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Evolución Dirigida de Enzimas
Miguel Alcalde
Grupo de Biocatálisis Aplicada (Prof. A. Ballesteros)
Departamento de BiocatálisisInstituto de Catálisis y Petroleoquímica
CSIC, Madrid
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
DISEÑO RACIONAL DE BIOCATALIZADORES
Concepto: re-diseñar una enzima (cuya estructura 3D es conocida) mediante cambios puntuales en residuos específicos
Problemas:
•Necesidad de estructuras 3D del biocatalizador
•Debemos considerar las proteínas como moléculas dinámicas
•No es satisfactorio para diseñar catalizadores industriales:cambio en una propiedad a costa de otra
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
ALTERNATIVA: DISEÑO IRRACIONAL DE BIOCATALIZADORES
Concepto: utilizar el algoritmo de la evolución para el diseño de biocatalizadores
Ventajas frente al enfoque racional
•La Evolución es un poderosos algoritmo: Infinitas posibilidades.
•No es necesario el manejo de estructuras 3D
•Podemos realizar estudios mecanísticos “a posteriori”
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
1a Generación 4a Generación
3a Generación2a Generación
Charles Darwin (1809-1882)Padre de la Teoría Evolutiva
Miles de millones de añosEvolución natural
Evolución dirigida Semanas o mesesESCALA TEMPORAL
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
DESARROLLO INDUSTRIAL DE LA EVOLUCIÓN DIRIGIDA
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
DESARROLLO INDUSTRIAL DE LA EVOLUCIÓN DIRIGIDA
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
SUBTILISINA EVOLUCIONADAMEDIANTE FAMILY SHUFFLING
COMPUESTO
ENZIMA INDUSTRIAL
LIPOLASA
SUBTILISINA
PEROXIDASA
ANTICUERPO VITAXIN
PROTEINA DE SANGRE
SUPRESOR DE TUMORES P53
ALFA INTERFERON
RECEPTOR DE CELULAS T
APLICACION
Pilas de combustible
Detergente para lavadoras
Detergente para lavadoras
Detergente para lavadoras
medicamento contra el cancer
Substituto sanguíneo
medicamento contra el cancer
fármaco antiviral
Medicamento para la artritis
COMPAÑIA
Oficina de Investigación Naval, USA
Novo Nordisk
Maxygen/Novo Nordisk
Novo Nordisk (Novozymes, A/S)
Ixsys
Diversa
Universidad de Texas, Austin
Maxygen
Universidad de Illinois
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
Aminoacil transferasap-nitrobencil-esterasaCitocromo P450 monooxigenasa
LacasaSubtilisinap-nitrobenzil-esterasa
Subtilisinap-nitrobenzil-esterasaCloroperoxidasaCitocromo P450 monooxigenasa
GalactoxidasaAtrazina hidrolasaTimidina quinasaAlquil-transferasaLipasaAspartato aminotransferasaDioxigenasaCitocromo P450 monooxigenasa
LipasaEsterasaTransaminasa
Proteína verde fluorescenteSubtilisina ELacasaPeroxidasa de rábanoGalactoxidasa
AUMENTO DE LA ACTIVIDAD
AUMENTO DE LA EXPRESION GENICA
AUMENTO DE LA ENANTIOSELECTIVIDAD
ALTERACION DE LA ESPECIFIDAD DE SUSTRATO
AUMENTO DE LA ACTIVIDAD EN PRESENCIA DE DISOLVENTES
AUMENTO DE LA TERMOESTABILIDAD
PROPIEDAD EVOLUCIONADAENZIMA
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
CREACION DE DIVERSIDAD
Mutagénesis aleatoria
Inserción de la librería de genesen un vector de expresión
Introducción de la librería/vectoren el microorganismo
mutación1Genes parentales
Recombinación
Transferencia de coloniasa platos multipocillo
Expresión de la enzima
SELECCION DE LA PROPIEDAD DESEADA
Gen “ganador”
NUEVA GENERACION
Crecimiento de las coloniasPlato maestro
2
45
6
7
SCREENING
“YOU GET WHAT YOU SCREEN FOR”
3
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
Plato de 96 pocillos
“Ganadores” de la generación
Diferentes métodos colorimétricos para evolucionardistintas propiedades de la enzima lacasa
Degradación de la lignina(blanqueado del papel)
Transformación de xenobióticos
Nivel de expresión en levadura
Evolución de rutas metabólicas:Búsqueda de carotenoidesen fase sólida
Colonias con diferentes colores, contienen distintos carotenoides.Para su análisis se empleanprocesadores digitales
Carotenoidesidentificados
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
O
OLacasa
(con/sin mediador)
OH
OH
solución NaBH4
Ensayo colorimetrico específico para biodegradación de PAHs
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.20
10
20
30
40
0.000 0.005 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.035
U/ml en reacción con mediador
U/ml en reacción sin mediador
Dec
olor
izac
ión
%
CON MEDIADOR
SIN MEDIADORTime 0
After 6 h
Baja toxicidad en levaduray E. coli
Ensayo de decolorización de PolyR478
Alcalde, Bulter and Arnold (2002). Colorimetric assays for biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbonsby fungal laccases. J. Biomol. Screen. Vol 7, 6: 537-543.
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
0 100 200 300 400 500 6000.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
µMolar [NBPproduct]
Abs
(60
0n
m)
STYRENE OXIDE CALIBRATION CURVE
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
0.4
0.6
0.8
1.0
µMolar [purified 139-3]A
bs(6
00
nm
)
ENZYME CONCENTRATION
50-100 µMolar of product0.2 µMolar of enzymeDETECTION LIMIT
SENSITIVITY LIMIT
Alcalde, M, Farinas, ET and Arnold, FH (2004) Colorimetric high-throughput assay for the alkeneEpoxidation catalyzed by cytochrome P450 BM-3 variant 139-3. J. Biomol. Screen 9:141-145
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
clone0 20 40 60 80
rela
tive
activ
ity
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
COEFICIENTE DE VARIANZA: <10%
20 µl
Screening assay(ABTS)
Plato maestro
-Incubación durante 24 h en mediomínimo a 30 °C y 270 rpm
-Adición de medio de expresión.Incubación durante 24 h.
Transferencia De colonias
Centrifugación40µl sobrenadante
Plato de estabilidadconteniendo 80 µlStability buffer
-First rescreen (five wells per clone)-Second rescreen:Zymoprep, E.coli transformation, miniprep,yeast transformation
SelladoIncubación a 40 °C
48h
Selladode los platos
SCREENING DE ACTIVIDADY TERMOESTABILIDAD
EN LACASAS EXPRESADASEN LEVADURA
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
Mutazima, bajo indice de mutaciónScreening de actividad y termoestabilidad
0 1 2 3activ
idad
resi
dual
(uni
dade
s re
lativ
as)
0
1
2
3
número de mutantes
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
activ
idad
rela
tiva
0
1
2
3
Actividad inicial (unidades relativas)
8H935H1
35H1
Bulter, Sieber and Alcalde (2003). Screening mutant libraries in S. Cerevisiae. In: Directed Enzyme Evolution. Screening and selection methods. Methods in Molecular Biology Vol230. Eds: Arnold and Georgiou. Humana Press,Totowa,, New Jersey:99-108
3200 clones explorados
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
Mutagénesis aleatoria
Genes parentales
Recombinación
CREACION DE DIVERSIDAD
Inserción de la librería de genesen un vector de expresión
Introducción de la librería/vectoren el microorganismo
Transferencia de coloniasa platos multipocillo
Expresión de la enzima
SELECCION DE LA PROPIEDAD DESEADA
Gen “ganador”
NUEVA GENERACION
Crecimiento de las coloniasPlato maestro
12
3
45
6
7
mutación
SCREENING
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
AJUSTE DE LAS CONDICIONES DE LA MUTAGENESIS ALEATORIA
0
10
20
30
40
50
60
70
0 500 10000
20
40
60
80
100
120
0 200 400 600 800 1000
Alto índice de mutación: 4 pg/µl Bajo índice de mutación: 4 ng/µl
HERRAMIENTAS: mutazima y Taq polimerasas
EVOLUCIÓN ASEXUAL: PCR PROPENSO A ERROR
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
EVOLUCION SEXUAL: LA CRÍA MOLECULAR
ANIMALES Y PLANTAS CRÍA MOLECULAR
Dos organismos parentales Uno, dos o muchos “padres”
Unica y pequeña generación de cada cruce
Ilimitadas combinaciones de generaciones (sólo restringidasPor el método de screening)
Barreras filogenéticas estrictas(mismas especies)
Barreras filogenéticas muy flexibles(especies diferentes)
Ciclos temporales lentos (1 o dos por año)
Ciclos temporales rápidos (dos por semana)
Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
“Barajado”del DNAGenes parentales
DNasa DNA polimerasa
PCRDigestión aleatoria del DNA parental
StEP
Repetición de los pasosde desnaturalización yextensión del DNA para conseguir genes completosGenes parentales
cebadores
Fragmentos cortos de DNAcreados por ciclos cortos de de hibridación y extensión
Tras la desnaturalización, los fragmentos se hibridan aleatoriamentecon los genes parentales continuando su extensión
“Barajado” in vivo del DNA
Genes parentales
Plásmido linearizado
Introducción de los Fragmentos parentales, junto con un plásmidolinearizado, en la
célula de levadura
1
43
2
O
OH
OH
CH2OH
OH
OH GOasanativa
O2
+ H2O2
O
OH
OH
CH2OH
OHOH
GOasamutante
O2
HRPABTS
Sun, Bulter, Alcalde, Petronia and Arnold (2002). Modification of galactose oxidase to introduce glucose 6-oxidase Activity. ChemBioChem. 8:781-783
O
OH
OH
CHO
OH
OH
APLICACIONES-Industria alimentaria-Marcado de azúcares-Polímeros sintéticos
O
OH
OH
CHO
OHOH ABTS? + H2O2HRP
Ensayo de screening no específico
Ejemplos: evolución dirigida de Galactooxidasa
Ejemplos: evolución dirigida de Galactooxidasa
DISEÑO COMBINATORIO Y COMPUTACIONAL
1.- Combinatorial saturation mutagenesis
ChemBioChem(2002)8:781-783
Q406F464
T495
H496
H581C228
W290
T272
R330F194
Ejemplos: evolución dirigida de Galactooxidasa
.
0 1 2 3 4 5 6
Generation
Rel
ativ
e ac
tivity
1
10
20
139-3
wtrandom mutagenesis
recombination
Starting point: Ed’s mutantOO2N
OO2N
OH
O-O2NH
O
P450NADPH
O2
+H2O
+
Ejemplos: evolución dirigida de Citocromo P450 monooxigenasa
Max
imum
turn
over
rate
(m
ole
subs
trate
/min
/mol
e en
zym
e)Maximum turnover rates for wildtype and 139-3*
propane butane pentane cyclohexane hexane octane lauric acid palmitic acid0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Wt139-3
Ejemplos: evolución dirigida de Citocromo P450 monooxigenasa
*Glieder, A. Farinas, E.T. & Arnold, F.H. (2002). Nature Biotech. 20:1135-1139.
Ejemplos: evolución dirigida de Citocromo P450 monooxigenasa
FIRST GENERATION (MUTAZYME)
0 100 200 300 400 500 600
0
1
2
3
0 100 200 300 400 500 600
0
1
2
3
NADPH depletion NBP product formation
clone clone
rela
tive
acti
vity
rela
tive
acti
vity
Farinas, ET, Alcalde, M and Arnold, FH (2004) Alkene epoxidation catalyzed by cytochrome P450 BM-3 139-3. Tetrahedron 60:525-528
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 100
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Activ
ity [A
U]
# Generations
-Error prone PCR (taq y mutazima)-In vivo DNA shuffling-StEP (Staggered extension proccess)-In vivo assembly recombination
Herramientas evolutivas utilizadas
Mejoras respecto a la enzima parental:-170 veces la actividad total-Expresión más alta descrita para una lacasa en levadura (18mg/l)-kcat incrementada 22 veces y expresión 8 veces
Bulter, Alcalde, Sieber, Meinhold, Schlachtbauer, and Arnold, F.H. (2003).Functional expression of a fungal laccase in S. Cerevisiae by directed evolution. Appl. Environ. Microbiol.69: 987-995 .
Ejemplos: evolución dirigida de lacasas para su expresión funcional
Modelo creado por molecular threadingCon la lacasa deMelanocarpusAlbomyces(76% de homología)
Ejemplos: evolución dirigida de lacasas para su expresión funcional
BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA
•Arnold, FH (2001). Combinatorial and computationalchallenges for biocatalyst design. Nature 409: 253-257
•Tao, H and Cornish, VW (2002) Milestones in directedenzyme evolution. Current Opinion in Chemical Biology. 858-864.
•Alcalde, M. (2003).Evolución Molecular Dirigida.Investigación y Ciencia. 326: 69-77.
•http://www.che.caltech.edu/groups/fha/
AGRADECIMIENTOS
CALTECH
Frances.H. ArnoldThomas BulterEdgardoFarinas
Pat CirinoLianHong Sun
Instituto de Catálisis Departamento de BiocatálisisGrupo de Biocatálisis AplicadaCSIC (www.icp.csic.es/abg)
Antonio Ballesteros Francisco J. PlouArantza Gómez de Segura Miren Zumárraga
Humberto GarcíaDolores ReyesNieves LópezManuel FerrerEitel Pastor
RMLCantisense 2antisense 1
RMLN sense 1 sense 2
PRIMERS50% MUTATION
3 PCR reactions
TRANSFORMATIONIN YEAST
Linear vector
PCR PRODUCTS
xxx
x x xx
xx x x
...
In vivo assembly recombination
5’
5’
3’
3’
Miguel Evolución Molecular Dirigida: conceptos generales
Directed Evolution of a variant P450 BM3 for alkene epoxidation
CH CH2P450
NADPHCH CH2
K2CO3
CH2 NO2N+OH
NO2OH N CH
CH2 NO2N+OH
O
N
CH2
NO2
..+
Nucleophilic attackStyrene
NBP
Abs 600 nm
Directed Evolution of a variant P450 BM3 for alkene epoxidation
PROTOCOL STEP BY STEP
P450 Lysate in buffer with Styrene and NADPH
Sealed platesincubation at 80°C
for 30 min
5min room tp
Stop the reaction by addingNBP solution
Chilling on ice
Add DMF, K2CO3
READ INMEDIATELY AT 600nm
Directed Evolution of a variant P450 BM3 for alkene epoxidation
Inoculation of cloneswith 96-pin replicator
Plate with expression media
Incubation for 24h at 30 °C and 250 rpm
-
Centrifuge,discard the medium and frezeethe pellets at -20 °C
-Incubation for 24h at 30 °C and 250 rpm
-
colony transferto 96 deep well platesin LB media
Lysate the cellsand use supernantant for screening
Master plate
PROTOCOL
0 5 10 15 20 25 30
-0.3
-0.2
-0.1
0.0
Time (seconds)
Abs
(340
nm) DEPLETION ASSAY NBP ASSAY
Lacasa de Myceliophtora thermophila (MtL)
-oxidoreductasa extracelular (Blue copper protein)-4 iones Cu-Potencial redox 465 mV-glicoproteína ácida (pI 4.2)-572 aa-MW 85 kDa-Monómero
OH
OH
O
O
Laccase1/2 O2 + + H2O
O
O
LMS
Aplicaciones de las lacasas
- Eliminación de xenobióticos (PAHs)
- Industria papelera: blanqueado de la pasta de papel, deslignificación- Analíticas: Biosensores
LACCASE-MEDIATOR SYSTEM (LMS)Expansión del espectro de sustratos hacia Compuestos industrialmente importantes
Ejemplos: evolución dirigida de lacasas para su expresión funcional
Problema: Expresión demasiado baja para una mejora funcional del biocatalizador
Planteamiento: usar sistema sensible para mejorar expresión mediante evolución dirigida
Límite de detección: 10 µg /l (5 µU)Endpoint-assay λ: 418 nm
SS
NN
CH3 CH3
CH3 CH3
NN
NN
NN
SS
+.Laccase
O2
HO S3
SO3H
HO S3
SO3H
Mejor sistema: ABTS-assay (2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
Alcalde and Bulter (2003). Colorimetric assays for screening laccases. In: Directed Enzyme Evolution. Screeningand Selection methods. Methods in Molecular Biology Vol230. Eds: Arnold and Georgiou. Humana Press, Totowa, New Jersey.193-202.
Ejemplos: evolución dirigida de lacasas para su expresión funcional
Directed Evolution of a variant P450 BM3 for alkene epoxidation
-Advent to oxygen in earth’s atmosphere: detoxification of oxygen
-All P450s have the same oxygen activating system
RH+O2 ROH+H2O2e-, 2H+
P450
P450 BACKGROUND
-Superfamily P450: mamalia, birds, fish, reptiles, amphibia, insects, plants, bacteria and fungi.
-10 P450s have been characterized by X-ray.- MW 46-57 kDa.-Single heme prosthetic group-Soret band (binding of CO at 450 in heme domain)-Redox potential (Fe2+/Fe3+) about -300 and -400 mV
- Little or no activity for alkanes.- Advantage over other alkane hydroxylases (MMO or AlkB). Easy to express
in E. coli, soluble, does not require additional electron transfer protein.
-Water-soluble heme enzyme-Natural fusion protein-120 kDa
-Inserts oxygen into subterminal C-H bonds of fatty acids (C12-C18)-Kcat 10-1000 fold higher than those eucaryotic fatty acid hydroxylases.
Cytochrome P450 monoxygenase BM3 from Bacillus megaterium
Directed Evolution of a variant P450 BM3 for alkene epoxidation
Directed Evolution of a variant P450 BM3 for alkene epoxidation
Fe3+ S
S1
Fe2+ S
e-
2
O2
Fe2+ S O23e-
Fe+ S
O2
4
2H+
H2O+SOH
5
H2O
Fe3+
O2-
2H+ H2O2
UNCOUPLING
2e-+2H+ H2O
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