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FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES
GRADO EN BIOTECNOLOGÍA
TRABAJO DE FIN DE GRADO
Variación morfológica en la arquitectura
radicular en una colección de líneas de
introgresión de tomate (S. pennellii S. lycopersicum)
Alfonso Azorín Guaita
Directores: José Manuel Pérez Pérez
Aurora Alaguero Cordovilla
Departamento de Biología Aplicada
Área de Genética
Curso 2016‐17
JOSÉ MANUEL PÉREZ‐PÉREZ, Profesor Titular de Universidad en el área de conocimiento de Genética
de la Universidad Miguel Hernández de Elche, y
AURORA ALAGUERO CORDOVILLA, Titulada Superior del Instituto de Bioingeniería de la Universidad
Miguel Hernández de Elche,
HACEMOS CONSTAR
que el presente trabajo ha sido realizado bajo nuestra dirección y recoge fielmente la labor realizada
por el alumno Alfonso Azorín Guaita. Las investigaciones reflejadas en esta memoria se han
desarrollado íntegramente en la Unidad de Genética del Instituto de Bioingeniería de la Universidad
Miguel Hernández de Elche.
José Manuel Pérez‐Pérez Aurora Alaguero Cordovilla
Elche, 6 de septiembre de 2017
RESUMEN
Con este Trabajo de Fin de Grado se pretende contribuir a la disección genética de la
formación y el desarrollo del sistema radicular en tomate (Solanum lycopersicum L.). Se ha
caracterizado la morfología de la raíz principal en una colección de 11 líneas de introgresión
derivadas del cruzamiento S. pennellii × S. lycopersicum, así como en las raíces laterales y las
adventicias en respuesta a herida. Hemos determinado la formación de órganos de novo en
respuesta a la adición exógena de auxinas o citoquininas en las líneas que mostraron valores
extremos para algunos de los parámetros estudiados de la arquitectura radicular. Nuestros
resultados indican la participación de múltiples genes en la determinación de los parámetros
básicos de la arquitectura radicular, tales como la densidad de raíces laterales y adventicias,
su longitud y su ángulo de crecimiento.
PALABRAS CLAVE: raíces adventicias, arquitectura radicular, organogénesis de novo,
caracteres cuantitativos, Solanum lycopersicum
ABSTRACT
The aim of this work is to contribute to the genetic dissection of root system architecture in
tomato (Solanum lycopersicum L.). Some morphological traits of the primary root have been
measured in a collection of 11 introgression lines derived from an S. pennellii × S.
lycopersicum cross, as well as of the lateral and adventitious root architecture after
wounding. We analyzed de novo organ formation in response to exogenous auxin or
cytokinin treatments in the lines that showed extreme values for some of the studied root
system parameters. Our results indicate the eventual participation of multiple genes to
determine basic root architecture traits, such as lateral and adventitious root density, its
length and its growing angle.
KEY WORDS: adventitious roots, root architecture, de novo organogenesis, quantitative
traits, Solanum lycopersicum
ÍNDICE GENERAL Página
1. . INTRODUCCIÓN……………………………….……………………………………………………………………1
1.1 EL TOMATE…………….…………………………………………………………………………………………1
1.2 EL TOMATE COMO SISTEMA MODELO………………………………………………………………2
1.2.1 SOLANUN LYCOPERSICUM………………………………………………………………………2
1.2.2 SOLANUM PENNELLII……………………………………………………………………………..3
1.3 LÍNEAS DE INTROGRESIÓN…………………………………………………………………………………4
1.4 SISTEMA RADICULAR EN LAS PLANTAS DE TOMATE …………………………………………5
1.5 REGULACIÓN HORMONAL DE LA FORMACIÓN DE RAÍCES …………………………………6
2. . ANTECEDENTES Y OBJETIVOS……………………………………………………………………..…………8
3. . MATERIALES Y MÉTODOS………………..……………………..……………………………………………9
3.1 MATERIAL VEGETAL…………………….…………………………………………………………………..…9
3.2 FENOTIPADO DE LAS LÍNEAS DE INTROGRESIÓN……………………………………………….10
3.3 ESTUDIO CELULAR DE LA MORFOLOGÍA RADICULAR POR EL MÉTODO
DE TINCIÓN PS‐PI……………………………………………………………………………………………12
3.4 ANÁLISI DE LA FORMACIÓN DE RAÍCES ADVENTICIAS EN EXPLANTOS EN MEDIO
CON HORMONAS…………………………………………………………………………………………...12
3.5 ANALISIS DE IMÁGENES………………………………………….………………………………………...14
3.5.1 ANALISIS DEL FENOTIPADO RADICULAR…………………………………………….....14
3.5.2 ANÁLISIS DE REGENERACIÓN CON HORMONAS………………………………………16
3.6 ANALISIS DE DATOS……………………………………………………………………………………………16
4. . RESULTADOS………..………...……………………………………………..…………….……………………..19
4.1 SELECCIÓN DE LAS LÍNEAS DE INTROGRESIÓN……………………………………………………19
4.2 GERMINACIÓN……………………………………….…………………………………………………………19
4.3 CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA DE LA ARQUITECTURA RADICULAR………………20
4.3.1 RAÍZ PRINCIPAL….………………………………………………………………………………….20
4.3.2 RAÍCES LATERALES……………………………………………………..……………………………22
4.3.3 RAÍCES ADVENTICIAS…………………………………………………………..…………………27
4.4 REGENERACIÓN EN MEDIO SUPLEMENTADO CON HORMONAS…………………………30
5. . DISCUSIÓN…………………………………….…………………………………………………….………………32
6. . CONCLUSIONES Y PROYECCIÓN FUTURA…………………………………………………………….…34
7. . BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………………………………………………35
8. . ANEXO………………………………………………………………………………………………………………….38
ÍNDICE DE TABLAS Página
Tabla 1 Valor de P en los parámetros de la raíz principal en
S. lycopersicum…………………………………………………………………………………………20
Tabla 2 Valor de P en los parámetros de las raíces laterales en
S. lycopersicum……………….…………………..…………………………….........................22
Tabla 3 Valor de P en los parámetros de las raíces adventicias en
S. lycopersicum………….…………………………………………………….……………………….27
ÍNDICE DE FIGURAS Página
Figura 1 Diferencias morfológicas en frutos y hojas entre el tomate doméstico, S.
lycopersicum, y la especie silvestre S. pennellii………….................................3
Figura 2 Estructura del sistema radicular en tomate………………….…………..………………5
Figura 3 Líneas de introgresión empleadas en este trabajo………………………………..……9
Figura 4 Esquema sobre el protocolo seguido para la realización del fenotipado
de las líneas de introgresión.........................................................................11
Figura 5 Corte y distribución de los explantos de tomate….......................................13
Figura 6 Etapas del procesado de imágenes para el fenotipado radicular…………….…15
Figura 7 Porcentaje de germinación de las líneas de introgresión estudiadas…………19
Figura 8 Caracterización morfológica de la raíz principal……………………..….………………21
Figura 9 Caracterización morfológica de la arquitectura radicular secundaria………..23
Figura 10 Gráficos de correlación entre algunos parentales estudiados…...................24
Figura 11 Caracterización morfológica de las raíces laterales.….……..……………………….25
Figura 12 Ápice radicular de las raíces laterales...........................................................26
Figura 13 Caracterización morfológica de las raíces adventicias I……….……………………28
Figura 14 Caracterización morfológica de las raíces adventicias II………………….….…….29
Figura 15 Regeneración en medio suplementado con hormonas….............................31
Introducción 1
1. INTRODUCCIÓN
1.1. El tomate
El tomate cultivado (Solanum lycopersicum L.), es una planta herbácea de la familia de las
solanáceas (Solanaceae), orden Solanales, subclase Asteridae, clase Magnoliopsida, división
Magnoliophyta, superdivisión Spermatophyta y subreino Traqueobionta
(http://solgenomics.net/). Con esta clasificación taxonómica se puede describir al tomate
como una planta vascular angiosperma (ya que posee flor y semilla) y dicotiledónea. Dentro
de la familia de las solanáceas podemos encontrar más de 3000 especies, distribuidas en 90
géneros con muy diversos usos, entre las que destacan la berenjena (Solanum melongena
L.), la patata (Solanum tuberosum L.), el pimiento (Capsicum annuum L.), el tabaco
(Nicotiana tabacum L.), la belladona (Atropa belladonna L.), la mandrágora (Mandragora
officinarum L.), y la petunia (Petunia hybrida) (Knapp et al., 2014; Mueller et al., 2005b).
La familia de las solanáceas es una de las más destacadas tanto en su cultivo como en el
número de especies hortícolas que abarca, siendo la tercera con mayor importancia
económica dentro del cultivo vegetal detrás de las familias Poaceae y Fabaceae. (Ghatak et
al., 2017). Además, esta familia incluye una fuente importante de plantas modelo para la
investigación científica (Mueller et al., 2005a). Entre las plantas de este taxón se puede
destacar el papel que juega el tomate, siendo su cultivo y su consumo para alimentación
generalizados a lo largo de todo el mundo, constituyendo el segundo vegetal más consumido
dentro de la familia de las solanáceas detrás de la patata, y el noveno a nivel mundial con un
consumo total de 159 millones de toneladas por año. (Foolad, 2007; Ghatak et al., 2017)
(http://faostat.fao.org/).
Existen 17 especies distintas de tomate, todas ellas originarias del continente americano,
pero solo una de ellas, Solanum lycopersicum L., ha sufrido un proceso de domesticación a lo
largo de los siglos. Las especies silvestres presentan una gran diversidad genética, que
contrasta con la poca diversidad de la especie cultivada, estimada en sólo el 5% en
comparación con las silvestres (Bai y Lindhout, 2007). Por ello, el estudio de la diversidad
genética de estas especies silvestres es de gran interés para la investigación y mejora del
tomate cultivado.
Introducción 2
1.2. El tomate como sistema modelo
1.2.1. Solanum lycopersicum
El tomate (S. lycopersicum L.) puede ser considerado como un buen sistema modelo tanto
para el estudio básico como para el estudio aplicado de los diferentes procesos vegetales en
plantas (Gerszberg et al., 2015). Entre las características que hacen posible el empleo del
tomate como sistema modelo vegetal podemos destacar su corto ciclo de vida (entre 3 y 6
meses dependiendo de la variedad), su facilidad de cultivo en muy diversas condiciones
ambientales y su reproducción por autogamia con posibilidad de polinización e hibridación
controlada (Gerszberg et al., 2015). Además, con sus 12 pares de cromosomas, se considera
que posee un genoma relativamente pequeño, de aproximadamente 950 Mb, presentando
ausencia de duplicación génica o poliploidías genómicas, así como facilidad para la
transformación genética (Mueller et al., 2005a; Foolad, 2007). Actualmente se dispone de
numerosas herramientas genéticas para el estudio del tomate, como son unas amplias
colecciones de mutantes, multitud de marcadores génicos, mapas de ligamiento saturados y
un gran número de variedades caracterizadas (Arikita et al., 2013; Gerszberg et al., 2015).
Otro de los motivos que confieren al tomate su gran potencial como sistema modelo es la
información disponible sobre su genoma, secuenciado por un consorcio internacional
conocido como The International Solanaceae Genome Project (SOL), constituido por 10
países entre los que se encuentra España. Este proyecto se inició en 2004, y sus objetivos
incluían tanto la investigación en genómica funcional como la investigación de la evolución
de los genomas en la familia de las solanáceas (Mueller et al., 2005a). De los datos
disponibles podemos destacar que al menos el 75% de las 950 Mb que conforman el genoma
está constituido por heterocromatina desprovista en gran parte de genes. Por otro lado,
muchos de los genes de esta especie se pueden encontrar en grandes agrupaciones en las
secciones distales de los brazos cromosómicos, constituyendo la eucromatina (Mueller et al.,
2005a y 2005b). De esta forma, aproximadamente el 59% de su genoma corresponde a
secuencias no codificantes, el 28% a secuencias codificantes, el 11% a transposones y el 2%
restante a secuencias de los genomas de los orgánulos (Foolad, 2007). Con esta
configuración, el tomate cuenta con alrededor de 35.000 genes, con una densidad genética
de 6,7 genes por kilobase, densidad similar a la del arroz (Oryza sativa L.) y la planta modelo
por excelencia Arabidopsis thaliana L. (Foolad, 2007).
Introducción 3
Toda esta información disponible, junto con las características biológicas del tomate,
aportan las herramientas necesarias para el empleo de esta especie como sistema modelo
en el estudio de numerosos procesos fisiológicos a nivel genético.
1.2.2. Solanum pennellii
La especie Solanum pennelli (Correll), originaria de la región de los Andes en Sudamérica
es una de las especies de tomate silvestre (Figura 1). Presenta frutos pequeños de color
verde y posee una gran tolerancia al estrés, es autógama y se caracteriza por presentar una
gran facilidad para hibridar con S. lycopersicum, actuando como donante de material génico
y confiriéndole de esta forma mayor tolerancia en respuesta al estrés. Estas características la
convierten en una especie ideal para la construcción de líneas de introgresión y para el
estudio del genoma mediante análisis de caracteres cuantitativos (Eshed et al., 1991; Bolger
et al., 2014).
Su importancia en los estudios moleculares es también notable, ya que juega un papel
básico en el clado Lycopersicon, siendo un intermediario filogenético entre S. lycopersicum y
otras especies como S. lycopersicoides (Canady et al., 2006). También es importante el hecho
de que es la única especie del clado que puede hibridar con estas dos especies, sirviendo, a
su vez, de puente para la introgresión entre ambas.
Figura 1. Diferencias morfológicas en frutos y hojas entre el tomate cultivado, S. lycopersicum, y la especie silvestre S. pennellii. Imagen tomada de Lockhart (2013), con modificaciones.
HojasFrutos
Introducción 4
1.3. Líneas de introgresión
Un locus de carácter cuantitativo o QTL (Quantitative Trait Locus), se puede definir como
una región del genoma que ejerce un efecto cuantitativo, es decir, medible, sobre un
carácter fenotípico concreto (Salvi y Tuberosa, 2005). Los genes que están implicados en la
variación fenotípica de rasgos cuantitativos conforman la gran mayoría de la diversidad
genética (Price, 2007). Asimismo, estos loci pueden ser cartografiados o detectados
mediante la identificación de marcadores polimórficos ligados a dichos QTL, pudiendo de
esta forma localizar todas las regiones génicas que participan de forma cuantitativa en un
carácter concreto (van Eeuwijk et al., 2010; Price, 2007). Con este propósito es posible
emplear líneas en las que son conocidos tanto los marcadores como los genotipos que las
componen. El estudio de los caracteres cuantitativos mediante QTL se utiliza en gran
variedad de especies y con diversos fines, como por ejemplo para la mejora del cultivo de
alto rendimiento en arroz (Oryza sativa L.) (Miura et al., 2011) o para la identificación de
genes de resistencia a patógenos en maíz (Zea mays L.) (Cao et al., 2017), en la colza (Yu et
al., 2017) o en chopo (Populus nigra L.) (Carletti et al., 2016).
Las líneas de introgresión o ILs (Introgression Lines), están formadas por un conjunto de
NILs (Nearly Isogenic Lines o líneas casi isogénicas) construidas a partir de un proceso de
retrocruzamiento, de tal manera que cada línea es homocigótica para un solo fragmento
cromosómico del parental donante en el fondo genético del parental recurrente (Lippman et
al., 2007). Así, una población completa de líneas de introgresión alberga todo el genoma del
parental donante contenido en fragmentos cromosómicos mínimamente solapantes.
Estas líneas también poseen una gran estabilidad genética debido a su carácter autógamo
y a la ausencia de segregación de los caracteres a estudio, y las diferencias fenotípicas
observadas entre el parental recurrente y las ILs pueden ser atribuidas exclusivamente al gen
o genes que constituyen el fragmento cromosómico de la línea donante (Lippman et al.,
2007). Por estos motivos, las líneas de introgresión constituyen una herramienta muy eficaz
tanto para la construcción e identificación de QTL como para la realización de estudios
genéticos con diferentes objetivos. Algunos ejemplos de estas aplicaciones pueden ser el
estudio de las bases genéticas de la capacidad de formación de órganos adventicios en
tomate (Arikita et al., 2013), el aumento de la productividad (Sasaki et al., 2017) y la
resistencia a la salinidad en arroz (De león et al., 2017), así como la mejora del desarrollo del
sistema radicular en condiciones de sequía en el trigo (Triticum) (Merchuk‐Ovnat et al.,
Introducción 5
2017), la composición lipídica de la cutícula en tomate (Fernández‐Moreno et al., 2017) o la
longitud de la fibra en el algodón (Gossypium) (Xu et al., 2017).
1.4. Sistema radicular en las plantas de tomate
Las raíces son estructuras de gran importancia para las plantas vasculares, ya que
participan en funciones esenciales como la absorción y transporte de agua, nutrientes y
solutos hacia la parte aérea, además de constituir el anclaje de la planta al suelo
contribuyendo a su soporte (Bellini et al., 2014; Ron et al., 2013).
El sistema radicular en tomate está formado por una raíz principal que se establece
durante la embriogénesis (Scheres et al., 1994). Tras la germinación de la semilla, la raíz
principal emerge y crece de forma gravitrópica hacia el suelo, gracias a su elongación
producida por la divisiones celulares que se dan en el meristemo apical (Beemster y Baskin,
1998). Este meristemo apical funciona como un centro de organización del crecimiento
radicular, y está constituido por células quiescentes, que permanecen indiferenciadas para
seguir promoviendo las sucesivas divisiones celulares del resto de células del meristemo
(Verstraeten et al., 2014).
Figura 2. Estructura del sistema radicular en tomate. (A) Sistema radicular en S. lycopersicum,
raíz principal y laterales. (B) Raíces adventicias en respuesta a herida. La barra de escala indica 10
mm. (C) Esquema del ápice radicular en S. lycopersicum var. M82 a la izquierda y S. pennellii a la
derecha. Imagen tomada de Ron et al. (2013), con modificaciones.
De la raíz principal pueden surgir otras raíces postembrionarias, denominadas raíces
laterales (Figura 2A) (Nibau et al., 2008). En el caso de Arabidopsis thaliana, se ha estudiado
que estas raíces laterales se desarrollan a partir de tres filas de células del periciclo en el
C B A
Introducción 6
polo del xilema (Casimiro et al., 2003). En estas células fundadoras del xilema se reactiva el
ciclo celular y se inicia un primordio de raíz lateral (De Smet, 2012). Tras la formación del
primordio se producen dos divisiones asimétricas que llevan a la formación de una única
capa de primordio, y divisiones periclinales posteriores terminan de conformar el primordio
de la raíz lateral (Benková y Bielach, 2010).
Además, existe un tercer tipo de raíces conocidas como raíces adventicias (Figura 2B), que
se desarrollan en tejidos no radiculares, sobretodo en partes aéreas como hipocótilos, hojas
o tallos (Verstraeten et al., 2014). El primordio de la raíz adventicia se desarrolla y emerge de
callos indiferenciados, o a partir de la reprogramación de células residentes. A pesar de los
estudios disponibles, el origen celular de las raíces adventicias no se conoce con detalle, y
varios tejidos han sido propuestos como fuente de las células formadoras de raíces
adventicias, tales como el cámbium (Davis y Haissing, 1994; Naija et al., 2008; Bellini et al.,
2014).
La formación de raíces adventicias es un proceso complejo en el que influyen múltiples
factores tanto endógenos como exógenos, entre los que se encuentran las hormonas
vegetales, la intensidad lumínica, las heridas y el estrés entre otros (Verstraeten et al., 2014).
Las raíces están compuestas por numerosos tipos de células, las cuales contribuyen a que
el desarrollo radicular sea un proceso dinámico, plástico y con gran sensibilidad a los
cambios en el ambiente para garantizar, de esta forma, un correcto desarrollo de la planta
(Ron et al., 2013). Entre las capas de células que componen la raíz podemos encontrar, del
interior hacia el exterior; los haces vasculares (xilema y floema), procámbium, periciclo,
endodermis, córtex y epidermis (Ron et al., 2013), figura 2C.
1.5. Regulación hormonal de la formación de raíces
Los cambios en factores bióticos y abióticos tienen repercusiones en el desarrollo de la
planta, más concretamente estos cambios pueden afectar al sistema radicular debido a una
alteración de la regulación de la homeostasis o del transporte de los factores endógenos.
Dentro de estos factores endógenos podemos destacar el papel que juegan las hormonas en
la regulación del desarrollo radicular (Bellini et al., 2014).
Las auxinas son hormonas que participan en múltiples procesos dentro del desarrollo
normal de la planta. En el desarrollo radicular, en concreto, participan en etapas tan
importantes como la iniciación y el proceso de emergencia, la formación del patrón del
Introducción 7
meristemo apical, el gravitropismo y la elongación, siendo claves para el desarrollo de las
raíces laterales y adventicias (De Klerk et al., 1999; Pop et al., 2011). Utilizando mutantes de
arroz, Arabidopsis y maíz se han identificado los componentes del transporte polar de
auxinas y de la vía de señalización de auxinas requeridos en todos los pasos del desarrollo de
las raíces laterales (Courdert et al., 2010; von Behrens et al., 2011; Lavenus et al., 2013) y en
el inicio de la formación de las raíces adventicias (da Costa et al., 2013; Sukumar et al.,
2013). Por ello, las líneas mutantes en el transporte polar de las auxinas dan como resultado
defectos en la formación tanto de raíces laterales como adventicias (Li et al., 2012).
Las citoquininas son un tipo de fitohormonas requeridas en el proceso de división celular
y en el desarrollo de los tallos, siendo antagonistas de las auxinas y por tanto suprimiendo la
formación de raíces laterales y adventicias (Bellini et al., 2014). Estas hormonas promueven
una modificación de la expresión de los transportadores polares de auxinas, impidiendo de
este modo la formación del gradiente de auxinas necesario para la formación del primordio
de la raíz lateral (Laplace et al., 2007). En estudios con líneas que sobreexpresan los genes
codificantes de la oxidasa/deshidrogenasa de las citoquininas en Arabidopsis thaliana, se ha
observado, consecuentemente, una disminución en los niveles de citoquininas, aumentado
así la formación de raíces laterales y adventicias (Werner et al., 2003). De esta forma,
mutantes en los receptores de citoquininas ven aumentada la cantidad de raíces laterales
(Riefler et al., 2006). Por otra parte también se ha visto que niveles bajos de citoquininas,
sumados a la acción de las auxinas, son beneficiosos durante los primeros estadios de la
formación de raíces adventicias en plantas como el pino de Monterrey (Pinus radiata D.) o el
algarrobo (Ceratonia siliqua L.) (Ricci et al., 2008; 2016; Brunoni et al., 2014).
Antecedentes y objetivos 8
2. ANTECEDENTES Y OBJETIVOS
A pesar de la relevancia de los factores genéticos en la regulación de la arquitectura y la anatomía
radicular en distintas especies vegetales (Wachsman et al., 2015), los estudios genéticos destinados a
la identificación de los factores moleculares implicados en la formación de raíces en tomate son
escasos (Ron et al., 2013). Entender estos factores podría ser de gran importancia en la identificación
de características deseables en líneas de tomate y en la mejora de variedades, procesos pueden ser
de gran interés en los sectores tanto de la agricultura, como en la investigación básica.
En el laboratorio del Prof. José Manuel Pérez Pérez y en el marco del proyecto “Genómica
comparada de la formación de raíces adventicias en tomate y clavel (BIO2015‐64255‐R)”, se están
llevando a cabo distintas aproximaciones experimentales para entender las bases genéticas de la
formación de raíces adventicias en las plantas. Este Trabajo de Fin de Grado se centra en el estudio
de algunos parámetros relevantes de la arquitectura radicular en una selección de líneas de
introgresión obtenidas a partir del cruzamiento de una especie silvestre de tomate con una variedad
comercial de tomate (Eshed y Zamir, 1995). Existen estudios previos en esta población para la
formación de raíces y tallos adventicios en respuesta a la adición de hormonas vegetales (Arikita et
al., 2013) que se han utilizado como punto de partida para la selección de las líneas a estudio.
Los objetivos específicos de este Trabajo de Fin de Grado son:
Diseñar y evaluar un protocolo adecuado para el análisis fenotípico de la arquitectura
radicular en plántulas de tomate que se han cultivado in vitro.
Caracterizar la variación fenotípica existente en la morfología del sistema radicular (raíz
primaria y raíces laterales) durante el desarrollo temprano en una selección de líneas de
introgresión de tomate.
Caracterizar la variación fenotípica existente en la morfología del sistema radicular
adventicio en respuesta a herida en una selección de líneas de introgresión de tomate.
Estudiar la estructura tisular del meristemo apical en alguna de las líneas estudiadas.
Materiales y métodos 9
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Material vegetal
La colección de líneas de introgresión o ILs, derivadas del retrocruzamiento de Solanum
lycopersicum cv. M82 x Solanum pennelii LA716, así como también las F1 derivadas de los
distintos cruzamientos entre las líneas de introgresión y S. lycopersicum cv. M82, utilizadas
en este trabajo han sido cedidas por el Dr. Lázaro Eustáquio Pereira Peres, de la Universidad
de São Paulo (Brasil). En la Figura 3 se puede observar un esquema de los genotipos
utilizados. Estos se dividieron en tres series de trabajo; la serie 1 contenía las líneas IL1‐3,
IL2‐6, IL3‐2, IL3‐4, e IL11‐4; en la serie 2 se englobaron las líneas IL6‐2, IL7‐5, IL7‐5‐5 e IL12‐2;
y en la serie 3 se encontraban las líneas IL5‐4, IL8‐1, IL8‐1‐1 e IL11‐4‐1. En las tres series de
trabajo siempre se añadieron como control las líneas parentales S. lycopersicum y S.
pennellii.
Figura 3. Líneas de introgresión empleadas en este trabajo. (A) Esquema de los cromosomas de
tomate y las diferentes líneas de introgresión (derecha). (B) Listado de líneas estudiadas (izquierda).
Tomado de http://solgenomics.net/, con ligeras modificaciones. Se destacan en verde las distintas
líneas de introgresión utilizadas en este trabajo.
A B
Materiales y métodos 10
3.2. Fenotipado de las líneas de introgresión
El primer paso fue llevar a cabo una esterilización de semillas de cada genotipo a estudio
(20 semillas de cada genotipo), que se depositaron en el interior de un tubo Eppendorf de
1,5 mL. Posteriormente se preparó una disolución de hipoclorito de sodio (lejía comercial
que contenía 37 gramos de cloro activo por litro) diluida al 50% con agua destilada, de la
cual se añadió 1 ml en cada uno de los tubos Eppendorf que contenía las semillas para
proceder a su desinfección. Se realizó un primer lavado con hipoclorito sódico agitando los
tubos constantemente durante 10 min. Tras esto, se realizaron 4 lavados con 1 mL de agua
destilada estéril, con tiempos de lavado de 5, 5, 10 y 10 min, consecutivamente. Una vez
esterilizadas y sin restos de lejía, las semillas de cada genotipo se traspasaron a una caja de
Petri cuadrada de 120x120x20 mm, sobre un papel de filtro humedecido con agua destilada
estéril, a modo de cámara húmeda, incubándolas durante 48 h a una temperatura de 28°C
en oscuridad. Tras estas primeras 48 h, las semillas que hubieron germinado se transfirieron
a cajas de Petri estériles de 240x240x25 mm que contenían 150 mL de medio de cultivo
previamente autoclavado (20 min a 121°C), que contenía: 2,15 g/L de la mezcla básica de
sales Murashige y Skoog (Duchefa); 20 g/L de sacarosa, y una disolución de 2mL/L de la
mezcla de vitaminas “Gamborg B5” (Duchefa), pH ajustado a 5,8 utilizando para ello KOH
1M, usando como tampón MES monohidrato (Duchefa) a una concentración de 0,5 g/L. Por
último se añadió el agente gelificante Gelrite (Duchefa) a una concentración de 2,5 g/L.
Debido a la necesidad de un ambiente estéril todo el proceso se realizó en una cabina de
flujo laminar Tesltar H‐100. Con ayuda de unas pinzas estériles, se trasfirieron 12 semillas
germinadas de cada genotipo siguiendo una disposición de 6 semillas equidistantes por fila
con un total de dos filas por caja, como se muestra en la Figura 4.
Una vez completado este proceso, las cajas de Petri se sellaron y se colocaron
posteriormente en una cámara de crecimiento Bioclim a una temperatura de 20‐24°C
durante 72 h con periodo de día largo, es decir un total de 16 h de luz y 8 h de oscuridad. Las
cajas de disponían de manera vertical para favorecer el crecimiento gravitrópico de las
plantas y se cambiaban de posición diariamente en la cámara de cultivo para evitar
diferencias de temperatura o iluminación dentro de la cámara.
Después de pasar 72 h en la cámara de crecimiento, las plántulas de cada placa fueron
numeradas y se escanearon. A continuación se llevó a cabo el corte del ápice radicular. Para
Materiales y métodos 11
ello, con la ayuda de un bisturí estéril, se realizó un corte de unos 5 mm del ápice de la raíz
que una vez seccionado se retiró del medio de cultivo. Del mismo modo, se llevó a cabo un
segundo escaneado de las placas tras realizar este proceso de corte. A las 72 horas tras el
corte del ápice se procedió a la escisión de la raíz principal, escaneando previamente cada
una de las cajas de Petri. Para eliminar la raíz principal se realizó un corte en el tercio inferior
del hipocótilo, eliminando así, por un lado la raíz principal y las raíces laterales, y asegurando
por otro, la eliminación de los posibles primordios de raíces adventicias ya formados en este
tiempo. Los hipocótilos cortados se trasladaron a nuevas cajas de Petri de 240x240x25 mm
con medio de cultivo con la misma composición descrita anteriormente, realizando un
escaneado de las nuevas placas tras la correcta colocación de los hipocótilos cortados. Las
raíces laterales retiradas tras el corte del hipocótilo, se fijaron para su posterior uso.
Figura 4. Esquema del protocolo seguido para la realización del fenotipado de las líneas de introgresión. Esquema del procedimiento de fenotipado seguido en este trabajo, desde la siembra de semillas hasta el desarrollo de las plantas en el invernadero. Las líneas discontinuas en rojo representan cortes efectuados. E1-E8 simbolizan el momento de la toma de imágenes de las distintas placas mediante su escaneado.
Una vez crecidas las raíces adventicias, se llevó a cabo un seguimiento visual de éstas,
realizando recuentos periódicos del número de raíces adventicias por explanto en cada
genotipo así como toma de imágenes con el escáner de forma periódica (Figura 4). Al
finalizar el experimento, se seleccionaron plantas para su crecimiento en el invernadero,
cultivándose estas plantas con una proporción 1:1 de sustrato comercial (J&P Viverismo) y
perlita (Proquilab), en macetas de 3 L, con riego automático de 4 min cada 6 horas, así como
con un rango de temperatura de 25‐35°C, y fotoperiodo de 11 h luz/13 h oscuridad, durante
el tiempo necesario hasta que maduraron los frutos y se obtuvieron nuevas semillas.
Materiales y métodos 12
3.3. Estudio celular de la morfología radicular por el método de tinción
pseudo Schiff con yoduro de propidio (PS‐PI)
Después del corte del sistema radicular siguiendo el protocolo anteriormente descrito, las
raíces laterales cortadas se introdujeron en un tubo Eppendorf con una disolución fijadora
(50% de metanol y 10% de ácido acético) durante 12 h a 4°C (Truernit et al., 2008).
Tras la fijación, se realizó un lavado con 1 mL de agua destilada, y posteriormente se
añadió al tejido 1mL de una dilución al 1% de ácido periódico en agua destilada, dejando
actuar durante 40 min a temperatura ambiente. Una vez transcurrido este tiempo, se realizó
un nuevo lavado con agua destilada y se incubaron las muestras durante 2 h con 1 mL del
reactivo de Schiff a temperatura ambiente; este reactivo contiene 1,9 g de metabisulfito de
sodio en 0,54% de ácido clorhídrico y 0,1 mg/mL de yoduro de propidio, en un volumen final
de 100 mL. Pasado este tiempo de incubación se retiró el reactivo de Schiff y se añadió 1 mL
de una disolución que contenía hidrato de cloral (80 g de hidrato de cloral en 20 mL de agua
destilada), dejándolo a temperatura ambiente durante toda la noche para eliminar el exceso
de yoduro de propidio de las muestras.
Al día siguiente, con la ayuda de unas pinzas, se depositó el tejido a estudio en un
portaobjetos de 76x26 mm y se le añadió una gota de reactivo de Hoyer (20 mL de agua
destilada, 30 g de goma arábiga, 20 g de glicerol y 200 g de hidrato de cloral), colocando
sobre la muestra el cubreobjetos y sellando los portaobjetos con laca de uñas para su
posterior visualización con el microscopio confocal.
Para la visualización de las muestras se ha empleado un microscopio láser confocal Leica
TCS‐SPE. La longitud de onda de excitación para las muestras teñidas por el método PS‐PI fue
de 488 nm, la longitud de onda de emisión se recogió entre 485 y 491nm.
3.4. Análisis de la formación de raíces adventicias en explantos de cotiledón e
hipocótilo en medio con hormonas
El ensayo de regeneración consistió en el estudio de la formación de raíces adventicias en
explantos de hipocótilo y cotiledón en medios con presencia de hormonas exógenas. Se
utilizaron tres medios de cultivo para la realización de estos ensayos; 1) medio de cultivo
MS, descrito en el apartado 3.2; (2) medio MS suplementado con 0,1 M de la auxina ácido
1‐naftalenacético o ANA, y (3) medio MS suplementado con 2,25 M de la citoquinina 6‐
benzilaminopurina o 6‐BAP.
Materiales y métodos 13
Las semillas utilizadas en este ensayo se esterilizaron y germinaron del mismo modo que
el descrito en el apartado 3.2. Las plántulas germinadas se pasaron a cajas de Petri
240x240x25 mm en la disposición descrita en el apartado 3.2 con medio de cultivo MS,
donde se desarrollaron durante 10 días antes de proceder al corte de la planta. Para obtener
la muestra de hipocótilo de la parte superior o apical se realizó un corte transversal por
debajo de los peciolos de los cotiledones y otro inferior, obteniendo un explanto de
aproximadamente 5 mm como se observa en la Figura 5A. Del mismo modo, para obtener el
fragmento de hipocótilo de la parte inferior o basal, se seccionó el sistema radicular y se
realizó otro corte superior de 5 mm. Por otro lado, se eliminó el peciolo de ambos
cotiledones, y se realizó un corte transversal dividiendo el cotiledón en dos partes de igual
tamaño, obteniéndose de esta forma dos muestras diferenciadas por cada uno de los dos
cotiledones, una de las partes contenía el ápice del cotiledón mientras que la otra contenía
la base del mismo.
Figura 5. Corte y distribución de los explantos de tomate. (A) Esquema de una plántula de tomate a los 12 días de la germinación, las líneas discontinuas representan los cortes efectuados. (B) Distribución de los explantos en las cajas de Petri de 90 mm de diámetro.
Como se muestra en la Figura 5B, se utilizaron cajas de Petri redondas de 90 mm de
diámetro que se dividieron en 4 secciones equivalentes en tamaño, y en cada sección se
colocó una planta. Cada sección se divide en dos subsecciones, donde el lado izquierdo
contiene el fragmento de la parte inferior del hipocótilo (numerado como 1), así como dos
de cotiledón (3 y 5), correspondientes a la base de los dos cotiledones de la planta, y el lado
5 mm región apical
5 mm regiónbasal
Cotiledón región basal
Cotiledón región apical
A B
Materiales y métodos 14
derecho contiene la muestra de la parte superior del hipocótilo (numerado como 2), y los
fragmentos pertenecientes al ápice de cada uno de los cotiledones (4 y 6).
Las muestras de hipocótilo se colocaron de forma vertical de tal modo que sólo la parte
basal de cada fragmento, correspondiente a uno de los cortes, estaba en contacto con el
medio. Además, los explantos de cotiledón se posicionaron procurando maximizar el
contacto de la superficie abaxial y la zona de corte con el medio de cultivo.
Tras la colocación de los explantos se realizó un escaneado de las cajas de Petri,
dejándolas posteriormente en la cámara de crecimiento a una temperatura de 20‐24°C
durante 25 días, con período de día largo (16 h de luz y 8 h de oscuridad), con luz procedente
de la parte superior de la cámara, disponiéndose las placas en la cámara de manera
horizontal con la parte adaxial de los cotiledones (cara sin contacto con el medio) hacia la
fuente de luz. Se mantuvieron los explantos en contacto con el medio con diferentes
hormonas durante 25 días, realizándose escaneados periódicos hasta el día de finalización
del ensayo en el que se escanearon de nuevo cada una de las cajas de Petri.
3.5. Análisis de imágenes
3.5.1. Análisis del fenotipado radicular
Las imágenes se obtuvieron mediante el escaneo de las distintas cajas de Petri utilizando
un escáner HP Epson V330, con una resolución de imagen tanto vertical como horizontal de
800 ppp (píxeles por pulgada). El protocolo de escaneado comenzó con una primera toma de
imagen el día de la colocación en las cajas de Petri de las semillas germinadas procedente de
cámara húmeda. Posteriormente se realizaron dos escaneos el día del corte del ápice, uno
antes y otro después de este proceso; de igual forma se procedía en el momento del corte
del sistema radicular, tomando dos imágenes, siendo la segunda de los hipocótilos ya
cortados. Tras este proceso se realizaban tomas de imágenes de los hipocótilos
periódicamente cada 3‐4 días, hasta el último escaneo a los 10 días del corte.
Para la recogida de datos cuantitativos se han utilizado las imágenes de los escáneres
realizados el día 5 después de la germinación, en este caso para el estudio de la raíz
principal; las imágenes del día 8 después de la germinación se utilizaron para el estudio de
las raíces laterales y las del día 10 después del corte de la raíz principal para el estudio de las
adventicias. En la Figura 6 se pueden observar las distintas fases del editado de las imágenes
que se llevó a cabo para el ensayo de las líneas de introgresión. En la Figura 6A se detalla el
Materiales y métodos 15
sistema radicular de una plántula a los 8 días desde su germinación, proveniente de la
imagen tomada antes del corte de la raíz principal. El procedimiento que se ha utilizado es
igual para el análisis de la raíz principal y laterales, así como para raíces adventicias. Esta
imagen se editó con el programa ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/); para ello, el primer
paso fue la separación de los canales primarios que forman la imagen, seleccionando el canal
rojo, por ser el que presentaba la imagen más clara, obteniendo de esta forma una imagen
en escala de grises. Posteriormente se ajustó el contraste y el brillo de la imagen, así como el
balance de color, para conseguir una mejor calidad de la imagen disminuyendo el ruido de
esta (Figura 6B).
Figura 6. Etapas del procesado de imágenes para el fenotipado radicular. (A) Imagen original obtenida del escaneado de las placas, (B) Imagen en escala de grises, (C) Conversión de la imagen a píxeles binarios, (D) Eliminación manual de ruido, (E) Esqueletonización o conversión a línea única de píxeles. La barra de escala indica 10 mm.
La imagen obtenida se introduce en el programa EZ Rhizo (Armengaud et al., 2009),
donde se llevó a cabo un proceso de conversión de la imagen en la que los pixeles de esta,
según su intensidad luminosa se transforman, bajo un umbral ajustable, en pixeles binarios,
obteniéndose de esa forma la imagen “C” a partir de la anterior (Figura 6C). Tras este primer
paso, se llevó a cabo un proceso de editado manual de la imagen, con el fin de disminuir el
ruido alrededor de la raíz, así como una suavización tanto de las raíces laterales una a una,
como de la raíz principal. Se realizó también una definición de todas las raíces, de tal forma
que el programa pudiera detectarlas correctamente, así como una separación de las raíces
superpuestas. Una vez terminado este proceso de editado manual se obtuvo la imagen “D”
(Figura 6D), posteriormente se llevó a cabo un proceso de “esqueletonización”, en el que
cada raíz se transformó en una única fila de pixeles, requiriendo en este caso, un segundo
A B C D E
Materiales y métodos 16
editado manual. El último paso fue la detección de la raíz principal y de las raíces laterales
(Figura 6E), destacándose en diferentes colores, y obteniendo posteriormente un archivo de
texto plano con los datos de longitud, posición y ángulo de crecimiento de las raíces, tanto
principal como lateral, así como también el número de raíces laterales.
3.5.2. Análisis de regeneración con hormonas
En el ensayo de regeneración se realizó una primera toma de imágenes tras la colocación
de los explantos en las cajas de Petri, tras ello se obtuvieron escaneos de las cajas
periódicamente cada 5‐7 días, hasta los 25 días, utilizando tanto el primero como el último
de ellos para obtener los datos necesarios para completar el ensayo.
En las placas suplementadas con citoquininas, las imágenes se analizaron con el programa
ImageJ, midiendo el área del callo formado a día 0 y día 25. Los datos de las gráficas se
obtuvieron restando el área del día 25 menos el área del día 0. En las placas suplementadas
con auxina se realizó un recuento de raíces periódicamente, y se utilizaron los datos
obtenidos a día 25.
3.6. Análisis de datos
Una vez recopilados todos los datos de cada una de las imágenes, y agrupados por
características a estudio, se obtuvieron distintos parámetros como longitud, numero de
raíces laterales y adventicias, distancia entre raíces, distancia al hipocótilo de las raíces
laterales, distancia entre raíces adventicias y ángulo de crecimiento de los tres tipos de
raíces estudiados.
Los valores de la longitud de la raíz principal, de raíces laterales y raíces adventicias se
obtuvieron del archivo de texto plano proporcionado, por el programa EZ Rhizo. Para realizar
el gráfico correspondiente a estos parámetros, se agruparon los datos por planta y genotipo,
realizando en el caso de raíces laterales y adventicias una media de cada una de las plantas,
obteniéndose de esta forma la longitud media de raíz para cada planta. Posteriormente se
realizó una media de la longitud para cada genotipo en los tres tipos de raíces estudiadas,
aplicando en ambos procesos el tratamiento de los datos descritos posteriormente. Estos
cálculos se llevaron a cabo con ayuda del programa Excel de Microsoft Office 2010.
En las imágenes correspondientes al análisis de las raíces adventicias se tomó el
hipocótilo como referencia para la obtención de los datos correspondientes a las raíces
adventicias. Los datos del número de raíces laterales y adventicias se obtuvieron
Materiales y métodos 17
directamente del archivo proporcionado por el programa EZ Rhizo. El tratamiento de los
datos fue similar al seguido en el cálculo de la longitud de las raíces.
El ángulo de crecimiento de los tres tipos de raíces estudiadas se ha obtenido agrupando
los valores por planta y genotipo, siguiendo el mismo protocolo de tratamiento de datos que
se ha utilizado para la longitud de las raíces. Sin embargo, en este caso el programa EZ Rhizo
nos proporcionaba el valor del ángulo referido a la vertical de la imagen, dato que se utilizó
directamente en el caso de la raíz principal y adventicias, pero que en el caso de las raíces
laterales se ha decidido referenciar a su respectiva raíz principal; de esta forma se ha
procedido con la resta del valor del ángulo de la raíz principal al de la raíz lateral,
obteniéndose el valor del ángulo de crecimiento de estas raíces con respecto al de su raíz
principal.
La distancia al hipocótilo de las raíces laterales se obtuvo directamente de su posición en
la raíz principal, dato que proporciona el programa EZ Rhizo. La distancia entre raíces
laterales y raíces adventicias se ha calculado mediante la resta de las posiciones de raíces
contiguas. Tras la obtención de los datos para cada uno de los parámetros, se procedió a una
ponderación de los mismos, referenciándolos a los datos obtenidos para los mismos
parámetros en el genotipo de referencia en cada serie y obteniendo así valores relativos en
los casos en los que se observaron diferencias entre series en las líneas control.
Para todos los parámetros descritos anteriormente se han realizado distintos análisis
estadísticos. En primer lugar, se ha procedido con una detección y descarte de valores
atípicos previa al cálculo de los distintos promedios. Posteriormente, para identificar
diferencias significativas entre los valores de los distintos genotipos, se han llevado a cabo
análisis ANOVA entre los valores de las medias de cada planta, para cada parámetro,
referenciados a sus genotipos. Estos dos procedimientos se han realizado con el programa
de estadística Statgraphics Centurion XII.
En el caso del ensayo de regeneración, los datos del número de raíces en los explantos se
agruparon por tipo de explanto, tipo de tratamiento, número de planta, y genotipo al que
pertenecían. Para el estudio de los datos de realizó un análisis estadístico ANOVA con el
programa Statgraphics Centurion XII, para destacar las diferencias significativas en la
formación de raíces adventicias, dentro de un mismo tipo de explanto y genotipo, y entre los
explantos depositados en medio MS y en medio MS con hormonas.
Materiales y métodos 18
De la misma forma se procedió con los datos de las áreas de los explantos, agrupándolos
por tipo, tratamiento, planta y genotipo, además, de en este caso, por día de la medición, es
decir, si fue tomada al principio o al final del ensayo. Realizando una media en cada uno de
estos grupos para cada planta, e identificando a su vez los datos atípicos con el programa
Statgraphics Centurion XII, con el que se realizó posteriormente un análisis ANOVA, para
destacar las diferencias significativas existentes entre el área al principio y al final del ensayo
dentro un mismo tipo de medio de cultivo; y las diferencias existentes en el área entre el
medio MS y el medio MS con hormonas al finalizar el ensayo.
Resultados 19
4. RESULTADOS
4.1. Selección de las líneas de introgresión
Las líneas de introgresión seleccionadas para este trabajo fueron cedidas por el Dr. Lázaro
Eustáquio Pereira Peres de la Universidad de São Paulo (Brasil). Estas líneas contienen
pequeños fragmentos de los cromosomas de Solanum pennellii, una especie silvestre de
tomate que mostró una elevada capacidad de regeneración in vitro (Arikita et al., 2013), y
que fueron introgresados en el cultivar comercial M82 de S. lycopersicum. Con el fin de
encontrar variaciones genéticas naturales que controlen la capacidad de formar raíces
adventicias tras una herida, se seleccionaron las 11 líneas de introgresión de la población
derivada del cruzamiento S .pennellii × S. lycopersicum que presentaron valores extremos en
su capacidad de regeneración de tallo a partir de explantos de cotiledón y en respuesta a la
adición exógena de auxinas y citoquininas (Arikita et al., 2013).
4.2. Germinación
Para determinar si la introgresión de un fragmento cromosómico de S. pennellii podría
afectar a la germinación de las líneas a estudio, se evaluó el porcentaje de germinación en
cada línea y en los parentales S. lycopersicum M82 y S. pennellii. Los resultados obtenidos se
muestran en la Figura 7.
Figura 7. Porcentaje de germinación de las líneas de introgresión estudiadas.
El porcentaje de germinación de las líneas parentales fue del 60% en el caso de S.
lycopersicum y del 74% en el caso de S. pennellii, sin encontrar demasiada variación en los
Resultados 20
porcentajes de germinación de las líneas parentales entre las distintas siembras realizadas.
La mayoría de las líneas de introgresión presentaron valores de germinación similares a los
de sus parentales, a excepción de la línea IL3‐4, con un 15% de germinación, y la IL8‐1 en el
que todas la semillas germinaron (Figura 7).
4.3. Caracterización morfológica de la arquitectura radicular
4.3.1. Raíz principal
El estudio de la raíz principal se llevó a cabo a las 72 h de la germinación de las semillas (5
días después de la siembra). A partir de las imágenes obtenidas se analizaron los siguientes
parámetros: (1) longitud de la raíz principal, (2) ángulo de la raíz principal respecto a la
vertical, y (3) dirección de crecimiento de la raíz principal, considerando el valor 1 si crece
hacia la izquierda de la imagen y el valor 0 si crece hacia la derecha. Estos tres parámetros se
cuantificaron tal cómo se describe en el apartado de materiales y métodos.
Debido a que hemos encontrado diferencias significativas en la longitud de la raíz
principal de los parentales en función de la siembra (Tabla 1), se procedió a corregir los
resultados de cada serie respecto a la línea M82 de S. lycopersicum, lo que nos ha permitido
comparar entre sí los resultados obtenidos en las distintas siembras.
Tabla 1. Valor de P en los parámetros de la raíz principal en S. lycopersicum
Parámetro estudiado Factor: siembraa
Longitud <0,001
Ángulo 0,122
Dirección 0,623
a Se indican en negrita y cursiva los valores de P<0,01.
El valor promedio de la longitud de la raíz principal en las plántulas de S. lycopersicum a
los 5 días tras la siembra fue de 33,2 11,9 mm, mientras que en S. pennellii este valor fue
significativamente mayor. En lo que respecta a las líneas de introgresión estudiadas, se
observaron diferencias significativas con el parental S. lycopersicum en las líneas IL1‐3 e IL3‐
4, que mostraron una raíz principal significativamente más corta (Figura 8A y 8D). Por otro
lado, el valor promedio de longitud de la raíz principal fue significativamente mayor que el
del parental de referencia en las líneas IL7‐5, IL7‐5‐5, IL8‐1, IL11‐4 e IL12‐2 (Figura 8A y 8D).
No se encontraron diferencias significativas en la longitud de la raíz principal de estas líneas
Resultados 21
entre sí y con respecto al parental S. pennellii, a excepción de la línea IL7‐5 que mostró una
raíz principal significativamente más larga que S. pennellii.
Figura 8. Caracterización morfológica de la raíz principal. (A) Longitud promedio de la raíz principal respecto a S. lycopersicum. (B) Valor promedio del ángulo de la raíz principal con respecto a la vertical. (C) Dirección de crecimiento de la raíz principal. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas con S. lycopersicum (P<0,05). En rojo valores inferiores y en verde valores superiores. (D) Imágenes representativas de plántulas de S. lycopersicum (M82) (izquierda), IL7-5 (centro) e IL3-4 (derecha) a los 5 días después de la siembra. La barra de escala indica 10 mm.
El ángulo de la raíz principal respecto a la vertical fue de 14,4 6,8 en S. lycopersicum y
de 12,1 9,7 en S. pennelli (Figura 8B). Dos líneas, la IL7‐5 y la IL8‐1, mostraron un ángulo
de crecimiento de la raíz principal menor de 10. En el caso de las líneas IL3‐2 y IL3‐4, ambas
mostraron un ángulo mayor de 40 (Figura 8B).
Respecto a la dirección de crecimiento de la raíz principal, no se encontraron diferencias
estadísticamente significativas entre las líneas analizadas y con respecto a sus parentales,
A
B
C
D IL7‐5 M82 IL3‐4
Resultados 22
observándose que en la mitad de los casos la raíz principal crecía hacia la derecha y en la
otra mitad crecía hacia la izquierda (Figura 8C).
4.3.2. Raíces laterales
Para el análisis del sistema radicular secundario se indujo la formación de raíces laterales
mediante la escisión del ápice de la raíz primaria, de manera similar a cómo se había descrito
previamente en Arabidopsis thaliana (Van Norman et al., 2014) y tal cómo se indica en
materiales y métodos. A los 3 días tras la escisión del ápice radicular (8 días tras la siembra),
se analizaron los siguientes parámetros: (1) número de raíces laterales; (2) densidad,
definida como la distancia entre dos raíces laterales consecutivas; (3) longitud promedio de
las raíces laterales; (4) ángulo promedio de las raíces laterales respecto a la raíz principal; y
(5) dirección de crecimiento de las raíces laterales. Además se introdujo un parámetro
adicional que hemos denominado: (6) profundidad mínima del sistema radicular secundario,
y que se define como la distancia, en la raíz principal, entre la base del hipocótilo y la raíz
lateral más próxima a ésta.
Hemos encontrado diferencias estadísticamente significativas en los parentales para
algunos de los parámetros cuantificados en el sistema radicular secundario en función de la
siembra (Tabla 2), por lo que se procedió a corregir los resultados de cada serie respecto a la
línea M82 de S. lycopersicum, de manera similar a cómo se ha descrito en el apartado
anterior.
Tabla 2. Valor de P en los parámetros de las raíces laterales en S. lycopersicum
Parámetro estudiado Factor: siembraa
Número <0,001
Densidad <0,001
Longitud <0,001
Ángulo <0,001
Dirección 0,488
Profundidad mínima 0,024
a Se indican en negrita y cursiva los valores de P<0,01.
El número de raíces laterales en el parental de referencia S. lycopersicum fue de 10,8
6,5 raíces, mientras que en S. pennelli no se observó un número significativamente distinto
Resultados 23
de raíces laterales aunque su número era algo mayor (Figura 9A). Tres de las líneas de
introgresión analizadas, IL2‐6, IL7‐5 e IL11‐4, presentaron un número de raíces laterales
significativamente mayor que el parental S. lycopersicum y dos de ellas (IL2‐6 e IL11‐4)
superaron los valores de S. pennellii (Figura 9A y 9D). En otras especies, como Arabidopsis, el
número de raíces laterales se correlaciona de manera positiva con la longitud de la raíz
principal (Lupini et al., 2014). En nuestra población a estudio hemos determinado que
también existe correlación entre la longitud de la raíz principal y el número de raíces
laterales tras la escisión del ápice radicular en tomate (Figura 10).
Figura 9. Caracterización morfológica de la arquitectura radicular secundaria. (A) Número promedio de raíces laterales respecto a S. lycopersicum. (B) Densidad del sistema radicular secundario. (C) Profundidad mínima del sistema radicular secundario. (D) Imágenes representativas de plántulas de S. lycopersicum M82 (izquierda), IL7-5 (centro) e IL8-1 (derecha) a los 8 días después de la siembra. Se siguen las pautas indicadas en la Figura 8.
DA
B
C
DM82 IL11‐4 IL8‐1 D
Resultados 24
Respecto a la densidad del sistema radicular secundario, hemos determinado que el valor
promedio de distancia entre dos raíces laterales consecutivas en los parentales fue de 1,7
1,1 mm y 2,0 0,8 mm en S. lycopersicum y S. pennellii, respectivamente. La mayoría de
líneas estudiadas presentaron una menor densidad del sistema radicular secundario que el
parental S. lycopersicum (Figura 9B).
Hemos observado que tres de las líneas estudiadas presentaron valores promedio de
profundidad mínima del sistema radicular significativamente distintos de sus parentales
(Figura 9C). Es de destacar el caso de la línea IL7‐5, que presentó el valor promedio más alto
(6,5 3,3 mm), en comparación con el del parental de referencia S. lycopersicum (3,3 1,4
mm). En el otro extremo, la línea IL2‐6 presentó los valores mínimos para este parámetro
(0,4 0,2 mm). IL2‐6 e IL7‐5 presentaron un mayor número de raíces laterales que sus
parentales, que en el primer caso (IL2‐6) podría deberse a una disminución en la
profundidad mínima del sistema radicular, mientras que en el segundo caso (IL7‐5) este
aumento en el número de raíces laterales podría deberse a un alargamiento de la raíz
principal.
Figura 10. Gráficos de correlación entre algunos parentales estudiados. (A) Gráfico de correlación entre los valores de longitud de la raíz principal y el número de raíces laterales en todas las líneas analizadas. (B) Gráficos de correlación entre los valores de longitud de la raíz principal y el número de raíces laterales en el parental S. pennellii.
La longitud de las raíces laterales en una misma planta depende, en gran medida, del
estadio de desarrollo de las mismas, de tal forma que las raíces laterales viejas son más
largas que las raíces laterales más jóvenes. Existe, por tanto, un gradiente posicional por el
que las raíces laterales inician su desarrollo desde las regiones más próximas a la base del
hipocótilo. A pesar de estas diferencias locales entre las longitudes de las raíces laterales
A B
Resultados 25
dentro de cada plántula, hemos determinado que existen diferencias estadísticamente
significativas entre algunas de las líneas analizadas y sus parentales (Figura 11A). Las líneas
IL5‐4, IL8‐1 e IL11‐4‐1 presentaron un valor promedio de la longitud de raíces laterales
superior al de sus parentales, que en el caso de S. lycopersicum supone 4,1 2,6 mm de
longitud (Figura 11D). De estas tres líneas, solo la IL8‐1 presentó también una mayor
longitud de la raíz principal (Figura 8A).
Figura 11. Caracterización morfológica de las raíces laterales. (A) Longitud promedio de las raíces laterales respecto a S. lycopersicum. (B) Valor promedio del ángulo de crecimiento de las raíces laterales con respecto a la raíz principal del parental S. lycopersicum M82. (C) Dirección de crecimiento de las raíces laterales. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas con S. lycopersicum (P<0,05); en rojo se muestran los valores inferiores y en verde los superiores. La barra de escala indica 10 mm.
DA
B
C
Resultados 26
A B C
D FE
El ángulo de crecimiento de las raíces laterales en el parental S. lycopersicum fue de 60,3
12,9 y algo menor (53,5 18,9) en S. pennelli (Figura 11B). Es interesante destacar que
un gran número de líneas presentó valores significativamente superiores o inferiores al
parental S. lycopersicum (Figura 11B), lo que sugiere el carácter multigénico de este
parámetro, tan relevante para la mejora genética del sistema radicular en condiciones de
estrés.
No se han observado diferencias significativas en la dirección de crecimiento de las raíces
laterales (Figura 11C).
Para comprobar si las diferencias observadas en las raíces laterales podrían tener su
origen en la morfología celular, se fijaron, se tiñeron y se visualizaron las raíces laterales
mediante microscopía confocal (véase el apartado correspondiente de materiales y
métodos). Las líneas parentales así como aquellas en las que se han visto los fenotipos más
pronunciados se representan en la Figura 12. Se indican las células que conforman el centro
quiescente, las células iniciadoras del córtex y la endodermis, la endodermis, el córtex y la
epidermis.
Figura 12. Ápice radicular de las raíces laterales. (A) S. lycopersicum. (B) S. pennellii. (C) IL11-4, (D) IL12-2, (E) IL7-5, (F) IL2-6. Epi: epidermis; Co: córtex; En: endodermis; CEI: células iniciadoras
de córtex y endodermis; CQ: centro quiescente. La barra de escala indica 100 m.
Resultados 27
4.3.3. Raíces adventicias
Para el análisis del sistema radicular adventicio se indujo la formación de raíces
adventicias mediante la escisión del sistema radicular completo, (la raíz principal y las raíces
laterales), tal como se indica en materiales y métodos. A los 10 días después de la escisión
del sistema radicular (18 días tras la siembra) se analizaron los siguientes parámetros: (1)
número de raíces adventicias; (2) densidad, definida como la distancia entre dos raíces
adventicias consecutivas; (3) longitud de las raíces adventicias; (4) ángulo de las raíces
adventicias respecto a la vertical; y (5) dirección de crecimiento de las raíces adventicias.
Hemos encontrado diferencias estadísticamente significativas en algunos de los
parámetros cuantificados en el sistema radicular adventicio en los parentales en función de
la siembra (Tabla 3), por lo que se procedió a corregir los resultados de cada serie respecto a
la línea M82 de S. lycopersicum, de manera similar a cómo se ha descrito previamente. No
obtuvimos resultados de la línea IL7‐5‐5 porque no había datos suficientes.
Tabla 3. Valor de P en los parámetros de las raíces adventicias en S. lycopersicum
Parámetro estudiado Factor: siembraa
Número 0,316
Densidad <0,001
Longitud 0,023
Ángulo 0,811
Dirección 0,947
a Se indican en negrita y cursiva los valores de P<0,01.
El número de raíces adventicias en el parental de referencia S. lycopersicum fue de 4,9
1,2 raíces, mientras que en S. pennelli presentó un número de raíces adventicias de 8,7 ± 2,3,
siendo estas diferencias estadísticamente significativas (Figura 13A). Tres de las líneas de
introgresión analizadas, IL5‐4, IL8‐1 e IL11‐4‐1, presentaron un número de raíces adventicias
significativamente mayor que el parental S. lycopersicum y una de ellas (IL11‐4‐1) superó los
valores de S. pennellii (Figura 13A y 13D).
Respecto a la densidad del sistema radicular adventicio, hemos determinado que el valor
promedio de distancia entre dos raíces adventicias consecutivas en los parentales fue de 0,5
0,2 mm y 0,3 0,1 mm en S. lycopersicum y S. pennellii, respectivamente. Las líneas IL1‐3,
Resultados 28
C DM82 S. pennellii IL3‐2 IL11‐4‐1
IL3‐4, IL5‐4 e IL11‐4 presentaron una menor densidad del sistema radicular adventicio que el
parental S. lycopersicum (Figura 13B).
Figura 13. Caracterización morfológica de las raíces adventicias I. (A) Número de raíces adventicias. (B) Valor promedio de la densidad de raíces adventicias. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas con S. lycopersicum (P<0,05), en rojo se muestran los valores inferiores y en verde los superiores. (C) Imágenes representativas de plántulas de las líneas S. lycopersicum M82 (izquierda) y S. pennellii (derecha). (D) Imágenes representativas de plántulas IL3-2 (izquierda) e IL11-4-1 (derecha). Las barras de escala indican 10 mm.
La longitud de las raíces adventicias se representa en la Figura 14A. La longitud promedio
de las raíces adventicias de las plantas S. lycopersicum fue de 36,9 ± 18,5 mm, mientras que
C
A
B
Resultados 29
las plantas S. pennellii presentaron un valor promedio en la longitud de raíces adventicias
significativamente menor, de 14,9 ± 6,9 mm. También se observaron raíces adventicias
significativamente más cortas en las líneas IL5‐4, IL8‐1 e IL11‐4‐1. Estas mismas líneas
presentaban un número significativamente mayor de raíces adventicias. La línea IL3‐2
presentó mayor longitud de raíces adventicias que el control, siendo la única que presentaba
menor número de raíces adventicias de manera significativa.
El ángulo de crecimiento de las raíces adventicias en el parental S. lycopersicum fue
de 49,0 19,9 y algo mayor (56,2 20,8) en S. pennellii (Figura 14B). Únicamente IL7‐5
poseía un ángulo de raíces adventicias similar al de S. pennellii, 57,0 ± 19,3, mientras que
varias líneas poseían un ángulo significativamente menor al observado en el parental S.
lycopersicum (Figura 14B).
Figura 14. Caracterización morfológica de las raíces adventicias II. (A) Longitud de las raíces adventicias. (B) Valor del ángulo de crecimiento de las raíces adventicias con respecto a la vertical. (C) Dirección de crecimiento de las raíces adventicias. Los asteriscos indican diferencias estadísticamente significativas con S. lycopersicum M82 (P<0,05), en rojo se muestran los valores inferiores y en verde los superiores.
A
B
C
Resultados 30
No se han observado diferencias significativas en la dirección de crecimiento de las raíces
adventicias (Figura 14C).
4.4. Regeneración en medio suplementado con hormonas
Para el estudio de la regeneración en la parte basal del hipocótilo en medio
suplementado con hormonas se llevaron a cabo dos ensayos: (1) en medio suplementado
con la citoquinina 6‐benzilaminopurina (6‐BAP) y (2) en medio suplementado con la auxina
ácido naftalenacético (ANA), tal y como se indica en el apartado de materiales y métodos. En
el medio suplementado con citoquininas se observó la aparición de callos, conjunto de
células sin estructura organizada aparente y con capacidad pluripotente (Ikeuchi et al.,
2013), en la base de los fragmentos de hipocótilo. Al no observarse diferencias
estadisticamente significativas en el área de la base de los explantos de en función de la
región estudiada, apical o basal, los datos se combinaron para su análisis.
En la Figura 15A se representa el aumento del área de la base de los explantos de
hipocótilo en las diferentes líneas estudiadas en el medio de cultivo suplementado con
citoquininas (en rojo) y en medio sin citoquininas (en azul). El área de la base de los
explantos de hipocótilos del parental S. lycopersicum en medio sin hormonas aumentó 3,6 ±
2,4 mm2 y no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre las líneas
estudiadas en el medio sin suplemento. El valor del aumento del área de los callos en el
medio de cultivo con citoquininas para S. lycopersicum fue de 12,9 ± 2,4 mm2. Al igual que S.
lycopersicum, la mayoría de las líneas de introgresión estudiadas también mostraron
diferencias estadísticamente significativas cuando comparábamos el área de la base de los
explantos de hipocótilo en los dos tratamientos (con y sin citoquininas). La línea IL12‐2
presentó la mayor diferencia en el área de los explantos de los hipocótilos entre
tratamientos, 4,4 ± 3.3 mm2 en el medio de cultivo sin hormonas y 26,2 ± 4,3 mm2 en el
medio de cultivo con hormonas.
Para el estudio de la respuesta a las auxinas, se observó el número de raíces adventicias a
los 25 días tras la colocación de los explantos de hipocótilo en los tratamientos (medio de
cultivo MS y medio de cultivo suplementado con 0,1 µM de ANA auxinas), no se observaron
diferencias estadisticamente significativas entre la parte de arriba y la de debajo de los
explantos y por tanto se combinaron los datos para su análisis estadístico.
El número de raíces adventicias en los explantos de hipocótilo de S. lycopersicum en el
medio sin hormonas fue de 2,6 ± 2,2. No observándose diferencias estadísticamente
Resultados 31
significativas cuando comparamos el número de raíces adventicias en los explantos de
hipocótilo de S. lycopersicum y las demás líneas estudiadas en el medio sin hormonas (Figura
15B). Solo las líneas IL11‐4, IL3‐2 e IL5‐4 mostraron diferencias estadísticamente
significativas entre tratamientos.
Figura 15. Regeneración en medio suplementado con hormonas. (A) Incremento en el área del callo en medio de cultivo con y sin citoquininas. (B-C) Número de raíces adventicias en explantos de hipocótilo (B) o de cotiledón. CH: medio con hormonas.
A
B
Explantos de hipocótilo
Explantos de hipocótilo
** *
2,5 µm 6-BAP
0,1 µM ANA
*
*
*
*
*
*
Área del callo
Número de raíces adventicias
Discusión 32
5. DISCUSIÓN
Los estudios genéticos sobre la formación y el desarrollo de las raíces en Arabidopsis thaliana
han dado cuenta de la simplicidad del proceso a nivel celular que presenta esta planta modelo (Dolan
et al., 1993), habiéndose identificado en estos estudios genéticos distintos loci o genes que
intervienen en la regulación de los diferentes parámetros que intervienen en la formación y
desarrollo del sistema radicular, como pueden ser la longitud, el número de raíces laterales o el
patrón a nivel celular (Benfey and Scheres, 2000; Mähönen et al., 2000; Schiefelbein et al., 2009). A pesar
del mayor conocimiento de estos procesos en Arabidopsis, existen factores que difieren con respecto a
otras especies, por ello es necesario estudiar estos procesos desarrollo del sistema radicular en otros
sistemas vegetales. Una de las líneas seguidas en el laboratorio del Prof. José Manuel Pérez Pérez es el
estudio de la formación y desarrollo de raíces adventicias en distintas especies vegetales, entre ellas
el tomate, habiéndose establecido un protocolo previo para este propósito (Alaguero., 2016).
En este Trabajo de Fin de Grado se pretende aportar información sobre los procesos genéticos
relacionados con la formación y el desarrollo del sistema radicular en tomate utilizando para ello una
colección de 11 líneas de introgresión de tomate derivadas del cruzamiento de S. lycopersicum y S.
pennellii. Se han llevado a cabo tres ensayos diferentes. En el primero de ellos se ha realizado un
análisis fenotípico de la morfología de la raíz principal, las raíces laterales y las raíces adventicias en la
colección de líneas estudiadas. A continuación se visualizó mediante microscopia confocal la
estructura celular del meristemo en las raíces laterales de algunas de las líneas que mostraron
valores extremos en los parámetros estudiados del sistema radicular. Por último, se estudió la
formación de raíces adventicias o callos en explantos de hipocótilo y cotiledón expuestos a un
estímulo hormonal de auxina o citoquinina, respectivamente.
En el trabajo de Ron et al. (2013) se llevó a cabo un estudio detallado de la morfología radicular
en S. lycopersicum M82 y S. pennellii. En sus condiciones de cultivo, el S. lycopersicum presentó una
mayor longitud de la raíz principal que S. pennellii, que se correlacionó además con las diferencias
observadas en la estructura celular del meristemo de la raíz principal (Ron et al., 2013). En nuestras
condiciones sin embargo, apenas se observaron diferencias en el crecimiento de la raíz principal o de
las laterales entre S. lycopersicum y S. pennellii, aunque sí que se observó un número
significativamente mayor de raíces adventicias (y de menor longitud) en S. pennellii en respuesta a
herida. A nivel histológico, no hemos apreciado diferencias apreciables en la estructura del
meristemo de las raíces laterales entre S. lycopersicum y S. pennellii, aunque harán falta
experimentos adicionales para confirmar estos resultados.
Discusión 33
Hemos observado fenotipos transgresivos en las líneas de introgresión analizadas para algunos
parámetros relevantes de la arquitectura radicular como son la longitud de la raíz principal (IL3‐2 e
IL7‐5) o de las laterales (IL8‐1) o en la profundidad mínima de aparición del sistema radicular
secundario (IL2‐6 e IL7‐5). Es notable la variación existente en los parámetros analizados del sistema
radicular adventicio, con los extremos representados por las líneas IL3‐2 (pocas raíces adventicias
pero muy largas) e IL11‐4‐1 (muchas raíces adventicias pero cortas). Sería interesante obtener la
descendencia del cruzamiento entre ambas líneas para determinar la eventual interacción genética
entre ambos segmentos cromosómicos. Todos estos resultados se explicarían debido al carácter
cuantitativo de los rasgos analizados y a la combinación de alelos favorables o desfavorables en la
región introgresada del parental S. pennellii con respecto a la variedad comercial M82.
En lo que respecta a algunos de los parámetros analizados, como la dirección de crecimiento de
las raíces, nuestros resultados indican que no existe variación genética suficiente en la población
analizada para identificar los factores genéticos que podrían estar implicados en este rasgo.
En el trabajo de Arikita et al. (2013), se llevó a cabo un estudio con una población de 46 líneas
de introgresión del cruzamiento S. lycopersicum M82 S. pennellii para determinar la variación
genética existente en la formación de raíces y tallos adventicios en explantos cultivados in vitro en
respuesta a la adición de 5 M 6‐BAP o 0,4 M de ANA (Arikita et al., 2013). Hemos utilizado estos
resultados y otros proporcionados por el Dr. Lázaro Eustáquio Pereira Pére para la selección de
nuestras líneas a estudio. De manera similar a lo encontrado en este trabajo, hemos observado que
algunas líneas presentaban una menor formación de callo en respuesta a citoquininas, a expensas de
presentar una mayor respuesta a la formación de auxinas en la formación de raíces adventicias (caso
de la IL12‐2), mientras que en otros casos la elevada respuesta a citoquininas se contrarrestó por la
respuesta limitada a las auxinas (como en la IL2‐6). Estos resultados están en consonancia con la
interacción de auxinas y citoquininas para la formación de órganos durante el cultivo in vitro de
plantas (Pacifici et al., 2015)
Conclusiones y proyección futura 34
6. CONCLUSIONES Y PROYECCIÓN FUTURA
Se ha establecido un protocolo estandarizado para el análisis morfológico de la arquitectura
radicular en tomate y se ha evaluado éste en una población de 11 líneas de introgresión y sus
parentales, S. lycopersicum y S. pennellii.
Se han encontrado diferencias estadísticamente significativas entre S. lycopersicum y S.
pennelli. Para longitud de raíz principal, longitud de raíces laterales y raíces adventicias y
número de raíces adventicias, entre otros parámetros.
Se han encontrado diferencias estadísticamente significativas entre alguna de las líneas de
introgresión y el parental recurrente S. lycopersicum para la longitud y ángulo, entre otros
parámetros, tanto en la raíz principal, como en las raíces laterales y adventicias.
Los resultados obtenidos indican que la mayoría de los caracteres estudiados están
determinados por múltiples loci distribuidos de manera diferencial en los genomas de los
parentales.
No se han observado diferencias apreciables en la estructura tisular del meristemo apical
radicular en las líneas que presentaron valores extremos entre sí y con sus parentales.
Algunas de las líneas analizadas presentan una mayor capacidad de formación de raíces
adventicias en respuesta al tratamiento con la auxina ácido 1‐naftalenacético.
Algunas de las líneas analizadas presentan una mayor capacidad de formación de callos en
respuesta al tratamiento con la citoquinina 6‐benzilaminopurina.
En este trabajo se han sentado las bases para la caracterización de la arquitectura radicular en
las líneas de introgresión de tomate y se han identificado algunas regiones genómicas que podrían
contribuir a las diferencias cuantitativas en algunos parámetros de la arquitectura radicular entre los
parentales S. lycopersicum y S. pennellii. En un trabajo futuro del laboratorio del Prof. José Manuel
Pérez Pérez, se pretende llevar a cabo la identificación de algunos de los loci implicados en las
diferencias observadas en el número de raíces laterales y adventicias, mediante el análisis detallado
de las nuevas poblaciones de líneas de introgresión que se han generado recientemente (Ofner et al.,
2016; Fulop et al., 2016).
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Reports 7, 4516.
Morphological characterization and assessment of variability in adventitious root formation in diverse tomato genotypes
Alaguero, A.1, Azorín., A.1, Gran, F.J.1, Peres, L.E.2, and Pérez‐Pérez, J.M.1 1Instituto de Bioingeniería, Universidad Miguel Hernández de Elche, Avda. de la Universidad s/n, 03202 Elche, Spain
2Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ), Universidade de São Paulo, 13418‐900 Piracicaba, Brasil
Adventitious roots (ARs) are ectopic roots that arise either naturally or in response to stress from various plant tissues, such as stems and leaves; they may also be induced by mechanical damage or following in vitro tissue culture regeneration.
Tomato is an attractive model to study the genetic basis of adventitious organ formation. To explore the phenotypic space of this trait in tomato, we characterized AR formation in excised hypocotyls in a genotypically diverse set of 10 wild tomato species, 7 commercial cultivars, and 20 tomato mutants affected in known genes involved in light or hormonal signaling. A combination of semi‐automated image capture and quantitative histology methods allowed us to define the cellular dynamics during the early stages of AR initiation. By studying a collection of Solanum pennellii introgression lines (1), we identified several genomic regions that might include genes involved in AR development.
Mendelization of the causal genes will allow us to understand the genetic basis of AR variability within the tomato clade. (1) Arikita et al. (2013) Plant Sci 199‐200: 121 Work funded by MINECO/FEDER (AGL2012‐33610 and BIO2015‐64255‐R)
8. ANEXO
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
Re
lative
AR
le
ng
th
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
1 Instituto de Bioingeniería, Universidad Miguel Hernández, Avda. de la Universidad s/n, 03202 Elche, Spain
2 Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ), Universidade de São Paulo (Piracicaba) Brasil
aalaguero@umh.es
Aurora Alaguero1, Alfonso Azorin1, F.rancisco Javier Gran1, Lazaro E. P. Peres2, José Manuel Pérez-Pérez1
Morphological characterization and assessment of variability
in adventitious root formation in diverse tomato genotypes
References
1.- Bellini et al. (2014). Annu Rev Plant Biol 65: 639
2.- Arikita et al. (2013). Plant Sci 199-200: 121
3.- Bedinger et al. (2010). Sex Plant Reprod 24: 171
Introduction
Adventitious roots (ARs) are ectopic roots that arise either naturally or in
response to stress from various plant tissues, such as stems and leaves;
they may also be induced by mechanical damage or following in vitro tissue
culture regeneration1.
Results
To explore the phenotypic space of AR morphology in tomato, we
characterized AR formation in excised hypocotyls in a genotypically diverse
set of wild tomato species, commercial cultivars, and previously-described
tomato mutants affected in known genes involved in light or hormonal
signaling. A combination of semi-automated image capture and quantitative
histology methods allowed us to define the cellular dynamics during the
early stages of AR initiation. By studying a collection of Solanum
pennellii introgression lines2, we identified several genomic regions that
might include genes involved in AR development.
Conclusion
We have initiated the genetic dissection of AR formation in tomato. Mendelization of the causal genes
will allow us to understand the genetic basis of the observed variability in AR traits within the tomato
clade.
Figure 1.- Adventitious root (AR)
formation in tomato hypocotyls after
root excision
(A) Hypocotyl base at 5 days after excision
(dae). (B) Transverse section of vascular
bundle at 4 dae showing initiation of an AR
primordium. (C) Phenotyping of AR growth.
(D) Emergence time between consecutive
ARs. (E) Growth speed of ARs. Scale bars:
5 mm (A, C), 100 m (B). 0 hae 90 hae 129 hae 198 hae 240 hae
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Re
lative
AR
nu
mb
er
a
ab bc
d
f
e
f
cd cd
ef
Growth speed (mm/h)
0,0
0,4
0,8
1,2
Re
lative
AR
le
ng
th
e
d
c abc
ab a
bc
ab b b
c
Figure 2.- AR growth in
wild tomato species and
cultivars
(A) Phylogenetic tree of
allied Solanum species in
the tomato clade as
described in 3. (B) Relative
AR number in 10 wild
tomato species and 6
commercial cultivars at 12
dae. (C) Relative AR length
at 12 dae. Reference
genotypes are depicted in
blue. (D) Hypocotyl base at
5 dae in Craigella (left) and
Micro-Tom (right) cultivars.
Scale bar: 5 mm.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Re
lative
AR
nu
mb
er
*
*
**
*
* *
**
Figure 3.- AR growth in a selection of tomato mutants affected in known
pathways
(A) AR number and (B) AR length in 20 previously-described tomato mutants at 12
dae. (C) AR phenotype at 8 dae in some tomato mutants. Scale bar: 5 mm.
0,0
0,4
0,8
1,2b b ab
a ab
ab
ab
bc
a
c
a a
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
*
*
*
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
* *
* *
Figure 4.- AR growth in a
selection of tomato
introgression lines
(A) AR number and (B) AR
length in a selection of
introgression lines (IL) of S.
pennellii into a S.
lycopersicum background.
S. lycopersicum
S. pimpinellifolium
S. galapagense
S. cheesmaniae
S. chmielewskii
S. arcanum
S. neorickii
S. huaylasense
S. chilense
S. peruvianum
S. corneliomulleri
S. penellii
S. habrochaites
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Re
lative
AR
nu
mb
er
b
e
d
b
a
bc
a
cd
a
bc
d
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
Re
lative
AR
le
ng
th
bc
a
ab b
cd
bc bc
e
d
bc
e
B
C
D
A C
B
A
B
C
D
IL12-2 IL1-3 IL7-5
*
*
Emergence time (h)
E
AR4
3
4
AR2
AR3
AR4
AR1 AR2
AR3
A B
C
a
D
*
CCD7 RNAi Micro-Tom
entire diageotropica
aerial roots rosette
S. pennellii S. lycopersicum IL12-2
(C) AR phenotype at 10 dae in IL12-2 and its
parental genotypes. Scale bar: 5 mm. (D) Ils
selected for further studies; blue, S. pennellii;
orange, S. lycopersicum.
Acknowledgements
Work in the laboratory of J.M.P.-P. (AGL2012-33610 and BIO2015-64255-R) is financed by the Ministry of Economy and Competitiveness
(MINECO) and by FEDER funds of the EC - "A way to build Europe"
AGRADECIMIENTOS
La realización de este Trabajo de Fin de Grado ha sido posible gracias a la financiación
por el Ministerio de Economía y Competitividad en el proyecto “Genómica comparada de la
formación de raíces adventicias en tomate y clavel (BIO2015-64255-R)”.
A José Manuel Pérez, por haberme permitido realizar este trabajo en su laboratorio y
haberme guiado de la mejor manera posible, haciendo que aprenda en cada momento.
A Aurora Alaguero, Sergio Ibañez, María Salud Justamante, Ana Belén Sánchez, Francisco
Javier Gran y José Manuel Pérez, por hacerme sentir tan integrado en el equipo.
A Aurora Alaguero, por haberme enseñado todo durante mis primeros pasos en el
laboratorio y por toda su ayuda durante la realización de este TFG.
A mi padre, a mi madre, a mis hermanos y a esa persona especial, por todo su cariño y apoyo
durante estos años.
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