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Fundamentos de PCR
Dr. José A. Cardé-SerranoDr. Jesús Lee-BorgesDra. Liza JiménezDr. José M. PlanasBiol 4207 – Lab de Virologia y BiotecnologiaUniversidad de Puerto Rico - Aguadilla
Objetivos
Estudiar los pasos que componen la reacción de PCR
Discutir factores importantes en la optimización de esta técnica
Conocer Aplicaciones Preparar una reacción de PCR e incubarla
en el termociclador.
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
PCR es básicamente una técnica de amplificación del ADN.
PCR
amplificación
ADN
(molécula sencilla)
Muchasmoléculas
PCRDolan Learning Center
Biology Animation LibraryCSHL
Historia 1985 – se crea la
técnica molecular conocida como “PCR”
Kary B. Mullis, Coorporacion CETUS Premio Nobel en
Química 1993
Procedimiento del “PCR”
Desnaturalización Hibridización Extensión
Desnaturalización
Calor del ADN 94°C. Filamentos dobles
se derriten. Hay una separación
física de las dos cadenas.
Hibridización
La temperatura se reduce a 54°C. Movimiento Browniano.
El movimiento que lleva a cabo una partícula muy pequeña que esta inmersa en un fluido
Enlaces de hidrógeno. Filamento de ADN. Bases construidas.
Extensión o Polimerización
Temperatura de polimerasas 72°C. Los “primers” tienen una fuerte
atracción al molde o templado Los “primers” sin exacto pareo se
pierden. No dan extensiones de fragmento. El procedimiento se repite y se forman
copias del ADN.
LINK
Síntesis por DNA polimerasa
-A T G C A T G C A T G C * *
A C G-T
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Cortos primers de ADN específicos hibridizan con la cadena que tiene que ser copiada
5’ 3’
Síntesis por DNA polimerasa
-A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
5’ 3’
Síntesis por DNA polimerasa
-A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A5’ 3’
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Síntesis por DNA polimerasa
-A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A C
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
5’ 3’
Síntesis por DNA polimerasa
-A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A C G
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
5’ 3’
Síntesis por DNA polimerasa
-A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A C G T
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
5’ 3’
Síntesis por DNA polimerasa
-A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A C G T A
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
5’ 3’
Primero, la fusión separa las dos cadenas de ADN a alta temperatura (~100°C)
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias
Fusión95°C
Hibridización50-60ºC
Extensión deLa cadena
75ºCPrimer Ciclo
2do Ciclo95ºC
50 - 60ºC75ºC
Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de copias
PCR LINK
Hay 6 componentes esenciales en el proceso de PCR
ADN polimerasa termoestable Oligonucleotidos iniciadores (“primers”) Desoxiribonucleótidos trifosfatados
(dNTPs) Cationes divalentes Buffer (para mantener el pH) ADN molde (Templado)
ADN polimerasas termoestables
Llevan a cabo la síntesis de ADN dependiente del templado.
Estabilidad – Taq: 9 min at 97°C, Pwo >2 hr a 100°C Fidelidad – Taq: baja, Pfu: alta Algunas presentan actividad transferasa terminal en el
extremo 3´, ej. Taq agrega una A al extremo 3´, especialmente si en el extremo hay una C. Pwo y Tli generan extremos romos
Cantidad usada = 5 x 1012 moléculas (1.5 unidades) La mas comúnmente usada = Taq ADN polimerasa
Taq Thermus aquaticus, Pwo Pyrococcus woesei, Pfu Pyrococcus furiosus, Tli Thermococcus littoralis
Oligonucleótidos iniciadores (primers) Se conoce su secuencia Es el factor mas importante para la
eficiencia y la especificidad del proceso Deben estar presentes en exceso (1013 = 30
ciclos, 1 kb) Requieren de un cuidadoso diseño Reglas de diseño:
(a) longitud = 18-25 bases (b) Contenido de G+C entre 40-60%(c) Evitar las secuencias repetidas
Evitar las secuencias repetidas
5´5´
3´3´
5´5´3´
3´
Dímero de primer
PCR3´ repetido
5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’5’-NNNNNNNNNNNNNTATA-3’
5’-NNNNNNNNTATA-3’ 3’-ATATNNNNNNNN-5’
Evitar las secuencias repetidas
5´5´
3´3´
no hay extensión
PCR5´ repetido
5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´5´-TATANNNNNNNNNNNNN-3´
5´-TATANNNNNNNN-3´3´-NNNNNNNNATAT-5´
5´5´
3´3´
Evitar las secuencias repetidas
5´
5´
3´
3´
Productos de PCR no deseados
PCRFormación de horquillas
5’-NNNNNNNNNNNGCATGC-3’5’-NNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
5’-NNNNNNNNNNNGCA 3’-CGT
5´3´
ADN molde (templado) Puede ser ssADN o dsADN (simple o doble
cadena) ADN circular y cerrado es levemente menos
efectivo que el ADN lineal Usualmente se utilizan varios miles de copias,
ej: 1 µg de humano, 10 ng de levadura, 1 ng de bacteriano o 1 pg de plasmídico
Se puede amplificar a partir de una sola molécula de ADN molde, pero las condiciones deben estar muy optimizadas
El ciclo de PCR
Desnaturalización - 94-95°C por 45 segundos si G+C < 55%
Temperatura de hibridización (Annealing) – debe ser calculada o determinada empíricamente para cada par de primers demasiado alta = poco o nada de producto demasiado baja = annealing no específico =
productos incorrectos Extensión - a la temperatura óptima de la
ADN polimerasa utilizadaej.: 72°C para Taq
Variantes de la PCR Touchdown PCR Colony PCR Multiplex PCR Hot start PCR Nested PCR Inverse PCR Long PCR Quantitative “real time” PCR
Multiplex PCR Describe una PCR en la cual hay presentes
múltiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de productos. Los mismos pueden verse como múltiples bandas en un gel de agarosa
Multiplex PCR es frecuentemente usada en diagnóstico médico
Ahorra templado, tiempo y gastos Requiere una cuidadosa optimización
Nested PCR
A veces 1 ronda de PCR no da un producto único a partir de un templado complejo, apareciendo un “esparcido”
Se puede resolver utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco mas internamente que los primeros
Realizar una segunda ronda de PCR usando el producto de la primera (esparcido)
Rinde un producto único porque solo el fragmento correcto de ADN posee los sitios correctos de hibridización para el segundo par de primers
Nested PCR
2da PCR
Esparcido de ADN
1era PCR
ADN específico
Clonado con PCR: clonado T-A 3’-A
A-3’
AA
Ligamiento con extremo adhesivo de 1 base = 50 veces mejor que ligamiento con extremos romos
ligamiento
Producto de PCR a partir de Taq Vector con cola-T
Mutagénesis por PCR Introduce cambios de secuencia dentro de
fragmentos (clonados) de ADN El método de extensión solapada requiere 2
primers mutagénicos y otros 2 Amplifica un fragmento 5´ y un fragmento 3´
que se solapan. Ambos portan la mutación Usa los productos en otra reacción para
producir el ADN mutado de longitud completa
Dos 1ras PCRs
separadas
Primer SP6 Primer mutagénico directo (forward)
primer mutagénico inverso (reverse) Primer T7
X
x
x
x
remover primers, desnaturalizar y re-hibridizar
2da PCR
Mutagenesis con PCR- extension solapada
Para amplificar copias de cADN de ANR Es especialmente útil cuando solo se dispone de pequeñas
cantidades de ANR Frecuentemente usada para amplificar genes específicos
(como cANDs) si algo de su secuencia es conocida Requiere primer “antisense” y un AND polimerasa
dependendinte de ANR Puede ser usada para construir bibliotecas de cAND Primero se hace un cAND a partir del templado de ARN Luego se usa un segundo primer (“sense”) para hacer el
duplex de cAND por PCR
RT-PCR = PCR con transcriptasa reversa
RT-PCR LINK
AAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’
Transcripción reversa
PCR usando GSP+GSP1
AAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’
mANR(sense)
Primer Antisense:oligo(dT)o
1ra cadena cDNA
GSP1 (sense)
GSP (antisense)
GSP1
GSP
Requiere el conocimiento de la secuencia para diseñar GSP and GSP1
Real Time - PCR
-Alta especificidad
-Usa primers marcados con moleculas fluorescentes
- Resultados son no solo cualitativos sino cuantitativos
-Sensitividad mucho mayor
-LINK
Parte Práctica
Amplificación de DNA de Fago λ
Lambda ADN
Bacteriófago Lambda (λ) Aislado de E. coli W3110 (c/857 sam7
strain) Usado como sustrato para enzimas de
restricción Peso molecular 31.5×106 daltons y
genoma de 48502 pares de bases
Secuencia de Lambda DNA
Sanger et al. 1982 J. Mol. Biol. 162: 729-773
Protocolo Seguir el protocolo delineado en el “PCR AMplificatiom Kit” Cat. #R011
React Vol (ul) [ ] Fin [ ] IniPCR Buff 5 1xdNTP Mix 4 200uMPrimer 1 0.5 0.2uMPrimer 2/3 0.5 0.2uMTaq Pol 0.25 1.25U/50ul -DNA Temp 0.5 0.5ng/50ul -dH20 50 (39.25) - -Total 50 - -
Sondas control
Sonda control 1 5’-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACT-3’
Sonda control 2 5’-CCACATCCATACCGGGTTTCAC-3’
Sonda control 3 5’-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3’
¿Preguntas?
Preguntas
Muy poco magnesio no produce suficiente producto de PCR y mucho produce bases pareadas erróneas, ¿por qué?
Al escoger los “primers” es importante evitar secuencias que sean complementarias entre estos, ¿por qué?
¿Como cambiaria el producto del PCR si en vez de amplificar ADN viral se amplificara ADN bacteriano (este ADN es metilado)?
Asignación
Hacer un reporte con la secuencia de λ y donde en ella se pegan los primers usados.
Demostrar la complementaridad y la secuencia comprendida en la amplificación.
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