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Ingeniería Genética II
Expresión de proteínas recombinantes
Características adicionales:- Promotor regulable
- Terminador de la transcripción
- Sitio de reconocimiento por el ribosoma
Vectores de expresión
IPTG inductor
Análisis de la expresión de
proteínas recombinantes
empleando PAGE
Producción de proteínas recombinantes en bacterias
Escalamiento y purificación de la proteína
La tecnología de DNA recombinante genera
herramientas para estudiar los genes y sus productos
Insertar en
vector de
expresión
Transformar
E. coli u otro
hospedero
Deducir
secuencia de
aminoácidos
Preparar
péptidos
sintéticos
Preparar anticuerpos
específicos para una
proteína
Secuencia
de
aminoácidos
Anticuerpo específico
Sintetizar
sonda
específica
Escrutinio de una
biblioteca de DNA
por Southern blot
Escrutinio de una
biblioteca de
expresión por
Western blot
Western Blot (detección de proteínas específicas empleando anticuerpos)
La detección de proteínas sirve para conocer:
1. Niveles de expresión
2. Isoformas
3. Modificaciones postraduccionales
4. Tiempo de vida media y degradación
5. Localización subcelular
El uso de anticuerpos permite la localización de
proteínas en las estructuras celulares
Uso de las técnicas
de DNA
recombinante en
diferentes ámbitos
de utilidad al hombre
Aplicaciones las técnicas de DNA recombinante en Biotecnología
Vegetal
• Plantas transgénicas que expresan proteínas que le confieren alguna propiedad agronómica importante:
– Resistencia a plagas de insectos
– Resistencia a herbicidas
– Resistencia a virus
• Detección de microorganismos patógenos en plantas por métodos moleculares.
– Virus, bacterias, micoplasmas
El mejoramiento tradicional de plantas implica hacer una cruza entre genotipos
distintos para incorporar un carácter y luego hacer selección y autocruzas para
obtener un homocigoto.
Patrón de herencia Mendeliana. Puede llevar varios años hasta obtener el
homocigoto con los caracteres deseados.
La ingeniería genética de plantas implica el aislamiento
de un gen de cualquier especie e incorporarlo en plantas
para que tengan una nueva característica
Una limitación importante es la
transformación (introducción del DNA)
de céluals vegetales.
Transformación por bombardeo
Transformación de células vegetales
T-DNA: plásmido
presente en
Agrobacterium
tumefaciens
Agrobacterium
tumefasciens
produce tumores en
las plantas
Transformación mediada por Agrobacterium
tumefaciens
Transformación por Agrobacterium tumefaciens
Proceso de transformacion por Agrobacterium
Transformación por biobalística
Aplicación: resistencia a plagas de insectos Gusano barrenador en maíz
En las esporas de Bacillus thuringiensis se acumulan proteínas (Cry) con actividad
insecticida.
Toxinas Bt
El insecto ingiere la protoxina al
alimentarse del tejido de la planta
La protoxina sufre proteólisis en el
intestino del insecto y se genera la
toxina activa
La toxina se une a receptores en las
células epiteliales del intestino
La toxina se oligomeriza y forma poros
en la membrana plasmática de las
células epiteliales
Mecanismo de acción de las toxinas Bt
La toxina Bt es orgánica, por lo tanto es biodegradable
Por el uso de cultivos Bt resistentes a insectos:
Se reduce el número de aplicaciones de insecticidas.
Se incrementa el rendimiento
El uso de estos cultivos se ha incrementado mundialmente en los últimos años:
Controversias sobre plantas transgénicas.
Los vectores para la transformación de plantas tienen marcadores de resistencia
a antibióticos como marcadores de selección. La presencia ubicua de estos
genes pueden facilitar la transferencia de resistencia a antibióticos a bacterias
pátogenas.
Generalmente los marcadores de selección son KanR y NeoR
Escape de genes del cultivo transgénico a malezas. Por ej. generación de
malezas con capacidades de resistencia a herbicidas.
El caso de maíz en México. Riesgos que hay que considerar para diseñar
estrategias para evitarlos.
México es el centro de origen del maíz. Hay amplia diversidad y especies de maíz
silvestre en México.
Transferencia de genes a estas especies.
Bancos de mutantes en los organismos modelos
Métodos de transfección
Permeabilización química de las membranas
Electroporación
Liposomas
Vectores
Vectores derivados de virus animales
SV40
Retrovirus
Vacuna
Vectores mixtos
Métodos de selección
Detección de actividades enzimáticas
Resistencia a inhibidores
Resistencia a antibióticos
Integración dirigida
Clonación en células animales
Transformacion en células eucariontes
Transformación
directa
Biobalística
Microinyección
Virus
Vectores de expresión para transformar células
animales
Promotor
inducible para
animales
Animales transgénicos
Mutación en una helicasa causa envejecimiento prematuro
Creando ratones Knockout
Los ratones
knockout permiten
estudiar la función
de una proteína
codificada por un
gen
La técnica implica la mutación dirigida de un
gen específico
Medicina genómica/ Terapia génica
Introducir células
transformadas (con un
gen intacto) en el tejido
somático para corregir
una función defectuosa o
en la línea germinal.
Inmunodeficiencia combinada sevéra. Defecto en la desaminasa de adenosina.
Células madre de la médula ósea se transforman.
Problemas potenciales
El vector, basado en retrovirus, puede actuar como mutágeno al insertarse en un
gen. También, estos vectores basados en retrovirus solamente pueden en
células en proliferación, por lo que están limitados a células sanguíneas.
Paciente homocigoto para un alelo mutante de LDLR que determina el receptor
de lipoproteínas de baja densidad (LDLR-/LDLR-).
Elevado riesgo de ateroesclerosis y enfermedades coronarias.
Se extrajo 15% del hígado del paciente. Las células se transformaron con el
gen LDLR+ (silvestre). Las células tranformadas se reinyectaron al paciente
por la vena porta y se reestableció un número suficiente de células en el
hígado en el que se redujeron los niveles de lípidos.
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