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Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de
Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Yeison Tangarife Morales
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Minas, Departamento de Procesos y Energía
Medellín, Colombia 2016
Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de
Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Yeison Tangarife Morales
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Magister en Ingeniería Química
Director (a):
Ph. D., Ángela Adriana Ruiz Colorado
Línea de Investigación:
Producción y Aplicación de Metabolitos Secundarios
Grupo de Investigación:
Bioprocesos y Flujos Reactivos
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Minas, Departamento de Procesos y energía
Medellín, Colombia
2016
La ciencia no sabe de países, porque el
conocimiento le pertenece a la humanidad y
es la antorcha que ilumina el mundo. La
ciencia es el alma de la prosperidad de las
naciones y la fuente de todo progreso.
Louis Pasteur
Agradecimientos
Agradezco a Dios por permitirme vivir esta experiencia tan enriquecedora. A mi
familia por el apoyo incondicional y constante. A amigos y seres queridos que de
una o cierta manera me apoyaron y colaboraron.
A la profesora Ángela Adriana Ruiz Colorado por sus aportes y directrices que
ayudaron a la terminación satisfactoria de esta investigación. Al grupo de
investigación Bioprocesos y Flujos Reactivos de la Universidad Nacional de
Colombia por sus aportes, ideas y apoyo económico y de infraestructura.
Al profesor Roberto Parra Saldívar del Tecnológico de Monterrey por la invitación
a la pasantía de investigación en esta universidad, donde se ganó conocimientos
académicos fundamentales y crecimiento personal. A la Doctora Magdalena Rostro
Alanis por dirigir directamente esta pasantía y al grupo de investigación
Bioprocesos Ambientales por sus valiosos aportes.
A Colciencias por su programa Jóvenes Investigadores e Innovadores, mediante el
cual se pudo financiar gran parte de la maestría.
Resumen y Abstract IX
Resumen
El hongo Fusarium spp es un patógeno que produce marchitación en plantas, generando
pérdidas económicas cuantiosas en el sector alimentario. Este microorganismo tiene la
capacidad de producir lacasas, una enzima que cataliza la degradación de compuestos
fenólicos. En este trabajo se evalúo la separación y purificación de lacasa producida a
partir del extracto crudo del microorganismo Fusarium spp. Se realizó esta purificación con
la Partición de Tres Fases y se obtuvo un rendimiento de 115% y 1.25 veces de
purificación. Luego de separar y Purificar, se aplicó la lacasa purificada sobre material
lignocelulósico, raquis de palma. Este residuo es generado de la producción de aceite de
palma. En este pretratamiento enzimático se comparó la aplicación de lacasa purificada y
extracto crudo, se maximizó la cantidad de fenoles formados a pH 4.0 y temperatura
58.7°C. Finalmente las remociones de lignina fueron del 15% para el extracto purificado y
la purificación aumentó la acción de la lacasa en el raquis de palma.
Palabras clave: Lacasa, Fusarium spp, pretratamiento enzimático, Separación y
purificación, raquis de palma.
X Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Abstract
The fungus Fusarium spp is a pathogen that produces withering plants, generating large
economic losses in the food sector. This microorganism has the ability to produce laccases,
an enzyme that catalyzes the degradation of phenolic compounds. In this work, it was
evaluated the separation and purification of the laccase produced from the crude extract of
the microorganism Fusarium spp. This purification was achieved by the Three Phase
Partitioning and a yield of 115% and fold purification of 1.25 was obtained. After separation
and Purification, the purified laccase was applied on lignocellulosic material, rachis of palm.
This residue is generated from the production of palm oil. In this enzymatic pretreatment
the application of purified laccase and crude extract was compared, the amount of phenols
formed by pH 4.0 and 58.7 °C were maximized. Finally the lignin removals were 15%.
Purification increased the action of the laccase on the palm rachis.
Keywords: Laccase, Fusarium spp, enzymatic pretreatment, Separation and
purification, palm rachis.
Contenido XI
Contenido
Pág.
Resumen ........................................................................................................................ IX
Contenido ...................................................................................................................... XI
Lista de figuras ............................................................................................................ XIII
Lista de tablas ............................................................................................................. XIV
Lista de Abreviaturas ................................................................................................... XV
Introducción ................................................................................................................... 1
1. Contexto General .................................................................................................... 3
Resumen ...................................................................................................................... 3 Introducción .................................................................................................................. 3 1.1. Lacasa ............................................................................................................... 3
1.1.1. Fuentes de producción ................................................................................ 4 1.1.2. Condiciones de producción ......................................................................... 5 1.1.3. Aplicaciones en diferentes procesos ........................................................... 6 1.1.4. Bioquímica de la lacasa .............................................................................. 7
1.2. Fusarium spp ..................................................................................................... 9 1.2.1. Características ............................................................................................ 9 1.2.2. Aplicaciones en distintos procesos ............................................................ 10 1.2.3. Producción de lacasa a partir de Fusarium spp ......................................... 11
1.3. Separación y purificación de proteínas ............................................................. 12 1.3.1. Tipos de separación y purificación ............................................................ 12
1.4. Materiales lignocelulósicos ............................................................................... 17 1.4.1. Celulosa .................................................................................................... 18 1.4.2. Hemicelulosa............................................................................................. 18 1.4.3. Lignina ...................................................................................................... 18 1.4.4. Clasificación de Materiales Lignocelulósicos ............................................. 19
1.5. Pretratamiento de materiales lignocelulósicos .................................................. 20 1.5.1. Tipos de pretratamientos ........................................................................... 21 1.5.2. Pretratamiento enzimático ......................................................................... 23 1.5.3. Estado del arte del pretratamiento enzimático ........................................... 24
1.6. Raquis de Palma .............................................................................................. 26 1.7. Conclusiones .................................................................................................... 27
2. Métodos de separación y Purificación para lacasa de Fusarium spp ............... 29
Resumen .................................................................................................................... 29 Introducción ................................................................................................................ 29 2.1. Separación y purificación de lacasas ............................................................... 29 2.2. Subproductos de la separación y purificación de lacasas ................................. 30 2.3. Métodos Reportados ........................................................................................ 30 2.4. Selección del método ....................................................................................... 33 2.5. Partición de Tres Fases (TPP) ......................................................................... 34
2.5.1. Principio .................................................................................................... 35 2.5.2. Impactos del Sulfato de amonio ................................................................ 35
XII Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
2.5.3. Impactos del Ter-butanol ........................................................................... 36 2.5.4. Ventajas y Desventajas ............................................................................. 36 2.5.5. Aplicaciones .............................................................................................. 36
2.6. Conclusiones .................................................................................................... 37
3. Condiciones óptimas para el método de separación y purificación de lacasa de
Fusarium spp. ............................................................................................................... 39
Resumen .................................................................................................................... 39 Introducción ................................................................................................................ 39 3.1. Metodología ..................................................................................................... 40
3.1.1. Microorganismo ......................................................................................... 40 3.1.2. Activación de inóculo de Fusarium spp ..................................................... 40 3.1.3. Fermentación sumergida de inóculo producido ......................................... 40 3.1.4. Medición de actividad enzimática lacasa y proteína .................................. 41 3.1.5. Partición Trifásica (TPP) ........................................................................... 42 3.1.6. Diseño Experimental ................................................................................. 42
3.2. Resultados y Discusión .................................................................................... 43 3.2.1. Partición Trifásica (TPP) ........................................................................... 43
3.3. Conclusiones .................................................................................................... 50
4. Acción de lacasa purificada en un material lignocelulósico .............................. 53
Resumen .................................................................................................................... 53 Introducción ................................................................................................................ 53 4.1. Metodología ..................................................................................................... 54
4.1.1. Raquis de Palma ....................................................................................... 54 4.1.2. Pretratamiento enzimático ......................................................................... 55 4.1.3. Determinación de Compuestos Fenólicos ................................................. 55 4.1.4. Diseño Experimental ................................................................................. 56 4.1.5. Comprobación ........................................................................................... 56
4.2. Resultados y Discusión .................................................................................... 56 4.2.1. Caracterización ......................................................................................... 56 4.2.2. Pretratamiento enzimático ......................................................................... 57 4.2.3. Comprobación ........................................................................................... 60
4.3. Conclusiones .................................................................................................... 62
5. Conclusiones y recomendaciones ....................................................................... 63
5.1. Conclusiones .................................................................................................... 63 5.2. Recomendaciones............................................................................................ 63
Anexos .......................................................................................................................... 65
Anexo A. Curva de Calibración de Proteínas. ............................................................. 65 Anexo B. Determinación pH para TPP. ....................................................................... 67 Anexo C. Curva de Calibración de Fenoles Totales por Folin-Ciocalteau. .................. 69 Anexo D. Prueba de Diferencia Significativamente Honesta para el tiempo de pretratamiento. ............................................................................................................ 71 Anexo E. Análisis Granulométrico del Raquis de Palma. ............................................ 75 Anexo F. Resultados de proteína cruda (Kjeldahl). ..................................................... 77
Referencias ................................................................................................................... 79
Contenido XIII
Lista de figuras Figura 1-1: Ciclo catalítico de la lacasa. Tomado de (Desai & Nityanand, 2011) ............. 4 Figura 1-2: Estructura del sitio activo (a) Estructura molecular del cobre T1 en sitio
activo, mostrando cisteína (amarillo) e histidinas (azul). (b) Estructuras moleculares de
los cobres T2 y T3 en sitio activo de la lacasa y los residuos de carboxilatos (D77 y
D456). (c) Absorbancia en espectro UV-Vis. Tomado de (Jones & Solomon, 2015). ....... 8 Figura 1-3: Transporte de electrones en una reacción con lacasa como catalizador.
Tomado de (Hakulinen & Rouvinen, 2015). ...................................................................... 9 Figura 1-4: Precipitación de proteínas. Precipitación salina (parte superior) y con
compuestos orgánicos (inferior). Proteína de interés (círculo), compuestos polares
(triángulos) y compuestos no polares (estrellas). ............................................................ 13 Figura 1-5: Formación de fases. ATPE (parte superior) y TPP (Parte inferior)............... 14 Figura 1-6: Tipos de cromatografía. Adaptado de (Hedhammar et al., 2006) ................ 15 Figura 1-7: Purificación por filtración. ............................................................................ 16 Figura 1-8: Tipos de Centrifugación. Adaptado de Frei (2011) ...................................... 17 Figura 1-9: Estructura de los materiales lignocelulósicos. Adaptado de (Menon & Rao,
2012) .............................................................................................................................. 17 Figura 1-10: Estructura de la celulosa.Tomado de (van Zyl et al., 2011) ....................... 18 Figura 1-11: Los tres mayores precursores de la lignina. Tomado de (Munk et al., 2015).
....................................................................................................................................... 19 Figura 1-12: Tusa o raquis de palma Tomado de (Cenipalma 2014) ............................. 26 Figura 2-1: Representación Esquemática de la TPP. .................................................... 35 Figura 3-1: Relación de los distintos factores de entrada con respecto al Rendimiento. 47 Figura 3-2: Relación de los distintos factores de entrada con respecto a las Veces de
Purificación. .................................................................................................................... 48 Figura 3-3: Formación de Fases en sistema con condiciones donde se maximiza los
factores de respuesta. .................................................................................................... 49 Figura 4-1: Raquis de Palma en natura. Molino con malla de 2mm. Raquis de Palma
molida. ........................................................................................................................... 54 Figura 4-2: Resultados del Diseño Central Compuesto para el Pretratamiento enzimático
....................................................................................................................................... 58 Figura 4-3: Relación del pH y la Temperatura con los Fenoles Totales ......................... 59
Figura A- 1: Curva de calibración obtenida para proteínas medido por Bradford……….65 Figura B- 1. Cambios del rendimiento variando el pH en sistema TPP…………………..66 Figura B- 2. Cambios de las veces de purificación variando el pH en sistema TPP…....67 Figura C- 1: Curva de calibración obtenida para fenoles totales por Folin-Ciocalteau…..68 Figura E- 1. Análisis granulométrico diferencial…………………………………………..…74 Figura E- 2. Análisis granulométrico acumulativo………………………….………………..74
XIV
Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Lista de tablas Tabla 1-1: Aplicaciones de la lacasa en la industria. ........................................................ 6 Tabla 1-2: Genomas de Fusarium spp (Brown & Proctor, 2013; Ma et al., 2013). .......... 10 Tabla 1-3: Aplicación de Fusarium spp en la industria. .................................................. 11 Tabla 1-4: Porcentaje de los diferentes componentes de los materiales lignocelulósicos. (Betts, Dart, Ball, & Pedlar, 1991) ................................................................................... 19 Tabla 1-5: Porcentaje de los diferentes monolignoles presentes en la lignina para varios tipos de plantas (Chávez-Sifontes & Domine, 2013) ....................................................... 20 Tabla 1-6: Pretratamientos enzimáticos con lacasa en materiales lignocelulósicos reportados en literatura. ................................................................................................. 25 Tabla 1-7: Composición de Raquis de Palma. ............................................................... 27 Tabla 2-1: Separación y purificación de lacasa encontrados en la literatura .................. 31 Tabla 2-2: Condiciones de TPP para lacasa reportados ................................................ 37 Tabla 3-1: Componentes de medio líquido para producir lacasa a partir de Fusarium spp. ....................................................................................................................................... 40 Tabla 3-2: Composición de elementos trazas. ............................................................... 41 Tabla 3-3: Diseño Experimental para la Partición de Tres Fases (TPP) del extracto crudo ....................................................................................................................................... 43 Tabla 3-4: Resultados del diseño experimental .............................................................. 43 Tabla 3-5: ANOVA de las veces de purificado y el Rendimiento en TPP ....................... 45 Tabla 3-6: Condiciones donde se maximizan los factores de respuesta obtenidos en los modelos de regresión. .................................................................................................... 49 Tabla 3-7: Comparación de TPP de lacasas .................................................................. 50 Tabla 4-1: Protocolos NREL .......................................................................................... 55 Tabla 4-2: Diseño Experimental para el pretratamiento enzimático del raquis de palma 56 Tabla 4-3: Comparación de los resultados de caracterización del raquis de palma de otros reportes con este estudio. ..................................................................................... 57 Tabla 4-4: ANOVA de los fenoles totales obtenidos en la fase líquida del pretratamiento enzimático. ..................................................................................................................... 59 Tabla 4-5: Condiciones donde se maximizan los factores de respuesta obtenidos en los modelos de regresión para fenoles totales ..................................................................... 60 Tabla 4-6: Comparación pretratamiento con lacasa purificada y extracto crudo. ............ 61 Tabla B- 1. Grupos generados por el análisis de diferencia de significativamente honesta. ……………………………………………………………………………………………………..67 Tabla D- 1: Grupos formados a 45°C y pH 4…………………………………………...…... 69 Tabla D- 2: Grupos formados a 34.4°C y pH 5.7………………………………………...…. 69 Tabla D- 3: Grupos formados a 55.6°C y pH 4.3……………………………………...……. 69 Tabla D- 4: Grupos formados a 55.6 °C y pH 5.7…………………………………...……… 70 Tabla D- 5: Grupos formados a 45 °C y pH 6………………………………………...…….. 70 Tabla D- 6: Grupos formados a 34.4 °C y pH 5.7…………………………………...……… 70 Tabla D- 7: Grupos formados a 60 °C y pH 5……………………………………………..... 70 Tabla D- 8: Grupos formados a 30 °C y pH 5……………………………………...……….. 71 Tabla D- 9: Grupos formados a 45 °C y pH 5………………………………………...…….. 71 Tabla E- 1. Número de tamiz y diámetro…………………………………………………….. 74
Contenido XV
Lista de Abreviaturas
ANOVA Análisis de Varianza
ATPE Extracción Acuosa de Dos Fases
NREL Laboratorio Nacional de Energía Renovables
PDA Agar Papa Dextrosa
PDB Caldo Papa Dextrosa
TNC Cúmulo de Cobre Trinuclear
TPP Partición de Tres Fases
VF Veces de Purificación
Y Rendimiento
Introducción 1
Introducción La lacasa degrada grupos fenólicos y aromáticos y utiliza O2 como aceptor de electrones.
Generalmente, la lacasa se produce de forma extracelular y pertenece a las enzimas
multicobre (Desai & Nityanand, 2011). Esta enzima tiene baja especificidad de sustrato, lo
que permite usarla en varios procesos. Dentro de sus aplicaciones está el tratamiento de
aguas residuales degradando compuestos aromáticos, degradación de colorantes como el
índigo carmesí y el remazol azul brillante R y la degradación de lignina en materiales
lignocelulósicos (Cañas & Camarero, 2010).
La producción de esta enzima se da en bacterias, plantas, algunos artrópodos, rumen de
bovinos y hongos, siendo esta última donde se alcanza mayor producción (Dwivedi et al.,
2011). Un hongo productor de lacasa es el Fusarium spp que pertenece al género de los
ascomicetos, patógeno en las cadenas productivas de varios alimentos, en especial el
maíz (de la Torre-Hernández et al., 2014). Este hongo se encuentra aislado y conservado
en el Laboratorio Bioprocesos y Flujos Reactivos, de la Facultad de Minas de la
Universidad Nacional de Medellín (Lopera, 2009).
Para el Fusarium spp, se tienen condiciones de cultivo específicas para la producción de
lacasa (Cano, 2011; Certain, 2015), sin embargo es necesario realizar la separación y
purificación de la enzima producida, ya que los microorganismos producen de forma
simultánea sustancias que inhiben la actividad enzimática de la lacasa, como proteasas,
celulasas, isoformas de lacasa provenientes de procesos postraduccionales, compuestos
hidrofóbicos y polisacáridos de bajo peso molecular (Camperi et al., 2014).
Para las lacasas provenientes de hongos, se ha desarrollado varios métodos de
separación y purificación. Entre los más reportados, se encuentran la precipitación,
formación de fases, cromatografía, filtración, entre otros. Para la lacasa proveniente de
hongos como el Fusarium solani o Fusarium proliferatum, se ha realizado cromatografía
por intercambio iónico para separar y purificar la lacasa producida. Para lacasa de
Fusarium spp aislada y conservada en el laboratorio de Bioprocesos y Flujos Reactivos de
la Facultad de Minas de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín no se han
reportado métodos de separación y purificación.
Se planteó en este trabajo, como objetivo general, evaluar un proceso de separación y
purificación de enzimas para la lacasa de Fusarium spp, y se establecieron los siguientes
objetivos específicos
2 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Seleccionar el método de separación y purificación adecuado para lacasa de Fusarium
spp.
Determinar las condiciones óptimas para el método de separación y purificación que
aumente la actividad enzimática lacasa.
Establecer la acción lacasa purificada en un material lignocelulósico.
Contexto General 3
1. Contexto General
Resumen
La lacasa es una enzima con la capacidad de degradar compuestos fenólicos y aromáticos,
la cual es producida a partir de animales, plantas, bacterias y hongos. Uno de estos
microorganismos es el Fusarium spp, debido a que el extracto crudo producido contiene
otras proteínas y compuestos, es necesario seleccionar el método de separación y
purificación adecuado, dentro de los que se encuentra la precipitación, formación de fases,
cromatografía, filtración, centrifugación, entre otras.
Introducción
Con la necesidad de realizar pretratamientos sobre materiales lignocelulósicos para
remover la lignina presente, se han desarrollado varios tipos de procesos, que abarcan
desde la modificación de la temperatura y la presión, hasta los pretratamientos del tipo
ácido y alcalinos (Chiaramonti et al., 2012), sin embargo estos pretratamientos generan
altos costos económicos y generan inhibidores innecesarios. Una alternativa son los
pretratamientos enzimáticos, que se usan condiciones cercanas al ambiente, reduciendo
el uso excesivo de energía. Estos pretratamientos se hacen con la enzima lacasa, el cual
es una oxidorreductasa que puede degradar las unidades fenólicas y aromáticas de la
lignina presente en los materiales lignocelulósicos (Munk et al., 2015). El objetivo de este
capítulo es mostrar un contexto general sobre la lacasa, las fuentes y condiciones de
producción, aplicación y lo relacionado con su bioquímica. Además, se profundizó sobre el
Fusarium spp del cual se tiene una cepa conservada en el laboratorio Bioprocesos y Flujos
Reactivos de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín., conociendo que el
microrganismo produce varios tipos de compuestos, se examinó los distintos tipos de
separación y purificación que se usan para la lacasa. Se presenta un contexto sobre los
materiales lignocelulósicos y sus pretratamientos, enfatizando en los pretratamientos
enzimáticos y el raquis de palma.
1.1. Lacasa
La lacasa (bencenodiol: oxígeno oxidorreductasa (EC 1.10.3.2)) consume O2 para
degradar compuestos fenólicos y aromáticos (da Silva et al., 2012), retirando electrones
de los sustratos (oxidación) que luego se entregan al aceptor de electrones (O2) para
convertirse en H2O (Giardina & Sannia, 2015). La lacasa pertenece a la clase de enzimas
4 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
que es capaz catalizar la reducción de oxígeno, junto a la citocromo-c oxidasa, L-ascorbato
oxidasa, ceruloplasmina, bilirrubina oxidasa, y fenoxazinona sintasa (Giardina et al., 2010).
En comparación con otras oxidorreductasa, la lacasa tiene un bajo potencial redox, que le
da, la capacidad de ser un buen agente reductor (Desai & Nityanand, 2011).
Figura 1-1: Ciclo catalítico de la lacasa. Tomado de (Desai & Nityanand, 2011)
1.1.1. Fuentes de producción
Bacterias: La lacasa bacteriana se produce a partir de bacterias del género
Azospirrullum y Bacillus. Estas bacterias se encuentra en grasas y cereales y por lo
general producen lacasa intracelular (Dwivedi et al., 2011). Su actividad se incrementa
en temperaturas y valores de pH altos (Strong & Claus, 2011) pero su comercialización
es difícil ya que los mediadores suelen ser muy costosos (Muthukumar & Murugan,
2014).
Hongos: Son los más usados para la producción de lacasa (Rivera-Hoyos et al., 2013),
siendo, hasta ahora, el grupo de las lacasas más importante dentro de los grupos que
se han caracterizado (Giardina et al., 2010). Este tipo de lacasa proviene de hongos
llamados de podredumbre blanca (More et al., 2011), son hongos del filo Ascomycota
y Basidiomycota (Dwivedi et al., 2011; Rivera-Hoyos et al., 2013). La lacasa de estos
hongos interviene en la degradación de la vegetación, en especial de material
celulósico (Dwivedi et al., 2011). Se ha dado producción de lacasa a partir de hongos
del genero Trametes, Cerrena, Melanucarpus, Trichoderma (Viswanath et al., 2014).
Plantas: Se ha identificado que se produce la enzima de varias fuentes frutales como
el mango, piña, durazno, entre otros (Dwivedi et al., 2011). La lacasa producida de
estas fuentes, tiene mayor peso molecular, además de que tiene alta retención de las
unidades de cobre de la enzima, estabilidad térmica y aumento en la actividad en la
enzima debido a que la planta generadora de la enzima permite la glicosilación de
forma más sencilla que en otras fuentes (Dwivedi et al., 2011). Desafortunadamente,
Contexto General 5
no se han hecho muchas investigaciones sobre plantas debido a la complejidad de su
estructura, viéndose desplazada por los hongos y bacterias (Hakulinen & Rouvinen,
2015).
Animales: En animales es donde menos existe aplicación, siendo secretado en
insectos para esclerotización de la cutícula en la epidermis (Giardina et al., 2010) y en
el rumen de bovinos (D. M. Mate & Alcalde, 2015).
1.1.2. Condiciones de producción
Generalmente, la lacasa es secretada de forma extracelular (Shraddha et al., 2011), en
algunas ocasiones se expresa de forma intracelular (Cañero & Roncero, 2008). Esta
enzima es producida en los microorganismos como metabolismo secundario (Viswanath
et al., 2014) influenciada por los siguientes factores:
Fuente de carbono: El carbono es la fuente de vida de todos los organismos, ya que
al romper los enlaces de esta fuente, se genera energía usada para su crecimiento y
desarrollo. La glucosa es una de las fuentes de carbono más usada, en especial por
los hongos del género Basidiomiceto como Trametes versicolor o Pleurotus florida
(Viswanath et al., 2014). Hay otras fuentes de carbono como la xilosa, manosa,
fructosa, lactosa, sacarosa, galactosa, ácido galacturónico, pectina, inulina, entre otros
(Desai & Nityanand, 2011; Shraddha et al., 2011; Viswanath et al., 2014). También se
usan algunos residuos a base de celulosa y almidón como el arroz y el maíz (Shraddha
et al., 2011).
Fuente de Nitrógeno: La producción de lacasa se da por el agotamiento de nitrógeno,
aunque existen algunas fuentes que no afectan a la actividad enzimática (Shraddha et
al., 2011). Altas concentraciones de nitrógeno en ocasiones pueden aumentar la
actividad enzimática lacasa, pero no afectan al incremento o disminución de la
biomasa del microorganismo (Viswanath et al., 2014). Las fuentes de nitrógeno usadas
son el tartrato de amonio, peptona, caseína, sales de nitrato, ácido glutámico, glicina,
desechos de maíz, extracto de levadura, extracto de carne, entre otros (Desai &
Nityanand, 2011; Muthukumar & Murugan, 2014).
Inductor: Es necesario agregar compuestos xenobióticos al microorganismo
productor, ya que la producción de lacasa sin inductor genera enzimas con baja
actividades enzimáticas. Hay varios tipos de inductores, como los compuestos
aromáticos, siendo los más usados el ABTS, HBT, ácido verátrico y ácido ferúlico
6 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
(Viswanath et al., 2014; Zucca et al., 2011). Los aminoácidos como la asparagina,
histidina, arginina o ácido aspártico pueden ser buenos inductores, aunque la cisteína
inhibe completamente la producción (Viswanath et al., 2014). Otros inductores usados
son las sales de cobre (Tinoco et al., 2011) y algunos alcoholes como el etanol y el
metanol (Manavalan et al., 2013)
pH y Temperatura: Para hongos se han usado valores de pH entre 4 y 6 y temperatura
entre 25 y 30°C, pero los niveles de aumento de la actividad enzimática no se controlan
(Muthukumar & Murugan, 2014; Shraddha et al., 2011; Viswanath et al., 2014).
Otros factores que afectan la producción de lacasa son: el tiempo de cultivo, si se hace
el cultivo sumergido o estacionario, concentración de compuestos orgánicos e
inorgánicos distintos a los ya nombrados, aeración, degradación o activación por
proteasas, entre otros (Shraddha et al., 2011).
1.1.3. Aplicaciones en diferentes procesos
En la Tabla 1-1 se muestran aplicaciones reportadas para la lacasa. De estas aplicaciones,
las más usadas son la decoloración de tintes, la industria de papel y el tratamiento de
materiales lignocelulósicos.
Tabla 1-1: Aplicaciones de la lacasa en la industria.
Industria Aplicación Referencia
Decoloración de
tintes
Degradación de colorantes como
Índigo Carmesí, Remazol Azul
Brillante R, Amaranto, entre otros
(Giardina et al., 2010; Mate &
Alcalde, 2015)
Industria del papel Mejoramiento del algodón,
producción de tableros de fibra
(Polizeli & Rai, 2014; Strong
& Claus, 2011)
Contexto General 7
Biorremediación Degradación de herbicidas,
pesticidas, insecticidas.
(Strong & Claus, 2011)
Materiales
lignocelulósicos
Degradación de lignina para
aumentar la cantidad de celulosa
disponible
(Adrio & Demain, 2014;
Munk et al., 2015)
Alimentos Mejoramiento de parámetros
sensoriales, mejoramiento del
gluten.
(Dwivedi et al., 2011; Vohra
& Satyanarayana, 2012)
Cosméticos y
fármacos
Productos de belleza, higiene
personal, sedantes, antibióticos y
antiinflamatorios.
(Shraddha et al., 2011;
Vohra & Satyanarayana,
2012)
Nanotecnología Sensores para identificar
compuestos fenólicos.
(Polizeli & Rai, 2014)
Celdas de
Biocombustible
Generación de energía con motor
basado en lacasa y celulasa.
(Polizeli & Rai, 2014;
Shraddha et al., 2011; Vohra
& Satyanarayana, 2012)
Síntesis Formación de polímeros de
polifenol, polímeros de acrilamida y
compuestos orgánicos funcionales.
(Polizeli & Rai, 2014)
1.1.4. Bioquímica de la lacasa
La lacasa tiene en su sitio activo 4 átomos de cobre que pueden ser clasificados en tres
tipos basados en su espectroscopía (Jones & Solomon, 2015):
1 cobre tipo 1 (T1) que exhibe una absorción intensa alrededor de los 600 nm,
correspondiente al color azul profundo, que forma enlaces altamente covalentes entre
el cobre y la cisteína y está unido a dos histidinas y cisteína en configuración sp3.
1 cobre tipo 2 (T2) que no muestra absorbancia y se les consideran cobres normales,
los cuales están ligado a dos histidinas y un ligando enlazado con agua en un arreglo
sp2.
2 cobres tipo 3 (T3) que tiene una alta absorbancia con una longitud de onda 330 nm,
se generan momentos antiferromagnéticos, está ligado a tres histidinas en un arreglo
sp3.
8 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Los cobre T2 y T3 están arreglados en un cúmulo de cobre trinuclear (TNC) que están
conectados con T1 mediante la cisteína del T1 y las histidinas de los T3 a una distancia de
13 Å, fuera de esto, se encuentran residuos de carboxilatos que ayudan al mecanismo de
reacción, todo esto ilustrado en la figura 1-2.
Figura 1-2: Estructura del sitio activo (a) Estructura molecular del cobre T1 en sitio activo, mostrando cisteína (amarillo) e histidinas (azul). (b) Estructuras moleculares de los cobres T2 y T3 en sitio activo de la lacasa y los residuos de carboxilatos (D77 y D456). (c) Absorbancia en espectro UV-Vis. Tomado de (Jones & Solomon, 2015).
En la figura 1-3, se muestra el mecanismo de reacción que se da en el sitio activo, donde
el sustrato le pasa electrones al cobre T1. Luego estos van al TNC mediante un enlace
intermolecular mediante la cisteína del T1 y las histidinas del TNC. Finalmente. el O2 es
capaz de transformarse en agua en el TNC (Hakulinen & Rouvinen, 2015; Jones &
Solomon, 2015).
Contexto General 9
Figura 1-3: Transporte de electrones en una reacción con lacasa como catalizador. Tomado de (Hakulinen & Rouvinen, 2015).
1.2. Fusarium spp
El Fusarium spp es un hongo patógeno filamentoso del filo Ascomycota (Ma et al., 2013).
Este hongo es conocido por ser patógeno del maíz mediante micotoxinas llamadas
Fumonisinas (Waskiewicz et al., 2012). Debido a esta patogenicidad, este hongo genera
pérdidas económicas, ya que requiere esfuerzos de erradicarlo (Kotowicz et al., 2014;
Miller et al., 2014). En Colombia, se ha visto que los hongos de este género afectan a
plantaciones de productos alimenticios de la canasta familiar, provocando principalmente
marchitez (Rodríguez Estupiñan & Ossa Canencio, 2007).
1.2.1. Características
La taxonomía del hongo Fusarium spp está definida a continuación (Kotowicz et al., 2014):
1. Dominio: Eukaryota.
2. Clado: Ophisthokonta.
3. Reino: Fungi.
4. Subreino: Dikarya.
5. Filo: Ascomycota.
6. Subdivisión: Pezizomycotina
7. Clase: Sordariomycetes.
8. Subclase: Hypocreomycetidae.
10 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
9. Orden: Hypocreales.
10. Familia: Nectriaceae.
11. Género: Fusarium.
Para los hongos del género Fusarium, se han secuenciado varias especies, como se
muestra en la Tabla 1-2.
Tabla 1-2: Genomas de Fusarium spp (Brown & Proctor, 2013; Ma et al., 2013).
Especie Cepa Cromosomas Genes
F. graminearum PH-1 4 13332
F. verticillioides 7600 11 14179
F. oxysporum 4287 15 17735
F. solani 77-13-4 17 15707
F. circinatum FSP34 Desconocido 15713
F. fujikuroi IMI58289 12 14813
Los Fusarium para su reproducción generan micelios haploides (puede haber reproducción
sexual o asexual) (Ma et al., 2013). En general, para los microorganismos del género
Fusarium predomina la fase asexual (Brown & Proctor, 2013). El proceso de reproducción
asexual (solo mitosis), hay 3 formas especiales de esporas: Microconidias, macroconidias
y Clamidosporas (Ma et al., 2013).
1.2.2. Aplicaciones en distintos procesos
Debido a que es un patógeno que genera pérdidas en la industria agricultora, muchas de
las investigaciones apuntan a la remoción de otros patógenos del mismo tipo. Sin embargo,
es utilizado para producción de metabolitos secundarios generados por estrés externo o
remoción de contaminantes por su capacidad de degradación de fenoles y aromáticos.
Contexto General 11
Tabla 1-3: Aplicación de Fusarium spp en la industria.
Aplicación Referencia
Producción de enzimas: lacasa, celulasa,
xilanasa, entre otras.
(Ravalason et al., 2012; Roberts et al.,
1996)
Extracción de metales alcalinos y
alcalinotérreos
(Mahmoud et al., 2013)
Degradación de materiales lignocelulósicos (Hernández Fernaud et al., 2006)
Estudios de impacto de diferentes patógenos
en plantas
(de la Torre-Hernández et al., 2014;
Pizzolitto et al., 2013)
Producción de etanol (de Almeida et al., 2013)
Prevención de enfermedades (Babič et al., 2015; Cocchi et al., 2011)
Degradación de contaminantes (Guillén-Jiménez et al., 2012)
Producción de sustancias químicas quirales (Monsalve, 2009)
1.2.3. Producción de lacasa a partir de Fusarium spp
Los hongos del género Fusarium puede producir varias isoenzimas de lacasa a partir de
varios genes (Ravalason et al., 2012), con la capacidad de producir lacasa con estructuras
primarias de 540-640 aminoácidos, con pesos moleculares de 60-73 kDa. Lacasa
producida se pueden secretar al medio (extracelular), permanecer en el interior del hongo
(intracelular) o enlazada a la membrana celular (Cañero & Roncero, 2008).
En el grupo de investigación de Bioprocesos y Flujos Reactivos, se han desarrollado
trabajos con el hongo Fusarium spp con miras a producir lacasa, aplicable en materiales
lignocelulósicos. Inicialmente se realizaron trabajos de aislamiento y conservación de la
cepa (Lopera, 2009), la cual fue obtenida en la región del Urabá antioqueño. Luego de
tener la cepa productora aislada, se determinaron condiciones ambientales, como
temperatura y agitación, que favorecen la producción de lacasa. Se encontró que la
temperatura de producción es 30°C y 200 rpm (Cano, 2011). Posterior a esto, se determinó
la fuente de carbono y nitrógeno adecuado para la producción de lacasa. Se encontró que
esta enzima tiene producción óptima con xilosa y peptona como fuentes de carbono y
nitrógeno respectivamente. También se encontró que el metanol es un inductor adecuado
para obtener lacasa con mayor actividad (Certain, 2015).
12 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
1.3. Separación y purificación de proteínas
Para avances en el campo de la biotecnología, el desarrollo de técnicas y métodos de
separación y purificación de proteínas ha sido una parte importante en los productos
biobasados durante las últimas décadas (Janson, 2012). Escoger un método adecuado
para separar y purificar proteínas permitirá desarrollar diversas la aplicaciones de la
proteína. Para separar y purificar de forma exitosa, es necesario seleccionar las técnicas
más adecuadas, optimizar su rendimiento para tener los resultados requeridos y reducir el
número de etapas necesarias (Amersham Pharmacia Biotech, 1998).
1.3.1. Tipos de separación y purificación
Precipitación:
Se utiliza una sustancia que se agrega al caldo enzimático, modificando las propiedades
del sistema: pH, temperatura, constante dieléctrica, pI, entre otros, provocando una
precipitación selectiva de enzimas (Scopes, 2002). La base de su separación es la
solubilidad y tiene una resolución baja (Camperi et al., 2014). Varios tipos de precipitación
se han dado, por ejemplo, con sales inorgánicas y solventes orgánicos (Camperi et al.,
2014; Viswanath et al., 2014), estos métodos se ilustran en la figura 1-4. En la precipitación
salina, se produce un efecto salting-out, donde la proteína de interés forma enlaces
hidrofóbicos con ella misma y se precipita. Mientras que en la precipitación con solventes
orgánicos se forman micelios donde se aprovecha la naturaleza hidrofóbica e hidrofílica de
la proteína de interés.
Contexto General 13
Figura 1-4: Precipitación de proteínas. Precipitación salina (parte superior) y con compuestos orgánicos (inferior). Proteína de interés (círculo), compuestos polares (triángulos) y compuestos no polares (estrellas).
Formación de fases:
En este método, los compuestos son separados o se forman sustancias inmiscibles o
parcialmente inmiscibles, en donde la enzima es estable en uno de ellos (Scopes, 2013).
Este tipo de técnicas involucra varios efectos como salting out, precipitación isoiónica y
precipitación de enzimas osmolíticas y kosmotrópicas (Dhananjay & Mulimani, 2009).
Dentro de las técnicas más usadas están la formación de dos y tres fases (Hong Yang,
2013; Rachana & Lyju Jose, 2014). En la formación de dos fases (extracción acuosa de
dos fases ATPE) se usa un compuesto salino y otro polimérico generalmente, donde los
compuestos interaccionan con el extracto crudo y uno de ellos (el más afín al compuesto
de interés) extrae la proteína que se desea separar. Para la formación de tres fases
(Partición de Tres Fases TPP), se usa un compuesto salino y otro orgánico (generalmente
un alcohol C5) que al interactuar con el extracto crudo forma una fase o precipitado
intermedio donde se encuentra la proteína de interés. Ambos métodos se presentan en la
Figura 1-5.
14 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Figura 1-5: Formación de fases. ATPE (parte superior) y TPP (Parte inferior)
Cromatografía:
De los métodos más reportados en la purificación de enzimas. La salida de la proteína se
retrasa con respecto al resto de compuestos por medio de un material absorbente (Scopes,
2013). Hay varias formas de cromatografía: intercambio iónico (distribución de cargas),
afinidad (reconocimiento molecular o especificidad del ligando), entre otros (Camperi et al.,
2014; General Electrics Healthcare, 2007). La cromatografía de intercambio iónico se basa
en la competencia entre proteínas con distintas cargas superficiales que se enlaza con un
adsorbente que tiene cargas opuestas a la proteína de interés (Hedhammar et al., 2006).
En la cromatografía de afinidad se enlaza el compuesto que se quiere separar acoplándolo
a ligandos específicos (General Electrics Healthcare, 2007). Otros métodos usados en
menor medida para purificación son los de interacción hidrofóbica y de fase reversa. Los
métodos cromatográficos se ilustran en la Figura 1-6.
Contexto General 15
Figura 1-6: Tipos de cromatografía. Adaptado de (Hedhammar et al., 2006)
Filtración:
En este método se basa en cambios de presión para separar los distintos compuestos en
el sistema. El extracto se coloca en una malla en la que se aplica diferenciales de presión
haciendo que quede un retenido con la lacasa y un permeado con el resto de compuestos
que había en el caldo enzimático (Amersham Pharmacia Biotech, 1998; Camperi et al.,
2014). Dentro de los métodos más usados para este tipo de separación y purificación están
la ultrafiltración y la filtración en gel (Amersham Pharmacia Biotech, 1998). Para la
ultrafiltración convencional, hay una barrera semipermeable donde queda atrapada la
proteína de interés y el resto pasa la barrera, haciendo que la proteína aumente conforme
se disminuya el volumen inicial (Arakawa, Ejima, & Akuta, 2016). La filtración en gel es una
combinación de la ultrafiltración y la cromatografía, donde en la columna hay un adsorbente
específico que retiene la proteína. El esquema general de la filtración se muestra en la
Figura 1-7.
16 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Figura 1-7: Purificación por filtración.
Centrifugación:
Este método usa la fuerza centrífuga para separar las partículas presentes en el extracto
crudo producido. Dependiendo del tamaño de partícula y la densidad, los distintos
compuestos presentes se sedimentan de distintas maneras, logrando una separación de
partículas. Esta sedimentación se logra al girar el sistema sobre un eje de rotación a altas
velocidades, las partículas en suspensión se muevan por fuerzas centrifugas radiales lejos
de su eje (Frei, 2011). Aquí se diferencian dos tipos de centrifugación especiales para la
separación y purificación de proteínas: Diferencial y Zonal con gradiente de densidad. Los
distintos tipos de centrifugación se ilustran en la Figura 1-8. En la centrifugación diferencial,
las partículas se sedimentan a distintas velocidades, a medida que aumenta el tiempo, se
varía la velocidad de centrifugación (Figura 1-1 (a)), sin embargo partículas livianas pueden
verse contaminadas por partículas pesadas. Para solucionar este problema, se utiliza
centrifugación zonal con gradiente de densidad. Con este método se suspende la proteína
en un medio que tenga un gradiente de densidad, haciendo que a una velocidad constante,
las partículas menos densas se enlazan en la parte superior y las más pesadas en la parte
inferior (Figura 1-1 (b) y (c)). Hay dos tipos de este tipo de centrifugación: en una de ellas
coloca la muestra en la parte superior del medio con el gradiente y las partículas se
sedimentan al bajar generando bandas de concentración (zona de velocidad), y en la otra,
se forman las bandas solo por su densidad haciendo que no se forme ninguna en la parte
superior del sistema (isopícnico)
Contexto General 17
Figura 1-8: Tipos de Centrifugación. Adaptado de Frei (2011)
1.4. Materiales lignocelulósicos
Los materiales lignocelulósicos son una fuente alternativa de azúcares para la producción
de jarabes fermentables y posterior bioetanol, entre otras aplicaciones. Estos materiales
no afectan negativamente las cadenas de producción y suministro de alimentos, de hecho,
en la producción de jarabes y biocombustibles se usan los residuos de estas cadenas. Esta
biomasa tiene 3 componentes principales: celulosa, hemicelulosa y lignina. Estos
componentes están enlazados de tal manera que la estructura formada del material es
compleja y reacia a descomposiciones sencillas. La variedad de los componentes
principales determina la dureza y flexibilidad del material (Haghighi Mood et al., 2013).
Figura 1-9: Estructura de los materiales lignocelulósicos. Adaptado de (Menon & Rao, 2012)
18 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
1.4.1. Celulosa
Es el componente orgánico más abundante obtenido a partir de biomasas. Es un
polisacárido con una fórmula base (C6H10O5)n y consiste en una cadena lineal de miles de
unidades de glucosas unidas por el enlaces β (1,4) glicosidicos. Estos conforman
estructuras tanto cristalinas como amorfas (Ummartyotin & Manuspiya, 2015).
Figura 1-10: Estructura de la celulosa. Tomado de (van Zyl et al., 2011)
1.4.2. Hemicelulosa
La hemicelulosa es otro polisacárido que tiene una estructura más compleja que la
celulosa. Este biopolímero está compuesto de otro biopolímeros como xilano, manano,
galactano y arabinano generalmente, siendo el xilano el más abundante. El xilano es un
biopolímero conformado por residuos de xilosa en su mayoría, con sustituyentes de
glucosa, arabinosa y acetatos. Estas xilosas se enlazan mediante enlaces β (1,4)
glicosidicos. Otro biopolímero presente en la hemicelulosa es el manano, el cual se
conforma de manosa, galactosa y glucosa (Van Dyk & Pletschke, 2012).
1.4.3. Lignina
La lignina es uno de los biopolímeros más abundantes junto a la celulosa y la hemicelulosa
(Chávez-Sifontes & Domine, 2013), es un polímero hidrofóbico con unidades
fenilpropanoides que se presenta en las paredes celulares de las plantas, está presente
en materias primas usadas en la industria del papel y en la producción de biocombustibles
celulósicos. Este biopolímero se compone mayoritariamente de tres precursores
monoméricos (Chávez-Sifontes & Domine, 2013): alcohol p-cumarílico, alcohol coniferílico
y alcohol sinapílico, cuyas estructuras se muestran en la figura 1-11. Cuando estos
Contexto General 19
precursores son incorporados en los polímeros de lignina, entran como unidades
monoméricas de p-hidroxifenil (H), guayacil (G) y siringil (S) (Munk et al., 2015).
Figura 1-11: Los tres mayores precursores de la lignina. Tomado de (Munk et al., 2015).
Si bien la estructura de la lignina tiene una alta complejidad, numerosos estudios de
fisiología de plantas, estructura general de lignina y síntesis de lignina tienen buen
acercamiento a la realidad (Munk et al., 2015). La composición de la lignina está
fuertemente influenciada por las condiciones de origen y crecimiento de la planta e incluso
puede variar entre los distintos tipos de células, dentro de la misma planta (Moura et al.,
2010).
1.4.4. Clasificación de Materiales Lignocelulósicos
Los materiales lignocelulósicos se clasifican según el contenido de lignina, hemicelulosa y
celulosa, como se muestra en la Tabla 1-4. Las materias duras tienen altos contenidos de
celulosa y bajos de lignina, importantes a la hora de definir pretratamientos, ya que requiere
de menos esfuerzos para remover la lignina.
Tabla 1-4: Porcentaje de los diferentes componentes de los materiales lignocelulósicos.
(Betts, Dart, Ball, & Pedlar, 1991)
Lignina (%) Celulosa (%) Hemicelulosa (%)
Maderas duras 18-25 45-55 24-40
Madera Blanda 25-35 45-50 25-35
Herbáceas 25-30 25-40 25-50
20 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Debido a esta clasificación, la lignina clasificá tres tipos de plantas de acuerdo a la
composición de sus unidades monoméricas (Djikanović et al., 2012):
Madera blanda (gimnospermas): compuestas mayormente por unidades monoméricas
G con unidades menores de H.
Maderas duras (angiospermas dicotiledóneas): están compuestos de unidades G y S
aproximadamente en iguales cantidades.
Ligninas herbáceas (angiospermas monocotiledóneas): contiene todas las unidades
monoméricas pero sus cantidades varían.
En la Tabla 1-5 se muestran los porcentajes de las unidades monoméricas (representadas
en precursores monolíticos o monolignoles) en los distintos tipos de plantas mostrados en
la tabla 1-4.
Tabla 1-5: Porcentaje de los diferentes monolignoles en la lignina para varios tipos de
plantas (Chávez-Sifontes & Domine, 2013)
Tipo de Planta Porcentajes (%)
P-cumarílico Coniferílico Sinapílico
Gimnospermas Madera Blanda <5 >95 0
Angiospermas Dicotiledóneas (maderas duras) 0-8 25-50 45-75
Monocotiledóneas (Herbáceas) 5-35 35-80 20-55
1.5. Pretratamiento de materiales lignocelulósicos
Los pretratamientos en materiales lignocelulósicos tienen como objetivo degradar la mayor
cantidad de lignina y hemicelulosa, para que aumente la celulosa disponible y con ello
obtener mayor cantidad de producto (Singh et al., 2015). Este proceso es necesario, ya
que la lignina y la hemicelulosa (en especial la lignina) forma una barrera que disminuye la
acción de la celulasa en la celulosa disponible, una de las razones principales, para costos
elevados de producción de etanol a partir de materiales lignocelulósicos (Moilanen et al.,
2011).
Contexto General 21
1.5.1. Tipos de pretratamientos
La Lignina puede ser aislada del material lignocelulósico por varios métodos que incluyen
procesos mecánicos y/o químicos, los cuales se pueden agrupar en dos vías principales
(Chávez-Sifontes & Domine, 2013):
1. Liberación de la celulosa y la hemicelulosa mediante solubilización, dejando la
lignina como residuo insoluble.
2. Dilución de la lignina, dejando como residuos insolubles la celulosa y la
hemicelulosa, seguido de la recuperación de la lignina a partir de fase líquida.
No se ha llegado a un método disponible para realizar aislamiento de la lignina sin el riesgo
de modificarla estructuralmente durante el proceso, pero se ha llegado a información
valiosa sobre su reactividad química y su estructura (Bauer et al., 2012). Los
pretratamientos en materiales lignocelulósicos tienen como objetivo degradar la mayor
cantidad de lignina y hemicelulosa, para que aumente la cantidad de celulosa disponible y
con ello obtener mayor cantidad de producto (Singh et al., 2015) ya que la lignina y la
hemicelulosa (en especial la lignina), forma una barrera que disminuye la acción de la
celulasa en la celulosa disponible. (Moilanen et al., 2011). Según Menon y rao (2012), un
pretratamiento efectivo se caracteriza por: la preservación de las fracciones de
hemicelulosa, lo que limita la formación de inhibidores debido a productos de degradación,
aumento del área superficial, reducción de la energía requerida, rentabilidad energética y
económica, recuperación de productos de alto valor agregado, entre otros.
Térmico:
También llamado autohidrólisis, es uno de los pretratamientos más usados (Radeva et al.,
2012), ya que dentro de sus procesos incluye expansiones de vapor de agua y separación
acuosa (Singh et al., 2015). Es un método amigable con el ambiente ya que reemplaza
agentes químicos ácidos o alcalinos (Zakaria et al., 2016) pero usa grandes cantidades de
energía (Egüés et al., 2012). Provoca la fusión de la lignina pero produce rompimiento
imparcial de la matriz de la celulosa (Singh et al., 2015). Manteniendo el proceso en pH de
4-7, la suspensión generada después del pretratamiento se puede filtrar para obtener dos
fracciones: una fracción sólida enriquecida de celulosa y una fracción líquida rica en
azúcares derivados de la hemicelulosa.
22 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Ácido:
Uno de los métodos más usados para obtener altos rendimientos de azúcar a partir de
biomasas lignocelulósicas, en donde se usan sustancias ácidas como el ácido sulfúrico
con condiciones de pH y temperatura tal que se rompen los enlaces intermoleculares de
la lignina con la celulosa (Lee et al., 2013), sin embargo este pretratamiento no logra
remover completamente la lignina de la celulosa (Singh et al., 2015).
Este pretratamiento es usado para reducir la cantidad de hemicelulosa para hacer más
accesible la celulosa a la acción de la celulasa, pero a estas condiciones también se puede
degradar la lignina presente. Este pretratamiento se realiza con ácido sulfúrico, que puede
estar concentrado o diluido. Sin embargo, trabajar con ácido concentrado es poco atractivo
debido a que tiene efectos corrosivos sobre los equipos usados y forma compuesto
inhibidores (Alvira et al., 2010).
Además del ácido sulfúrico también se puede usar ácido nítrico, ácido clorhídrico, ácido
fosfórico, ácido peracético y ácido oxálico. Generalmente se usa más el ácido sulfúrico
debido a su bajo costo, alta actividad y disponibilidad, pero se pueden producir compuestos
inhibidores provenientes de la hemicelulosa. Estos productos se pueden reducir utilizando
ácido maleico y fumárico (Singh et al., 2015).
Básico (Alcalino):
Es igual que el pretratamiento ácido, solo que se usan sustancias como hidróxido de sodio,
potasio, calcio y amonio, cuya característica es pH más altos (Singh et al., 2015) y produce
menos productos inhibitorios que el pretratamiento ácido (Shaibani et al., 2011). Este
pretratamiento es más efectivo en maderas duras y cultivos herbáceos con bajos
contenidos de lignina, en maderas blandas con altos contenidos de lignina, este
pretratamiento es poco efectivo (Deejing & Ketkorn, 2009).
Ozonólisis
El ozono es un oxidante potente que muestra una alta eficiencia de deslignificación. Esta
eliminación de la lignina aumenta el rendimiento de la hidrólisis enzimática. El
pretratamiento se realiza generalmente a temperatura ambiente y presión normal y no
conduce a la formación de compuestos inhibidores que pueden afectar a la hidrólisis y la
fermentación posterior (Balat, 2011). Un inconveniente importante a considerar es la gran
cantidad de ozono necesaria, que pueden hacer que el proceso sea económicamente
inviable (Limayem & Ricke, 2012).
Contexto General 23
Organosolvente
Se utilizan diferentes mezclas de disolventes orgánicos o acuosos como: etanol, acetona,
etilenglicol y alcohol tetrahidrofurfurílico, con el fin de solubilizar la lignina y celulosa para
la hidrólisis enzimática. La principal ventaja es la recuperación de subproductos como la
lignina la cual es relativamente pura. Los disolventes deben ser recuperados por técnicas
de separación, para que puedan ser reciclados y disminuir los costos, además de que estos
solventes pueden tener efectos inhibidores de la hidrólisis enzimática y fermentación de
microorganismos (Chiaramonti et al., 2012).
Líquidos iónicos
El uso de líquidos iónicos como disolventes para el pretratamiento de la biomasa celulósica
ha recibido recientemente mucha atención. Líquidos iónicos son sales, normalmente
compuestos por cationes orgánicos grandes y pequeños aniones inorgánicos, que existen
como líquidos a temperaturas relativamente bajas; a menudo a temperatura ambiente. Los
líquidos iónicos tienen una gran ventaja ya que no se forman gases tóxicos o explosivos
(Pérez de los Ríos & Hernández Fernández, 2014).
Explosión de fibra de amoniaco (AFEX)
En el proceso AFEX, la biomasa se trata con amoníaco anhidro líquido a temperaturas
entre 60 y 100 ° C y alta presión durante un período de tiempo variable se libera la presión,
luna rápida expansión del gas amoníaco que causa inflamación y ruptura física de las fibras
en la biomasa y descristalización parcial de la celulosa. A diferencia de otros
pretratamientos como la expansión a vapor que se puede separar una fase liquida de la
sólida en el AFEX solo se recupera un sólido pretratado (Chiaramonti et al., 2012).
1.5.2. Pretratamiento enzimático
Con el objetivo de usar compuestos más amigables con el ambiente y reducir el uso
excesivo de energía debido a condiciones de temperatura y presión, una opción es la
degradación de lignina con biocatalizadores como lacasas, manganeso peroxidasa, lignina
peroxidasa, entre otros, los cuales provienen de hongos de podredumbre blanca
(Chiaramonti et al., 2012; Van Dyk & Pletschke, 2012).
24 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
En la naturaleza, la lignina de los materiales lignocelulósicos son selectivamente
degradados por hongos de podredumbre blanca, (Lange et al., 2013). Es más común usar
lacasa como enzima en estos pretratamientos que las distintas peroxidasas, ya que la
lacasa usa como aceptor de electrones el oxígeno, que es económicamente más barato
que el peróxido de hidrógeno usado por las peroxidasas (Munk et al., 2015). La lacasa no
puede actuar directamente sobre la lignina del material lignocelulósico, por lo que esta
requiere un mediador (Munk et al., 2015).
La unión de la lacasa con el mediador se le llama Sistema Mediador Lacasa (LMS). Este
mediador permite que se dé una transferencia de electrones, un radical de transferencia
de átomo de hidrógeno, o un mecanismo iónico en la reacción de degradación de lignina,
dependiendo del mediador que se use (Widsten & Kandelbauer, 2008). El uso del LMS
permite que las velocidades de reacciones sean mayores, hayan aumento de rendimientos
y adhieren nuevas reacciones oxidativas a la lacasa (Kunamneni et al., 2008). Un mediador
ideal es una molécula pequeña, que genera radicales estables que no interactúen con la
enzima (Cañas & Camarero, 2010). Se ha identificado que para aumentar la degradación
de lignina en materiales lignocelulósicos, el mediador usado para el LMS puede tener
similitudes con la lignina, es decir, estos pueden tener fenoles y aromáticos, sin embargo,
es necesario verificar que estos mediadores fenólicos y aromáticos sean capaces de
transportar electrones, ya que no todos los compuestos de este tipo tienen esta
característica (Munk et al., 2015).
1.5.3. Estado del arte del pretratamiento enzimático
En la literatura, se encuentran pretratamientos enzimáticos con remociones que superan
el 50%, algunos alcanzan remociones del 80%. Estas diferencias en las remociones de la
lignina ocurren debido a la estructura de la lignina, que varía según el material
lignocelulósico (Moilanen et al., 2011; Munk et al., 2015) y la estructura de la lacasa varía
según el microorganismo (Hakulinen & Rouvinen, 2015).
Contexto General 25
Tabla 1-6: Pretratamientos enzimáticos con lacasa en materiales lignocelulósicos
reportados en literatura (elaboración propia).
Lacasa Mediador Sustrato Remoción
de lignina Referencia
Cerrena unicolor -- Caña de azúcar
pretratada 80%
(Moilanen et al.,
2011)
Melanocarpus
albomyces ABTS, HBT Pino 53%
(van de Pas et al.,
2011)
Myceliophthora
thermophila
Siringato de metilo,
Siringaldehido
Pulpa de
Eucalipto 50% (Babot et al., 2011)
Siringato de metilo Materia prima
de eucalipto >50% (Rico et al. , 2014)
ácido violúrico,
siringaldehido
Pulpa de
Eucalipto 50%
(Gouveia et al.,
2012)
Sclerotium sp. ABTS Paja de Trigo 84.23% (Qiu & Chen, 2012)
Thermus
thermophilus
ABTS, HBT,
Guaiacol
Pulpa de paja
de trigo 27% (Zheng et al., 2012)
Trametes villosa
HBT Hierba para
elefantes 50%
(Gutiérrez et al.,
2012)
HBT, Ácido violúrico,
Siringaldehido
Materia prima
de eucalipto 55-60%
(Garcia-Ubasart et
al., 2011; Moldes &
Vidal, 2011)
Laurilgalato Residuos de
papel 50%
(Cusola et al.,
2013)
Trichoderma reesei - Caña de azúcar 84% (Kuila et al., 2011)
Como antecedentes para el microorganismo del género Fusarium, se ha realizado
aplicaciones sobre pino con lacasa de Fusarium proliferatum, con remociones de lignina
entre el 50 y el 60% (Regalado et al., 1997, 1999). Para esta aplicación se cultivó el
microorganismo directamente sobre el material lignocelulósico, a diferencia de otros
pretratamientos. Otra aplicación con F. proliferatum se hizo sobre papel a partir de sisal,
que tuvo remociones entre el 54 y 59% (Hernández Fernaud, Carnicero, et al., 2006). En
residuos de soya, se ha removido entre el 60 y 80% con lacasa a partir de Fusarium solani
26 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
(Lozovaya et al., 2006). Para estos pretratamientos se usaron como mediadores ABTS y
HBT.
En investigaciones pasadas, se realizó pretratamientos de la lacasa de Fusarium spp sobre
tallos de yuca (Liscano-Martinez & Tangarife-Morales, 2015). Se obtuvo una remoción de
lignina del 40%. Sin embargo, también hubo degradación de celulosa
1.6. Raquis de Palma
La palma de aceite Elaeis guineensis Jacq, es la palma más usada para la producción de
aceite de palma del mundo, la cual es originaria de África. Esta palma, es usada
principalmente en los trópicos debido a sus bajos costos, facilidad de establecimiento y
altos rendimientos, haciendo el cultivo de aceite más eficiente en el mundo (Dislich et al.,
2016). Colombia es el cuarto productor de aceite de palma en el mundo y el primero en
Latinoamérica teniendo una capacidad de producción de 1.143.446 toneladas de aceite
crudo aproximadamente. Sin embargo el aceite extraído de palma representa
aproximadamente el 10% de la palma inicial, lo que dejó aproximadamente 10.606.980 de
toneladas de residuos al año (Fedepalma, 2016).
Parte de estos residuos se generan al extraer de la palma el fruto con un tambor rotatorio,
donde se separan los frutos y se obtienen racimos vacíos, tusas vacías o raquis,
representan el 20.2% de la carga inicial. Este raquis se dispone a campo abierto o en
plantas de compost (Cenipalma, 2014).
Figura 1-12: Tusa o raquis de palma Tomado de (Cenipalma 2014)
Contexto General 27
En la Tabla 1-7 se muestran reportes relacionados con la composición del raquis de palma.
Cabe señalar que clasifica como madera dura, material de interés para los pretratamientos
enzimáticos deseados para este trabajo.
Tabla 1-7: Composición de Raquis de Palma.
Compuesto (C. Lu et
al., 2010)
(Piñeros
Castro,
2012)
(Mora Cano &
Flórez Pérez,
2016)
(Medina
et al.,
2016)
(Chin et
al., 2015)
(Fang et
al., 2015)
Celulosa (%) 42.0 37.9 30.0 28.0 39.9 38.3
Hemicelulosa
(%) 30.1 26.2 33.0 24.2 27.1 20.7
Lignina (%) 14.2 22.1 22.0 29.9 24.6 24.6
Extractivos (%) 10.2 7.9 15.0
-- 9.5 --
Cenizas (%) 2.8 2.9 3.2 1.6 --
Humedad (%) -- -- -- -- -- 3
Proteína (%) -- -- -- 3.36 -- --
Total (%) 99.3 97.0 100.0 88.7 102.51 86.6
1.7. Conclusiones
Los distintos métodos de separación y purificación de enzimas pueden mejorar los
pretratamientos enzimáticos realizados con lacasa de Fusarium spp.
Por los reportes de literatura, se encontró que el raquis de palma, al ser un material
duro, es una biomasa lignocelulósica y se puede aplicar pretratamientos con la lacasa
de Fusarium spp.
Métodos de separación y Purificación adecuado para lacasa de Fusarium spp
29
2. Métodos de separación y Purificación para lacasa de
Fusarium spp
Resumen
Varios han sido los métodos usados para la separación y purificación de lacasas obtenidos
de extracto crudo, se caracterizan la cromatografía, centrifugación, formación de fases,
precipitación y filtración. En este trabajo se escogió la formación de fases para la
purificación de lacasa de Fusarium spp, específicamente, la Partición de Tres Fases. Este
método consta de la interacción de sulfato de amonio y ter-butanol con el extracto crudo
que favorezca efectos kosmotrópicos y de salting out. Con esto se forma una fase o
precipitado intermedio de una fase superior orgánica y una fase acuosa.
Introducción
Generalmente, la lacasa producida a partir de hongos viene acompañada de otros tipos de
compuestos como isoformas, proteasas, celulasas y oros compuestos derivados de la
producción del extracto crudo (Janson, 2012). Entre los distintos métodos de separación y
purificación se encuentran la cromatografía, precipitación, formación de fases,
centrifugación, filtración, entre otras, los cuales se utilizan dependiendo de la utilidad de la
proteína purificada, ya sea identificación o mejorar un proceso posterior (Camperi et al.,
2014). Entre estos procesos se encuentra la Partición de Tres Fases (TPP por sus siglas
en ingles), en el que se agrega un alcohol orgánico (ter-butanol) y un compuesto salino
(sulfato de amonio) a un extracto crudo con lacasa producida, donde se forman tres fases:
una fase orgánica, una fase salina y un precipitado intermedio donde se encuentra la
lacasa (Gagaoua & Hafid, 2016). El objetivo de este capítulo esjustificar la selección de la
TPP como método de separación y purificación de la lacasa producida por Fusarium spp
para aplicarse en raquis de palma.
2.1. Separación y purificación de lacasas
Como se vio en la sección 1.3, es necesario separar y purificar enzimas, ya que en la
producción de enzimas, se forman subproductos que no permiten una actividad enzimática
óptima (Camperi et al., 2014). Para el caso particular de lacasas, se ha desarrollado varios
30 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
métodos para separar y purificar esta enzima a partir de Basidiomicetos, Ascomicetos y
bacterias (Rivera-Hoyos et al., 2013).
2.2. Subproductos de la separación y purificación de lacasas
Para el caso específico de la producción de lacasas a partir de hongos, se ha encontrado
los siguientes subproductos:
Celulasas: Estas enzima se encargan de degradar la celulosa presente en materiales
lignocelulósicos (Maitan-Alfenas et al., 2015). Hongos del género Fusarium han
producido celulasas y lacasas (Ravalason et al., 2012). Ya que la intención de este
trabajo es usar la lacasa para degradar la lignina presente en materiales
lignocelulósicos, se hace necesario retirar la celulasa presente, porque quedaría
menos celulosa disponible para procesos posteriores.
Proteasas: Estas enzimas se encargan de degradar proteínas, al estar en altas
concentraciones puede generar partición proteolítica de la lacasa (Pierce, 2005). Se ha
demostrado que los hongos ligninolíticos pueden producir proteasas que afectan
procesos posteriores (Brown & Proctor, 2013; Kirk et al., 1987; Polizeli & Rai, 2014;
Strong & Claus, 2011; Van Dyk & Pletschke, 2012; Viswanath et al., 2014).
Isoformas: Son lacasas que en su estructura primaria tienen alta similitud con su
estructura nativa, pero en las estructura secundaria y terciaria pueden variar,
desactivando su sitio activo (Strong & Claus, 2011). Es posible que por procesos post-
traduccionales del Fusarium spp se generen este tipo de estructuras que disminuirían
la actividad enzimática, es necesario separarla de la lacasa activa.
Compuestos contaminantes: Sustancias hidrofóbicas y demás moléculas generadas
a partir de la producción de la misma lacasa. Estas pueden afectar la estructura de la
enzima, modificando su sitio activo y reduciendo su actividad enzimática (Camperi et
al., 2014).
2.3. Métodos Reportados
Tradicionalmente, los procesos que se han realizado para separar y purificar lacasas han
usado métodos cromatográficos, aclarando que siempre aparece un paso previo de
precipitación con sulfato de amonio. Para comparar la efectividad de los métodos, se
verifica cuánto es el rendimiento de la enzima y en cuanto aumentó la actividad específica
Métodos de separación y Purificación adecuado para lacasa de Fusarium spp
31
de la lacasa (Veces de Purificación). El cual se determina usando las ecuaciones (2-1)-(1-
3) (Referencia).
Y=LAf
LA0
×100% (2-1) FP=SAf
SA0
(2-2) SA=LA
P (2-3)
Donde Y es el rendimiento, FP es las veces de purificación, LAf y LA0 son las actividades
enzimáticas (U/L) de lacasa purificada y el extracto crudo respectivamente, SAf y SA0 son
las actividades específicas (U/mgproteína), y P es la concentración de proteína (mg/mL).
Como se observa en la ecuación (2-1), el rendimiento es el cambio de actividad enzimática
en el proceso aplicado, el cual puede ser mayor a 100% debido a que la actividad puede
ser levemente aumentada. La ecuación (2-2) describe las veces de purificación, que es el
cambio de actividad específica. Este término se incluye el cambio de actividad enzimática
y la proteína, lo que puede describir mejor si una purificación usada es viable o no.
Tabla 2-1: Separación y purificación de lacasa encontrados en la literatura
Método de separación y
purificación Microorganismo Recuperación
Veces de
purificación Referencia
Formación de fases
Partición
trifásica
Pleurotus ostreatus 161% 27.8 (Kumar et al., 2012)
Ganoderma sp. 60% 13.2 (Rajeeva & Lele,
2011)
Coriolopsis trogii 72% 14 (Liu et al., 2015)
Extracción
acuosa en
dos fases
Agaricus bisporus 95% 2.48 (Mayolo-Deloisa et
al., 2009)
Trametes
versicolor 96% 1.91
(Prinz et al., 2014)
Pleurotus sapidus 64% 1.84
Peniophora
cinerea 107% 1.61
(Moreira et al.,
2013)
Lentinus
polychrous 99% 1.98
(Ratanapongleka,
2012)
Pleurotus ostreatus 98.31% 9.97 (Bertrand et al.,
2016)
32 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Tabla 2-1: (Continuación)
Método de separación y
purificación Microorganismo Recuperación
Veces de
purificación Referencia
Precipitación
Solventes
orgánicos
Coriolus
versicolor 92.7% 4.79
(Peng et al.,
2012)
Compuestos
salinos
Pseudomonas
aeruginosa 49.48% 0.74
(Peter &
Vandana, 2014)
Cromatografía
Intercambio
iónico
Leptographium
qinlingensis 23.5% 25.6 (Hu et al., 2013)
Pleurotus ferulae 26.91% 4.85 (Ding et al.,
2014)
Russula
virescens 36.1% 128.1
(Zhu et al.,
2013)
Pleurotus
ostreatus 11.82% 147.74
(Othman et al.,
2014)
Carica papaya 61.5% 1376.70 (Jaiswal et al.,
2015)
Afinidad
Agaricus
bisporous 0.8% 8
(Bhadauria et
al., 2014)
Ganoderma
lucidum 30.65% 7.19
(Ding et al.,
2012)
Cerrena sp. 39.8% 3.1 (J. Yang et al.,
2014)
Trametes hirsuta 31% 180 (Haibo et al.,
2009)
Filtración
Ultrafiltración
Pycnoporus
sanguineus 71% 1.9
(Ramírez-
Cavazos et al.,
2014)
Trametes
Versicolor 44% --
(Martínez-
Morales et al.,
2014)
Filtración en
gel
Paraconiothyrium
variabile 22% 0.85
(Forootanfar et
al., 2011)
Métodos de separación y Purificación adecuado para lacasa de Fusarium spp
33
Para lacasa producida a partir de microorganismos del género Fusarium, se han
desarrollado algunos métodos de separación y purificación. Entre las especies que se han
purificado se encuentran Fusarium solani (Wu et al., 2010) y el Fusarium ploriferatum
(Hernández Fernaud et al., 2006) con veces de purificación de 75.9 y 69.1 respectivamente
y rendimientos de 9 y 23%. Los métodos usados por Wu y colaboradores, y Hernández
Fernaud y colaboradores. Incluyen precipitación con sulfato de amonio y columnas
cromatográficas de intercambio iónico. En trabajos previos con la lacasa de Fusarium spp,
la separación y purificación se realizó mediante precipitación con sulfato de amonio
(Liscano-Martinez & Tangarife-Morales, 2015; Rodríquez-Siza, 2015). Donde se obtuvo
rendimientos de 130% y veces de purificación de 1.26 y 1.31.
2.4. Selección del método
Para seleccionar el método dentro de los reportados para lacasa (Tabla 2-1) y aplicados
para proteínas en general (sección 1.3.1), se tuvo cuenta varios factores:
Disponibilidad de aplicación.
Conservación de la actividad de la enzima (Rendimiento, (2-1)).
Tiempos de separación bajos (1h-1 semana).
Cantidad de proteína purificada (Veces de purificación, (2-2)).
Con estos factores, inicialmente se descarta la centrifugación para separar la lacasa de
Fusarium spp. Este método según lo reportado por Frei (2011), es ideal para separar
enzimas de remanentes de biomasa en el extracto enzimático y para analizar estructuras
y tiempos de separación variable. Sin embargo, genera fases donde está la proteína
objetivo, con otras proteínas de peso molecular similar generando confusiones, genera
modificaciones estructurales de la proteína y los rendimientos muy bajos para la actividad
enzimática (Shi, 2016).
Si bien los métodos cromatográficos son los más usados y con altas veces de purificación,
para este trabajo se descartan. Si se observa la Tabla 2-1, los rendimientos son menores
al 30% , lo que indica que lacasa purificada obtenida tiene alta actividad específica pero
se obtiene en pocas cantidades, es poco conveniente a la hora de aplicarlo a un
pretratamiento. Generalmente, estos métodos son usados para la producción de fármacos
y la identificación de proteínas (Camperi et al., 2014), lo cual no es el objetivo de esta
investigación. Además, tiene tiempos largos de separación (1 día-1 semana) que incluye
34 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
equilibrio, limpieza de columna y diálisis (General Electrics Healthcare, 2007) y puede
haber limitaciones de selectividad por grupo (Hedhammar et al., 2006).
La filtración tiene tiempos de separación variable, sin embargo puede generar cambios de
presión muy altos (Seader & Henley, 2006) lo que puede afectar la estructura de la lacasa
y por consiguiente su actividad enzimática. Además, como se puede ver en la Tabla 2-1,
sus resultados son bajos en comparación con métodos como formación de fases. Se
descarta la filtración como método para separar y purificar lacasa usada en este trabajo.
La precipitación como se presenta en esta investigación es un método sencillo, que solo
requiere de un compuesto interactúe con los compuestos que hay en el extracto enzimático
y afecte ciertas propiedades como el pH, solubilidad o cargas de la proteína que se quiere
precipitar y tiempos de separación variable (Camperi et al., 2014). Sin embargo, para los
reportes de literatura mostrados en la Tabla 2-1, los resultados son muy bajos con respecto
a otro métodos, Se descarta la precipitación.
Por último queda la formación de fases, donde se caracterizan la Extracción Acuosa de
Dos Fases (ATPE) y la Partición de Tres Fases (TPP). Ambos tienen resultados parecidos,
donde se conserva la actividad enzimática por encima del 50% y la cantidad de proteína
no es tan baja como la cromatografía. Para la ATPE, donde se usan polímeros como
Polietilenglicol (PEG) y UCON y sales fosfato y sulfato, es difícil determinar la fase donde
la enzima de interés termine, inconveniente que no tiene la TPP. Además, es posible que
la actividad enzimática se vea afectada por estar en contacto constante con un polímero o
sal que inhiba la reacción deseada (Hong Yang, 2013). Con esto, se puede descartar la
ATPE, dejando la TPP como el método de separación y purificación usado para esa
investigación.
2.5. Partición de Tres Fases (TPP)
La partición de Tres Fases (TPP por sus siglas en inglés), es un método sencillo, fácil y
rápido, que se realiza en un paso (Gagaoua & Hafid, 2016). En este método se agrega un
compuesto salino (generalmente sulfato de amonio) y un compuesto orgánico (un alcohol
orgánico de alto peso molecular) que forman un precipitado entre una fase superior
orgánica y una fase salina inferior (Borbás et al., 2003; Dennison & Lovrien, 1997), como
se muestra en la Figura 2-1.
Métodos de separación y Purificación adecuado para lacasa de Fusarium spp
35
Figura 2-1: Representación Esquemática de la TPP.
2.5.1. Principio
Se usan sulfato de amonio como compuesto salino y ter-butanol como compuesto
orgánico. Este alcohol es miscible en agua, pero al agregar una sal como la que se usa en
este método se forman dos fases inmiscibles. De esta manera, como se muestra en la
Figura 2-1, en la fase inferior quedan compuestos polares afines al sulfato de amonio como
proteínas y carbohidratos, y en la parte superior quedan compuestos no polares afines al
ter-butanol como pigmentos y lípidos. Denison y Lovrein (1997) veían este método como
el fortalecimiento de la proteína de interés con iones sulfato y la parte no polar del ter-
butanol, mientras Borbás y colaboradores (2003) como la adsorción de proteínas a un
fluido estable en la interface generada. La capacidad de la TPP de formar la fase
intermedia se basa en dos reacciones (Rachana & Lyju Jose, 2014). La primera reacción
se tiene la proteína en el extracto crudo totalmente penetrada por el agua que pasa a estar
conformacionalmente más apretada con menos penetración de moléculas de agua. En la
segunda reacción los cambios en viscosidad son más evidentes y la proteína, al estar
mucho menos penetrada por el agua, realiza interacciones hidrofóbicas con otras
proteínas, lo que produce la precipitación y formación de la fase o precipitado intermedio.
2.5.2. Impactos del Sulfato de amonio
Su efecto es importante, ya que es la encargada de realizar el proceso de salting-out, en
el cual al aumentar la concentración de sal, se disminuye la cantidad de agua disponible
en la proteína y empieza a precipitar. El sulfato de amonio es la sal más usada por este
método debido a su alta solubilidad y fuerza iónica (Rachana & Lyju Jose, 2014). Los iones
36 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
que conforman esta sal están al final de su respectiva serie de Hofmeister, sus efectos
caotrópicos son los más bajos, favoreciendo el efecto de salting out. Esta sal juega un rol
importante en la TPP ya que es la encargada los enlaces proteína-proteína (Gagaoua &
Hafid, 2016).
2.5.3. Impactos del Ter-butanol
El ter-butanol es un alcohol orgánico C4, que reduce efectos caotrópicos y sirve como
solvente diferenciador. Este compuesto orgánico no es capaz de penetrar la proteína
debido a que su tamaño molecular es más grande que los espacios generados en la
estructura tridimensional de la proteína. Se ha descubierto que el ter-butanol tiene
importantes efectos kosmotrópicos (contrario a los efectos caotrópicos) y de
amontonamiento sobre la proteína de interés cuando el sistema trabajado se incuba a
temperaturas entre 20-40°C, lo que mejora la estabilidad de la proteína.
2.5.4. Ventajas y Desventajas
Además de lo ya mencionado, otras ventajas de la TPP (Gagaoua & Hafid, 2016; Rachana
& Lyju Jose, 2014):
El uso de menos cantidad de sal en comparación con precipitaciones salinas.
La concentración de la proteína obtenida es mayor que la cromatografía.
Se usa a temperaturas cercanas al ambiente, evitando las temperaturas bajas.
Las condiciones donde se maximiza la TPP favorecen la estabilidad de la proteína.
Facilidad en procesos de escalado (scale-up y scale-down).
Además, tiene la capacidad de formar un proteína purificada más rígida (Rather & Gupta,
2013), sin embargo, puede desestabilizar proteínas con estructuras cuaternarias.
2.5.5. Aplicaciones
Como se nombró en la Tabla 2-1, ya se han hecho aplicaciones de este método sobre
extractos crudos con actividad lacasa. En la tabla 2-2 se muestran las condiciones
reportadas en literatura. Es importante marcar que se usan grandes cantidades de sulfato
de amonio, la temperaturas usadas favorecen efectos kosmotrópicos de la lacasa y la
cantidad de ter-butanol no supera la relación 1:2.
Métodos de separación y Purificación adecuado para lacasa de Fusarium spp
37
Tabla 2-2: Condiciones de TPP para lacasa reportados
Microorganismo Extracto-Ter-
butanol (v:v)
Sulfato de
amonio
(%)
Temperatura
(°C)
Rendimiento
(%)
Veces de
Purificación Referencias
Pleurotus
ostreatus 1.0:1.8 60 42±3 161 27.8
(Kumar et al.,
2012)
Ganoderma sp. 1.0:0.5 80-90 35 60 13.2 (Rajeeva & Lele,
2011)
Coriolopsis trogii 1.0:1.0 40 20 75 20 (Liu et al., 2015)
También se ha aplicado para remover pigmentos de la celulosa producida para
sacarificación (Rachana & Lyju Jose, 2014), separar la captesinas de hemoglobinas (que
se desestabilizan por su estructura cuaternaria) presentes en la sangre (Gagaoua & Hafid,
2016), y para separar y purificar gran cantidad de enzimas y proteínas como α-amilasa,
proteinasa, proteasa, galactosidasa, lipasa, albúminas, entre otras (Rather & Gupta, 2013).
2.6. Conclusiones
La separación y purificación por formación de fases, fue el método escogido para aplicarse
sobre el extracto crudo con actividad lacasa de Fusarium spp. Esto se debió a que con
este tipo de métodos se concentra la proteína mejor en comparación a los demás métodos.
Sin embargo, si el objetivo de purificar fuera diferente a la posterior aplicación, es posible
cambiar por otro método. Si el objetivo es concentrar todas las proteínas presentes en el
extracto crudo, la precipitación y la ultrafiltración son buenas opciones. Si se necesitan
cantidades bajas para procesos a bajas escalas o identificar el tipo de lacasa que se está
trabajando, la centrifugación y la cromatografía toma importancia.
Dentro de la formación de fases, se escogió la TPP por encima de la ATPE debido a poca
certeza sobre ciertos factores de la ATPE. Ya que la lacasa no cuenta con estructura
cuaternaria la TPP no se va a desestabilizar con este método. Sin embargo, para
maximizar la separación y purificación de la lacasa es necesario tener en cuenta el sulfato
de amonio, ter-butanol y temperatura de incubación del sistema, que varían los efectos
kosmotrópicos de la lacasa.
Condiciones óptimas para el método de separación y purificación de lacasa de Fusarium spp.
39
3. Condiciones óptimas para el método de separación y
purificación de lacasa de Fusarium spp.
Resumen
En este capítulo, se presenta las condiciones donde se maximiza la cantidad de lacasa
purificada mediante TPP. Los factores más importantes del proceso, encontrados en
reportes de literatura, fueron el sulfato de amonio, el ter-butanol y la temperatura de
incubación, que corresponden a un máximo de la variable respuesta. Estos factores se
ingresaron a un Diseño Central Compuesto, las variables respuesta fueron, El rendimiento
y las veces de purificación, definidas en las ecuaciones (1-1) y (1-2). Mediante un Análisis
de Varianza (ANOVA) se encontró que los factores que afectan de forma significativa a
esta purificación, son la saturación de sulfato de amonio y la relación volumétrica del
extracto crudo con el ter-butanol. Las condiciones que favorecieron el rendimiento y las
veces de purificación máximo fueron, 1.0:1.13131 relación extracto crudo con ter-butanol,
38.4°C de temperatura y 77.9798% m/v de saturación de Sulfato de Amonio, con los que
se obtiene 114.13±7.69% de rendimiento y 1.216±0.183 de veces de purificado.
Comparado con los métodos reportados, se concluyó que se logra maximizar la TPP para
lacasa de Fusarium spp.
Introducción
El hongo Fusarium spp es un hongo ascomiceto patógeno que genera grandes pérdidas
económicas (Miller et al., 2014). Este hongo, aislado en el Urabá Antioqueño, tiene
potencial ligninolítico, con la capacidad de producir lacasa (Lopera, 2009), sobre el cual
hay un medio específico para producción de lacasa (Cano, 2011; Certain, 2015). Sobre el
extracto crudo producido se ha hecho aplicaciones en materiales lignocelulósicos,
concluyendo que es posible que hayan otras enzimas como celulasas o peroxidasas que
disminuyen los rendimientos del proceso de remoción de lignina (Liscano-Martinez &
Tangarife-Morales, 2015). Para mejorar esto, se propone separar y purificar lacasa
producida mediante TPP. El objetivo de este capítulo es determinar las condiciones para
la TPP, aumente la actividad específica de la lacasa.
40 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
3.1. Metodología
3.1.1. Microorganismo
Fusarium spp fue aislado por el laboratorio de Bioprocesos y Flujos Reactivos del
Departamento de Procesos y Energía de la Facultad de Minas, en la Universidad Nacional
de Colombia, sede Medellín (Lopera, 2009), el cual presentó potencial ligninolítico en
estudios previos (Cano, 2011).
3.1.2. Activación de inóculo de Fusarium spp
Se preparó 20 mL de PDA en agua destilada y esterilizó a 15 psi durante 15 minutos. Luego
de agregar PDA a caja de Petri, se inoculó hongo que se tiene aislado y conservado
(Lopera, 2009). Se selló e incubó a 25°C durante 10 días. Se prepararon 100 mL de PDB
que se esterilizan a 15 psi durante 15 minutos. Del medio de cultivo incubado en medio
sólido se sacaron 3 o más discos agar de aproximadamente 5 mm de diámetro de la
periferia del crecimiento y se agregaron en PDB. Se incubó el inóculo a 25°C y a 150 rpm
durante 5 días.
3.1.3. Fermentación sumergida de inóculo producido
Se prepararon 100 mL de medio de cultivo con los compuestos nombrados en las Tablas
3-1 y 3-2, basados en el trabajo hecho por Certain (2015):
Tabla 3-1: Componentes de medio líquido para producir lacasa a partir de Fusarium spp.
Compuesto Concentración Compuesto Concentración
Xilosa 1.53 g/L CaCl2 0.1 g/L
Peptona 0.56 g/L Acetato de sodio 3.3 g/L
Metanol 1% v/v Tween 80 (10%) 5 mL/L
KH2PO4 2 g/L Metanol 1% (v/v)
MgSO4*7H2O 0.5 g/L Elementos trazas 10 mL/L
Condiciones óptimas para el método de separación y purificación de lacasa de Fusarium spp.
41
Tabla 3-2: Composición de elementos trazas.
Componente Concentración (g/L)
MgSO4*7H2O 3.00
MnSO4 0.50
NaCl 1.00
FeSO4*7H2O 0.10
CoCl2 0.10
ZnSO4*7H2O 0.10
CuSO4 0.10
H3BO4 0.01
Na2MoO4 0.01
AlK(SO4)2 0.01
A excepción del metanol, se esterilizó el medio de cultivo a 15 psi durante 15 minutos.
Luego de la esterilización, se agregó asépticamente el metanol. Se agregó 1mL de inóculo
líquido y se incubó a 25°C y 100 rpm en agitador orbital. Luego de la incubación, se filtró
el medio de cultivo en un sistema de filtrado al vacío con porosidad de 0.2 µm, obteniendo
un extracto crudo.
3.1.4. Medición de actividad enzimática lacasa y proteína
Para un sistema de reacción de 1mL, se agregaron en dos celdas para espectrofotómetro
100 µL de amortiguador Acetato de sodio/Ácido acético 1M pH 5, 700 µL de agua destilada
y 100µL de muestra a analizar. Se Incubaron las celdas a 40°C durante un minuto. En una
de las celdas incubadas, se agregó 100µL de amortiguador acetato (blanco). En la otra
celda, se agregaron 100µL de sustrato ABTS 5mM disuelto en amortiguador acetato
(muestra). Se pusieron las celdas en espectrofotómetro UV-VIS y se leyeron los
incrementos de absorbancia a una longitud de onda de 436 nm cada 15 segundos durante
3 minutos, verificando que el comportamiento sea lineal. Para calcular la actividad
enzimática se utilizó la ecuación (2-1).
E.A.=A×Vt×Fd
t×ε×Vm
(2-1)
42 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Donde E.A. es la actividad lacasa (U/L), A es el cambio de absorbancia a 436 nm (Absinicial-
Absfinal), Vt es el Volumen total de la reacción, Fd es el factor de dilución, t es el tiempo de
dilución, ε es el coeficiente de extinción molar de ABTS oxidado que es 29300 M-1cm-1 y
Vm es el Volumen de muestra.
La unidad de actividad enzimática es la cantidad de micromoles catalizadas por la lacasa
por minuto, ahora considerando El ABTS como indicador de la enzima se obtiene una
definición de actividad enzimática de lacasa, como la cantidad de ABTS oxidado por
minuto.
Para la medición de proteína se usó el método de Bradford (Walker, 2002), usando como
colorante el azul de Coomasie G250 y como estándar la albúmina, generando una curva
estándar mostrada en el Anexo A.
3.1.5. Partición Trifásica (TPP)
Al extracto enzimático producido (con actividad enzimática y concentración de proteína
previamente medidos) se le agregó sulfato de amonio y ter-butanol. Luego, se homogenizó
el sistema mediante agitación moderada con equipo vórtex. El sistema homogéneo se
incubó durante 1 hora en baño maría, donde se formaron 3 fases. Posterior a la incubación,
se sometió a centrifugación a 4000 rpm durante 10 minutos a 25 °C en centrífuga Thermo
scientific IEC CL31R, con el objetivo que el precipitado intermedio quede más compacto y
sea fácil de separar. Después, se separaron las fases con un embudo de separación,
donde queda la fase intermedia, la cual se depositó en buffer fosfato pH 7 (Determinación
de pH Anexo B). Por último se determinó la actividad enzimática y la concentración de
proteína de lacasa purificada para compararla con las medidas en el extracto crudo
producido. Esta comparación se hizo mediante el cálculo del rendimiento y las veces de
purificación (fold purification) según las ecuaciones (2-1) y (2-2) ya mostradas.
3.1.6. Diseño Experimental
Para el TPP, se realizó un diseño central compuesto, usando 4 repeticiones del punto
central, donde los factores de entrada fueron la relación de extracto crudo con ter-butanol
(1.00:0.50-1.00:3.00 v:v), la temperatura de incubación (25-60 °C) y la saturación de sulfato
de amonio (20-90 %p/v). Los factores de respuesta fueron el rendimiento y las veces de
Condiciones óptimas para el método de separación y purificación de lacasa de Fusarium spp.
43
purificación definidos en la sección anterior. Los análisis estadísticos se realizaron en el
software Minitab versión 16.1.0.0 de prueba, con un nivel de significancia del 5%. En la
tabla 3.3 se presentan los datos del diseño experimental.
Tabla 3-3: Diseño Experimental para la Partición de Tres Fases (TPP) del extracto crudo
Factores de entrada Símbolo Unidades codificadas
- 0 +
Relación de extracto crudo con ter-butanol (v:v) A 1.00:0.50 1.00:1.75 1.00:3.00
Temperatura (°C) B 25 42.5 60
Saturación de (NH4)2SO4 (% w/v) C 20 55 90
3.2. Resultados y Discusión
Para la experimentación aquí mostrada, el extracto crudo tuvo una actividad lacasa de
51.75 U/L y 0.062 g/L de proteína. En comparación con los extractos usados en otros
estudios de partición trifásica (V. Vinoth Kumar et al., 2012; Liu et al., 2015; Rajeeva &
Lele, 2011), la actividad enzimática y la cantidad de proteína son muy bajos. Es posible
que el rendimiento se mantenga alrededor del 100% pero las veces de purificación pueden
verse disminuidas.
3.2.1. Partición Trifásica (TPP)
En la tabla 3.4 se muestra los resultados del diseño experimental mostrado en la tabla 3.3.
Dentro de lo más apreciable de esta tabla, se observa que a valores bajos de saturación
el precipitado intermedio no tiene actividad lacasa, representando valores de rendimiento
y veces de purificación nulos. Por el contrario, cuando hay valores altos de saturación, el
precipitado formado tiende a tener altos valores de actividad enzimática.
Tabla 3-4: Resultados del diseño experimental
Extracto crudo-ter-butanol (v:v) Temperatura (°C) Saturación de
(NH4)2SO4 (%w/v) Rendimiento (%) Veces de purificación
1.00:1.75 42.5 55.00 90.74 0.91
1.00:1.01 32.1 34.19 0.00 0.00
1.00:1.01 52.9 34.19 0.00 0.00
44 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Tabla 3-4: (Continuación)
Extracto crudo-ter-butanol (v:v) Temperatura (°C) Saturación de
(NH4)2SO4 (%w/v) Rendimiento (%) Veces de purificación
1.00:2.49 32.1 75.81 59.26 0.59
1.00:2.49 32.1 34.19 0.00 0.00
1.00:1.75 42.5 90.00 50.00 0.75
1.00:3.00 42.5 55.00 12.96 0.16
1.00:1.75 25.0 55.00 127.78 1.22
1.00:1.01 32.1 75.81 142.59 1.34
1.00:1.75 60.0 55.00 44.44 0.69
1.00:1.75 42.5 55.00 40.46 0.38
1.00:1.75 42.5 20.00 0.00 0.00
1.00:1.75 42.5 55.00 118.52 1.53
1.00:1.75 42.5 55.00 94.44 0.92
1.00:1.75 42.5 55.00 40.74 0.43
1.00:2.49 52.9 75.81 37.04 0.42
1.00:1.01 52.9 75.81 146.30 1.78
1.00:1.75 42.5 55.00 118.52 1.07
1.00:0.50 42.5 55.00 38.89 0.55
1.00:2.49 52.9 34.19 5.56 0.07
Los resultados experimentales fueron ajustados a ecuaciones de segundo grado completo
con interacciones. Las ecuaciones (2-2) y (2-3) representan el modelo encontrado para el
rendimiento y las veces de purificado respectivamente. La tabla 3-5 muestra el análisis de
varianza (ANOVA) hecho sobre el modelo propuesto en las ecuaciones obtenidas de la
regresión. La tabla 3-4 indica que, para las veces de purificación los factores que influyeron
de forma significativa fueron la saturación de sulfato de amonio y la relación de extracto
crudo y ter-butanol. La relación de estos factores es significativo, lo que indica que un
aumento o disminución del sulfato de amonio afecta los cambios de ter-butanol agregado
en el sistema formado, lo que indica una dependencia de estos factores entre sí. Por otro
lado, la temperatura no generó cambios significativos en las veces de purificado, lo que
indica que en este rango de temperaturas no hubo cambios significativos en las veces de
purificado.
Condiciones óptimas para el método de separación y purificación de lacasa de Fusarium spp.
45
Por otro lado el único factor que afectó de forma significativa el rendimiento es la saturación
de sulfato de amonio. Para este factor de respuesta, la relación de extracto crudo y ter-
butanol tiene significancia en el rendimiento de estos experimentos siempre y cuando esté
relacionado con el sulfato de amonio. En general, para la purificación de lacasa proveniente
de Fusarium spp por TPP, fue muy importante la cantidad de sulfato de amonio que se
agregue al sistema, siendo más importante que los otros factores evaluados, como se ha
dicho Gagaoua y Hafid (2016), argumentándolo bajo el hecho que aumenta el efecto
salting-out en el sistema, aumentando la interacción proteína-proteína que forma la fase
intermedia.
VP= -5.56289+2.77265*A+0.0472930*B+0.110477*C-0.483529*A2-4.93380*10-4
*B2
-5.97983*10-4
*C2-0.00886738*A*B-0.0176121*A*C+0.000113846*B*C (2-2)
Y(%)= -536.748+248.389*A+4.50474*B+11.8843*C-48.2994*A2-0.0499026*B2
-0.0623623*C2-0.329235*A*B-1.60128*A*C-0.0138963*B*C (2-3)
Tabla 3-5: ANOVA de las veces de purificado y el Rendimiento en TPP
Factor Valor P
Veces de Purificado Rendimiento
Modelo 0.013 0.014
A- Extracto crudo: ter-butanol 0.047 0.069
B-Temperatura 0.642 0.201
C- Saturación de (NH4)2SO4 0.002 0.003
A2 0.016 0.013
B2 0.558 0.536
C2 0.018 0.012
A*B 0.55 0.815
A*C 0.038 0.046
B*C 0.828 0.782
Falta de Ajuste 0.454 0.093
R2 85.94 % 85.50 %
R2 Ajustado 70.13 % 69.20 %
46 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Adicionalmente, en la Tabla 3-5 se observa que el valor p del modelo dio menor que el
nivel de significancia (α=0.05) y la falta de ajuste dio mayor para las veces de purificación
y el rendimiento. Lo que indica que las regresiones propuestas son adecuadas para los
experimentos propuestos. Al revisar los coeficientes de determinación (R2 y R2 ajustado),
vemos que hay más cercanía entre los valores dados para las veces de purificación que
con el rendimiento, lo que indica que las veces de purificación predice de forma más
acertada la TPP hechas en estos experimentos en comparación con el rendimiento.
En las Figuras 3-1 y 3-2 se muestran la respuesta de las veces de purificación y el
rendimiento basado en las condiciones del experimento y la regresión hecha como gráficas
de superficie y de contorno. Se observó que los cambios de temperatura hacen que los
cambios de las veces de purificado sean muy bajos, corroborando los resultados de la
ANOVA en la Tabla 3-5. No obstante, la temperatura tiene valores altos de respuesta
cercanos a su límite inferior. Para el sulfato de amonio, los valores donde la respuesta se
maximiza fueron cercanos al límite superior, resultados cercanos a los propuestos por
Rajeeva y Lele (2015). Por último, la relación de extracto crudo-ter-butanol maximizó las
veces de purificación y el rendimiento en valores entre 1.0:1.2 y 1.0:2.0, rango donde esta
relación es similar a lo reportado por Kumar y colaboradores (2012).
Los valores máximos predichos para las veces de purificación y rendimiento basado en los
modelos de regresión calculados (ecuaciones (2-2) y (2-3)), fueron calculados y se
muestran en la Tabla 3-6, cuyas fases formadas se muestran en la Figura 3-3. Esta figura
muestra que claramente hay una fase intermedia formada entre una fase superior y una
fase orgánica. Al realizar la validación de estas condiciones, se obtuvo respuestas
experimentales que al comparar con las respuestas teóricas se interceptan sus rangos, por
lo que ambos valores no muestran diferencias significativas.
Condiciones óptimas para el método de separación y purificación de lacasa de Fusarium spp.
47
Figura 3-1: Relación de los distintos factores de entrada con respecto al Rendimiento.
48 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Figura 3-2: Relación de los distintos factores de entrada con respecto a las Veces de Purificación.
Condiciones óptimas para el método de separación y purificación de lacasa de Fusarium spp.
49
Tabla 3-6: Condiciones donde se maximizan los factores de respuesta obtenidos en los modelos de regresión.
Factor Valor
Relación de extracto crudo con ter-butanol (v:v) 1.0:1.13131
Temperatura (°C) 38.4
Saturación de (NH4)2SO4 (% m/v) 77.9798
Rendimiento Teórico (%) 124.04±18.61
Veces de Purificación Teórico 1.427±0.214
Rendimiento Experimental (%) 114.13±7.69
Veces de Purificación Experimental 1.216±0.183
Figura 3-3: Formación de Fases en sistema con condiciones donde se maximiza los factores de respuesta.
La Tabla 3-7 compara los resultados obtenidos en la Tabla 3-6 con los resultados
reportados en otros estudios. Las condiciones en las que se hace el TPP para este estudio
son más cercanas a las condiciones usadas por Rajeeva y Lele (2011). El resultado de
rendimiento obtenido en este estudio fue mayor a 100%, además es uno, de lo más altos
obtenidos para este proceso. Esto indica que la TPP para lacasa de Fusarium spp aumentó
en 14% la actividad enzimática. Sin embargo, las veces de purificación obtenida fueron
muy bajo comparado con los estudios reportados en la Tabla 3-7. Esto señala que el
precipitado intermedio obtenido, tuvo lacasa sin pérdida de actividad enzimática pero en
muy poca cantidad. Es posible que las veces de purificación hayan sido muy baja en
comparación con otros estudios debido a que la proteína presente en el extracto crudo
50 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
puede ser en su gran mayoría lacasa, en comparación con los extractos crudos usados en
los estudios reportados, donde puede haber más cantidad de compuestos a separar. Para
identificar si hay varios compuesto en el extracto a purificar, se sugiere realizar
electroforesis, donde de forma cualitativa se identifican los compuestos presentes ya sea
en el extracto crudo o en la lacasa purificada.
Tabla 3-7: Comparación de TPP de lacasas
Componente Este estudio (Kumar et
al., 2012)
(Rajeeva & Lele,
2011)
(Liu et al.,
2015)
Microorganismo Fusarium spp. Pleurotus
ostreatus Ganoderma sp.
Coriolopsis
trogii
Extracto-Ter-
butanol (v:v) 1.0:1.1 1.0:1.8 1.0:0.5 1.0:1.0
Sulfato de
amonio (%) 77.98 60 80-90 40
Temperatura (°C) 38.4 42±3 35 20
Rendimiento (%) 114.13 161 60 75
Veces de
Purificación 1.2 27.8 13.2 20
3.3. Conclusiones
Se logró realizar purificación de lacasa producida a partir de Fusarium spp por la TPP.
Mediante un Diseño Central Compuesto, se encontró que el sulfato de amonio es el factor
de mayor significancia para los experimentos desarrollados en comparación con la
temperatura y relación de extracto crudo producido y ter-butanol.
Fue posible realizar una regresión lineal cuadrática completa con interacciones tanto para
el rendimiento y las veces de purificación. Estas regresiones fueron adecuadas para los
experimentos propuestos ya que, mediante el ANOVA realizado, el modelo fue significativo
y la falta de ajuste no lo fue. La regresión propuesta para las veces de purificación tuvo
mejor capacidad de predicción que la propuesta para el rendimiento, debido a que los
coeficientes de determinación (R2 y R2 ajustado) encontrados para las veces de purificado
son más cercanos que los encontrados para el rendimiento.
Condiciones óptimas para el método de separación y purificación de lacasa de Fusarium spp.
51
Con los experimentos realizados, se encontraron condiciones para las veces de
purificación y el rendimiento máximos. Con una relación de extracto crudo-ter-butanol de
1.0:1.1, una saturación de sulfato de amonio de aproximadamente 78% y una temperatura
de 38 °C, se mejoró la actividad enzimática en 14% y la actividad específica en 20%.
Acción de lacasa purificada en un material lignocelulósico 53
4. Acción de lacasa purificada en un material
lignocelulósico
Resumen
Con la lacasa purificada mediante TPP, se procede con la aplicación de esta lacasa a una
biomasa lignocelulósica. Para este capítulo, se realizaron caracterizaciones de un raquis
de palma, con características de material duro, es factible un pretratamiento enzimático
debido a la concentración de lignina. Con el material caracterizado, se logró realizar un
diseño central compuesto donde las variables de estudio fueron el pH y la temperatura, las
constantes fueron la cantidad de sólidos, agitación y la cantidad de enzima, y la variable
de respuesta fue la concentración de fenoles totales en la fase líquida generada. Se
encontró que a temperaturas de 58.7 °C y pH 4 se dio la máxima producción de fenoles.
Luego de encontrar el máximo de producción de fenoles, se comparó pretratamientos con
lacasa purificada y extracto crudo en el raquis. Se encontró que la lacasa purificada
removió más lignina y degradó menos celulosa. Aunque la remoción de lignina fue baja en
comparación con lo reportado en literatura. La lacasa purificada mejoró el pretratamiento
enzimático.
Introducción
El raquis de palma es uno de los principales desechos generados de la producción de
aceite de palma. Es necesario un pretratamiento para degradar la lignina, la cual inhibe la
acción de celulasas necesarias para aumentar la cantidad de celulosa disponible para otros
procesos en los que se requiera de este biopolímero.
Sabiendo que la lacasa de Fusarium spp ya cuenta con un método de separación y
purificación mediante la TPP, el objetivo de este capítulo es establecer la acción de la
lacasa purificada sobre un material lignocelulósico, en este caso el raquis de palma. Donde
se comparó la acción de esta enzima con el extracto crudo.
54 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
4.1. Metodología
4.1.1. Raquis de Palma
El raquis de palma usado fue donado por la Federación Nacional de Cultivadores de Palma
de Aceite (Fedepalma). Este material fue secado a temperatura ambiente hasta que la
humedad de la muestra fuera inferior a 10%. Luego se redujo el tamaño de partícula con
molino de cuchillas con malla 2mm y almacenado en bolsas de plástico a 23°C.
Figura 4-1: Raquis de Palma en natura. Molino con malla de 2mm. Raquis de Palma molida.
Los métodos usados para la caracterización del material lignocelulósico siguió las
metodologías del Laboratorio Nacional de Energías Renovables NREL (Hames et al.,
2008; a Sluiter et al., 2008; A. Sluiter et al., 2004) mostrados en la Tabla 4-1. La proteína
cruda se determinó mediante la técnica de Kjeldahl basado en NTC 4657, realizado por el
Laboratorio de Análisis Químico y Bromatológico de la Universidad Nacional de Colombia.
La determinación de carbohidratos, se realizó por cromatografía líquida de alta resolución
en fase reversa (HPLC). Usando la columna Aminex HPX-87H, HPX-87P marca BIORAD.
Acción de lacasa purificada en un material lignocelulósico 55
Tabla 4-1: Protocolos NREL
Procedimiento Protocolo
Preparación de muestras NREL/TP-510-42620
Determinación de humedad NREL/TP-510-42621
Determinación de cenizas NREL/TP-510-42622
Extractivos con hexano, agua y etanol NREL/TP-510-42621
Lignina soluble e insoluble NREL/TP-510-42618
Celulosa y Hemicelulosa NREL TP-510-42618
Se realizó un análisis granulométrico que se muestra en el Anexo E.
4.1.2. Pretratamiento enzimático
El raquis de palma caracterizado fue sometido a tratamiento con lacasas de Fusarium spp
que fueron purificadas bajo las condiciones obtenidas en el capítulo anterior. Este
tratamiento se hizo con presencia de mediador ATBS 5 mM, en baño maría a 150 rpm. Se
usó un buffer acetato con pH variable, con una carga de sólidos en base seca de 10% en
Erlenmeyer de 500 mL con un volumen de trabajo de 100 mL con una carga de enzima de
1 U/gsustrato. El tratamiento duró 24 h, tomando muestras a 1, 2, 3, 4, 5, 7 y 24 h. Luego del
tratamiento se sacó una muestra a la que se agregó NaOH al 1.5% p/v con el fin de detener
la reacción y extraer todos los compuestos fenólicos en la fase líquida generada (Piñeros
Castro, 2012). Luego de ello se deja incubando a 60°C durante 1 hora. Posterior a esto se
centrifuga a 6000 rpm y se sacó el sobrenandante para determinar los compuestos
fenólicos. Para evitar interferencias provocadas por el NaOH y otros compuestos presentes
en la fase líquida, se hicieron controles: uno sin el sustrato y otro sin la enzima.
4.1.3. Determinación de Compuestos Fenólicos
La determinación de compuestos fenólicos en la fase líquida del pretratamiento realizó
mediante el método colorimétrico Folin-Ciocalteau. Se realizó agregando 20 µL de
muestra, 1580 µL de agua desionizada, 100 µL de colorante y 300 µL de solución
carbonato de sodio, que se deja incubando a 40 °C durante 30 minutos. Luego se lee la
absorbancia del sistema en espectrofotómetro UV-VIS a 765 nm. La absorbancia obtenida
se ingresa a una curva de calibración (Anexo C) con ácido gálico (Waterhouse, 2003).
56 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
4.1.4. Diseño Experimental
Para el pretratamiento con lacasas, se realizó un diseño central compuesto, usando 4
repeticiones del punto central, donde los factores de entrada fueron el pH (4-6) y la
temperatura (30-60 °C). El factor de respuesta fue la concentración de fenoles totales
medido por Folin-Cicolteau en la fase líquida. Los análisis estadísticos se realizaron en el
software Minitab versión 16.1.0.0 de prueba, con un nivel de significancia del 5%. En la
tabla 4-2 se presentan los datos del diseño experimental.
Tabla 4-2: Diseño Experimental para el pretratamiento enzimático del raquis de palma
Factores de entrada Símbolo Unidades codificadas
- 0 +
pH A 4.0 5.0 6.0
Temperatura (°C) B 30 45 60
4.1.5. Comprobación
Luego de obtener el punto donde la concentración de fenoles totales en la fase líquida es
máximo, se realizó dos pretratamientos con las condiciones críticas de pH y temperatura,
en los cuales se diferenció el uso de lacasa purificada y extracto crudo con el objetivo de
establecer la acción de la lacasa purificada sobre el raquis de palma en comparación con
el extracto crudo. Para ello, se hizo medición de fenoles totales, proteína (Bradford) y
azucares presentes en la fase líquida, y caracterización de la fase sólida por los protocolos
de NREL.
4.2. Resultados y Discusión
4.2.1. Caracterización
La caracterización sobre el raquis de palma molido comparado con los mostrados en la
Tabla 1-7, se muestra en la Tabla 4-3. Debido a la concentración de lignina, este material
puede corroborarse que es un material duro. El contenido de celulosa obtenido en este
estudio es comparable con el reporte hecho por Lu y colaboradores (2010). La
hemicelulosa es comparable con el estudio hecho por Mora y Flórez (2016). La
composición de Lignina entra en un rango cuyos valores son los reportes propuestos por
Piñeros Castro (2012) y C. Lu y colaboradores (2010). Se observa que la cantidad de
extractivos es más alto que los reportados y la cantidad de cenizas se acerca a lo reportado
Acción de lacasa purificada en un material lignocelulósico 57
por Chin y colaboradores (2015). Según Khiari y colaboradores (2010), la mayoría de las
cenizas están compuestas de átomos de Ca, Cl, K y Na.
Tabla 4-3: Comparación de los resultados de caracterización del raquis de palma de otros reportes con este estudio.
Compuesto Este estudio (C. Lu et al., 2010)
(Piñeros Castro, 2012)
(Mora Cano & Flórez Pérez, 2016)
(Medina et al., 2016)
(Chin et al., 2015)
(Fang et al., 2015)
Celulosa (%) 42.58±0.28 42.0 37.9 30.0 28.0 39.9 38.3
Hemicelulosa (%) 33.48±0.21 30.1 26.2 33.0 24.2 27.1 20.7
Lignina (%) 15.35±0.26 14.2 22.1 22.0 29.9 24.6 24.6
Extractivos (%) 16.46±0.74 10.2 7.9 15.0
-- 9.5 --
Cenizas (%) 1.71±0.48 2.8 2.9 3.2 1.6 --
Humedad (%) 1.75±0.05 -- -- -- -- -- 3
Proteína (%) 2.7±0.0 -- -- -- 3.36 -- --
Total (%) 109.58±2.02 99.3 97.0 100.0 88.7 102.51 86.6
4.2.2. Pretratamiento enzimático
Los resultados del Diseño Central Compuesto se muestran en la Figura 4-2. Se observó
que a partir de las 5 horas no se dan cambios significativos en los fenoles totales, los cuales
se verificaron con prueba de diferencia significativamente honesta (ver Anexo D). Se
determinó que 5 horas es el tiempo donde se maximiza el pretratamiento enzimático.
Además que la mayor cantidad de fenoles producidos se generó a temperaturas de 55.6°C
y pH de 4.3, comparado con 34.4 °C y pH 4.3 que es un punto donde se generaron bajas
concentraciones. Inicialmente, los pretratamientos obtuvieron la mayor cantidad de fenoles
al usar pH bajos y temperaturas altas. También es necesario un control del sustrato.
58 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Figura 4-2: Resultados del Diseño Central Compuesto para el Pretratamiento enzimático
Los resultados experimentales fueron ajustados a una ecuación de segundo grado
completo con interacciones. La ecuación (4-1) representa el modelo encontrado para la
cantidad de fenoles totales obtenidos en la fase líquida. La tabla 4-4 muestra el análisis de
varianza (ANOVA) hecho sobre el modelo propuesto en las ecuaciones obtenidas de la
regresión. Esta tabla indica que todos los factores evaluados afectaron de forma
significativa la formación de fenoles totales. Sin embargo, la relación entre factores no fue
significativa, lo que indica que un cambio de pH hizo cambios significativos sobre los
fenoles obtenidos pero sin ser afectado por los cambios de temperatura y viceversa. En
general, para el pretratamiento enzimático de raquis de palma con lacasa purificada fue
importante la temperatura del sistema y el pH al cual está el medio.
Fenoles (mg/L)=315.742 -134.867*A+7.16907*B+11.5815*A2 -0.0634622*B2+0.0713172*A*B (4-1)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 1 2 3 4 5 6 7
Fe
no
les T
ota
les (
mg
/L)
Tiempo (horas)
T=45.0 °C pH=5.0 T=45.0 °C pH=4.0 T=34.4 °C pH=5.7
T=55.6 °C pH=4.3 T=45.0 °C pH=6.0 T=34.4 °C pH=4.3
T=60.0 °C pH=5.0 T=30.0 °C pH=5.0 T=55.6 °C pH=5.7
Acción de lacasa purificada en un material lignocelulósico 59
Tabla 4-4: ANOVA de los fenoles totales obtenidos en la fase líquida del pretratamiento enzimático.
Factor Valor p
Modelo 0.000
A- pH 0.001
B-Temperatura 0.000
A2 0.019
B2 0.043
A*B 0.868
Falta de Ajuste 0.429
R2 94.53%
R2 Ajustado 90.63%
Adicionalmente, en la Tabla 4-4 se observa que el valor p del modelo dio menor que el
nivel de significancia (α=0.05) y la falta de ajuste dio mayor que α. Lo que indica que la
regresión propuesta es adecuada para los experimentos propuestos. Al revisar los
coeficientes de determinación (R2 y R2 ajustado), se observa que hay cercanía entre estos
parámetros, además que son valores por encima del 90%, lo que indica que el modelo
propuesto tiene un poder de predicción mayor al 90%.
En Figura 4-3 se muestra los cambios de los fenoles producidos con base en las
condiciones del experimento y la regresión hecha como gráficas de superficie y de
contorno. Se observó que los valores en los que la respuesta tiene valores máximos fueron
cuando la temperatura se acerca a su límite superior, mientras que el pH maximiza la
respuesta cuando sus valores son cercanos al límite inferior.
Figura 4-3: Relación del pH y la Temperatura con los Fenoles Totales
60 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
El valor máximo predicho para los fenoles totales basado en el modelo de regresión
calculado (ecuación (4-1)) fue calculado y se muestra en la Tabla 4-5. Debido a que el pH
donde se maximiza la producción de fenoles dio en el extremo inferior, fue necesario
comprobar los valores obtenidos variando el pH a un valor menor. Para este estudio se
comprobó el máximo comparando el pH con otro experimento donde este factor vale 3.8.
Al comparar los valores experimentales del máximo obtenido y la comprobación, se
observó que no hay diferencias significativas. Además, el máximo teórico y el máximo
experimental se interceptan, lo que indica que no hay diferencias significativas.
Tabla 4-5: Condiciones donde se maximizan los factores de respuesta obtenidos en los modelos de regresión para fenoles totales
Factor Valor Comprobación
pH 4.0 3.8
Temperatura (°C) 58.7029 58.7029
Fenoles Totales Teórico (mg/L) 180.477±8.497 --
Fenoles Totales Experimentales (mg/L) 174.527±6.982 177.938±16.139
4.2.3. Comprobación
Al realizar un pretratamiento con extracto crudo y compararlo con la lacasa purificada, se
realizó un balance de masa mostrado en la Tabla 4-6. Como se observó en la tabla, los
balances tuvieron errores que no superaron el 1%, por lo que no hubo pérdidas apreciables
de masa. Si bien aumentó la concentración de celulosa en la biomasa pretratada, hay parte
de la celulosa inicial que en el pretratamiento se convirtió en glucosa y va a la fase líquida.
Según Haghighi Mood y colaboradores (2013), las estructuras de las biomasas
lignocelulósicas tienen estructuras complejas y reacias, donde la lignina se entrelaza con
la celulosa y la hemicelulosa, por lo que puede haber rompimientos de fracciones de estos
polisacáridos. Sin embargo, el pretratamiento con lacasa purificada removió menos
celulosa que el realizado con extracto crudo, lo que indica que la purificación con TPP
realizado en el capítulo 3 aumento la disponibilidad de celulosa.
La lignina removida por el pretratamiento con lacasa purificada fue mayor que el
pretratamiento con extracto crudo. Esto significa que la purificación aumentó la capacidad
catalítica que tiene la lacasa en el pretratamiento, pero esta capacidad de remoción fue
Acción de lacasa purificada en un material lignocelulósico 61
muy poca comparado con otros reportes mostrados en la Tabla 1-6. La cantidad de fenoles
formados en el líquido no correspondieron a la cantidad de lignina degradada, esto pudo
pasar por la formación de nuevos polímero en la fase líquida (Munk et al., 2015). Debido a
la reducción de lignina y azúcares en la biomasa, compuestos como cenizas y extractivos
aumentaron.
Tabla 4-6: Comparación pretratamiento con lacasa purificada y extracto crudo.
Compuesto Biomasa inicial Biomasa pretratada (Lacasa Purificada)
Biomasa pretratada (Extracto Crudo)
Fase sólida (g) 12.00±0.00 10.01±0.09 8.82±1.08
Celulosa (%) 42.58±0.28 32.60±0.11 32.65±0.72
Hemicelulosa (%) 33.48±0.21 40.14±0.32 45.55±0.29
Lignina (%) 15.35±0.26 19.84±1.25 24.09±1.99
Extractivos (%) 16.46±0.74 20.07±1.62 18.17±0.82
Cenizas (%) 1.71±0.48 1.27±0.07 1.01±0.05
Proteína (%) 2.7±0.0 2.5 <2.5
Fase líquida (g) 100.28±0.25 g 102.70±0.49 103.06±1.13
Fenoles Totales (mg/L) -- 174.53±6.98 160.36±3.86
Proteína (mg/L) 7.16±0.801
87.45±15.75 37.33±3.94 6.24±0.702
Glucosa (%) -- 0.73±0.06 1.02±0.06
Xilosa (%) -- 0.00±0.00 0.00±0.00
Error del Balance (%) -- 0.58±0.38 0.55±0.37
Remoción de Lignina (%) -- 14.83 8.82
La baja capacidad de remoción pudo darse por varias razones:
Como se había dicho en el capítulo anterior el extracto tiene poca proteína, por lo que
hay poca lacasa, que puede haberse inhibido por exceso de sustrato.
Según Munk y colaboradores (2015), es posible que se haya dado la polimerización de
los monolignoles, generando estructuras secundarias que se forma simultáneamente
al rompimiento de la lignina presente.
Debido a la complicada estructura que puede tener la lignina, es posible que a la lacasa
le cueste degradar este biopolímero.
1 Proteína inicial en extracto crudo 2 Proteína inicial en lacasa purificada
62 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
4.3. Conclusiones
La biomasa tratada en este capítulo fue un material adecuado para realizar pretratamientos
debido a los contenidos de lignina. Al ser una madera dura es posible realizar
pretratamientos enzimáticos con menor esfuerzo y entregar un material libre de lignina.
Se logró obtener una regresión que explica más del 90% de la formación de fenoles a
partir de un pretratamiento con variaciones en el pH y la temperatura. Mediante este
modelo, se obtuvo un punto donde se maximizó la cantidad de fenoles presentes en la fase
líquida resultante del pretratamiento 175 mg/L de fenoles a partir de un pretratamiento con
pH 4 y temperatura de 58 °C.
Aunque los pretratamientos enzimáticos no tienen la misma capacidad de remoción que
los reportados en literatura, la lacasa purificada logró aumentar la remoción de lignina en
41%, en comparación con el pretratamiento con extracto crudo. Además redujo la cantidad
de azúcares presentes en la fase líquida resultante en 40%.
Conclusiones 63
5. Conclusiones y recomendaciones
5.1. Conclusiones
Fue posible encontrar un método de separación y purificación como la TPP que
aumente la actividad enzimática de lacasa y concentre las proteínas con la posibilidad
de aplicación en métodos de pretratamientos enzimáticos.
Se encontró que la TPP de lacasa de Fusarium spp maximiza su separación y
purificación cuando la relación de extracto crudo-ter-butanol es 1.0:1.1, la saturación
de sulfato de amonio es aproximadamente 78% y la temperatura 38 °C. Con esas
condiciones maximizadas se obtiene un rendimiento de 115% y veces de purificación
de 1.25 veces.
El raquis de palma, al ser un material lignocelulósico duro, tuvo la suficiente
concentración de lignina para considerarse en los pretratamientos enzimáticos con
lacasa.
Fue posible maximizar los fenoles totales producidos por el pretratamiento, ajustando
el pH a 4 y la temperatura a 58.7 °C.
La lacasa purificada mejoró el pretratamiento enzimático en 40% comparado con el
pretratamiento realizado con extracto crudo.
5.2. Recomendaciones
Con la necesidad de identificar completamente el microorganismo productor y la lacasa
producida, es necesario identificar las rutas metabólicas y biología molecular del
Fusarium spp, con los que se identifiquen otros compuestos producidos en el extracto
crudo.
Es necesario realizar electroforesis, con los que se evalué de forma cualitativa la
proporción de la lacasa con respecto a otros compuestos.
64 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Al mejorar la remoción de lignina con extracto purificado, es importante analizar las
estructuras que quedan luego del pretratamiento. Según Moilanen y colaboradores
(2011) es posible que los pretratamientos enzimáticos mejoren o empeoren la hidrólisis
con celulasas por esos cambios de estructura.
Anexos 65
Anexos
Anexo A. Curva de Calibración de Proteínas.
Figura A—1: Curva de calibración obtenida para proteínas medido por Bradford.
Para la Figura A—1, se tiene la ecuación (A—1), con un coeficiente de determinación (R2)
de 98.22%.
Absorbancia=-0.0070+1.4156*Proteína (mg
L) (A-1)
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.700
0.800
0 200 400 600 800 1000
Ab
so
rban
cia
Concentración de Proteína (mg/L)
Anexos 67
Anexo B. Determinación pH para TPP.
Para verificar el pH del buffer usado en la fase intermedia se establecieron condiciones de
literatura (Vaidyanathan Vinoth Kumar et al., 2011; Liu et al., 2015; Rajeeva & Lele, 2011).
Las respuestas generadas se compararon mediante una prueba de diferencia
significativamente honesta.
Condiciones
Factores estables: Temperatura (40°C), relación de extracto crudo a t-butanol
(1.00:1.00 v:v), Saturación de (NH4)2SO4 (60% w/v), buffer fosfato
Factores variables: pH (6, 7, 8).
Factores de respuesta: Rendimiento, Veces de purificación.
Resultados
Figura B- 3. Cambios del rendimiento variando el pH en sistema TPP.
0
20
40
60
80
100
120
pH6 pH7 pH8
Ren
dim
ien
to (
%)
68 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Figura B- 4. Cambios de las veces de purificación variando el pH en sistema TPP.
Tabla B- 1. Grupos generados por el análisis de diferencia de significativamente honesta.
pH Grupo
7 A
6 B
8 B
Según las figuras B-1 y B-2, el pH que genera mejores resultados es el pH 7 el cual es un
pH neutro. Al realizar el análisis de diferencia de significativamente honesta, se genera la
Tabla B-1, en la que se corrobora que los resultados a pH 7 son significativamente distinto
y genera resultados mayores que los otros pH. Estos resultados corroboran que el proceso
busca la estabilidad estructural de la lacasa (Gagaoua & Hafid, 2016; Rachana & Lyju Jose,
2014).
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
pH6 pH7 pH8
Fo
ld P
uri
fic
ati
on
Anexos 69
Anexo C. Curva de Calibración de Fenoles Totales por Folin-
Ciocalteau.
Figura C- 1: Curva de calibración obtenida para fenoles totales por Folin-Ciocalteau.
Para la Figura C-1, se tiene la ecuación (C-1), con un coeficiente de determinación (R2) de
99.93%.
Absorbancia= -0.0008+0.0011*Fenoles (mg
L) (C-1)
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0 100 200 300 400 500
Ab
so
rban
cia
Concentración (mg/L)
Anexos 71
Anexo D. Prueba de Diferencia Significativamente Honesta para el
tiempo de pretratamiento.
Realizando las pruebas con α=0.05, se obtuvo un valor P de 0.000, por lo que hay
diferencias significativas. Se obtuvieron los siguientes grupos.
Tabla D- 1. Grupos formados a 45°C y pH 4
Tiempo (h) Grupo
5 A
24 A
7 A
4 B
3 B
2 C
1 C
Tabla D- 2. Grupos formados a 34.4°C y pH 5.7
Tabla D- 3. Grupos formados a 55.6°C y pH 4.3
Tiempo (h) Grupo
7 A
24 A
5 A
4 B
3 B
2 C
1 C
Tiempo (h) Grupo
4 A
7 A
24 A
5 A
3 A
2 A
1 B
72 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Tabla D- 4. Grupos formados a 55.6 °C y pH 5.7
Tabla D- 5. Grupos formados a 45 °C y pH 6
Tabla D- 6. Grupos formados a 34.4 °C y pH 5.7
Tabla D- 7. Grupos formados a 60 °C y pH 5
Tiempo (h) Grupo
24 A
5 A
7 A
4 B
3 B
2 B
1 C
Tiempo (h) Grupo
5 A
24 A
7 A
4 B
3 B C
2 C D
1 D
Tiempo (h) Grupo
5 A
24 A B
7 B
4 C
3 D
2 E
1 F
Tiempo (h) Grupo
24 A
4 A
3 A
5 A
7 A B
2 B
1 C
Anexos 73
Tabla D- 8. Grupos formados a 30 °C y pH 5
Tabla D- 9. Grupos formados a 45 °C y pH 5
Como se observó en las tablas D-1 a D-9, el pretratamiento tenía diferencias significativas
hasta las 5 horas, a partir de allí no había diferencias. Se determinó que el tiempo donde
se da la mayor cantidad de fenoles fue a las 5 horas.
Tiempo (h) Grupo
7 A
5 A
24 B
4 B
3 B C
2 C D
1 D
Tiempo (h) Grupo
24 A
5 A B
7 A B
4 B
3 C
2 C D
1 D
Anexos 75
Anexo E. Análisis Granulométrico del Raquis de Palma.
Para hacer el análisis granulométrico del Raquis de palma, se usaron tamices tipo Pinzuar
referencia Sieve Test. Los tamices usados se registran en la Tabla E-1.
Tabla E- 2. Número de tamiz y diámetro.
Número de Tamiz Diámetro (micrómetros)
18 1000
20 850
35 500
40 425
70 212
80 180
100 150
200 75
Para calcular la biomasa retenida por cada tamiz se usó la ecuación (E-1)
Xi(%)=Mi
MT
(E-1)
Donde Xi es el porcentaje de biomasa retenida en el tamiz i, Mi es la cantidad de biomasa
retenida en el tamiz i y MT es la cantidad de biomasa total.
Los análisis granulométricos diferencial y acumulado se muestras en las Figuras E-1 y E-
2 respectivamente. Se observa que aproximadamente el 90% del raquis de palma
trabajado en los pretratamientos tiene un tamaño de partícula entre 0.2 y 1 mm de
diámetro. Además, se concluye que es posible realizar los procesos de caracterización
según NREL, ya que aproximadamente el 71% de la biomasa tiene un tamaño de partícula
entre 0.85 mm y 0.18 mm que son los tamaños requeridos para este procedimiento, lo cual
representa una amplia mayoría de la biomasa usada en los pretratamientos enzimáticos.
76 Evaluación de la Separación y Purificación de Lacasa a partir de Fusarium spp para su Aplicación en Materiales Lignocelulósicos
Figura E- 3. Análisis granulométrico diferencial.
Figura E- 4. Análisis granulométrico acumulativo.
0
5
10
15
20
25
30
1 0.85 0.5 0.425 0.212 0.18 0.15 0.075
Re
ten
ció
n (
%)
Diámetro (mm)
0
20
40
60
80
100
1 0.85 0.5 0.425 0.212 0.18 0.15 0.075
Re
ten
ció
n (
%)
Diámetro (mm)
Anexos 77
Anexo F. Resultados de proteína cruda (Kjeldahl).
Referencias 79
Referencias
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