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Hepatitis C
Biología Molecular
Su utilidad en el diagnóstico,
pronóstico y tratamiento
diego.arrigo@hospitalitaliano.org.ar
Según estudio del CDC en el 2013 la hepatitis C
produjo más muertes en EEUU que la combinación de
60 enfermedades infecciosas incluyendo HIV, TBC y
neumococo
El número de muertes por HCC crecen más
rápidamente que por cualquier otro tipo de cáncer
Es una enfermedad viral contagiosa que afecta el hígado, que puede
causar hepatitis tanto aguda como crónica.
La evolución natural de la enfermedad es el desarrollo de cirrosis y el riesgo
de desarrollo de hepatocarcinoma.
Se trata de la primera causa de trasplante y de muerte de origen hepático
El diagnóstico inicial se realiza mediante la detección de anticuerpos anti-
VHC y se confirma demostrando la replicación viral por métodos moleculares.
La indicación de tratamiento se establece tras la evaluación del grado de
fibrosis y el genotipo de VHC que ha infectado al paciente.
Los antivírales actuales pueden curar más del 90% de los casos de
infección por el VHC, lo que reduce el riesgo de muerte por cáncer de hígado
y cirrosis, pero el acceso al diagnóstico y el tratamiento es limitado
Hepatitis C ¿Qué Sabemos?
Epidemiologia
Historia natural de la Hepatitis C
Infección aguda
Recuperación
espontánea
15%-30%
Infección
crónica
70% - 85 %
Estable
70%-85% Cirrosis Hepática
15%-30%
20 años
Cirrosis descompensada 6% x año
Carcinoma
hepatocelular 4% x año
Transplante o
muerte 3 % x
año
El 75% de las
infecciones agudas
son asintomáticas
El 25% ictericia y
aumento de las
transaminasas
71.000.000 casos
en el mundo
Muertes: 399.000
al año en el mundo
Valores normales /
levemente elevados
de AST-ALTs
Valores
persistentemente
elevados de
enzimas
hepáticas
¡Muy difícil la detección temprana! Cuando persite por
mas de seis meses
Se cree que tanto factores virales como del hospedador
contribuyen a la incapacidad del sistema inmune para
resolver la infección inicial conduciendo a una infección
crónica
Algoritmo diagnóstico recomendado (consenso
2013) para identificación activa de HCV
Detección
ac anti HCV
No Reactivo
-
No se detecta ac anti-HCV
Fin *
Reactivo
ARN
HCV
Infección activa por
HCV
No tiene infección
activa por VHC
Pruebas adicionales
apropiadas **
Detectable
No
detectable
Tratamiento
-
Fuente: CDC. Testing for HCV infection: An update of guidance for clinicians and laboratorians. MMWR 2013;62(18
Quedará a criterio médico detenerse aquí si no se sospecha de:
a) Infección aguda (exposición dentro de los últimos 6 meses)
b) Inmunosupresión severa
De lo contrario: RNA HCV (a) (b) o seguimiento para la
detección de anticuerpos anti-HCV (a).
En todos los casos evaluar elevación de ALT.
SOLO indica probable
infección con el VHC.
• Infección Resuelta
• Infección Aguda o Crónica
- Con replicación (activa)
- Sin replicación (Intermitencia)
• Falso positivo biológico
Diagnóstico de Hepatitis C
Ac anti-HCV
RNA HCV No tiene infección activa
por Hepatitis C
Uso de un segundo ensayo de detección de ac anti HCV
diferente al usado inicialmente o LIA
+
-
- Falso positivos Biológico
+
a) Infección pasada con resolución espontánea
b) Falso “No detectable” del RNA HCV.
c) Infección crónica con disminución transitoria
del nivel de viremia (Intermitencia)
Si se sospecha de b) o c)
justificaría la repetición de un
RNA HCV
- FP
+ Falso N/D o
Intermitencia
RNA
Algoritmo Consenso Hepatitis C 2013
Secuencia recomendada para identificación activa de HCV
Detección
ac anti HCV
No Reactivo
-
No se detecta ac anti-HCV
Fin *
Reactivo
ARN
HCV
Infección activa por
HCV
No tiene infección
activa por VHC
Pruebas adicionales
apropiadas **
Detectable
No
detectable
Tratamiento
-
Fuente: CDC. Testing for HCV infection: An update of guidance for clinicians and laboratorians. MMWR 2013;62(18
Confirmación de infección por HCV
Ac anti HCV(+) RNA-HCV
Cualitativa Detectable RNA-HCV
Cuantitativa
Ac anti HCV(+) RNA-HCV
Cuantitativa
Opción 2
Opción 1
Decisión de tratamiento
Ac anti-HCV
RNA HCV
+
+
Caso confirmado de
Infección activa por VHC
Diagnóstico de la hepatitis C
Métodos serológicos y de Biología molecular
Detección de Anticuerpos Anti - HCV (EIA-CMIA)
Detección de Anticuerpos Anti – HCV (LIA)
Detección de HVC-Ag del core o Ag-Ac
Detección cualitativa de HCV-RNA
Cuantificación de la viremia HCV-RNA (carga viral)
Determinación del genotipo HCV
Serológicos
Moleculares
Patrón serológico durante la infección
por VHC
Patrón serológico de Infección
aguda con resolución
espontánea
Patrón serológico de Infección
aguda con progresión a la
infección crónica
Métodos moleculares
Para determinar infección activa por VHC
Permiten una detección tanto cualitativa como
cuantitativa del ARN-VHC circulante en suero o plasma.
El ARN-VHC es detectable entre la 1° y 2° semana después de la
infección (aproximadamente 1 mes antes de la detección de anticuerpos)
Ensayos Moleculares (cualitativos)
Aplicaciones de su detección
Diagnóstico de la infección en pacientes con serología positiva (replicación)
Diagnóstico de hepatitis C aguda durante el período de ventana
Detectar la infección en pacientes inmunodeficientes, inmunosuprimidos
o hemodializados (con serología negativa)
Tamizaje en donantes de sangre
Detectar la infección en recién nacidos de madres infectadas
Ref: Virología Medica. Cap 24.5 Carballal -Oubiña
Métodos Cualitativos
Informe de resultado:
Método: Especificar ensayo y marca comercial
Límite mínimo de detección del ensayo (LmDE)=Expresión en UI/ ml
Resultado
Detectable / No Detectable
Para la sensibilidad de esa técnica “no
detecta virus circulando”
Por eso es importante conocer el limite
de detección del ensayo
La detección de ARN viral indica que el
virus se está multiplicando activamente
(replicación viral).
Técnica
Estos ensayos están basados en la amplificación de la secuencia blanco
mediante:
RT-PCR (Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa reversa
equipos comerciales o no comerciales
TMA (Amplificaciòn mediada por transcripción) Equipos comerciales
Herramienta multidiagnóstico Monitorea y Predice la respuesta al tratamiento: cuanto más baja sea la
carga viral antes de la terapia, hay más posibilidades que funcione.
El nivel de carga viral no guarda relación con el grado de lesión hepática
y no permite inferir el estadio de la enfermedad hepática.
Ensayos moleculares
Cuantitativos (Carga viral)
La RT-PCR en tiempo real es la técnica mas usada para detectar y
cuantificar el ARN-VHC en la práctica clínica
1. Confirma una infección aguda por VHC
2. Verificar el diagnóstico de infección vertical
3. Confirma una hepatitis crónica C
4. Confirma la infección en pacientes con una alteración de la inmunidad
humoral
Con el aumento de la sensibilidad y al
descender los costos
Existen en el mercado diversas alternativas comerciales que permiten
estudiar la cantidad de virus circulante:
Carga Viral VHC
Segunda consideración :
Los métodos comerciales tienen diferentes:
- Límites de sensibilidad y diferentes rangos de detección.
- Diferentes sistemas de detección
- Distintas unidades de medida
La OMS ha establecido un estándar
internacional expresado en UI/ml
para poder intercronvertir los
resultados obtenidos por diferentes
equipos comerciales
Es recomendación medir la carga viral durante el tratamiento con
el mismo método y si se puede en el mismo laboratorio
- UI/mL
- Copias/mL (factor de conv.)
Primera consideración
Existe variabilidad en los resultados entre las
diferentes técnicas
- Amplifican el genoma
- Amplifican señales
Carga viral
Método: Especificar ensayo y marca comercial
Rango dinámico del ensayo :
LmCE (límite mínimo de cuantificación)
- Concentración mas baja de HCV RNA detectable y cuantificable
LMCE (límite máximo de cuantificación)
- Concentración mas alta de HCV RNA detectable y cuantificable
Límite de detección del ensayo (LmDE)=Expresión en UI/ Ml
- Mínima concentración de HCV RNA detectable
Resultado :
No Detectable / Detectable no cuantificable/ Detectable
Valor Hallado: Resultado expresado en UI/ml y Log. (Solo en resultados
detectables)
Informe de resultado:
LmCE > o = LmDE
Ejemplo LmCE : 25 UI/mL y LmDE : 10 UI/mL
Resultado del paciente : 20 UI/mL Detectable no cuantificable
- “No detectable”: Indica que no se detecta la presencia del virus
- Detectable <25 : Indica que la carga viral del paciente está por debajo del LmCE y
NO indica que el paciente NO esté infectado
- >100.000.000 indica que la carga viral del paciente excede el LMCE del ensayo
Ensayos cuantitativos comerciales
disponibles
Genotipificación: Utilidad en el
tratamiento
Debido a la diversidad y la alta
variabilidad genómica del HCV ,
desde su descubrimiento se han
identificado 6 genotipos
principales
Diversidad, variabilidad genómica del VHC
Genotipos que se
tratan son 6 Mas de 70
subtipos
Distribución global de genotipos de VHC
Los genotipos y subtipos del HCV se distribuyen de forma
diferente en diferentes partes del mundo, y algunos predominan en
ciertas áreas
Prevalencia
Ref: Virología Medica. Cap 24.5
Carballal -Oubiña
Genotipificación:
En pacientes que serán evaluados para terapia antiviral.
Por esto es imprescindible realizarlo antes de iniciar el tratamiento
Define la dosis y duración de la terapia antiviral, así como la
probabilidad de respuesta al tratamiento
Métodos de Genotipificación
• RT-PCR + Secuenciación nucleotídica directa: Gold-
standard
• RT-PCR +Hibridación inversa (INNO-LIPA)
• RT-PCR + endonucleasas (RFLP)
Extracción del RNA
|
Trascripción Reversa de región de RNA
|
Amplificación del cDNA con PCR región NS5b
(Termociclador)
I
PCR para obtener producto a secuencia
|
Secuenciación de los productos y análisis para determinar
genotipo de HCV
|
Informe de Resultados
Estrategia para el Análisis Estrategia para el análisis (secuenciación)
Sangre
entera con
EDTA,
solo la
fracción
plasma
PREPARACION DEL ADN MOLDE A
SECUENCIAR
PCR asimétrica (Método de Sanger)
marcados con diferentes fluoróforos Comparación a través de la
Herramienta BLAST de la
secuencia obtenida con
secuencias del HCV
caracterizados y disponibles
en bases de datos
El informe debe contener el método
utilizado, el genotipo y el subtipo
detectado acorde a la nomenclatura
internacional.
GenoHCV - HIBA 2013 (n=367)
INNO-LIPA: Principio de hibridación inversa.
Basado en la amplificación mediante RT-PCR seguida de una Hibridación
inversa
Genotipificación (consideraciones)
Se justifica una nueva investigación del genotipo HCV, cuando entre el
primer estudio y el comienzo del tratamiento, se produjo o se sospecha
una nueva exposición al virus C
Historicamente los Genotipos 1 y 4 tienen menos respuesta al tto que
genotipos 2 y 3
70-80% rta de Genos 2 y 3 vs 40-50% Genos 1 y 4 a largo plazo
Cambia con los AAD
Una vez realizado el diagnóstico Hepatitis C crónica Evaluar el grado de
daño hepático (fibrosis o cirrosis)
Biopsia hepática (método de referencia)
Pruebas no invasivas (Fibroscan).
Grado de daño hepático + Genotipo =
Orientan a las decisiones terapéuticas y la conducta clínica
OMS
? ..y la carga viral?
El nivel de carga viral HCV en sangre no muestra relación con el grado de
lesión hepática
Biopsia Hepática: Rol
Biopsia hepática método invasivo con baja complicaciones (0.6% -5%) .
Discrimina entre los distintos tipos de fibrosis y el grado de actividad
inflamatoria. Estadíos de F0 a F4. Umbral para iniciar tratamiento F2
Rol de los métodos no invasivos
La utilización del Fibroscan permite la evaluación no invasiva de la
Fibrosis Hepática mediante Elastografía
Su ventaja es la alta reproducibilidad inter e intra operador y es órgano
específico.
La Elastografía consiste en la estimación de la rigidez del tejido hepático
a una profundidad por debajo de la piel entre 25 a 65 mm, midiendo la
velocidad de propagación de una onda de deformación elástica dentro del
tejido.
Cuanto mayor sea la rigidez que presente el tejido, mayor será la
velocidad de propagación de la onda. La medición se realiza en sólo 10
minutos y el resultado se obtiene en el acto.
Elastografía por Fibroscan
Tratamiento
Candidatos: Todos los pacientes con hepatitis crónica por
HCV , naive o no respondedores a un tratamiento previo, que
quieran ser tratados (efectos adversos).
La tasa de curación depende de factores tales como la cepa
del virus, el grado de fibrosis y el tipo de tratamiento que se
dispensa.
Objetivo del tratamiento
Utilizar un método molecular sensible con un límite inferior de detección, de
15 UI/ml
El objetivo principal es erradicar la infección por el VHC
Cirrosis hepática
Hepatocarcinoma (HCC)
Manifestaciones extrahepáticas
Muerte
¡¡¿Que se puede prevenir?
Habrá una reducción
significativa de la
morbi-mortalidad
Van der Mer AJ et al – JAMA 2012
Objetivo: RVS: (Respuesta viral sostenida) es cuando el VHC es
No-detectable a las 12 semanas después de haberlo completado .
Drogas disponibles
2011 Antivirales de acción directa (AAD) emergieron como una nueva
promesa para acortar la terapia y reducir efectos secundarios y
complicaciones, consiguiendo algunos hasta mas del 90 % de curación
Históricamente, el VHC se trató con :
1991 - Interferón (IFN)
1998 - Ribavirina (RBV)
2002- IFN Pegilado (PEG IFN)
1991 2017
AAD: disponibles en la Argentina
Los AAD Diseñados para inhibir las proteínas virales
involucradas en el ciclo de replicación del HCV
Son mucho más eficaces y seguros, con menos efectos adversos y
mejor tolerados que los tratamientos antiguos, aunque mas caros.
Un único AAD no puede evitar por sí solo la replicación del VHC por
eso un tratamiento debe constar de dos AADs de diferente familia de
inhibidores como mínimo
Evolución del tratamiento Boceprevir –
Telapreviren G1
Sofosbuvir / simeprevir.
Sofosbuvir es el mejor inhibidor de la polimerasa. Actúa a nivel de la región NS5B del VHC.
Simeprevir es un inhibidor de la proteasa NS3/NS4 de primera generación con acción sobre los
genotipos 1, 2, 4, 5 y 6. Con este régimen se trata a pacientes con genotipos 1 y 4, durante 12
semanas y añadiendo ribavirina si existe cirrosis hepática.
Las pautas de tratamiento varían
principalmente en función de los genotipos del
VHC, de los tratamientos previos recibidos y
de la presencia o no de cirrosis
Tratamiento
El acceso al tratamiento del VHC está mejorando, pero sigue
siendo limitado
2015 71.000.000 (1%)
14.000.000 (20%) Diagnosticados
Inicio Tto. 2015 1.100.000 (7%)
550.000 (50%) Recibieron AAD
WHO Global Hepatitis Report 2017
Conclusiones Los métodos de detección cualitativos están prácticamente
en desuso (Por sensibilidad y costos)
Existen métodos que presentan limites de detección y
cuantificación diferentes.
Se recomienda a los laboratorios que realicen estos
ensayos que estén suscritos a programas de control de
calidad o que tengan acreditadas las técnicas moleculares
ante requisitos internacionales (CAP – ISO 15189)
Al inicio del tratamiento se debe disponer del genotipo y
subtipo viral, la carga viral y una evaluación del grado de
fibrosis.
Desafío Detectar a los pacientes no diagnosticados
Que todos los pacientes puedan acceder al tratamiento
¡Muchas gracias por su
atención!
diego.arrigo@hospitalitaliano.org.ar
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