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10/04/2019
1
Hidrocarburos poliaromáticos
Dra. Alicia G. Faletti
Profesora Adj. de Toxicología
Investigadora Ppal. del CONICET
CEFYBO-CONICET-Facultad de Medicina
Universidad de Buenos Aires
CEFYBO
CONICET
PRIMER CICLO DE CONFERENCIAS DE LA PRIMERA CÁTEDRA DE
TOXICOLOGÍA
PAHs no halogenados
Fenantreno
Antraceno
Naftaleno
Hidrocarburos poliaromáticos (PAHs)
PAHs no halogenados
PAHs halogenados
Dibenzo-p-dioxinas policlorados (dioxinas)
Bifenilos policlorados (PCBs)
Dibenzofuranos policlorados (PCDFs)
Bifenilos polibromados (PBBs)
Difeniléteres policlorados (PCDEs)
Difeniléteres polibromados (PBDEs)
PAHs halogenados
10/04/2019
2
PAHs no halogenadosBenzo[a]pireno(BaP)
9,10-Dimetilbenzoantraceno(DMBA)
H3C
H3C
3-Metilcolantreno(3MC)
H3C
Contaminantes ambientalesFuentes
PAHs no halogenados
Combustión incompleta de
Madera
Carbón
Motor de vehículos
Pirólisis de aminoácidos, lípidos o carbohidratos
Tabaco
Incienso
10/04/2019
3
PAHs
Mecanismo de acciónUnión del ligando
Ligando
Hsp90
Protein
quinasas
Fosforilación
proteica
Proliferación y
diferenciación
celular
Biotransformación
of xenobióticosAhRArnt
AhRmRNA
AhRArnt
GCGTGA
XRE
Ca2+
AhRHsp90
Hsp90XAP2
p23
XAP2
Traslocación
al núcleo
Heterodimerización
Unión al ADN
Fosforilación
Hsp90
Arnt
AhR = receptor de hidrocarburos aromáticos
XRE = elemento de respuesta al xenobiótico
Arnt = traslocador nuclear del receptor de hidrocarburos aromáticos
AhRR
AhRR
IARC: carcinógeno (promotor de tumores en distintos tejidos)
Disruptor endócrino
Toxicidad hepática
Alteraciones metabólicas: porfiria, diabetes, estrés oxidativo
Inducción enzimática (CYPs, GST)
Toxicidad reproductiva y del desarrollo
Alteraciones en el tracto gastrointestinal
Neurotoxicidad en niños
Inmunotoxicidad (infecciones, atrofia del timo, linfocitos T alterados
Toxicidad cutánea Cloracné
EfectosPAHs
(Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer)
Hipertrofia
Hiperplasia
Fibrosis
Inflamación
Acumulación de lípidos
10/04/2019
4
Respuestas adaptativas (biotransformación de xenobióticos)
Respuestas tóxicas
Organogénesis
Funciones hormonales
Rol del AhR
Genes blanco de acción de los AhR
Enzimas de biotransformación (Cyp1A1, Cyp1A2, Cyp1B1)
Enzimas de conjugación (UDP-G-transferasa, GST-S-transferasa)
Genes reguladoras del ciclo celular (p27, jun-B)
Genes reguladoras de la apoptosis (bax, bcl-2)
PAHs
Flavonoides
O
O
OFlavona
Compuestos
fenólicos
(5000)
Alimentos no energéticos
Naturales o sintéticos
Antioxidantes
Neutralizan radicales libres
Quelan Fe, Cu, Zn
O
O
OH
Flavonol
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5
Efecto carcinógeno
AhR
Arnt
XRE
AhR Arnt
TCDD
BaP
Señalización
extracelularProliferación
celular
Apoptosis
Ciclo celular
CYP1A1
CYP1A2
CYP1B1
Promotor a través de AhR
10/04/2019
6
Hidrocarburos poliaromáticos
y
Sistema reproductor masculino
Humo del cigarrillo
Fumadores
Volumen semen
Recuento espermático
Motilidad espermática
Viabilidad de las células germinales
Defectos estructurales células germinales
Tasa de fertilidad
Tasa de implantación
Niveles de ROS
Niveles de GSH, actividad de SOD
Aductos ADN en espermatozoides
10/04/2019
7
Benzo[a]pireno (BaP)
Xu y col. Plos One 2014
Benzo[a]pirenoBaP-7,8-diol-9,10-epoxido
OH
OH
OH
HN
N N
N
HN
O
ADN
O
HO
OH
CYP1A1
ADN
Aductos en
espermatozoides
0 50 200300 0 50 200300 0 50 200300 0 50 2003000
5
10
15
20
Es
pe
rma
toc
ito
Es
pe
rmá
tid
es
Es
pe
rma
tozo
ide
s
He
pa
toc
ito
s
[BaP] (mg/kg)
Fre
cu
en
cia
de
mu
tac
ion
es
7 días
25 días
60 días
Exposición aguda
Ctrl NF (80 mg/kg) 3MC 3MC + NF
3-Metilcolantreno
(3MC)
Control 0.1 10
15
3040
45
50
55
3MC (mg/kg)
**
***Pubertad p<0.001
p<0.01
Día
s
Control 0.1 10
5
10
15
3MC (mg/kg)
**
p<0.01
Recuento
Espermático
**
Célu
las (
x 1
07)/
ml
Control 0.1 10
20
40
60
80
100
3MC (mg/kg)
Motilidad
**
***
p<0.01p<0.001
Po
rce
nta
je
Control 0.1 10
20
40
60
80
100
Viabilidad
3MC (mg/kg)
*
***
p<0.05p<0.001
Esp
erm
ato
zo
ides
via
ble
s (
%)
Exposición repetitiva
Control
BaP (50 mg/kg)
Cabeza
anormal
Cola
enrollada
Jeng et al. Enrivor Toxicol 2013 Faletti et al. No publicado aún
10/04/2019
8
Anticuerpo
anti-BPDE
Benzo[a]pireno (BaP)
0,5 – 50 mg/kg/semana por 5 semanas
Exposición repetitiva
Revel et al. Reprod Toxicol 2001
Ctrl 0.5 1 3 5 10 30 500
30
60
90
120
[BaP] (mg/kg)
Es
pe
rma
tozo
ide
s x
10
6/m
l
Ctrl 0.5 1 3 5 10 30 500
5
10
15
20
25
30
35
[BaP] (mg/kg)
Cé
lua
s (
%)
P<0,0001 (correlación negativa)
Apoptóticas
Necróticas
Control BaP Bap+Res0
20
40
60
80
100
Po
rce
nta
je
BaPControl
BaP+Resver
0
1
2
3
BaP = 5 mg/kg
Resveratrol = 50 mg/kg
7,12-Dimetilbenz[a]antraceno
(DMBA)
in vivo: 20 mg/kg por 2 días
Raj et al. Mutat Res 1984
Espermatozoides
anormales
Control DMBA0
50
100
150
***
Nú
me
ro /
50
0 c
élu
las
Espermatozoides
con cabeza anormal
Control DMBA0
20
40
60
80
100
120
140***
Nú
me
ro /
50
0 c
élu
las
Síntesis de ADN
0 1 2 3 4 5 60
20
40
60
80
100
Control
BaP
DMBA
PAH (µM)
Célu
las
ge
rmin
ale
s (
%)
Espermatogénesis
Estadío V Estadío VIII0
1000
2000
3000
4000
5000
Control DMBA BaP
*** ***
***
**
33%
72%
21%
85%
Pro
lifera
ció
n c
elu
lar
In vitro
Georgellis et al. Mutat Res 1990
10/04/2019
9
Estadío II-III
Espermatogonias Espermatocitos Espermátides0
1
2
3
4
5
6
**
**
**
***
****
Cé
lula
s g
erm
ina
les
/
cé
lula
s d
e S
ert
oli
Estado VII
Espermatogonias Espermatocitos Espermátides0
1
2
3
4
5
6
7
** **
** *
Cé
lula
s g
erm
ina
les
/
cé
lula
s d
e S
ert
oli
Escape de motores diésel
Watanabe y Oonuki Environ Health Perspect 1999
Exposición diaria
Nacimiento 3 meses
6 h / día, 5 días/semana
FSH
LH
[E2]
[T]
Exposición crónica
Control E filtrado E total0
5
10
15
20
25
30
35
**
*
Es
pe
rma
tozo
ide
s x
10
6/
tes
tíc
ulo
Control E filtradoE total
Humo del cigarrillo
(10 mg/kg/day)
Total ProgresivaRápida Lenta Estática0123
20
30
40
50
60
70
* **
**
*
Mo
tili
da
d (
%)
Reacción acrosomal
Control CSC0
20
40
60
**
Po
rce
nta
je
Capacitación
-80
-60
-40
-20
0No capacitados Capacitados
*
Tasa de fertilización
Control CSC0
20
40
60
80
**
Po
rce
nta
je
Exposición diaria (40 días)
Esakky et al. Reprod Toxicol 2016 Control CSC
(CSC)
10/04/2019
10
Control CSC0
20
40
60
80
100
**
% T
úb
ulo
s(c
élu
las T
un
el
po
sit
ivo
)
Control CSC0
10
20
30
40
50
60
70
**
% T
úb
ulo
s(c
élu
las A
nexin
a p
osit
ivo
)
Esakky et al. Reprod Toxicol 2016
Humo del cigarrillo
(10 mg/kg/day)
Exposición diaria (40 días)(CSC)
Esakky et al. Reprod Toxicol. 2012
Presencia de Vacuolas
Pérdida células germinales
Células apoptóticas o
necróticas
Espermatozoides anormales
Espermatozoides no
liberados
Espermatozoides dañados
Humo del cigarrillo
2 mg/kg/día por 7 días
H&E Tunel
DM
SO
CS
CC
SC
(CSC)
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11
Esakky et al. Reprod Toxicol. 2012
Células
apoptóticas
Anti-BPDE FusiónTunel
Células con
aductos en el ADN
Control
Humo del cigarrillo
2 mg/kg/día por 7 días
Presencia del BaP
(CSC)
En resumen
Modelo animales
Células germinales anormales
Espermatogénesis
Apoptosis de células germinales
Frecuencia de mutaciones
Induce necrosis
Induce desbalance hormonal
Atrasa la pubertad
Proliferación celular
Motilidad espermática
Fertilidad
PAHs
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12
PAHs y
Sistema reproductor femenino
Humo del cigarrillo
Fumadores
Menopausia temprana
Pérdida de folículos inmaduros
Desarrollo folicular anormal
Inhibición de la maduración del oocito
Formación de ROS
Tasa de fertilización
Tasa de implantación
Tasa de embarazo en FIV
Contenido de GSH
Peroxidación lipídica
Alteraciones en el balance redox
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13
Oocito diploide
46 cromosomas en metafase II
Oocitos diploides
NF FP FM FI0
5
10
15
20
25
P = 0.0006
Po
rce
nta
jeTasa de fertilización
NF FP FM FI0
50
100
x2 = 9.32, P = 0.025Z = 2.635, P = 0.008
Po
rce
nta
je
Retraso en la maduración de
oocitos
Fallas probables en la meiosis
Zenzes et al. Hum Reprod 1995
Humo del cigarrillo
Humo del cigarrillo
Zenzes et al. 1998, 2000, 2004
No fumadora Fumadora Fumadora
pasiva
Aductos ADN en células
de granulosa
Altera el huso acromático
Altera la meiosis
Forma aductos ADN en oocitos
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14
Activiadad enzimática
de AHH ovárica
Control BaP 3MC DMBA0
5
10
15
20 ****
**
Ac
tiv
ida
d d
e A
HH
Oocitos/ovario
Control BaP 3MC DMBA0
1000
2000
3000
4000
5000
****** **
*
No d
e o
ocito
s
PAHs no halogenadosBenzo[a]pireno (BaP)
3-Metilcolantreno (3MC)
H3C
9,10-Dimetilbenzoantraceno
(DMBA)
Destrucción de los folículos
primordiales
Dosis aguda
(80 mg/kg)
DMBA 3MC BaP
Cepa D2
Cepa B6
Mattison et al. Toxicol Appl Pharmacol, 1980
H3C
H3C
0.001
0.01
0.1
1
10
100
1000
6.8
69
0.0030.0012
0.18
0.001
0.01
0.1
1
10
100
1000
0.045
0.009
0.45
6.8
69
0.001
0.01
0.1
1
10
100
1000
0.045
Ratón Rata
Primordiales
Primarios
Secundarios
DMBA
3MC
BaP
VCD
VCH
0.001
0.01
0.1
1
10
100
1000
0.45
8.6
0.001
0.01
0.1
1
10
100
1000
3.6 8.6
0.001
0.01
0.1
1
10
100
1000
3.6
0.004
0.45
Borman et al. Toxicol App Pharmacol, 2000
Menor dosis del tóxico que produce la pérdida del 50% de los folículos ováricos
ÍNDICE DE OVOTOXICIDAD PAHs
Dosis diarias
(15 días)
0.02 mg/kg
0.0075 mg/kg
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15
Α-Naftoflavona
(αNF)
7,8-Benzoflavona
O
O
Fo Fi PA FA0
10
20
30
***
***
**
Tipo de folículos
No d
e f
olícu
los/1
0 m
m2
Cuerpos luteos
Ctrl 0.1 1 10 800
3
6
9
12
15 *****
*
NF (mg/kg)
No d
e C
L/m
m2
Tasa ovulatoria
Ctrl 0.1 1 10 800
20
40
60
80
NF (mg/kg)
*
*** ***
**N
o d
e o
ocit
os/r
ata
Control
NF (80 mg/kg)
Estimula el desarrollo folicular
Estimula la tasa ovulatoria
Aumento de la reserva folicular????
Exposición diaria
(prepúber)
Barreiro et al, Toxicol Appl Pharmacol, 252: 11, 2011
Folículos primordiales Fo
Folículos primarios (Fi)
Folículos preantrales (PA)
3-Metilcolantreno
(3MC)
Rhon-Calderón et al, Toxicology, 353-354, 58, 2016
Exposición
diaria
(prepúber)
Folículos Primarios
Ctrl <0.1 0.1 1.00
100
200
300
400
500
3MC (mg/kg)
***** ***
*** P<0.01P<0.001P<0.001
No o
f fo
lícu
los/o
vari
o
Folículos Primordiales
Ctrl <0.1 0.1 1.00
2000
4000
6000
3MC (mg/kg)
*
******
**
***
P<0.01P<0.001
P<0.001
No o
f fo
lícu
los/o
vari
o
CtrolNF (80 mg/kg)
3MC
3MC+NF
10/04/2019
16
3-Metilcolantreno
(3MC)
Exposición diaria
(prepúber)
Rhon-Calderón et al, Toxicology, 353-354, 58, 2016
Folículos Antrales
Ctrl <0.1 0.1 1.00
10
20
30
3MC (mg/kg)
******
*
***P<0.001
P<0.001P<0.05
No o
f fo
lícu
los/o
vari
o
Ctrl NF (80 mg/kg) 3MC 3MC + NF
3-Metilcolantreno
(3MC)
Rhon-Calderón et al, Toxicology, 353-354, 58, 2016
Exposición diaria
(prepúber)
3MC 1 mg/kg
Ctrl
3MC+NF
Ctrl NF (80 mg/kg) 3MC 3MC + NF
Tasa ovulatoria
Ctrl <0.1 0.1 1.00
3
6
9
12
15
18
3MC (mg/kg)
*** ***
P<0.001P<0.05
No d
e o
ocit
os/r
ata
10/04/2019
17
3-Metilcolantreno (3MC)
Folículos antrales apoptóticosC
on
tro
l3M
C
(1 m
g/k
g)
3M
C +
N
F
CtrolNF (80 mg/kg)
3MC
3MC+NF
Exposición diaria
(prepúber)
Ctrl <0.1 0.1 1.00
2
4
6
8
3MC (mg/kg)
*
*** ***
P<0.001 P<0.001
P<0.05
No o
f F
olícu
os/c
am
po
Rhon Calderón et al. Enviado a Arch Toxicol 2019
Matikainen et al, Endocrinology, 143: 615, 2002
Efecto de DMBA sobre células germinales de ovario fetal
DMBA DMBA + ANF
células
germinales
apoptóticas
proteína Bax
células
germinales
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
Bax +/+ Bax -/-
Primordiales Pa Pre A
DMBA (1 mg/kg)
**
Tpo 0 C C+N V 0.01 0.1 10
50
100
150
200
250
DMBA (µM)
DMBA (0.1)+ ANF
******
***
p<0.01
nº
oo
cit
os
fe
tale
s
PAHs
Efecto in vitro
Efecto in vivo
N
Fo
lícu
los
no
atré
sic
os
/
ov
ario
10/04/2019
18
Integridad del oocito
Espacio perivitelino
Zona pelúcida
Exposición diaria
(prepúber)
3-Metilcolantreno (3MC)
Ctrl NF (80 mg/kg) 3MC 3MC + NF
Tamaño del oocito
Ctrl <0.1 0.1 1.00
5
10
15
20
3MC (mg/kg)
******
p<0.001p<0.001
Áre
a (
m2)
Zona pelúcida
Ctrl <0.1 0.1 1.00.0
0.5
1.0
1.5
2.0
3MC (mg/kg)
***** ***
p<0.001p<0.001p<0.01
An
ch
o (
m)
Espacio perivitelino
Ctrl <0.1 0.1 1.00.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3MC (mg/kg)
****** ***
p<0.001p<0.001p<0.01
An
ch
o (
m)
Rhon Calderón et al. Enviado a Arch Toxicol 2019
FusiónHoechst
33342
Ioduro de
propidio
Co
ntr
ol
3M
C 1
mg
/kg
Viabilidad
Ctrl <0.1 0.1 1.00
30
60
90
3MC (mg/kg)
***** ***
p<0.01p<0.001
p<0.001
Ocito
s v
iab
les (
%)
CtrolNF (80 mg/kg)
3MC
3MC+NF
Exposición diaria
(prepúber)
3-Metilcolantreno
(3MC)Viabilidad del oocito
Rhon Calderón et al. Enviado a Arch Toxicol 2019
10/04/2019
19
3-Metilcolantreno
(3MC)Segregación meiótica
Co
ntr
ol
3M
C
(1 m
g/k
g)
3M
C +
N
F
-Tubulina Hoechst 3342 Fusión
CtrolNF (80 mg/kg)
3MC
3MC+NF
Exposición diaria
(prepúber)
Ctrl <0.1 0.1 1.00
3060
80
90
100
* *** ***
p<0.001p<0.01
3MC (mg/kg)
Oo
cti
os
c/s
eg
reg
ac
ión
no
rma
l (%
)
Rhon Calderón et al. Enviado a Arch Toxicol 2019
Ctrl <0.1 0.1 1.00
5
10
15
20
25
3MC (mg/kg)
**
***
p<0.001
***
p<0.001
p<0.05
**
AD
N e
n la c
ola
(%
)
Daño al ADN
Oocito
Ctrl
3MC
(1 mg/kg)
3MC
+ αNFCtrl NF (80 mg/kg) 3MC 3MC + NF
Rhon-Calderón et al. Toxicology 2016
3-Metilcolantreno
10/04/2019
20
3MC
Interacción oocito
espermatozoideCiclo celular
Activación de los
folículos primordiales
Cdk2
Akt1
Dnajb6
Vía
Notch Dll1
Hes1
Jag1
Notch2
Desarrollo
Folicular
Igf2
Icam
Adamts1
Interacción
celular
Cyp1a1
Cyp1b1
Cd9
Expresión génica
Progresión
tumoralMetabolismo
de xenobióticos
Sp1Bax
Caspasa-9
Apoptosis
Rhon-Calderón et al. Arch Toxicol 2018
Modificación postraduccional
3MC
Ciclo celular
Activación de los
folículos primordiales
Cdk2
Dnajb6Vía
Notch
Jag1
Notch2
Desarrollo
Folicular
Igf2
Adamts1
Cyp1a1
Apoptosis
Metabolismo
de xenobióticos
H3K4Me3
Bax
Caspasa-9
Rhon-Calderón et al. Arch Toxicol 2018
10/04/2019
21
3MC
Ciclo celular
Activación de los
folículos primordiales
Cdk2
Akt1
Dnajb6
Vía
Notch
Jag1
Notch2
Desarrollo
Folicular
Igf2
Icam
Adamts1
Interacción
celular
Cyp1a1
Modificación postraduccional
Progresión
tumoral
Sp1
Caspasa-9
Apoptosis
Metabolismo
de xenobióticos
H3K9Ac
Rhon-Calderón et al. Arch Toxicol 2018
3-Metilcolantreno
Toxicidad sistémica
Rhon-Calderón et al. Toxicology 2016
Exposición diaria
(prepúber)
Ctrl <0.1 0.1 1.00
5
10
15
20
25
3MC (mg/kg)
***
***
p<0.001
p<0.001
Médula ósea
MN
/1000 r
eticu
locito
s
Ctrl <0.1 0.1 1.00
3
6
9
12
3MC (mg/kg)
***
p<0.001
***
p<0.001Médula ósea
AD
N e
n la c
ola
(%
)
CtrolNF (80 mg/kg)
3MC
3MC+NF
10/04/2019
22
3-Metilcolantreno
Exposición diaria
(prepúber)
Aberraciones cromosómicas
Cariotipo
control
Cariotipo
3MC
(1 mg/kg)CtrolNF (80 mg/kg)
3MC
3MC+NF
Ctrl <0.1 0.1 1.00
30
70
80
90
100
3MC (mg/kg)
***
p<0.001
***
p<0.001
Meta
fases n
orm
ale
s (
%)
Toxicidad sistémica
Rhon Calderón et al. Enviado a Arch Toxicol 2019
Fragmentos
Ctrl <0.1 0.1 1.00
2
4
6
8
3MC (mg/kg)
***
p<0.001 ***
p<0.001
Fra
gm
en
tos d
e
cro
mo
so
mas (
%)
Dicéntricos
Ctrl <0.1 0.1 1.00
2
4
6
8
10
12
3MC (mg/kg)
***
p<0.001
***
p<0.001
Cro
mo
so
mas
dic
én
tric
os (
%)
Ctrl NF (80 mg/kg) 3MC 3MC + NF
Aberraciones cromosómicas
3-Metilcolantreno
(3MC)
Rhon Calderón et al. Enviado a Arch Toxicol 2019
10/04/2019
23
Conclusiones3-Metilcolantreno(3MC)
H3C
Exposiciones
repetitivas
Diarias
(0,1-1,0 mg/kg)
3 vs/semana
(0,1 mg/kg)
Altera la expresión de genes involucrados en la función ovárica
Causa efecto sistémico No causa efecto sistémico
αNF previene el daño sistémico y gonadal
causado por 3MC
Destruye los folículos inmaduros y altera el desarrollo folicular
Afecta la integridad de los oocitos
En resumen
Modelo animales
Células germinales anormales
Destrucción folículos primordiales
Daño ADN en oocitos
Desarrollo folicular
Ovulación
Frecuencia de aductos de ADN
Aberraciones cromosómicas
Induce apoptosis
Induce desbalance hormonal
Altera regulación genética y epigenética
Atrasa la pubertad
Fertilidad
PAHs
10/04/2019
24
Conclusiones
Bajas dosis de exposición
repetitiva a PAHs causan
toxicidad gonadal sin
generar toxicidad sistémica
Facultad de Medicina
Universidad de Buenos Aires, Argentina
Dr. Eric A. Rhon Calderón
Lic. Rocío A. Galarza
M. Analía E. Cortez
Lic. María A. Meneghini
M.V. Marcela Marquez
Financiamiento:
PIP 112-201101-00799 (CONICET)
PICT 2015-0588 (FONCYT)
UBACYT 20020130100156BA (Universidad de Buenos Aires)
NIH 5R01HD084542-02 (National Institute of Health)
Muchas
gracias National Primate Research Center,
OHSU, Beaverton, Oregon, USA
Dr. Alejandro Lomniczi
Dr. Carlos A. Toro
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