunmakta olup, yurdumuzda kullanılmamaktadır. Daha önce
yapılan çalışmalarda aşının hastalığı tamamen önleyemediği, ancak klinik semptomları
hafiflettiği ve ölüm oranını azalttığı bildirilmiştir (12, 100, 104). Ayrıca B. canis ve B.
gibsoni’de premunisyon sağlayarak akut ve şiddetli enfeksiyonları önler (61).
Köpekler küçük bir bölgede yaşıyorlarsa kene enfestasyonlarına karşı kontrol
edilmeleri daha kolay olabilir ve böylece Babesia enfeksiyonlarından korumak mümkün
olabilir (92). Bu amaçla; hayvana bir akarisit uygulanmalı, boynuna pire /kene tasması
takılmalı, yaşadıkları yerlere akarisit uygulanmalıdır. Hayvan enzootik bölgeye giderse,
hastalığın klinik semptomları yönünden dikkatlice incelenmeli ve enfeksiyon
durumunda tedavi edilmelidir. Enfeksiyonu geçiren hayvan daha sonra immunite
kazanır ve sonraki enfeksiyonlara karşı dirençli hale gelir (71). Kenenin hastalığı
nakletmesi için en az üç güne ihtiyaç olduğundan, alternatif olarak her gün kenelerin
hayvandan uzaklaştırılması korunmada etkili olabilir. Rhipicephalus sanguineus köpek
barınaklarında hatta insanların evlerinde bile bulunabildiği için, düzenli olarak kene
mücadelesi yapılmalıdır (102).
30
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1.Saha Çalışması
Bu çalışmanın materyalini Aralık 2004-Haziran 2005 tarihleri arasında, % 95 CI
( Confident Interval- Güven Limiti) ve % 5 Absolute kesinlik sağlamak üzere (29)
İstanbul ili sınırları içinde bulunan 11 farklı barınaktaki 370 adet sokak köpeğinden ve
İstanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi Kliniklerine getirilen 123 adet sahipli köpekten
alınan toplam 493 kan örneği oluşturmuştur. Kan alınan merkezler ve köpek sayıları
Tablo 3-1’de verilmiştir. Kan, köpeklerin Vena cephalica’sından veya Vena
jugularis’inden alınmıştır. Kan örneği alınan köpeklerin genel durumları, klinik olarak
semptomlu olup olmadıkları, yaş ve cinsiyetleri kaydedilmiştir. Her bir köpekten
yaklaşık 4 ml kan steril vakumlu EDTA (di-sodium ethylenediaminetetra-acetic acid)
içeren hazır ticari tüplere (Greiner bio-one, Austria) alındı. Kanlar soğuk zincirde (buz
çantası) taşınarak İstanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı
laboratuvarına getirildi.
Tablo 3-1: Kan alınan merkezler ve örnek sayıları
Merkez Hayvan sayısı
Küçükçekmece 30
Bahçelievler 40
Avcılar 16
Kağıthane 39
Büyükçekmece 35
Zeytinburnu 40
Altınşehir 40
Kemerburgaz 51
Kadıköy 40
Ümraniye 19
Beylikdüzü 20
İ.Ü. Vet.Fak.Klinikleri 123
Toplam 493
31
3.2.Laboratuar Çalışmaları
3.2.1.Mikroskobik inceleme
EDTA’lı tüp içinde bulunan kan örneklerinden İstanbul Üniversitesi Veteriner
Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı laboratuvarında her bir hayvana ait 2’şer adet
sürme preparat hazırlandı. Preparatlar havada kurutularak, metanolde (Merck,
Germany) 5 dakika tespit edildi. Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi
Parazitoloji Anabilim Dalı laboratuvarında pH: 7.2 olan Giemsa’nın boya tamponu
(Gurr, buffer tablets pH: 7.2, BDH, England) ile hazırlanmış %5’lik Giemsa boya
solüsyonu (Merck, Germany) içinde 45 dk. süreyle boyandı. Daha sonra preparatlar
aynı tampon solüsyonu ile yıkanarak havada kurutuldu ve immersiyon yağı damlatılarak
x1000 büyütmede ışık mikroskobunda (Nikon, Japonya) incelendi. Her bir preparat
hakkında en az 50 saha gezilerek karar verildi. Pozitif bulunan preparatların
parazitemisi, 1000 eritrosit içindeki parazitli eritrosit oranına göre hesaplandı (76). Bu
aşamada kullanılan solüsyonların ad ve içerikleri 3.3’te verilmiştir.
3.2.2.Kan örneklerinin PCR-RLB için hazırlanması ve saklanması
Kan örnekleri EDTA’lı tüp içinde alt üst edilerek donma ve çözülmenin
etkilerinden korumak amacıyla çoklu kullanım gerekmesi olasılığına karşı 1.5 ml’lik
steril eppendorf tüplere bölünerek -20 oC’de saklandı. Soğuk zincir ile taşınarak ADÜ
Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı laboratuvarına getirildi ve işlenene kadar
-80 oC’de saklandı.
3.2.3.DNA Ekstraksiyonu
DNA ekstraksiyonu ADÜ Veteriner Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı’nda
herhangi bir kontaminasyonu önlemek amacıyla, kan protozoonu çalışılmayan bir
laboratuvarda aseptik kurallara uyularak yapıldı (69).
DNA örnekleri, -80 oC’de saklanmış olan kanlardan izole edildi. Kan örneği
önce oda sıcaklığında çözdürülerek 10-15 sn. vorteksle karıştırıldı. Tam kandan
genomik DNA izolasyonu, Wizard® Genomic DNA Purifikasyon Kiti (Promega
Corporation,USA) kullanılarak firmanın bildirdiği prosedüre göre yapıldı. Kısaca, 200
µl kan örneği steril 1,5 ml’lik eppendorf tüplere (Axygen,USA) koyularak üzerlerine
32
600 µl cell lysis solüsyonu ilave edilip 5-6 kez alt üst edilerek karıştırıldı. Karışım oda
sıcaklığında 10 dk inkubasyona bırakıldı. İnkubasyon süresince tüpler 2-3 kez alt üst
edildi. İnkubasyon sonunda örnekler mikrosantrifüj cihazında (Eppendorf AG,
Germany) oda ısısında 14,500 x rpm’de 20 sn. santrifüj edildi. Santrifüj sonunda dipteki
çöküntüye dokunulmadan üstteki sıvı uzaklaştırıldı. Donmuş kandan DNA izole edildiği
için dipteki çöküntünün üzerine 600µl cell lysis solüsyonu eklenip 5-6 kez alt üst
edilerek karıştırıldı ve tekrar aynı şartlarda santrifüj edildi. Üstteki sıvı uzaklaştırılarak
dipte kalan çöküntü süspansiyon haline gelene kadar 10-15 sn vortekslendi. Üzerine 200
µl nuclei lysis solüsyonu eklenip 5-6 kez pipetle alt üst edildi. Daha sonra 37 oC’de bir
saat inkubasyona bırakıldı. İnkubasyon sonunda üzerlerine 1 µl RNase solüsyonu
eklenerek 2-3 kez pipetle alt üst edildi ve 37 oC’de 15 dk inkubasyona bırakıldı.
Örnekler oda ısısına getirilerek üzerlerine 70 µl protein presipitasyon solüsyonu
eklenerek 10-20 sn vortekslendi. Daha sonra oda sıcaklığında 14,500 x rpm’de 3 dk
santrifüj edildi. Dipte kalan çöküntüye dokunulmadan üst sıvı alınarak 1,5 ml vida
kapaklı tüplere (Axygen, USA) aktarıldı ve üzerine 200 µl isopropanol (Merck,
Germany) eklendi. Beyaz DNA yumağı oluşuncaya kadar tüp alt üst edildi ve 14,500 x
rpm’de 1 dk santrifüj edildi. Santrifüj sonunda dipte toplanan DNA’ya dikkat edilerek
üstteki kısım döküldü. Üzerine 200 µl %70’lik etanol (Merck, Germany) konarak DNA
yıkandı ve tekrar 14,500 x rpm’de 1 dk santrifüj edildi. Üstteki etanol pipetle dikkatlice
uzaklaştırılarak tüpler temiz kurutma kağıtları üzerine ters çevrilerek kurumaya
bırakıldı. Daha sonra tüplere 70 µl DNA rehidrasyon solüsyonu eklenip 65 oC’de bir
saat inkubasyona bırakıldı. İnkubasyon sonunda DNA, PCR da kullanılmak üzere + 4 oC’de saklandı. Bu aşamada kullanılan madde, kit ve solusyonların ad ve içerikleri
3.3’te verilmiştir.
3.2.4.PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu)
B. canis türüne ait pozitif kontroller ADÜ Veteriner Fakültesi Parazitoloji
Anabilim Dalı’ndan, B. gibsoni türünün pozitif kontrolleri ise Alcalá de Henares
Üniversitesi Mikrobiyoloji ve Parazitoloji Departmanından sağlanmıştır.
Kontaminasyonu önlemek için; stok primer solüsyonlarının sulandırılması,
deoksinükleotit trifosfat (dNTPs) karışımlarının hazırlanması ve PCR karışımının
hazırlanması, ultraviole sterilizasyonu olan laminar akım kabininde (Nüve, Turkey)
33
yapıldı. Bu aşamada kullanılan bütün araç ve gereç (otomatik pipet, taşıma kapları,
vorteks, spin santrifüj vs.) sadece PCR için kullanıldı.
İlk aşama PCR için Theileria ve Babesia soylarında parazitlerin 18S ssu rRNA
(Small Subunit Ribozomal RNA) geninin V4 değişken bölgesinden büyüklüğü 460-540
bp (base pairs= baz çifti) arasında değişen bir parçayı amplifiye eden genel primerler
(RLB- F2: 5'-GAC ACA GGG AGG TAG TGA CAA G-3' ve RLB -R2: biotin-5'-CTA
AGA ATT TCA CCT CTG ACG AT-3') kullanıldı (41). Primerler, özel
modifikasyonlarla sentez yapabilen Thermo Electron GmbH (Germany) firmasına
yaptırıldı. PCR reaksiyon karışımı toplam 40 µl reaksiyon sıvısında;1 x PCR buffer
(10x PCR buffer: 20mM Tris-HCl pH: 8.0, 100mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1mM DTT,
0,5 % Tween® 20, 0,5 % Nonidet P-40 ve 50 % Gliserol) (Promega, USA), 1,25 U
TaqBead Hot start polimeraz (Promega, USA), 2,0 mM MgCl2 (Promega, USA), 200
µM dNTP \ dUTP (200µM herbir dATP,dCTP, dGTP ile 100µM dTTP ve dUTP)
(Roche Diagnostics, Germany), 25 pmol forward ve reverse primerleri (Thermo
Electron GmbH, Germany) olacak şekilde, DNase-free ependorf tüplerinde (Axygen
,USA) hazırlandı. Bu reaksiyon karışımından deneye alınacak örnek sayısı kadar PCR
tüpüne (Axygen,USA) 35µl koyuldu ve üzerlerine karışımın buharlaşmasını engellemek
amacıyla bir damla steril mineral yağ (Sigma-Aldrich, Germany) damlatıldı.
Laboratuarın başka bir bölümünde PCR tüplerine pipetle mineral yağın altına inilmesine
özen gösterilerek 5µl DNA örneği eklendi. Tüpler thermal cycler cihazına (GeneAmp
PCR Sistem 2400, Perkin Elmer, UK) yerleştirilene kadar buz üzerinde bekletildi. PCR
siklusları, 2. siklustan itibaren her iki siklus sonunda bağlanma sıcaklığı 57 oC 'ye inene
dek 2 oC düşecek şekilde (Touchdown PCR) programlandı. PCR şartları Tablo3-2 de
verilmiştir. Her PCR reaksiyonunda bir pozitif kontrol (B. canis pozitif olan köpeğin
kanından elde edilen DNA ), negatif kontrol (Babesia negatif köpek kanından elde
edilen DNA) ve negatif DNA kontrol (5 µl bidistile su) kullanıldı.
34
Tablo 3-2: PCR şartları
3.2.5.PCR Ürünlerinin Görüntülenmesi
Elde edilen PCR ürünlerinin görüntülenmesi için 1x TAE (Tris-Asetat-EDTA)
tamponu ve agaroz ile %2’lik agaroz jel hazırlandı (98). Agaroz jelin soğuması
aşamasında 2µl Ethidium bromide solüsyonu eklenerek karıştırıldı. Jel hazırlandıktan
sonra, örneklerden 10 µl alınıp, 2,5 µl 6x yükleme tamponu (Fermentas, USA) ile
karıştırılarak yatay elektroforez tankına (Bio Rad 1000, USA) yerleştirilen jelin
kuyucuklarına yüklendi ve sabit akımda 90 Voltta (Bio Rad Power Pac 1000, USA) 25
dk yürütüldü. Her jelde ilk kuyucuğa bantların bp değerlerini belirlemek amacıyla 100
1 siklus 95 oC 5 dk.
2 siklus 94 oC 67 oC 72 oC
20 sn. 30 sn. 30 sn.
2 siklus 94 oC 65 oC 72 oC
20 sn. 30 sn. 30 sn.
2 siklus 94 oC 63 oC 72 oC
20 sn. 30 sn. 30 sn.
2 siklus 94 oC 61 oC 72 oC
20 sn. 30 sn. 30 sn.
2 siklus 94 oC 59 oC 72 oC
20 sn. 30 sn. 30 sn.
40 siklus 94 oC 57 oC 72 oC
20 sn. 30 sn. 30 sn.
1 siklus 72 oC 10 dk.
35
bp’lik DNA cetveli (GeneRuler 100bp DNA Ladder, Fermentas) yüklendi. Yine her
jelin birer kuyucuğuna pozitif ve negatif kontroller yüklendi. Jeller UV transilluminatör
üzerine koyularak bantlar görünür hale getirildi ve DNA cetveliyle karşılaştırılarak
beklenen bantlar saptandı. PCR ürünlerinden kalan 30 µl ise daha sonra RLB
hibridizasyonunda kullanılmak üzere +4 oC 'de saklandı. Bu aşamada kullanılan madde
ve solüsyonların ad ve içerikleri 3.3’te verilmiştir.
3.2.6.Reverse Line Blot Hibridizasyonu:
3.2.6.1 Membranın Hazırlanması ve Sentetik Oligonükleotidlerin Membrana Bağlanması:
Laboratuarda blotladığımız (PCR ürünü ile hibrid yapabilecek
oligonükleotidlerin membrana yerleştirilmesi) Biodyne-C membran (PALL Gelman
Laboratory, USA), Matjila ve ark. (75) ile Gubbels ve ark.(43)’nın bildirdiği şekilde
hazırlandı. Kısaca, oda ısısında 10ml, %16 EDAC (1-ethyl-3-(3-dimethylamino-
propyl)carbodiimide) (Sigma,USA) solusyonu ile 10dk membran aktive edildi. Distile
su ile yıkandı ve MN45 miniblottera (Isogen Life Sciences, The Netherlands)
yerleştirildi (Şekil 3-3).
Şekil 3-3: Membranın miniblottera yerleştirilmesi.
Bu aşamada kullanılan oligonükleotidlerin tamamı negatif yüklü Biodyne-C
membrana kovalent olarak bağlanabilmeleri amacıyla 5' terminallerinde amino grubu
[N-terminal N-trifluoracetamidohexyl-cyanoethyl,N,N-diisopropyl phosphoramidite
(TFA)-C6 amino linker] olacak şekilde Thermo Electron GmbH (Germany) firmasına
sentezlettirildi. Oligonükleotidler 500mM NaHCO3 (pH 8.4) içinde 50-900 pmol/150µl
konsantrasyonlarda sulandırıldı (Tablo 3-3). Membran üzerindeki yıkama sıvıları iyice
36
aspire edildikten sonra, her bir oligonükleotidden 150 µl miniblotterın ayrı kanallarına
döküldü ve oda ısısında 1 dk inkübe edildi (Şekil 3-4). Kanallarda bulunan
oligonükleotidlerin solüsyonları aspire edilerek membran miniblotterdan çıkarıldı ve
100mM NaOH içinde 10dk inkübe edilerek inaktive edildi. Son olarak membran 2x
SSPE (Sigma, USA) / %0.1 SDS (Sigma,USA) karışımı ile 60 °C’de 5 dk yıkanarak
kullanıma hazır hale getirildi. Membrana bağlanan oligonükleotidlerin ayrıntılı bilgileri
Tablo3-3’de verilmiştir.
Tablo 3-3: RLB hibridizasyon tekniğinde kullanılmak üzere Biodyne C membrana tutturulan aminolinkerli oligonükleotidlerin 5'-3' dizilişleri
Özgün tür Diziliş (5'-3')a (pmol)* Kaynak
Theileria/Babesia
(CatchAll) TAATGGTTAATAGGARCRGTTG 50 43
B.canis rossi CGGTTTGTTGCCTTTGTG 200 75
B.canis vogeli AGCGTGTTCGAGTTTGCC 400 75
B.canis canis TGCGTTGACGGTTTGAC 400 75
B.gibsoni TACTTGCCTTGTCTGGTTT 900 28
T.annulata CCTCTGGGGTCTGTGCA 100 43
B.bovis CAGGTTTCGCCTGTATAATTGAG 200 43
*Konsantrasyon, a T: thymine; A: adenine; C: cytosine; G: guanine; R: A veya G
3.2.6.2. PCR Ürünlerinin Membrandaki Oligonükleotidlerle Hibridizasyonu:
Bu aşamada iki farklı membran-blot kullanıldı. İlk membran-blot laboratuvarda
tarafımızca hazırlanan (3.2.6.1), ikinci olarak da Isogen tarafından ADÜ Veteriner
Fakültesi Parazitoloji Anabilim Dalı’na deneme amaçlı gönderilen TBD-RLB Kit
(Isogen Life Science, Netherland) hazır membran-blotu kullanıldı. Böylece
hazırladığımız membrandaki pozitif örneklerin RLB sonuçları hazır blotla da konfirme
edildi ve pozitif bulunan örneklerde, kendi hazırladığımız membranda oligonükleotidi
37
bulunmayan diğer Babesia ve Theileria türlerinin (B. equi gibi) de bulunup bulunmadığı
kontrol edildi. Ticari membranda bulunan spesifik oligonükleotidler Tablo 3-4.’te
verilmiştir. Hibridizasyon Matjila ve ark. (75) ile Gubbels ve ark.(43)’na göre yapıldı.
Buna göre, önceden elde edilmiş olan PCR ürünlerinden 10'ar µl alınıp 2x SSPE / %0.1
SDS karışımı ile 150µl’ye tamamlanarak 100 °C’de 10 dk thermal cyclerda denatüre
edildi. Denatüre edilen ürünler buz üzerine alınarak kısaca santrifüj edildi (Eppendorf
Ag, Germany). Membran daha önceden uygulanan oligonükleotidlerin tersi yönünde 90
°C çevrilerek miniblottera yerleştirildi. Membran üzerinde kalan fazla sıvılar pipetle
aspire edildi. Denatüre edilen PCR ürünleri ayrı kanallara dökülerek, daha önce ayrı
sıralara dökülmüş oligonükleotidler ile 42 °C’de 1 saat boyunca (çalkalama olmaksızın)
inkübe edilerek hibridize olmaları sağlandı. RLB tekniğinde hibridizasyon prensibi
şematik olarak Şekil 3-4’de verilmiştir.
Tablo 3-4: Ticari membrana kovalent olarak bağlanmış oligonükleotidler
Sıra Türler Sıra Türler1 Ehrlichia/Anaplasma catch-all 19 Babesia canis rossi2 Anaplasma centrale 20 Babesia canis canis3 Anaplasma marginale 21 Babesia canis vogeli4 Anaplasma phagocytophilum 22 Babesia major 5 Anaplasma phagocytophilum 23 Babesia bicornis 6 Anaplasma phagocytophilum 24 Babesia caballi 7 Anaplasma phagocytophilum 25 Theileria sp Kudu8 Ehrlichia ruminantium 26 Theileria sp Sable9 Anaplasma bovis 27 Theileria bicornis10 Ehrlichia chaffeensis 28 Theileria annulata11 Ehrlichia sp (Omatjenne) 29 Theileria buffeli 12 Ehrlichia canis 30 Theileria sp Buffalo13 Theileria/Babesia catch-all 31 Theileria mutans 14 Babesia felis 32 Theileria parva 15 Babesia divergens 33 Theileria taurotragi16 Babesia microti 34 Theileria velifera 17 Babesia bigemina 35 Theileria equi 18 Babesia bovis 36 Theileria lestoquardi
38
Şekil 3-4: RLB hibridizasyonunun şematize prensibi (TBD-RLB Kit Manual, Isogen Life Sciences)
Bu sürenin sonunda kanallardaki solüsyonlar aspire edildi ve membran alınarak
50 °C’de 10 dk 2x SSPE / %0.5 SDS ile iki kez yıkandı. Ardından membran 42 °C’de
30 dk süreyle 10 ml peroksidaz ile işaretlenmiş streptavidin konjugatı (Roche,
Germany) (2x SSPE/ %0.05 SDS ile 1:4000 oranında sulandırılmış) içinde inkubasyona
bırakıldı. İnkübasyondan sonra membran 2x SSPE / %0.5 SDS ile 42 °C’de iki kez 10
dk daha sonra da 2x SSPE ile oda ısısında iki kez 5’er dk yıkandı. Son olarak membran
10 ml ECL tespit sıvısında (Amersham, UK) 1 dk bekletildi. Membran karanlık odada
Kodak Biomax Light Film (USA) altında 30 sn ile 10 dk. arasında tutuldu. Daha sonra
film banyo edildi. Filmler üzerinde oligonükleotidler ve PCR sıralarının kesiştiği
yerlerde oluşan siyah lekeler pozitif olarak kabul edildi (Şekil 3-5). Daha sonra
membran tekrar kullanıma hazır hale getirmek için 80 °C’de %1 SDS solüsyonu ile 30
dk. iki kez yıkandı ve oda sıcaklığında 15 dk 20mM EDTA ile muamele edildikten
sonra tekrar hibridizasyonlarda kullanılmak üzere, üzeri 20mM EDTA ile kaplanarak +4
°C’de saklandı. Bu aşamada kullanılan cihaz ve malzemelerin ad ve içerikleri başlık 3.3
altında verilmiştir.
39
Şekil 3-5: Oligonükleotidler ve PCR ürünlerinin membrana uygulanış şekli ve pozitifliğin oluşması
3.3. Gereç ve Yöntemde kullanılan cihaz ve malzemelerin listesi
Kullanılan Cihazlar
1. Işık mikroskop (Nikon, Japan)
2. Vorteks (Heidolph-Reax 2000, Germany)
3. Mikrosantrifüj (Eppendorf AG, Germany)
4. Su banyosu (Memmert, Germany)
5. Laminar akım kabini (Nüve, Turkey)
6. Thermal cycler (GeneAmp PCR sistem 2400 Perkin Elmer, UK)
7. Yatay elektroforez tankı (Bio Rad 1000 USA)
8. MN45 miniblotter (Isogen Life Sciences, The Netherlands)
9. Etüv (Memmert, Germany)
40
Mikroskopide kullanılan solüsyonlar: Metanol (Merck, Germany)
Giemsa stok solusyonu (Merck, Germany)
Giemsa’nın boya tamponu (BDH, England): 100 ml distile su içine 1 adet tablet
koyularak hazırlandı (pH: 7.2).
DNA ekstraksiyonunda kullanılan kit içeriği: Cell lysis solüsyonu
Nuclei lysis solüsyonu
RNase solüsyonu
Protein presipitasyon solüsyonu
DNA rehidrasyon solüsyonu
Ayrıca kitte bulunmayan isopropanol ve % 70 etanol kullanılmıştır.
PCR Ürünlerinin Görüntülenmesinde kullanılan kimyasal ve solüsyonlar X 50 TAE (Tris-acetate\EDTA Elektroforez) Solüsyonu
Tris 242 g
0,5 M EDTA 100 ml
Distile su ile 1 lt’ye tamamlanır
PH 57,1 ml glasiyel asetik asit ile 7,7- 8,0’a ayarlanır.
Bu stok solüsyondan 10 ml alınarak distile su ile 500 ml ye tamamlandı ve X10 TAE
kullanma solüsyonu hazırlandı.
%2 Agaroz Jel Hazırlanması
Agarose(Sigma) 1,041g
1X TAE Buffer 50 ml
Ethidium Bromide 2µl
41
Ethidium Bromide(10mg/ml) Hazırlanması
Ethidium Bromide 1 g
Distile su 100ml
RLB'de Kullanılan Solüsyonlar 500 mM NaHCO3 (pH 8.4) Hazırlanması
NaHCO3 42,005 g
Distile su ile 1 lt’e tamamlanır.
100 mM NaOH Hazırlanması
NaOH 40,0 g
Distile Su ile 1 lt’e tamamlanır.
20X SSPE Hazırlanması (Sodiumklorür-monosodyumfosfat-EDTA hibridizasyon
buffer)
NaCl 175,3 g
NaH2PO4 - H2O 27,6 g
EDTA 7,4 g
Distile Su 800 ml
Tamamı 1 litre distile suya tamamlanır. PH ~ 6,5 ml 10 N NaOH ile 7,4'e ayarlanır.
10X SDS (Sodyum dodesil sülfat) Hazırlanması
SDS 50,0 g
Distile su ile 500 ml’e tamamlanır.
HCl ile pH 7,2 ye ayarlanır.
42
0,5 M EDTA Hazırlanması (Disodium ethylenediaminetetraacetate.2H2O)
Disodium ethylenediaminetetraacetate.2H2O 186,1 g
Distile su 800 ml
~ 20 g NaOH tanesi ile pH 8.0’e ayarlanır.
% 16 EDAC (1-ethyl-3-(3-dimethylamino-propyl)carbodiimide) (Sigma,USA):
*EDAC 1,6 g
Distile su ile 10 ml’ye tamamlanır
*Taze olarak hazırlanır.
43
3.4. İstatistik Analiz
Mikroskobik bakı, PCR ve RLB sonuçlarının değerlendirilmesi ki-kare testi ile,
merkezlerin, dişi ve erkek, genç ve yaşlı grupların değerlendirilmesi ‘one-way ANOVA
testi’ üzerine, Tukey’s çoklu karşılaştırması uygulanarak yapılmıştır.
44
4. BULGULAR
4.1.Mikroskobik Bulgular:
Köpeklerden alınan kan örneklerinden hazırlanan yayma preparatlar x1000
büyütmede ışık mikroskobunda incelenmiştir. 493 köpeğin 2 (% 0,4)’sinde Babesia
trofozoitleri görülmüştür (Şekil 4-1). Trofozoitlerin boyutları 4-5 µm arasında (ortalama
4,2 µm ) ölçülmüştür (Mikroskop:Nikon/Japan Program: Image-Pro Plus 5.1). Görülen
Babesia etkenleri morfolojik yapı ve büyüklüklerine göre Babesia canis olarak
tanımlanmıştır (64). Bu iki örnekteki parazitemi oranının % 0,1 ve % 0,32 olduğu tespit
edilmiştir. Mikroskopik bakı sonuçlarının odaklara göre dağılımı Tablo 4-1’de
verilmiştir.
Tablo 4-1: Mikroskopik bakı sonuçlarının odaklara dağılımı
Merkezler Hayvan sayısı Pozitif %
Küçükçekmece 30 - -
Bahçelievler 40 - -
Avcılar 16 - -
Kağıthane 39 - -
Büyükçekmece 35 - -
Zeytinburnu 40 - -
Altınşehir 40 - -
Kemerburgaz 51 - -
Kadıköy 40 - -
Ümraniye 19 - -
Beylikdüzü 20 - -
İ.Ü. 123 2 1,4
Toplam 493 2 0,4
45
Şekil 4-1: Babesia trofozoitlerinin sürme preparatta görünüşleri (x1000 büyütme)
4.2.PCR bulguları
Theileria/Babesia cinslerine spesifik primerler kullanılarak yapılan PCR
sonucunda, 493 kan örneğinin 11 (% 2,2)’inde pozitiflik saptanmıştır. PCR sonuçlarının
odaklara göre dağılımı Tablo 4-2’ de verilmiştir.
Tablo 4-2: PCR sonuçlarının odaklara dağılımı
Merkezler Hayvan sayısı Pozitif %
Küçükçekmece 30 2 6,6
Bahçelievler 40 - -
Avcılar 16 - -
Kağıthane 39 1 2,5
Büyükçekmece 35 1 2,8
Zeytinburnu 40 - -
Altınşehir 40 - -
Kemerburgaz 51 3 5,8
Kadıköy 40 - -
Ümraniye 19 - -
Beylikdüzü 20 - -
İ.Ü. 123 4 2,8
Toplam 493 11 2,2
46
Theileria/Babesia cinsine spesifik primerler ile pozitif bulunan örneklerin
agaroz jel elektroforez görüntüleri, saptanan bantlar, DNA cetveline göre büyüklükleri
Şekil 4-2 ve 4-3’de verilmiştir.
Şekil 4-2: Theileria/Babesia cinslerine spesifik PCR sonucunda pozitif bulunan örneklerin agaroz jel elektroforez görüntüleri. M; DNA cetveli (100 bp), 1-2; pozitif örnekler, 3; negatif örnek, 4; negatif kontrol (köpek DNA’sı), 5; pozitif kontrol, 6; negatif kontrol (su), ok: ∼ 500bp
Şekil 4-3: Theileria/Babesia cinslerine spesifik PCR sonucunda pozitif bulunan örneklerin agaroz jel elektroforez görüntüleri. M; DNA cetveli (100 bp), 1-8;pozitif örnekler,9; pozitif kontrol, 10; negatif kontrol (köpek DNA’sı), 11; DNA negatif kontrol (su),ok: ∼ 500 bp
M 8 9 10 11
M 1 2 3 4 5 6 7
M 1 2 3 4 5 6
47
4.3.RLB bulgular
4.3.1.Laboratuvarda hazırlanan membranın sonucu
Theileria/Babesia cinslerine ait catch-all, B. canis canis, B. canis vogeli,
B. canis rossi, B. gibsoni, T. annulata ve B. bovis kullanılarak yapılan RLB
hibridizasyon sonuçlarına göre, 493 kan örneğinin 19 (% 3,9)’unda B. canis vogeli
bulunmuştur (Şekil 4-4A, Şekil 4-4B, 4-5). RLB sonuçlarının odaklara dağılımı Tablo
4-3’de verilmiştir.
Tablo 4-3: RLB sonuçlarının odaklara dağılımı
Merkezler Hayvan sayısı Pozitif %
Küçükçekmece 30 2 6,6
Bahçelievler 40 - -
Avcılar 16 - -
Kağıthane 39 1 2,6
Büyükçekmece 35 1 2,9
Zeytinburnu 40 - -
Altınşehir 40 - -
Kemerburgaz 51 3 6,0
Kadıköy 40 - -
Ümraniye 19 - -
Beylikdüzü 20 - -
İ.Ü. 123 12 9,8
Toplam 493 19 3,9
48
Şekil 4-4A: Theileria/Babesia cinslerine ait catch-all, B. canis canis, B. canis vogeli, B. canis
rossi, B. gibsoni, T. annulata ve B. bovis oligonükleotidleri kullanılarak hazırlanan
membranda yapılan reverse line blot hibridizasyon sonuçlarının görüntüsü. (Banyo süresi
3 dk) (A); Theileria/Babesia catch-all, (B); Babesia canis canis, (C); Babesia canis vogeli, (D); Babesia canis
rossi, (E); Babesia gibsoni, (F); Theileria annulata, (G); Babesia bovis. 1; Babesia canis vogeli kontrol, 2; Babesia
gibsoni kontrol, 3-21; örnekler, 22; Theileria annulata kontrol, 23; Babesia bovis kontrol.
Şekil 4-4B: Theileria / Babesia cinslerine ait catch-all, B. canis canis, B. canis vogeli, B.
canis rossi, B. gibsoni, T. annulata ve B. bovis oligonükleotidleri kullanılarak hazırlanan
membranda yapılan reverse line blot hibridizasyon sonuçlarının görüntüsü. Banyo süresi
5 dk. (A); Theileria/Babesia catch-all, (B); Babesia canis canis, (C); Babesia canis vogeli, (D); Babesia canis rossi,
(E); Babesia gibsoni kontrol (F); Theileria annulata kontrol, (G); Babesia bovis kontrol.
1; Babesia canis vogeli kontrol, 2; Babesia gibsoni kontrol, 3-21; örnekler, 22; Theileria annulata kontrol, 23; Babesia bovis kontrol.
A B C D E F
G
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
A B C D E
F G
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
49
4.3.2.TBD-RLB Kit hazır membranından elde edilen sonuçlar:
Laboratuvarda hazırladığımız membranda pozitif olarak belirlenen örneklerin
yeniden TBD-RLB membranı ile test edilmesi sonucunda 19 örneğin B. canis vogeli
olduğu bir kez daha teyit edilmiştir. Bunun dışında diğer Theileria veya Babesia
etkenlerinin oligonükleotidleri ile reaksiyon oluşmamıştır.
Şekil 4-5: TBD-RLB (Isogen, Netherland) membranı kullanılarak yapılan RLB hibridizasyon sonuçlarının görüntüsü. (A); kontrol DNA’lar, 1-19; pozitif örnekler
RLB sonucu pozitif köpeklerin yaş ve cinsiyete göre dağılımı Tablo 4-4’te
verilmiştir.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
A
50
Tablo 4-4: RLB sonucu pozitif örneklerin yaş ve cinsiyete göre dağılımı
cinsiyet yaş dişi erkek < 1 > 1
Merkezler
pozitif pozitif pozitif pozitif Küçükçekmece
2 2
Bahçelievler
Avcılar
Kağıthane
1 1
Büyükçekmece
1 1
Zeytinburnu
Altınşehir
Kemerburgaz
3 3
Kadıköy
Ümraniye
Beylikdüzü
İ.Ü. Vet. Fak. Klinikleri
9 3 12
Toplam 12 7 19
51
B. canis vogeli saptanan örneklerin kullanılan tekniklere göre dağılımı
Tablo 4-5’te verilmiştir.
Tablo 4-5: İstanbul ilinde, mikroskopi, PCR ve RLB ile tanımlanan Babesia canis vogeli’nin dağılımı
Küçükçekmece 30 2 2 2/19(10.53)
Bahçelievler 40 - - -
Avcılar 16 - - -
Kağıthane 39 1 1 1/19 (5,26)
Büyükçekmece 35 1 1 1/19 (5,26)
Zeytinburnu 40 - - -
Altınşehir 40 - - -
Kemerburgaz 51 3 3 3/19 (15,79)
Kadıköy 40 - - -
Ümraniye 19 - - -
Beylikdüzü 20 - - -
İ.Ü.Vet.Fak.Kli* 123 2 4 12 12/19(63,16)
Toplam 493 2 11 19 19
* İşaretli merkez ve diğer merkezler arasındaki farklılık istatistiksel olarak anlamlıdır (P<0,01)
Çalışmada incelenen tüm örneklerdeki pozitiflik oranlarına göre mikroskopi,
PCR ve RLB sonuçlarının karşılaştırılması Tablo 4-6’da verilmiştir.
Merkez Hayvan Mikroskopi PCR RLB Toplam (%)
52
Tablo 4-6: B. canis vogeli’nin tanısında mikroskopi, PCR ve RLB bulgularının karşılaştırılması
RLBb TOPLAM
– +
MBa – ; PCRb– 474 8 482
MBa – ; PCRb + 0 9 9
MBa + ; PCRb – 0 0 0
MBa + ; PCRb + 0 2 2
TOPLAM 474 19 493
MB: Mikroskopik bakı
a,b üstsimgelerini taşıyan gruplar arasındaki farklılık istatistiksel olarak anlamlıdır (P<0,001)
53
5. TARTIŞMA
Türkiye’de köpek babesiosisi ile ilgili ilk çalışma, Merdivenci’ye (81) göre,
Ankara’da Piroplasma canis’in mikroskopik olarak bulunduğunu bildiren Gören ve
Yetkin (40, kaynak:78 p.28) tarafından yapılmıştır. Daha sonra, 1961 yılında Ankara’da
bir köpekte Babesia canis’in varlığı mikroskobik olarak bildirilmiştir (87). Aydın ilinde
klinik babesiosis semptomları bulunan 7 köpekte B. canis PCR ile saptanmıştır (110).
Ege bölgesinde yapılan tarama çalışmasında, 383 köpeğin 40 (%10.44) ’ında B. canis
vogeli bulunmuştur (57). İstanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi kliniklerine getirilen
3 köpeğin kan örnekleri, Montpelliere hücre biyolojisi ve moleküler biyoloji
laboratuarına gönderilmiş ve örneklerde görülen Babesia altürleri PCR-RFLP yöntemi
ile B. canis vogeli olarak tanımlanmıştır (45). İstanbul ilinde, kliniklere anemi, yüksek
ateş gibi semptomlarla getirilen köpeklerde kan frotilerinde Babesia etkenlerinin
görüldüğü bilinmektedir. Ancak köpeklerde babesiosisin yaygınlığı ile ilgili bir
çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışma İstanbul ili köpeklerinde babesiosisin
yaygınlığının moleküler yöntemlerle taranması ve diğer Babesia/Theileria cinsindeki
türlerin araştırılması açısından ilk çalışmadır.
Son yıllarda çeşitli ülkelerde PCR yöntemi ile köpeklerdeki Babesia türlerinin
varlığı araştırılmıştır. Japonya’da 80 köpeğin 5 (% 6.3)’inin B. canis vogeli, 7
(% 8.8)’sinin B. gibsoni ile enfekte olduğu bildirilmiştir (51). Aynı ülkede yapılan diğer
bir araştırmada ise, 115 köpeğin 35 (% 30,4)’inde B. gibsoni enfeksiyonu tespit
edilmiştir (82). Slovenya’da 238 köpeğin 11 (% 4,6)’inde B. canis canis, 3 (% 1,3)’ünde
B. canis vogeli (27); Macaristan’da 44 köpeğin 39 (% 88.6)’unda B. canis canis
bulunmuştur (32); Sudan’da 78 köpeğin 5 (% 6.4)’inde B. canis rossi, 2 (% 2.5)’sinde
B. canis vogeli (86); Avustralya’da 55 köpeğin 22 (% 40)’sinde B. canis vogeli (72);
Brezilya’da ise 10 köpeğin hepsinde B. canis vogeli enfeksiyonu saptanmıştır (88).
Avrupanın değişik ülkelerinden temin edilen ve klinik semptom gösteren 11 köpeğin 10
(% 90)’unun B. canis canis, 1 (% 9)’inin B. canis vogeli ile enfekte olduğu
belirlenmiştir (17). Almanya’da klinik semptom gösteren 5 köpeğin B. canis,
İspanya’da ise 62 köpeğin T. annae ile enfekte olduğu bildirilmiştir (39, 97). Rusya’da
21 semptomlu köpekte B. canis canis (93), Amerika’da 150 köpekten 144’ünde
54
B. gibsoni (% 96) (8), Japonya’da 115 köpekten 35 tanesinde (% 30.4) B. gibsoni (82)
bulunduğu bildirilmiştir.
İstanbul ilinde yapılan bu çalışmada, klinik semptom gösteren 47 köpek
mikroskopik bakı, PCR ve RLB yöntemleri ile Babesia türleri yönünden incelenmiş ve
sırasıyla % 4,25, % 8,51 ve % 25,53 oranında B.canis vogeli saptanmıştır. Klinik belirti
göztermeyen köpeklerde mikroskopik bakı ile parazite rastlanmazken, PCR ve RLB ile
köpeklerin % 1,5’inde babesiosis tespit edilmiş ve enfeksiyona B. canis vogeli’nin
neden olduğu görülmüştür. Saptanan alt tür nadiren klinik semptom oluşturan ve hafif
şiddette enfeksiyona yol açan bir alt türdür (17). Diğer çalışmalarda da semptomsuz
köpeklerde görülme oranı % 1,3 ile % 6,3 arasında değişmektedir (39, 51). Bu
çalışmada rastlanan klinik şüpheli 2 köpeğin kan örnekleri her 3 yöntemle de pozitif
bulunmuştur. Semptomlu köpeklerden alınan kan örneklerinin incelendiği çalışmalarda
(8, 17, 93) % 90 ile % 90,6 arasında Babesia spp. pozitiflik oranı bildirilmiştir.
Köpeklerde piroplasmların RLB tekniği ile araştırılmasında Güney Afrika’da 326
köpekten 31’inde B. canis rossi (% 9,5), 13’ünde B. canis vogeli (% 3,9) (75),
Hollanda’da 23 köpekten 18’inde (% 78,2) B. canis canis bulunmuştur (74). Türkiye’de
ise Ege bölgesinde yapılan tarama çalışmasında B. canis spesifik primerleri kullanılarak
pozitif oldukları belirlenen 40 örneğin, RLB tekniği ile tekrar incelenmesi sonucunda
etkenin B. canis vogeli olduğu saptanmıştır (57).
Bu çalışmada ise toplam 493 köpek RLB ile Babesia türleri yönünden
incelenmiş ve 19 köpeğin B. canis vogeli ile enfekte olduğu bulunmuştur. Pozitif
örneklerin tamamının B. canis vogeli olması vektör kene Rhipicephalus sanguineus’un
Türkiye’de yaygın olarak bulunması (80) ile ilgili olabilir. Ancak aynı kene B.
gibsoni’nin de vektörü olmakla birlikte bu çalışmada B. gibsoni bulunamamıştır. Aynı
sonuç Ege Bölgesinde yapılan çalışmada da (57) gözlenmiştir ve yazar bu durumu,
sadece Babesia canis spesifik primerleri ile pozitif bulduğu örnekleri RLB ile incelediği
için B. gibsoni’ye rastlama şansının olmadığı şeklinde açıklamıştır. Ancak bu çalışmada
toplanan tüm kan örnekleri, RLB ile köpeklerdeki Babesia tür ve alt türleri yönünden
incelenmiş ve B. canis vogeli dışında diğer tür ve alt türlere rastlanmamıştır. Daha önce
Türkiye’de yapılan araştırmalarda da köpeklerde sadece B. canis vogeli’nin varlığı
bildirilmiştir (45, 57, 110).
55
Babesia türleri konak özgüllüğüne sahip oldukları için, ayırıcı tanı olarak
konaklarına göre tanıdan uzun süre yararlanılmıştır. Ancak son yıllarda B. microti’ ye
insanlarda ve primatlarda da rastlandığı, sığırlarda görülen B. divergens’in gerbil ve
insanlarda da görüldüğü bildirilmiştir (22, 106). Babesia gibsoni Kaliforniya izolatının
insan piroplasmlarına yakın genotipik ve antijenik yapıları olduğu, İspanya izolatının ise
B. microti’ye yakın olduğu bildirilmiştir (117). Babesia gibsoni ve B. microti
morfolojik benzerliklerinden dolayı mikroskobik tanıda ayırt edilemezler, serolojik
testlerde de çapraz reaksiyon verirler (22). Bu durum, moleküler yöntemlerin önemini
artırmaktadır. Ayrıca, moleküler teknikler ile son yıllarda köpeklerde T. annae ve
B. conradae gibi yeni etkenler tanımlanmıştır (58, 117). İstanbul ilinde yapılan bu
çalışmada, köpeklerde bulunabilecek Babesia ve Theileria türleri RLB ile araştırılmış
ve B. canis vogeli dışında diğer Babesia ve Theileria tür ve alt türlerine rastlanmamıştır.
Günümüzde moleküler tanı yöntemleri, bilinen klasik PCR yöntemlerinden,
DNA oligonükleotidleri memranda kullanılması gibi daha gelişmiş tekniklere kadar
çeşitlilik gösterir (43). Bu yöntemlerden kantitatif olanlar kullanılarak parazitler
hakkında sayısal anlamda da bilgi sağlanmasına karşın, sekans analizleri için
örneklerden bazıları seçildiği için kalitatif anlamda daha az bilgiye ulaşılır (24).
Moleküler tekniklerin tanıdaki bir özelliği de klinikte görülen parazitler üzerine
yoğunlaşmaları ve az görülen veya yeni bulunan parazitlerin tanısını
sağlayamamalarıdır (Atlarda B. equi, köpeklerde B. canis gibi). RLB tekniği ile farklı
cins ve türlerdeki piroplasmları aynı anda teşhis edebilmesi ve ayrımlarını yapabilmesi
özelliğinden dolayı bu güçlükler kısmen aşılmıştır (43). Bu teknikte de hibridizasyon
için belirli oligonükleotidler eklenmesi gerektiğinden yeni piroplasmların teşhis
edilemeyeceği belirtilmektedir (24). Ancak catch-all aşamasında pozitif bulunan
örneklerin membrandaki herhangi bir oligonükleotidle hibridize olmadığı ve sinyal
görülmediği durumlarda bu örnekler sekanslanarak yeni türlerin saptanabilme şansı
vardır. Çalışmamızda değerlendirilen 493 örnekten catch-all aşamasında pozitif bulunan
19 tanesi B.canis vogeli oligonükleotidiyle sinyal oluşturmuştur ve yeni bir türe
rastlanmamıştır.
İspanya’da seminested PCR ile yapılan çalışmada köpeklerde B. canis canis,
B. canis vogeli ve T. annae, 3 semptomsuz ve 1 adet semptomlu köpekte de ilk kez
B. equi bulunmuştur. Aynı çalışmada 1 atta da B. canis canis saptanmıştır. Bu örnekler
56
mikroskobik olarak incelendiğinde parazite rastlanmamıştır. Örneklerin karışmış olma
ihtimali tekrarlı yapılan PCR ile yok edilmiştir. Daha önce B. equi’nin köpeklerde
bildirilmemiş olması B. equi ile B. gibsoni’nin mikroskobik olarak ayrımlarının
yapılamamasından kaynaklanabilir (91, 118). Aynı şekilde daha önce atlarda B. canis
canis bulunamamasının da B. canis ile B. caballi’nin morfolojik olarak birbirinden
ayırt edilememesinden kaynaklandığı olabilir (91). Yeni parazitlerin, genotiplerin ya da
parazitlerin yeni konaklarının saptanması moleküler teknikler ile mümkün olmaktadır
(25). Köpeklerde babesiosisin tanısında kullanılan mikroskobik muayene ve serolojik
yöntemler tür ve alt tür ayrımlarında yeterli değildir. Mikroskobik muayene
piroplasmların genetik yapısını belirlemede kullanılamaz. Antikora dayalı tanı
yöntemleriyle ise çapraz reaksiyon nedeniyle Babesia tür ve alt türlerini kesin olarak
ayırt etmek mümkün değildir. Köpeklerde babesiosis etkenlerinin mikroskobik olarak
teşhis edilemeyeceğini ve ayrıca serolojik yöntemlerin de yanlış negatif sonuçlar
verdiğini gösteren yayınlar vardır (9, 11, 16). Dezavantajları olmakla birlikte PCR
yöntemleri değişik Babesia türleriyle oluşan enfeksiyonların tanı ve ayrımlarında pratik
bir yöntemdir. Aynı zamanda tedavi sonuçlarının belirlenmesinde de duyarlıdır (9).
PCR, mikroskobik muayene ve serolojik yöntemlere göre daha duyarlı bir tanı
yöntemidir (9, 14). Bu çalışmada incelenen 493 köpeğin mikroskobik olarak 2 tanesinde
(% 0,4) B. canis, PCR ile 11 tanesinde (% 2,2) Babesia/Theileria cins düzeyinde
pozitiflik, RLB ile 19 tanesinde (% 3,9) B. canis vogeli saptanmıştır. Kullanılan
yöntemler arasında, mikroskobi ile PCR ve RLB sonuçları arasındaki farklılık
istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (P<0, 001).
PCR yöntemleri ile yapılan çalışmalarda hem köpeklerdeki parasiteminin
dalgalanmaları hem de yöntemlerin standardize olmaması nedeniyle duyarlılık
karşılaştırması yapılamamaktadır. Babesia türlerinin PCR ile tanısı konusunda yapılan
çalışmaların büyük çoğunluğunda tanı alt limiti saptanmamıştır. Sadece Fukumoto ve
arkadaşları köpeklerde B. gibsoni’nin tanısında uyguladıkları PCR tanı alt limitini
bildirmişlerdir (36). PCR ile yapılan çalışmalarda en küçük saptanabilecek parasitemi
yüzdesini bildiren çalışmalar olmakla birlikte (9, 17, 19, 59, 60, 116) parasitemideki
dalgalanmalar ve teknik farklılıkları nedeniyle bu tip sonuçları birbiriyle karşılaştırmak
mümkün olmamaktadır. Ancak deneysel şartlarda oluşturulan enfeksiyonlardan alınan
standart örneklerin eş zamalı olarak farklı PCR tipleri ile değerlendirilmesi ile güvenilir
57
sonuçlar elde edilebilir. Çalışmamızda da tanı alt limiti ve yönteme dayalı olarak en
küçük saptanabilecek parasitemi yüzdesi belirlenmemiştir.
Köpeklerdeki piroplasmların yayılışı ile ilgili olarak, dişi ve erkek hayvanlar ya
da 1 yaşından genç ve yaşlı hayvanlar arasında enfeksiyon oranları arasında
karşılaştırma sonuçları bildirilen bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışmada dişi ve
erkek hayvanlar arasında enfeksiyon oranı bakımından anlamlı bir fark bulunmamıştır.
Bir yaşından küçük hayvanlarda enfeksiyona rastlanmazken, bir yaşından büyük
hayvanlarda enfeksiyon oranının % 5,5 olması ise istatiksel olarak anlamlı bulunmuştur
(P<0,01). Babesia canis vogeli ile enfekte olan hayvanların % 63,16’sı İ.Ü. Veteriner
Fakültesi kliniklerinde, % 15,79’u Kemerburgazda, % 5,26’sı Büyükçekmecede,
% 5,26’sı Kağıthane’de ve % 10,53’ü Küçükçekmece’de saptanmıştır. En yüksek oranın
İ.Ü. Veteriner Fakültesi kliniklerinde saptanması, burada kan örneği alınan köpeklerin
klinik şüphe nedeniyle getirilmiş olmasını düşündürmektedir.
Son yıllarda yapılan çalışmalar köpekleri enfekte eden piroplasmların,
bilinenden daha fazla olduğu yönündedir (44). Bu çalışma ile moleküler teknikler içinde
PCR’a göre daha duyarlı ve özgül bir teknik olan RLB ile köpeklerin Babesiaları
araştırılmış ve sonuçlar mikroskobik tanı ve PCR ile edilen sonuçlar ile
karşılaştırılmıştır. Sonuçlara göre mikroskopide negatif olan 9 örnek PCR sonucunda
pozitif, PCR da negatif olan 8 örnek de RLB sonucunda pozitif bulunmuş ve RLB
tekniğinin en duyarlı yöntem olduğu görülmüştür. Bu çalışmada İstanbul ilindeki
köpeklerde ilk kez babesiosis etkenleri yönünden tarama yapılarak, Theileria ve Babesia
cinslerinde bulunan kan protozoonları spesifik oligonükleotidlerle araştırılmıştır.
Sonuç olarak, bu çalışmada İstanbul ili köpeklerinde babesiosisin % 3,9
oranında yaygın olduğu, enfeksiyonların B. canis vogeli’ den kaynaklandığı
görülmüştür.
58
KAYNAKLAR
1. Adachi, K., Tateishi, M., Horii Y., Nagatomo, H., Shimizu, T., Makimura,
S. Immunologic characteristics of antierythrocyte membrane antibody produced in dogs
during Babesia gibsoni infection. J Vet Med Sci. 1995; 57: 121-123.
2. Anderson, J.F., Magnarelli, L.A., Sulzer, A.J. Canine babesiosis: indirect
fluorescent antibody test for a North American isolate of Babesia gibsoni. Am J Vet Res.
1980; 41(12):2102-2105.
3. Ano, H., Makimura, S., Harasawa, R., Detection of babesia species from
infected dog blood by polymerase chain reaction. J Vet Med Sci. 2001; 63(1):111-113.
4. Arai, S., Tsuji, M., Kim, S.J., Nakade, T., Kanno, Y., Ishihara, C. Babesia
canis infection in canine-red blood cell-substituted SCID mice. Int J Parasitol. 1998;
28(9):1429-1435.
5. Baneth, G., Breitschwerdt, E.B., Hegarty, B.C., Pappalardo, B., Ryan, J. A
survey of tick-borne bacteria and protozoa in naturally exposed dogs from Israel. Vet
Parasitol. 1998; 74(2-4):133-142.
6. Baneth, G., Kenny, M.J., Tasker, S., Anug, Y., Shkap, V., Levy, A., Shaw,
E.S. Infection with a proposed new subspecies of Babesia canis, Babesia canis subsp.
presentii, in domestic cats. Journal of Clin Microbiol. 2004; 42(1):99-105.
7. Bicalho, K.A., Ribeiro, M.F.B., Martins-Filho, O.A., Molecular fluorescent
approach to assessing intraerythrocytic hemoprotozoan Babesia canis infection in dogs.
Vet Parasitol. 2004; 125(3-4):221-235.
8. Birkenheuer, A.J., Correa, M.T., Levy, M.G., Breitschwerdt, E.B.
Geographic distribution of babesiosis among dogs in the United States and association
with dog bites: 150 cases (2000-2003). J Am Vet Med Assoc. 2005; 15:227(6):942-947.
9. Birkenheuer, A.J., Levy, M.G., Breitschwerdt, E.B. Development and
evaluation of a seminested PCR for detection and differentiation of Babesia gibsoni
(Asian genotype) and B. canis DNA in canine blood samples. J Clin Microbiol. 2003;
41(9):4172-4177.
59
10. Birkenheuer, A.J., Neel, J., Ruslader, D., Levy M.G., Breitschwerdt, E.B.
Detection and molecular charecterization of a novel large Babesia Species in a dog. Vet
Parasitol. 2004; 124(3-4):151-160.
11. Birkenheuer, A.J., Levy, M.G., Savary, K.C., Gager, R.B., Breitschwerdt,
E.B. Babesia gibsoni infections in dogs from North Carolina. J Am Anim Hosp Assoc.
1999; 35(2):125-128.
12. Blood, D.C., Otto, M.R., Gay, C.C., Radostits, O.M., editorler. Veterinary
Medicine: A Textbook of the Diseases of Cattle, Sheep, Pigs, Goats and Horses. 7nd ed.
London: Bailliere Tindall; 1994.
13. Boozer, A.L., Macintire, D.K. Canine babesiosis. Vet Clin North Am Small
Anim Pract. 2003; 33(4):885-904.
14. Bose, R., Jorgensen, W.K., Dalgliesh, R.J., Friedhoff, K.T., de Vos, A.J.
Current state and future trends in the diagnosis of babesiosis. Vet Parasitol. 1995; 57(1-
3):61-74.
15. Brandao, L.P., Hagiwara, M.K., Myiashiro, S.I. Humoral immunity and
reinfection resistance in dogs experimentally inoculated with Babesia canis and either
treated or untreated with imidocarb dipropionate. Vet Parasitol. 2003; 114(4):253-265.
16. Breitschwerdt, E.B., Malone, J.B., MacWilliams, P., Levy, M.G., Qualls,
C.W., Jr, Prudich, M.J. Babesiosis in the Greyhound. J Am Vet Med Assoc. 1983;
182(9):978-982.
17. Caccio, S.M., Antunovic, B., Moretti, A., Mangili, V., Marinculic, A., Baric,
R.R., Slemenda, S.B., Pieniazek, N.J., Molecular characterisation of Babesia canis
canis and Babesia canis vogeli from naturally infected European dogs. Vet Parasitol.
2002; 106(4):285-292.
18. Camacho, A.T., Pallas, E., Gestal, J.J., Guitian, F.J., Olmeda, A.S., Goethert,
H.K., Telford, S.R. Infection of dogs in north-west Spain with a Babesia microti-like
agent. Vet Rec. 2001; 149(18):552-5.
19. Carret, C., Walas, F., Carcy, B., Grande, N., Precigout, E., Moubri, K.,
Schetters, P.T., Gorenflot, A., Babesia canis canis, Babesia canis vogeli, Babesia canis
rossi: differentiation of the three subspecies by a restriction fragment length
60
polymorphism analysis on amplified small subunit ribosomal RNA genes. J Eukaryot
Microbiol. 1999; 46(3):298-303.
20. Casapulla, R., Baldi, L., Avallone, V., Sannino, R. Pazzanese, L., Mizzoni,
V. Canine piroplasmosis due to Babesia gibsoni: clinical and morphological aspects.
Vet Rec. 1998; 142(7):168-169.
21. Centeno-Lima, S., do Rosario, V., Parreira, R., Maia, A.J., Freudenthal,
A.M., Nijhof, A.M., Jongejan, F. A fatal case of human babesiosis in Portugal:
molecular and phylogenetic analysis. Trop Med Int Health. 2003; 8(8):760-764.
22. Conrad, P., Thomford, J., Yamane, I., Whiting, J., Bomsa, L., Uno, T.,
Holshuh, H.J.,Shelly, S. Hemolytic anemia caused by Babesia gibsoni infection in dogs.
J Am Vet Med Assoc. 1991; 199(5):601-605.
23. Criado-Fornelio, A., Gonzalez-del-Rio, M.A., Buling-Sarana, A., Barba-
Carretero, J.C. Molecular characterization of a Babesia gibsoni isolate from a Spanish
dog. Vet Parasitol. 2003; 117(1-2):123-129.
24. Criado-Fornelio, A., Martinez-Marcos, A., Buling-Sarana, A. Barba-
Carretero, J.C., Molecular studies on Babesia, Theileria and Hepatozoon in southern
Europe. Part I. Epizootiological aspects. Vet Parasitol. 2003a; 113(3-4):189-201.
25. Criado-Fornelio, A., Martinez-Marcos, A., Buling-Sarana, A. Barba-
Carretero, J.C., Molecular studies on Babesia, Theileria and Hepatozoon in southern
Europe. Part II. Phylogenetic analysis and evolutionary history. Vet Parasitol. 2003b;
114(3):173-194.
26. Criado-Fornelio, A., Martinez-Marcos, A., Buling-Sarana, A. Barba-
Carretero, J.C., Presence of Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemominutum and
Proplasmids in cats from Southern Europe: A molecular study. Vet Microbiol. 2003;
93:307-317.
27. Duh, D., Tozon, N., Petrovec, M., Strasek, K., Avsic-Zupanc, T. Canine
Babesiosis in Slovenia: Molecular evidence of Babesia canis canis and Babesia canis
vogeli. Vet Res. 2004; 35(3):363-8.
28. EMBO/ICTTD-2 Workshop kitapçığı, Güney Afrika 2003.
61
29. Erganiş O., Uçan U.S. Veteriner Epidemiyoloji. 2nd ed. Konya . Mimoza
yayınları; 2001.
30. Farwell, G.E., LeGrand, E.K., Cobb, C.C. Clinical observations on Babesia
gibsoni and Babesia canis infections in dogs. J Am Vet Med Assoc. 1982 ; 180(5):507-
511.
31. Figueroa, J.V., Chieves, L.P., Johnson, G.S., Buening, G.M. Multiplex
polymerase chain reaction based assay for the detection of Babesia bigemina, Babesia
bovis and Anaplasma marginale DNA in bovine blood. Vet Parasitol. 1993; 50(1-2):69-
81.
32. Foldvari, G., Hell, E., Farkas, R. Babesia canis canis in dogs from Hungary:
detection by PCR and sequencing. Vet Parasitol. 2005; 127(3-4):221-226.
33. Freeman, M.J., Kirby, B.M., Panciera, D.L., Henik, R.A., Rosin, E.,
Sullivan, L.J. Hypotensive shock syndrome associated with acute Babesia canis
infection in a dog. J Am Vet Med Assoc. 1994; 204(1):94-6.
34. Fukata, T., Ohnishi, T., Okuda, S., Sasai, K., Baba, E., Arakawa, A.
Detection of canine erythrocytes infected with Babesia gibsoni by flow cytometry. J
Parasitol. 1996; 82(4):641-642.
35. Fukumoto, S., Suzuki, H., Igarashi, I., Xuan, X. Fatal experimental
transplacental Babesia gibsoni infections in dogs. Int J Parasitol. 2005; 35(9):1031-
1035.
36. Fukumoto, S., Xuan, X., Kadota, K., Igarashi, I., Sugimoto, C., Fujisaki, K.,
Nagasawa, H., Mikami, T., Suzuki, H. High-level expression of truncated surface
antigen P50 of Babesia gibsoni in insect cells by baculovirus and evaluation of its
immunogenicity and antigenicity. Clin Diagn Lab Immunol. 2003; 10(4):596-601.
37. Fukumoto, S., Xuan, X., Shigeno, S., Kimbita, E., Igarashi, I., Nagasawa,
H., ve ark. Development of a polymerase chain reaction method for diagnosing Babesia
gibsoni infection in Dogs. J Vet Med Sci. 2001; 63(9):977-981.
38. Furlanello, T., Fiorio, F., Caldin, M., Lubas, G., Solano-Gallego, L.
Clinicopathological findings in naturally occurring cases of babesiosis caused by large
form Babesia from dogs of northeastern Italy. Vet Parasitol. 2005; 134(1-2):77-85.
62
39. Garcia, A.T. Piroplasma infection in dogs in northern Spain. Vet Parasitol.
2006; 31:138(1-2):97-102.
40. Gören, S., Yetkin, R. Tektırnaklıda, sığırda, koyunda, keçide ve köpekte
piroplasmoz. M.M.B. Bakt. Evi Yayını.Ulus Basımevi, 1935.Ankara.
41. Georges, K., Loria, G. R., Riili, S., Greco, A., Caracappa, S., Jongejan, F.,
Sparagano, O. Detection of haemoparasites in cattle by reverse line blot hybridisation
with a note on the distribution of ticks in Sicily. Vet Parasitol. 2001; 99(4):273-286.
42. Glaser, B., Gothe, R. Imported arthropod-borne parasites and parasitic
arthropods in dogs. Species spectrum and epidemiologic analysis of the cases diagnosed
in 1995/96. Tierarztl Prax Ausg K Klientiere Heimtiere. 1998; 26(1):40-46.
43. Gubbels, J.M., De Vos, A.P., Van Der Weide, M., Viseras, J., Schouls, L.M,
Jongejan, F. Simultaneous detection of bovine Theileria and Babesia species by
Reverse Line Blot Hybridization. Journal of Clin Microbiol. 1999; 37(6) 1782-1789.
44. Guitian, F.J., Camacho, A.T., Telford, S.R. Case-control study of canine
infection by a newly recognised Babesia microti-like piroplasm. Prev Vet Med. 2003;
61(2):137-145.
45. Gulanber, A., Gorenflot, A., Schetters, T.P., Carcy, B. First molecular
diagnosis of Babesia vogeli in domestic dogs from Turkey. Vet Parasitol. 2006 Baskıda.
46. Hauschild, S., Schein, E. The subspecies specificity of Babesia canis. Berl
Munch Tierarztl Wochenschr. 1996; 109(6-7):216-219.
47. Hauschild, S., Shayan, P., Schein, E. Characterization and comparison of
merozoite antigens of different Babesia canis isolates by serological and immunological
investigations. Parasitol Res. 1995; 81(8):638-642.
48. Hagan W.A., Burney D.W., editörler. The Infectious Diseases of Domestic
Animals. 2nd ed. New York. Cornell University Press.1951.
49. Hazıroğlu R., Hematopoietik Sistem İçinde Veteriner Patoloji Cilt 2: Milli
M., Hazıroğlu R. Medipress yayınları Ankara 2000.
50. Inokuma, H., Yoshizaki, Y., Shimada, Y., Sakata, Y., Okuda, M., Onishi, T.
Epidemiological survey of Babesia species in Japan performed with specimens from
63
ticks collected from dogs and detection of new Babesia DNA closely related to Babesia
odocoilei and Babesia divergens DNA. J Clin Microbiol. 2003; 41(8):3494-3498.
51. Inokuma, H., Yoshizaki, Y., Matsumoto, K., Matsumoto, K., Okuda, M,
Onishi, T., Nakagome, K., Kosugi, R., Hirakava, M. Molecular survey of Babesia
infection in dogs in Okinawa, Japan. Vet Parasitol. 2004; 121(3-4):341-346.
52. Irwin, P.J., Hutchinson, G.W. Clinical and pathological findings of Babesia
infection in dogs. Australian Vet Journal. 1991; 68(6) 204-209.
53. Jacobson, L.S. The South African form of severe and complicated canine
babesiosis: Clinical advances 1994-2004. Vet Parasitol. 2006; 138(1-2):126-139.
54. Jacobson, L.S., Clark, I.A. The pathophysiology of canine babesiosis: new
approaches to an old puzzle. J S Afr Vet Assoc. 1994; 65(3):134-145.
55. Kaufhold, A., Padbelski, A., Baumgarten, G., Blokpoel, M., Top, J.,
Schouls, L. Rapid typing of group A streptococci by the use of DNA amplification and
non-radioactive allele-specific oligonucleotide probes. FEMS Microbiol Lett. 1994;
119(1-2):19-25.
56. Kettner, F., Reyers, F., Miller, D. Thrombocytopaenia in canine babesiosis
and its clinical usefulness. J S Afr Vet Assoc. 2003; 74(3):63-8.
57. Kırlı, G., Ege Bölgesi’nde köpek Babesiosis’inin yaygınlığı. Yüksek Lisans
Tezi. 2006. Aydın.
58. Kjemtrup A.M., Conrad, A.P. A review of the small canine Piroplasms from
California: Babesia conradae in the literature. Vet Parasitol. 2006; Baskıda.
59. Kjemtrup, A.M., Kocan, A.A., Whitworth, L., Meinkoth, A.J., Birkenheuer,
A.J., Cummings, J., Boudreaux, M.K., Stockham, S.L., Irizarry-Rovira, A., Conrad, A.
There are at least three genetically distinct small piroplasms from dogs. Int J Parasitol.
2000; 30(14):1501-1505.
60. Kocan, A.A., A. Kjemtrup, J. Meınkoth, L.C. Whıtworth, G.L. Murphy, L.
Decker, M. Lorenz, A genotypically unique Babesia gibsoni-like parasite recovered
from a dog in Oklahoma. J Parasitol. 2001; 87(2):437-438.
61. Kraje, A.C., Canine Haemobartonellosis and Babesiosis. Small
Animal/Exotics. 2001; 23(4):310-318.
64
62. Kreier PJ editor. Parasitic Protozoa. New York: Academic Press; 1977.
63. Kuttler, K.L. World-wide impact of babesiosis.. İçinde, Ristic, M, editor.
Babesiosis of Domestic Animals and Man. CRC Press, 1988.
64. Levine N.D., editor. Protozoan Phylum Apicomplexa: v. 2. US, CRC Press
Inc., 1988.
65. Levy, M.G., Breitschwerdt, E.B., Moncol, D.J. Antibody activity to Babesia
canis in dogs in North Carolina. Am J Vet Res. 1987; 48(3):339-341.
66. Lewis, B.D., Penzhorn, B.L., Lopez Rebollar, L.M. Immune responses to
South African Babesia canis and the development of a preliminary vaccine. J S Afr Vet
Assoc. 1995; 66(2):61-5.
67. Lewis, B.D., Penzhorn, B.L., Lopez-Rebollar, L.M., De Waal, D.T. Isolation
of a South African vector-specific strain of Babesia canis. Vet Parasitol. 1996; 63(1-
2):9-16.
68. Ludford, C.G. Fluorescent antibody staining of four Babesia species. Exp
Parasitol. 1969; 24(3):327-35.
69. Lysby, G. Application of nucleic acid amplification in clinical microbiology.
İçinde: Meltzer, S., editor. Clinical method molecular biology: PCR in Bioanalysis.
Totowa, NJ: Human Press Inc; 1999. pp. 1-29.
70. Macwilliams, P.S., Erythrocytic Rickettsia and Protozoa of the dog and cat.
Vet Clin North Am Small Anim Pract. 1987; 17(6):1443-1461.
71. Marquart, W.C., Demaree, R.C, Grieve, B.R., editorler. Parasitology and
Vector Biology. 2nd ed. London. Harcourt Academic Press.
72. Martin, A.R., Dunstan, R.H., Roberts, T.K., Brown, G.K. Babesia canis
vogeli: a novel PCR for its detection in dogs in Australia. Exp Parasitol. 2006;
112(1):63-5.
73. Martinod, S., N. Laurent, Y. Moreau. Resistance And Immunity Of Dogs
Against Babesia canis İn An Endemic Area. Vet. Parasitol. 1986. 19 245-254.
65
74. Matjila, P.T., Nijhof, A.M., Taoufik, A., Houwers, D., Tekse, E., Penzhorn,
ve ark. Autochthonous canine babesiosis in The Netherlands. Vet Parasitol. 2005;
131(1-2):23-29.
75. Matjila, P.T., Penzhorn, B.L., Bekker, C.P.J., Nijhof, A.M., Jongejan, F.
Confirmation of occurrence of Babesia canis vogeli in domestic dogs in South Africa.
Vet Parasitol. 2004; 122(2):119-125.
76. Matsuu, A., Kawabe, A., Koshida, Y., Ikadai, H., Okano, S., Higuchi, S.
Incidence of canine Babesia gibsoni infection and subclinical infection among Tosa
dogs in Aomori Prefecture, Japan. J Vet Med Sci. 2004; 66(8):893-897.
77. Mehlhorn, H., Bunnag, D., E. Curio, J.F editörler. Parasitology in Focus,
Springer-Verlag. 1988 .
78. Mehlhorn, H., Shein, E. The piroplasms: life cycle and sexual stages. Adv
Parasitol. 1984; 23:37-103.
79. Melhorn H. 2001.Encylopedic reference of parasitology. Diseases,
Treatment,Therapy.2nd.ed,Heidelberg:Springer(http:parasitology.informatik.uni-
wuerzberg.de/login/frame.php Erişim:05.04.2006)
80. Merdivenci A., Türkiye Keneleri Üzerine Araştırmalar. 1969. Kutulmuş
Matbaası, İstanbul.
81. Merdivenci A. Türkiye parazitleri ve parazitolojik yayınları.1970. Kutulmuş
Matbaası, İstanbul.
82. Miyama, T., Sakata, Y., Shimada, Y., Ogino, S., Watanabe, M., Itamoto, K.,
Okuda, M., Verdida, R.A., Xuan, X., Nagasawa, H., Inokuma, H. Epidemiological
survey of Babesia gibsoni infection in dogs in eastern Japan. J Vet Med Sci. 2005;
67(5):467-471.
83. Muhlnickel, C.J., Jefferies, R., Morgan-Ryan, U.M., Irwin P.J. Babesia
gibsoni infection in three dogs in Victoria. Aust Vet J. 2002; 80(10):606-610.
84. Navarrete, I., Nieto, L., Babesiosis, hepatozoonosis, citauxzonoonosis felina.
İçinde Cordero-del-Campillo, M., Rojo-Vazquez, F.A., editorler. Parasitologia
Veterinaria. Madrid: McGraw-Hill/Interamericana; 1999. pp. 672-678.
66
85. Nijhof, A.M., Penzhorn, B.L., Lynen, G., Mollel, J.O., Morkel, P., Bekker,
C.P., Jongejan, F. Babesia bicornis sp. nov. and Theileria bicornis sp. nov.: tick-borne
parasites associated with mortality in the black rhinoceros (Diceros bicornis). J Clin
Microbiol. 2003; 41(5):2249-2254.
86. Oyamada, M., Davoust, B., Boni, M., Dereure, J., Bucheton, B., Hammad,
A., ve ark. Detection of Babesia canis rossi, B. canis vogeli, and Hepatozoon canis in
dogs in a village of eastern Sudan by using a screening PCR and sequencing
methodologies. Clin Diagn Lab Immunol. 2005; 12(11):1343-1346.
87. Özcan, C.H., Ankara ve civarında evcil hayvanlarda görülen Piroplasmose
vakaları ve tedavileri üzerinde araştırmalar. Ankara Üniversitesi Basımevi. 1961; 10-
106.
88. Passos, L.M., Geiger, S.M., Ribeiro, M.F., Pfister, K., Zahler-Rinder, M.
First molecular detection of Babesia vogeli in dogs from Brazil. Vet Parasitol. 2005;
127(1):81-85.
89. Penzhorn, B.L., Lewis, B.D., de Waal, D.T., Lopez Rebollar, L.M.
Sterilisation of Babesia canis infections by imidocarb alone or in combination with
diminazene. J S Afr Vet Assoc. 1995; 66(3):157-159.
90. Persing, D.H., Mathiesen D., Marshall W.F., Telford, R.S. Spielman, A.,
Thomford, W.J., Conrad, P.A. Detection of Babesia microti by PCR. J Clin Microbiol.
1992; 30(8):2097-2103.
91. Purnell, R.E., Babesiosis in various hosts. İçinde Ristic, M., Kreier, J.P.,
editörler. Babesiosis. New York: Academic Press; 1981. pp. 25-63.
92. Quinn, P.J., Donnely, W.J.C., Carter, M.E., Markey, B.K.J., Torgenson,
P.R., Breathnach, R.M.S., editorler. Microbial and parasitic diseases of the dog and cat.
London: Saunders. 1997.
93. Rar, V.A., Maksimova, T.G., Zakharenko, L.P., Bolykhina, S.A.,
Dobrotvorsky, A.K., Morozova, O.V. Babesia DNA detection in canine blood and
Dermacentor reticulatus ticks in southwestern Siberia, Russia. Vector Borne Zoonotic
Dis. 2005; 5(3):285-287.
67
94. Reyers, F., Leisewitz, A.L., Lobetti, R.G., Milner, R.J., Jacobson, L.S., van
Zyl, M. Canine babesiosis in South Africa: more than one disease. Does this serve as a
model for falciparum malaria? Ann Trop Med Parasitol. 1998; 92(4):503-511.
95. Rijpkema, S.G., Molkenboer, M.J., Schouls, L.M., Jongejan, F., Schellekens,
J.F. Simultaneous detection and genotyping of three genomic groups of Borrelia
burgdorferi sensu lato in Dutch Ixodes ricinus ticks by characterization of the amplified
intergenic spacer region between 5S and 23S rRNA genes. J Clin Microbiol. 1995;
33(12):3091-3095.
96. Roberts S.L., Janovy J.J., editor. Foundations of Parasitology. 7th ed. New
York: McGraw Hill: 2005.
97. Sager, H., Casati, S., Hartmeier, G., Sommer, B. Autochthonous cases of
canine babesiosis in the canton Solothurn. Schweiz Arch Tierheilkd. 2005; 147(6):259-
265.
98. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., editorler. Molecular Cloning: A
laboratuary manual 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratuary Press; 1989.
99. Schetters, T.P., Kleuskens, J.A., Scholtes, N.C., Gorenflot, A., Moubri, K.,
Vermeulen, A.N. Vaccination of dogs against heterologous Babesia canis infection
using antigens from culture supernatants. Vet Parasitol. 2001; 100(1-2):75-86.
100. Schetters, Th.P.M., Kleuskens, J.A., Scholtes, N.C., Pasman, J.W.,
Goovaerts, D. Vaccination of dogs against Babesia canis infection.Vet Parasitol. 1997;
73(1-2):35-41.
101. Schetters, T.P., Moubri, K., Precigout, E., Kleuskens, J., Scholtes, N.C.,
Gorenflot, A. Different Babesia canis isolates, different diseases. Parasitology. 1997;
115(Pt 5):485-493.
102. Soulsby, E.J.L., Helminths, Arthropods and Protozoa of Domesticated
Animals. 7 th ed London.. Bailliere Tindall, 1982.
103. Stewart, C.G. A comparison of the efficacy of isometamidium, amicarbalide
and diminazene against Babesia canis in dogs and the effect on subsequent immunity. J
S Afr Vet Assoc. 1983; 54(1):47-51.
68
104. Taboada, J., Merchant, S.R. Babesiosis of companion animals and man. Vet
Clin North Am Small Anim Pract. 1991; 21(1):103-123.
105. Toparlak M., Hazırlık aşamasındaki Parazitoloji ders notu. 2006.
106. Uguen, C., Girard, L., Brasseur, P., Leblay, R. Human Babesiosis in 1997.
Rev Med Interne. 1997; 18(12):945-951.
107. Uilenberg G. A historical overview. Vet Parasitol. 2006 Baskıda.
108. Uilenberg, G. Highlights in recent research on tick-borne diseases of
domestic animals. J Parasitol. 1986; 72(4):485-91.
109. Uilenberg, G., Franseen, F.F.J., Perie, N.M., Perie, M., Spanjer A.A.M.
Three groups of Babesia canis distinguished and a proposal for nomenclature. Vet Q.
1989; 11(1):33-40.
110. Ulutaş, B., Bayramlı, G., Ulutaş P.A., T. Karagenç. Serum concentration of
some acute phase proteins in naturally occuring canine Babesiosis: A preliminary study.
Vet Clin Pathol. 2005; 34(2):144-147.
111. Vercammen, F., De Deken, R., Maes, L. Duration of protective immunity in
experimental canine babesiosis after homologous and heterologous challenge. Vet
Parasitol. 1997; 68(1-2):51-55.
112. Vercammen, F., De Deken, R., Maes, L. Prophylactic treatment of
experimental canine babesiosis (Babesia canis) with doxycycline. Vet Parasitol. 1996;
66(3-4):251-255.
113. Wozniak, E.J., Barr, B.C., Thomford, J.W., Yamane, I., McDonough, S.P.,
Moore, P.F. ve ark. Clinical, anatomic, and immunopathologic characterization of
Babesia gibsoni infection in the domestic dog (Canis familiaris). J Parasitol. 1997;
83(4):692-699.
114. Wulansari, R., Wijaya, A., Ano, H., Horii, Y., Makimura, S. Lymphocyte
subsets and specific IgG antibody levels in clindamycin-treated and untreated dogs
experimentally infected with Babesia gibsoni. J Vet Med Sci. 2003; 65(5):579-584.
115. Yamane, I., Thomford, J.W., Gardner, I.A., Dubey, J.P., Levy, M., Conrad,
P.A. Evaluation of the indirect fluorescent antibody test for diagnosis of Babesia
gibsoni infection in dogs. Am J Vet Res.1993; 54(10):1579-1583.
69
116. Zahler, M., E. Scheın, H. Rınder, R. Gothe, Characteristic genotypes
discriminate between Babesia canis isolates of differing vector specificity and
pathogenicity to dogs. Parasitol Res. 1998; 84(7):544-548.
117. Zahler, M., Rinder, H., Schein, E., Gothe, R. Detection of a new pathogenic
Babesia microti-like species in dogs. Vet Parasitol. 2000a; 89(3):241-248.
118. Zahler, M., H. Rinder, E. Zweygarth, T. Fukata, Y. Maede, E. Schein, R.
Gothe,. ‘Babesia gibsoni’ of dogs form North America and Asia belong to different
species. Parasitology. 2000b; (120): 365-369.
70
ETİK KURUL KARARI
71
ÖZGEÇMİŞ
Kişisel Bilgiler Adı NURAN Soyadı AYSUL (Selek) Doğ.Yeri Ankara Doğ.Tar. 25.01.1973 Uyruğu T.C. TC Kim No 39253112994
Email seleknuran@hotmail.com Tel 0505 384 52 93
Eğitim Düzeyi Mezun Olduğu Kurumun Adı Mez. Yılı Doktora Yük.Lis. Lisans Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi 1996 Lise Aydın Lisesi 1990
İş Deneyimi (Sondan geçmişe doğru sıralayın) Görevi Kurum Süre (Yıl - Yıl)
1. Araş.Gör. Adnan Menderes Üniversitesi 2001-2002 2. Araş.Gör. İ.Ü.Sağlık Bilimleri Enstitüsü 2002- 3. -
Yabancı Dilleri
Okuduğunu Anlama* Konuşma* Yazma* KPDS/ÜDS
Puanı (Diğer)
Puanı İngilizce Çok iyi iyi orta 67 *Çok iyi, iyi, orta, zayıf olarak değerlendirin
Sayısal Eşit Ağırlık Sözel LES Puanı 49 51 53 (Diğer) Puanı
Bilgisayar Bilgisi Program Kullanma becerisi Microsoft; Word, Excel, Powerpoint, FrontPage, Paint, Photoshop İyi
Instat iyi
Yayınları/Tebligleri Sertifikaları/Ödülleri
72
Yayınlar:
Eren H., Aypak S., Selek N., İvermectin+Clorsulon Kombinasyonunun Doğal Enfekte Keçilerde Fasciola spp., Trichuris spp., Trichostrongylidae Türlerine etkileri. Bornova Vet. Kontr. ve Araşt. Enst.Md. Derg.,40,26,1-4,2001.
Eren H., Aypak S., Selek N., Aydın Yöresinde Deve (Camelus dromedurius)lerde Dışkı Bakılarına Göre Saptanan Parazitler. YYÜ Vet. Fak. Derg., 14(1) 59-60, 2003
Bildiriler:
Karagenç T., Selek N., Bakırcı S., Aypak S., Eren H., Aydın İli Sığırlarında Theileria annulata’nın Seroprevalansı: 18-25 Eylül 2005, İzmir.
Yaşar H., Gümüş D., Aşık L., Aysul N., Gargılı A., Altaş K., Kesmezacar F., Yıldırım M., İstanbul Valiliği Şehit Adem Yavuz İlköğretim Okulu Öğrencilerinde Bağırsak Parazitlerinin Yayılışı : 18-25 Eylül 2005, İzmir. Karagenç T., Bilgiç H.B., Hoşgör M., Selek N., Aypak S., Eren H., Aydın Yöresi Sığırlarında RLB Tekniği Kullanılarak Theileria, Babesia, Anaplasma, Ehrlichia Türlerinin Belirlenmesi. 18-25 Eylül 2005, İzmir. Sertifikalar : Molecular Biology of Leishmania 3-5 October Trieste, Italy. Proteom Analizi: Metodlar ve uygulamaları 4-11 Ağustos 2002. Görev Aldığı Projeler: Karagenç T., Eren H., Aypak N., Selek N., Development of Molecular Vaccines and Diagnostics for The Control Tropical Theileriosis, European Commision, 2001. Eren H., Aypak N., Selek N., Aydın Yöresi Develerinde Parazitlerin Yayılışı, ADÜ Araştırma Fonu, Aydın 2000. Karagenç T., Eren H., Aypak N., Selek N., Aydın Bölgesi Sığırlarında Bulunan Kan Parazitlerinden Theileria annulata, Babesia bovis, Babesia bigemina ve Anaplasma marginale’nin Teşhisinde Multiplex Polymerase Chain (PCR) Metodunun Geliştirilmesi, ADÜ Araştırma Fonu Aydın, 2002.
Özel İlgi Alanları (Hobileri):
Recommended