ELECTROFORESIS - Inicio · * Electroforesis de proteínas: • Papel, almidón, agar, acetato de...

Q U Í M I C A B I O L Ó G I C A .

D E P A R T A M E N T O D E B Q C A .

F C N Y C S .

U N P S J B

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ELECTROFORESIS

¿ Que es la electroforesis?

¿Qué permite analizar?

¿ Que factores influyen ?

Separar y analizar moléculas: proteínas ADN/ARN

... en función de su diferente movilidad al aplicar un campo eléctrico (dependerá de su carga eléctrica)

* Moléc. (+) polo (-) o cátodo * Moléc. (-) polo (+) o ánodo

ELECTROFORESIS LIBRE moléculas en disolución o suspensión: poco resolutiva

ELECTROFORESIS DE ZONA SOPORTE que retiene las moléculas: elevado poder de resolución

cátodo ánodo

ánodo

cátodo

SOPORTE

pH bajo:

carga neta positiva

pI: carga neta nula

pH alto: carga neta

negativa

EQUIPO ELECTROFORÉTICO

- +

muestra

muestra

+

-

fuente de alimentación

fuente de alimentación

cable

cable

cubeta

cubeta

tampón

tampón

gel

gel

electrodo electrodo

cátodo ánodo

electrodo cátodo

ánodo

* Fuente de alimentación

* Cubeta

* Tampón de electroforesis

* Soporte electroforético (gel)

* Dos electrodos ánodo (+) cátodo (-)

Componentes:

(E. horizontal)

(E. vertical)

FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS

1_ Campo eléctrico

*Diferencia de potencial (V-voltios): bajo voltaje (10-500 V)

alto voltaje (500-10000 V) *Intensidad (A-amperios): flujo de carga eléctrica depende de V y de R (Ley de Ohm V=RxI)

*Resistencia (R): determinada por el soporte y tampón electroforesis *Temperatura: efecto Joule : El aumento de temperatura generado puede dañar el soporte, el equipo electroforético y desnaturalización de las proteinas refrigerantes

2_ Muestra

*Carga o densidad de carga: carga eléctrica/masa de la molécula

*Tamaño *Forma: formas globulares avanzan más

3_ Tampón de electroforesis

*pH: determina el grado de solvatación y la carga de las moléculas

generalmente es ligeramente básico moléculas (-) *Fuerza iónica: generalmente 0.05 o 0.1 M para que no interfiera 4_ Soporte

SOPORTE ELECTROFORÉTICO

No restrictivo (Tipo I): Tamaño poro >>> moléculas, no opone impedimento a su paso separación sólo por CARGA

* Electroforesis de proteínas: • Papel, almidón, agar, acetato de

celulosa

Gel poroso

Características Gel poroso (entramado tridimensional interno) Tiene que permitir el paso de moléculas Material inerte: NO puede estar cargado y no debe adsorber las moléculas de la muestra

Tipos de Soporte

Restrictivo (Tipo II): Tamaño poro ≈ moléculas, opone resistencia a su paso separación por tamaño (tamizado molecular)

* Electroforesis de proteínas: • Separación por CARGA y TAMAÑO

• Acrilamida

* Electroforesis de DNA/RNA: • Separación sólo por TAMAÑO

• Agarosa, acrilamida

EN ACETATO DE CELULOSA: PROTEINOGRAMA

+ -

Campo eléctrico (DV)

Soporte: (no restrictivo) Tiras de acetato de celulosa

Electroforesis horizontal

1. Aplicación de la muestra 2. Electroforesis 3. Detección por tinción: Azul de Coomassie Negro amido 4. Densitometría / Espectrofotometría

Aplicaciones diagnósticas en serología (separación proteínas séricas).

muestra

Avance de las proteínas

EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)

Electroforesis vertical

Soporte: (restrictivo) Gel de Poliacrilamida * Polimerización de dos componentes: Acrilamida + Bisacrilamida * Variación de la concentración variación del tamaño de poro [poliacrilamida] tamaño poro

1. Preparación del gel 2. Montaje de la cubeta 3. Aplicación de la muestra 4. Electroforesis 5. Detección por tinción: Azul de Coomassie Sales de plata

Aplicaciones: * Separar proteínas * Determinar peso molecular de una proteína * Separar proteínas oligoméricas * Separar proteínas en función de su pI * Separar proteínas de mezclas muy complejas * Ver si hay una proteína en concreto

EN GEL DE POLIACRILAMIDA (PAGE)

SDS-PAGE

Electroforesis 2D

Western Blot

Electroenfoque

Ventajas: * Gran poder de separación por CARGA y por TAMAÑO * Químicamente inertes * Transparentes (permite densitometría) * Estables (pH, fuerza iónica, temperatura) * Versatilidad en cuanto al tamaño de poro y entramado uniforme

SDS-PAGE Condiciones de la PAGE: * No desnaturalizantes: separamos por CARGA y TAMAÑO PAGE

S-S S-S

- - - - -

- - -

- - - -

-

- -

+ SDS + DTT

25 kDa

S-S

+ SDS - - -

-

- - - -

- -

- - -

- - - -

-

- - - -

- -

- - -

- -

-

- - 44 kDa

S-S S-S

50 kDa

* Desnaturalizantes: separamos sólo por TAMAÑO SDS-PAGE

Agentes desnaturalizantes: SDS (dodecilsulfato sódico), urea,

reductores (DTT, b-mercaptoetanol)...

• SDS: detergente aniónico (-), dota a todas las proteínas de carga (-) todas migrarán hacia el ánodo (+), separándose sólo por tamaño

SDS-PAGE: determinación del peso molecular

Marcadores de peso molecular: * Mezcla de diferentes proteínas pre-teñidas de las que conocemos el peso molecular. * Por comparación podemos averiguar el PM de nuestra proteína.

A trabajar se ha dicho……………… ajo Práctico

Electroforesis en tiras de acetato de celulosa

Separar mediante electroforesis las proteínas contenidas en el suero.

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Calcular gráficamente la masa molecular aparente de proteínas por comparación con proteínas patrones en un grafico de distancia vs Log PM aparente.

Electroforesis en tiras de acetato de celulosa

Tipo de electroforesis …………..

Soporte: acetato de celulosa ( conservadas en metanol). Muestra: suero humano. pH de trabajo: 8, 5 Buffer: Veronal Sódico. Siembra: con aplicador , en ¿ cátodo o ánodo? Voltaje: 2mA por tira. Tiempo de corrida: 45 minutos. Revelado: Amidoschwart o Ponceau. Solución decolorante: metanol, agua y acido acético ( 47,5:47,5: 5). Disolución de cada banda: Acido Acético al 80 %. Cuantificación espectrofotométrica a 495 nm.

Electroforesis en gel de poliacrilamida