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Histotecnología aplicada a
la Odontología
Dimitrius Leonardo Pitol PhD
FORP/USP
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XXIII CONGRESO ARGENTINO DE HISTOTECNOLOGÍA
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XXIII CONGRESO ARGENTINO DE HISTOTECNOLOGÍA
Yo trabajo en la Facultad de Odontología de Ribeirão Preto de la
Universidad de São Paulo.
Utilizamos la Histotecnología, como una herramienta de auxilio en la
enseñanza y en la investigación.
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Facultad de Odontología de Ribeirão PretoUniversidad de São Paulo
En nuestra facultad tenemos
programas de Posgrados de
Maestría y Doctorado:
Odontopediatria.
Rehabilitación Oral.
Odontología Restauradora.
Cirugía Buco-Maxilo facial.
Periodoncia.
Biología Oral.
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Con seis programas de posgrado, nuestra facultad se
destaca con producción científica de calidad.
La Histotecnología se torno una herramienta
indispensable en la mayoría de investigaciones
realizadas en nuestra facultad.
Facultad de Odontología de Ribeirão PretoUniversidad de São Paulo
XXIII CONGRESO ARGENTINO DE HISTOTECNOLOGÍA
Investigaciones con diferentes objetivos:
Probar sustancias capaces de inducir reparación ósea.
Probar sustancian que puedan combatir la progresión de la
osteoporosis.
Probar Biomateriales que puedan ser utilizados en Implantes
dentales.
Aplicación de terapia con laser.
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Facultad de Odontología de Ribeirão PretoUniversidad de São Paulo
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En esta charla abordaremos las técnicas utilizadas de
rutina en nuestra Facultad de Odontología.
Preparación de especímenes calcificados para estudios del
Esmalte dental.
Preparación de especímenes calcificados con dispositivos
médicos u odontológicos.
Preparación de especímenes descalcificados.
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Facultad de Odontología de Ribeirão PretoUniversidad de São Paulo
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Preparación histológica de Dientes
por Desgaste
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Para realizar cortes por desgaste
debemos incluir los dientes en resina
acrílica.
Resina Acrílica auto polimerizable.
De uso Odontológico
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Para la preparación de los bloques utilizamos un molde de silicona, en
el cual colocamos el diente más la resina.
Así obtenemos el diente listo para ser cortado.
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Preparación de cortes histológicos de
dientes por desgaste
Este es uno de los equipos que
tenemos en nuestro laboratorio, en el
cual podemos realizar los costes que
nos permiten analizar la estructura
inorgánica de los dientes.
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Observen que el tiene un disco
diamantado.
Las mangueras derraman
agua sobre el disco para su
refrigeración.
El bloque de resina queda
preso en el equipo y es
empujado hacia el disco con
ayuda de la manivela.
Este equipo fue diseñado por
nuestros técnicos con la
finalidad de reducir costos.
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Preparación de cortes histológicos de
dientes por desgaste
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Tenemos también este equipo con
un disco diamantado y
refrigeración de agua.
En los dos equipamentos
logramos cortes entre 100 y 120
micrómetros.
Lo ideal es obtener cortes con
menos de 80 micrómetros.
Preparación de cortes histológicos de
dientes por desgaste
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Acabado de los cortes de dientes
por desgaste
Para evaluar se el espesor
del corte es de menos de 80
micrómetros
Contamos con ayuda de un
lente milimetrado que
colocamos no ocular del
microscopio.
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Esta es una imagen de un lentemilimetrado en la ocular.
Observen que la espesura estaentre 80 micrómetros.
Este acabado del corte inicialde 120 micrómetros para 80micrómetros es realizado conlijas.
Estos cortes pueden serlevemente coloreados.
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Acabado de los cortes de dientes
por desgaste
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Unión Amelo-dentinaria
Lamelas del Esmalte
Penachos del esmalte
Dentina
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Especímenes con Dispositivos Médicos u
Odontológicos
Algunas investigaciones realizadas en nuestra facultad requieren
cortes histológicos por desgaste, que además de cortar el
material calcificado consiga cortar los dispositivos médicos u
odontológicos.
Estas investigaciones son importantes para el desarrollo de
nuevas técnicas quirúrgicas buco maxilofaciales.
Y para probar la biocompatibilidad de nuevos dispositivos.
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Equipo (micrótomo) que
corta especímenes con
dispositivos médicos u
odontológicos.
Los especímenes deben ser
incluidos en resina LR White.
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Especímenes con Dispositivos Médicos u
Odontológicos
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S.K. SINGHRAO ET AL
MICROSCOPY RESEARCH AND TECHNIQUE
75:576–585 (2012)
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Fijación de Dientes
Utilizamos formol Tamponado a 4 % .
(paraformaldehido 40g diluído en 960 ml de Tampón PBS).
Los dientes cortados por la técnica de desgaste con el
objetivo de estudiar el esmalte también deben ser fijados.
El tiempo de fijación debe ser de 24 a 48 horas de acuerdo
con el tamaño del diente.
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Preparación de los especímenes
descalcificados
El tejido mineralizado contiene 33% de matriz orgánica
siendo que el 28% corresponde al colágeno tipo I y los
otros 5% son:
Osteonectina.
Osteocalcina.
Proteglicanos.
Sialoproteina.
Proteina morfogenética ósea.
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El otro 67% corresponde a la matriz inorgánica
conteniendo: fosfato, magnesio, potasio, sodio y citrato.
De estos elementos, el calcio es el que se encuentra en
mayor cantidad, y para estudiar los contituyentes
celulares, tenemos que retirarlo del tejido.
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Preparación de los especímenes
descalcificados
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EDTA 10 %
En nuestro laboratorio utilizamos como descalcificador el EDTA 10%.
Esto hace que el EDTA 10 % sea un descalcificador de óptima calidad para
la morfología del tejido, y es muy bueno cuando trabajamos con
microscopia electrónica, inmuno-histoquímica, y también para las técnicas
de biología molecular.
Y es el mejor descalcificador.
Promueve la descalcificación lenta.
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Como Saber el punto ideal de
descalcificación de un diente?
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Métodos de inclusión
Parafina (Histosec Merck)
Historesina ( Leica Historesin)
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Adhesión de cortes de diente a la
lamina
Los especímenes de diente humano que tengan grandes
restauraciones o tratamiento endodóntico son mas
susceptibles a soltarse de la lamina en la hora de la
coloración.
Esta es una de las dificultades de trabajar con dientes
descalcificados.
Esto también puede ocurrir cuando la descalcificación es
realizada por ácidos, y es necesario saber el tiempo correcto
para detener el proceso de descalcificación.
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Para minimizar la posibilidad de
separación de los cortes de la
lamina, debemos utilizar laminas:
Señalización.
Poly lisina.
Laminas con carga.
Hacer cortes de 3 a 5 micrómetros.
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Lâmina de Diente incisivo de
cierdo bem aderida.
Adhesión de cortes de diente a la
lamina
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Métodos de coloración
Hematoxilina Eosina.
Tricromico de Masson.
Tricromico de Mallory.
Picrosirus.
Trap (fosfatasa ácida
resistente al tartrato).
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Hematoxilina Eosina
Lamina de diente canino
coloreada con H.E.
Tejido Óseo.
Ligamento periodontal.
Dentina.
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Mandibula de camundongo o
raton, podemos observar un
diente, primer molar y sus
raizes.
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Hematoxilina Eosina
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Tricromico de Masson
Imagen de diente porcino
descalcificado com EDTA 10%.
Observen la área de la dentina
y los túbulos dentinários.
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Lamina de diente de cerdo
coloreada con Tricromico
de Mallory.
Presencia del Ligamento
Periodontal.
Dentina.
Tricromico de Mallory
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Trap
La coloración de TRAP(fosfatasa ácida resistente altartrato) permite queidentifiquemos lososteoclastos, como unareacción de color rojo.
Este método es muyimportante en investigacionesde ortodoncia, pues permitevisualizar la reabsorción ósea.
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Pitol et al : Int. J. Morphol., 25(4):907-910, 2007
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Histotecnología
Sin embargo, la Histotecnología no se resume solamente al
preparo de los especímenes de manera correcta y los
métodos de coloración adecuados.
También necesitamos aplicar métodos de análisis
cuantitativos.
Método histomorfométrico.
Usar software de análisis de imágenes.
Inmunohistoquímica.
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Esta es una imagen decuantificación de colágenoretirada de um artículopublicado por nuestrogrupo de investigación.
Con imágenesmicroscópicas polarizadasy con auxilio del softwareimagej, podemoscuantificar las fibras decolágeno.
Cuantificación de fibras de colágeno
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Análisis Histomorfométrico
Con cortes semi seriados dehuesos, hacemos el análisishistomorfométrico aplicandosobre la imagen del tejido unsistema - test.
El sistema test es colocadosobre la imagen con el softwareimageJ.
Contamos los puntos que caensobre el tejido óseo maduro, ysobre el tejido óseo reciénformado.
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Análisis Histomorfométrica
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En seguida aplicamos las
fórmulas y conseguimos
cuantificar el área de hueso
recién formado en
porcentaje.
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dimitrius@forp.usp.br
dimipitol@yahoo.com.br
Agradecimento
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