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Germán Bou
Microbiología
Complejo Hospitalario Universitario La Coruña
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1900 1950 1975 2000 2010
Culture-based Methods
Nucleic acid amplification technologies Serological
technologies
Proteomic-based Methods
¿¿¿¿???????
Los métodos tradicionales de identificación fenotípica bacteriana se basan en las características “observables” de las bacterias como su morfología, desarrollo, propiedades bioquímicas y metabólicas cuando estas crecen en cultivos
Φαίνειν “Mostrar” “Tipo”
“Conjunto de rasgos de un organismo”
Métodos Fenotípicos
Time from onset of septic shock to effective antibiotic initiation (hrs)
Inadequate initial therapy is associated with higher mortality in severe infections
• Métodos Fenotípicos
• Métodos Moleculares
• Métodos basados en Proteómica
• Métodos Fenotípicos
• Métodos Moleculares
• Métodos basados en Proteómica
» Pruebas iniciales: Morfología en tinción de Gram, crecimiento en función de la atmósfera de incubación, crecimiento en función de específicos medios de cultivo.
» Determinación del género. Pruebas primarias, con las cuales se puede determinar el género, grupo de géneros o en algún caso familia a la que pertenece un aislamiento. Las pruebas primarias son: Gram, morfología, catalasa, oxidasa, OF, esporas, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis y movilidad
Métodos Fenotípicos
» Por último, la conclusión debe hacerse con la identificación a nivel de especie. El empleo de ciertas pruebas bioquímicas permite identificar con un alto grado de precisión la mayoría de las cepas clínicamente significativas
Métodos Fenotípicos
Métodos Fenotípicos
Métodos Fenotípicos
Métodos Fenotípicos
PRUEBAS NEGATIVAS
PRUEBAS POSITIVAS
Métodos Fenotípicos
Métodos Fenotípicos
Métodos Fenotípicos
Métodos Fenotípicos
Métodos Fenotípicos
DNA Genes
mRNA (transcripto)
Proteínas
Metabolitos
Genoma
Transcriptoma
Proteoma
Metaboloma
FENOTIPO
Splicing alternativo
Interacciones proteína-proteína
Modificaciones Post-traducción
EXP
RESIO
N TEM
PO
RA
L
Métodos fenotípicos: Problemas » La identificación más probable y no definitiva, debido a la ausencia de
concordancia entre las características morfológicas y/o fenotípicas del aislamiento en cuestión y las correspondientes a la(s) cepa(s) de la especie tipo
» No todas las cepas de una misma especie muestran una característica específica
» Una misma cepa puede generar diferentes resultados en ensayos repetidos
» Las limitaciones en la base de datos de bacterias correspondiente
»MUY LENTOSSSSSSS
• Métodos Fenotípicos
• Métodos Moleculares
• Métodos basados en Proteómica
Métodos Moleculares
Con el objetivo de identificar el agente etiológico responsable del proceso infeccioso, para conocer las implicaciones patogénicas/patológicas, evolución clínica y aplicar una terapia antimicrobiana efectiva, un pilar fundamental en la práctica de la microbiología clínica lo constituye la asignación de especie a un aislamiento microbiano
Métodos basados en la amplificación de ácidos nucleicos
Secuenciación Espectroscopía basada en Electrospray ionización TOF
PLEX-ID (antiguo T5000)
Detección Molecular
Diagnóstico molecular no es sinónimo de rapidez
Rep-PCR diversilab Horas
DNA sequencing Horas-Días
454 Sequencing Días
Molecular detection
Day 4 Day 3 Day 2 Day 1
readjustment
Gram Species Blood Culture
2-3 days
Resistance
culture
Gram, Species, Resistance (VRE & MRSA & BLEE )
6 h
PCR PCR
readjustment
readjustment
+ culture
readjustment
readjustment
Reference Sample nº
BC+/SF+ BC+/SF- BC-/SF+
JCM. 2009. 47:2405 784 73 (61%) 27 (23%) 18 (15%)
JCM. 2005. 57: 601 103 20 (19%) 1 (1%) 14 (13%)
BMC Infect. Dis. 2009. 9: 126
101 14 (13%) 9 (9%) 14 (13%)
CMI. 2009. 15: 544 359 58 (10%) 16 (3%) 77 (14%)
Shock. 2010.34:27 144 30 (21%) 13 (9%) 10 (7%)
Molecular Diagnosis of Sepsis
Septifast MagicPlex Vyoo/ Looxster
Filmarray Verigene
Procedure RT-PCR (blood)
RT-PCR (blood)
Multiplex PCR+microarray
(blood)
RT-PCR (positive
BC)
Microarray+ signal
amplification (positive BC)
Microorganisms (N)
25 91 41 24 3 pannels (30)
Resistance markers
VanA/B mecA
VanA/B mecA
VanA/B, mecA, CTX-M-15, SHV
VanA/B mecA, KPC
VanA/B, mecA,+ 5
carbapenemases
Complexity Yes Yes Yes No No
Integrated system No No No Yes Yes
Turnaround time (h)
6 4-5 7 1 2.5
Verigene
PNA (Peptide Nucleic Acid) Probes
• Métodos Fenotípicos
• Métodos Moleculares
• Métodos basados en Proteómica
Maldi-TOF Bruker VITEK-MS BioMerieux
MALDI BIOTYPER
La identificación microbiana del siglo XXI
El diagnóstico rápido conduce a la detección u orientación del agente etiológico, ayudando al correcto tratamiento, mejorando el pronóstico del paciente, reduciendo la estancia hospitalaria y es la base para el establecimiento de medidas preventivas y coste-efectivas.
LA IMPORTANCIA DE UNA RESPUESTA RÁPIDA
4 a 72 HORAS
● Basados en propiedades morfológicas, fisiológicas y bioquímicas (tinciones, cultivos, pruebas bioquímicas, pruebas serológicas)
● Miniaturización y automatización en placas de microdilución ● Técnicas de biología molecular
MÉTODOS CONVENCIONALES DE IDENTIFICACIÓN Y SENSIBILIDAD
Bacterias
► Grampositivos
► Gramnegativos
► Anaerobios
► Exigentes
► Micobacterias
Levaduras
Hongos filamentosos
• Sin pruebas preliminares ni conocimiento presuntivo del microorganismo
• Misma base de datos y mismo procedimento para la identificación de distintos grupos de microorganismos:
IDENTIFICACIÓN POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI -TOF
RESULTADOS EN MINUTOS
Reproducibilidad
Medida de proteínas abundantes (ribosomales )
Espectrometría de masas. Técnica analítica que permite analizar con gran precisión la composición de diferentes elementos químicos, separándolos en función de su relación masa/carga (m/z).
En el espectrómetro de masas se produce la separación de las especies iónicas de la muestra, en función de su masa.
El espectro de masas de cada compuesto se denomina “huella química” y es una representación gráfica de los fragmentos obtenidos, por orden creciente de masa frente a su abundancia relativa.
Dado que la mayoría de los iones formados poseen una sola carga, la relación “m/z” es equivalente a “m”. masa/carga
inte
nsi
dad
BASE DE LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Fuente de ionización. Es el elemento del espectrómetro que ioniza el material que va ser analizado.
Ionización. Proceso físico o químico mediante el cual se producen iones (átomo o molécula cargada eléctricamente debido al exceso o falta de electrones)
Detector. Los iones que llegan al detector producen una señal eléctrica que es procesada, ampliada y enviada a un ordenador. El registro obtenido es el Espectro de masas.
Analizador de masa. Utiliza un campo eléctrico o magnético para acelerar los iones y separarlos en función de su relación masa/carga (m/z).
ESPECTRÓMETRO DE MASAS - COMPONENTES
Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight
Un ácido orgánico (denominado Matriz) colabora en el proceso al “amortiguar” la energía que recibe la muestra y facilitar la cesión de iones a la muestra.
La muestra es sometida un “bombardeo” láser que provoca su Desorción (paso de fase sólida a fase gaseosa).
Técnica basada en la Ionización de biomoléculas que son separadas en función de su masa formando un perfil específico.
Láser + Matriz: Energía para este fenómeno con poco calentamiento de la muestra: proteínas intactas pasan a fase gaseosa sin casi descomposición.
MALDI-TOF
MALDI-TOF
En el detector se genera el perfil o huella química
específico de esa muestra.
La muestra ionizada y vaporizada crea una densa nube de gas entre dos electrodos. El campo eléctrico formado se emplea para acelerar la muestra hasta el detector.
Perfiles de diferentes especies de Bacillus
-6000
-4000
-2000
0
2000
4000
6000
a.i.
B. globigii
B. licheniformis
B. subtilis
B. thuringiensis
Selección de la colonia
Transferencia a la tarjeta
Comparación del perfil con la base de datos
Especie identificada
Microorganismo desconocido
Generación del perfil o huella molecular
FLUJO DE TRABAJO MALDI Biotyper
1
2
3
4
Base datos microorganismos
Resultado identificación
Comparación de Perfil
Espectro principal
PROCESO DE COMPARACIÓN AUTOMÁTICO
● Resultado en menos de 30 minutos.
● MALDI Sepsityper: protocolo en 1 único microtubo
● A partir de 1 ml de hemocultivo
MALDI SEPSITYPER
Terapia empírica dirigida en pacientes críticos
Vlek, A. et al. PLoS ONE 2012 7(3)
IDENTIFICACIÓN DESDE HEMOCULTIVO
COMBINACIÓN CON ANTIBIOGRAMA DIRECTO
Incorporación de una estrategia de identificación temprana en hemocultivos.
● Identificación rápida permite una terapia apropiada de forma temprana ● Reducción en el desarrollo de resistencias ● Disminución efectos secundarios
Mejor pronóstico del paciente Reducción tiempo estancia hospitalaria
Coste total de hospitalización por paciente se redujo, de
media, en 19.547 $ (introducción de MALDI
Biotyper).
Perez, K et al. Arch Pathol Lab Med 2012
IMPACTO DE LA IDENTIFICACIÓN TEMPRANA
Identificación de MICOBACTERIAS desde ► Medio sólido ► Médio líquido ► Medio líquido en sistemas automáticos (MGIT)
Ventajas frente a técnicas de biología molecular (PCR) ► Rápidez (30 min vs 90-120 min) ► Coste-efectivo
MICOBACTERIAS
Gran mejora frente a métodos tradicionales
HONGOS FILAMENTOSOS
Ensayo funcional detección actividad antimicrobiana
Microorganismo portador enzima degrada antibiótico
Modificación sufrida por antibiótico detectada en MALDI Biotyper
NO SOLO IDENTIFICACIÓN
Microorganismo portador enzima degrada antibiótico
Modificación sufrida por antibiótico detectada en MALDI Biotyper
Ensayo funcional detección actividad antimicrobiana
NO SOLO IDENTIFICACIÓN
Proteomic detection
Oviaño M et al. Unpublished
Diversos estudios demuestran que MALDI-TOF es una herramienta relevante para la detección de resistencia a antibióticos y abre nuevos caminos en el entorno clínico
MALDI-TOF con aplicaciones para:
(1) detección de modificación de antibióticos por enzimas (2) detección de mecanismos de resistencia a través de estudios proteómicos de bacterias multiresistentes (3) análisis de la modificación de sitios diana, como la metilación ribosomal (4) estudio de mecanismos de expulsión de antibióticos por la cuantificación de los mismos.
Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization–Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry for Detection of Antibiotic Resistance Mechanisms: from Research to Routine Diagnosis - Hrabák, J. et al Clin. Microbiol. Rev. January 2013 vol. 26 no. 1 103-114
NO SOLO IDENTIFICACIÓN
Maldi MSP_sm
100
9080
A...
A...
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Aspergillus niger D_16_256_7_3 LLH
Aspergillus niger e7158 LLH
Aspergillus niger 2008_146035 MUZ
Aspergillus niger DSM 737 DSM
Aspergillus niger 01 MPA_1261 MPA
Aspergillus niger DSM 22593 DSM
Aspergillus niger M10 RLH
Aspergillus niger M14 RLH
Aspergillus niger Asp_Nr_2 UGB
Aspergillus niger M16 RLH
Aspergillus niger DSM 11167 DSM
Aspergillus niger DSM 12634 DSM
Aspergillus ochraceus DSM 63304 DSM
Aspergillus ochraceus DSM 2499 DSM
Aspergillus ochraceus F48 LLH
Aspergillus ochraceus DSM 824 DSM
Aspergillus candidus_BB MPA 1330 MPA
Aspergillus candidus_BB MPA 1339 MPA
Aspergillus candidus_BB F45 LLH
Aspergillus fumigatus 2008_136063 MUZ
Aspergillus fumigatus 2008_136033 MUZ
Aspergillus fumigatus M02 RLH
Aspergillus fumigatus F42 LLH
Aspergillus fumigatus ea1457 LLH
Aspergillus fumigatus DSM 15966 DSM
Aspergillus fumigatus D_16_256_4_6 LLH
Aspergillus fumigatus MPA 1342 MPA
Aspergillus fumigatus D_16_256_7_4 LLH
Aspergillus fumigatus e7499 LLH
Aspergillus fumigatus M03 RLH
Aspergillus fumigatus DSM 21023 DSM
Aspergillus clavatus_DD F44 LLH
Aspergillus flavus_CC1 M08 RLH
Aspergillus flavus_CC1 M09 RLH
Aspergillus flavus_CC1 M07 RLH
Aspergillus flavus_CC1 M19 RLH
Aspergillus flavus_CC1 MPA 1327 MPA
Aspergillus flavus_CC1 2008_146044 MUZ
Aspergillus oryzae_CC1 DSM 1863 DSM
Aspergillus oryzae_CC1 DSM 1147 DSM
Aspergillus oryzae_CC1 DSM 1862 DSM
Aspergillus oryzae_CC1 DSM 1861 DSM
Aspergillus flavus_CC1 DSM 62065 DSM
Aspergillus glaucus_DD 2009_305262 MUZ
Acremonium strictum_DD DSM 15965 DSM
Arthrinium phaeospermum_DD MPA_1268 MPA
Alternaria alternata DSM 62006 DSM
Alternaria alternata DSM 12633 DSM
Alternaria alternata DSM 62010 DSM
Alternaria alternata DSM 1102 DSM
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Posibilidad de realizar estudios epidemiológicos que facilitan el control de infecciones y el correcto manejo de las mismas.
Análisis de relaciones taxonómicas mediante dendogramas de sencilla generación.
La mayoría de proteínas estudiadas son proteínas ribosomales, lo que garantiza una capacidad de discriminación inter e intra-especie comparable a secuenciación DNA.
EPIDEMIOLOGÍA
Número de artículos
PUBLICACIONES IDENTIFICACIÓN POR MALDI- TOF MS
INCORPORACIÓN MALDI-TOF EN RUTINA DE IDENTIFICACIÓN
INCORPORACIÓN DE MALDI Biotyper
● Resultados muy rápidos; disminución del tiempo de respuesta entre 24-72 horas
● Resultados comparables con técnicas de secuenciación, que añaden valor clínico a la respuesta del laboratorio (UCI, hematología, oncología, pacientes crónicos, fibrosis quística, microorganismos emergentes)
● Reorganización de flujos y protocolos de trabajo. Eliminación de pruebas preliminares, menos repeticiones y subcultivos, sustitución de técnicas convencionales y de biología molecular
● Fácil implementación en el laboratorio. No precisa personal con experiencia previa en espectrometría de masas. Sin requerimiento especiales de instalación
● Gestión del antibiograma de forma más eficiente. Antibiograma dirigido en función de la identificación obtenida
MALDI Biotyper. IMPACTO EN EL LABORATORIO
● No modifica la Cartera de Servicios
● Resultado “inmediato”. Disponible dentro de la jornada laboral
● La sencillez de la técnica permite su realización en formato “24/7“
● Reducción gasto farmaceútico (tratamientos empíricos dirigidos, desescalado, correcta cobertura)
● En estudio de sepsis, permite identificar desde el hemocultivo positivo y preparar simultáneamente el antibiograma directo
● Reducción días de estancia
● Manejo infección nosocomial y de resistencias
● Optimización de stocks y gestión de residuos
MALDI Biotyper. IMPACTO EN LA GESTIÓN HOSPITALARIA
REDUCCIÓN DEL TIEMPO DE RESPUESTA EN LA IDENTIFICACIÓN MICROBIANA: IMPLANTACIÓN DE LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI-TOF EN EL SERVICIO
DE MICROBIOLOGÍA
COMPLEJO HOSPITALARIO UNIVERSITARIO A CORUÑA
“… drástico acortamiento de los tiempos diagnósticos de respuesta […] y con un importante ahorro económico en el hospital por el ahorro de terapias antibióticas empíricas.”
“… el gasto diario de antibióticos de amplio espectro que se administran empíricamente a la espera de un resultado microbiológico definitivo se sitúa en muchos casos entre 60 – 115 euros/día/paciente.”
“El coste del tratamiento dirigido una vez conocido el agente infeccioso causal podría reducirse en algunos casos a 3 – 5 euros/paciente/día.”
CONCLUSIONES
● Diseño ergonómico. Equipo de sobremesa que no precisa adecuación en el área de instalación
● Tecnología WhisperMode ™: Funcionamiento silencioso en la zona de trabajo
● Tecnología FlashDetector ™. Excelente sensibilidad comparable a los grandes equipos usados en investigación
● Tecnología “Full Spectrum Resolution”. Evita el empleo de tubos de vuelo innecesariamente largos
● SmartSpectra™ Acquisition: Mayor rápidez de análisis. Mayor vida útil de la fuente del láser. Menor número de “disparos” por muestra.
● Fuente Auto-Limpiable. Prolonga la vida media del láser y alarga las intervenciones preventivas.
● Rápida inserción de la tarjeta
MALDI Biotyper. Sistema compacto con un excelente rendimiento
Bruker - Microflex LT
Shimadzu - Axima
0.0
0.5
1.0
1.5
4 x10
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
4 x10
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
4 x10
3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 m/z
Microflex LT
Ultraflex II
Autoflex II
Aspergillus flavus
MALDI Biotyper. Sistema compacto con un excelente rendimiento
Resultados independientes del tamaño del instrumento
● Acelera de forma significativa la identificación de microorganismos en los laboratorios de rutina. ● Mejora la calidad de los resultados de identificación.
● Reduce la carga de trabajo y la utilización de consumibles.
● Las nuevas aplicaciones irán mejorando su utilidad en el laboratorio de Microbiología.
MALDI Biotyper
Others…
o Non-invasive test o Handheld portable devices o Inmediate results o Detection of selective breath
volatile organic compounds
Others…
VIDEO
Mutters et al. Annals of Laboratory Medicine. 2014; 34: 111-117
» Métodos fenotípicos siguen siendo válidos aunque adolecen de lentitud
» Métodos moleculares y los nuevos sistemas basados en proteómica pueden
ayudar a una perfecta identificación de los microorganismos
» La mayoría de los laboratorios siguen usando los métodos fenotípicos. De manera creciente y progresiva los laboratorios de microbiología van incorporando esta nueva tecnología, lo cuál supone una oportunidad para el diagnóstico microbiológico
» Hasta que no esté perfectamente establecida y consolidada es necesaria una comunicación entre los servicios clínicos y el laboratorio de microbiología para clarificar el significado clínico de los aislamientos para evitar cualquier tipo de confusión
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