Inmunohistoquimica

“Inmunohistoquímica aplicada al diagnostico histopatológico

Conceptos básicos”

Dr. César Lara Torres

Departamento de Patología

COE-ISSEMYM

Manuel Toussaint Vargas

El uso del microscopio en el diagnóstico de enfermedades ha adquirido en nuestros días tal incremento, que no existe en el arsenal del médico otro recurso que tenga tan variada y múltiples aplicaciones… Unas veces nos revela , al primer golpe de vista, el agente patógeno de una enfermedad; otras hace accesible a nuestra mirada el mecanismo íntimo de un estado patológico… preciosos elementos para formular pronóstico y conducir tratamiento… 1898

Gac Med Mex 1898;373-378

Técnicas adicionales de diagnóstico

• Tinciones especiales (PAS, Masson, ZN)• Cultivo de tejidos• Microscopía electrónica• Inmunofluorescencia• Inmunohistoquímica• Biología molecular

Primer antecedente: inmnofluorescencia

Albert H Coons ,Hugh Creech, Norman Jones y Ernst Berlinier, en la Universidad de Harvard en 1941.

Cesar Milstein Georges JF Köhler Niels K Jerne

Cambridge UK Basel Institute

PREMIO NOBEL EN MEDICINA 1984Cesar Milstein GJF Köhler Niels K Jerne

Célula TumoralInmunización

Cultivo de tejidos

Hibridomas

Tipos de proteínas que se pueden detectar ?

• Proteínas estructurales – Citoesqueleto (FI – CK, GFAP)– Uniones intercelulares (E-cadherina, B-

catenina)• Proteínas asociadas a vesículas secretoras

– Cromogranina A, sinaptofisina, CD68• Receptores

– HER2, EGFR1, RE, RP,• Factores de transcripción /ciclo celular

– P53, Ki67, TTF1, PAX5, Miogenina

Aplicaciones generales• Clasificación de neoplasias

linfoides/hematológicas• Identificación de primario desconocido• Identificación de sobre-expresión de

proteínas asociadas a translocaciones• Identificación de blancos terapéuticos• Infecciones• Caracterización de substancias

extracelulares

Anticuerpos epiteliales

CKAE1/3 Antígeno carcinoembrionario

Tiroglobulina

Receptores de estrógeno

CK5/6 CK8

Receptores de progesterona

CK7 Hepar-1

P53 CD20

Her2/neu Calcitonina

Ki67 E-cadherina

Antígeno Epitelial de Membrana

CK34BE12

Antígeno prostático específico

TTF-1 CMV

Racemasa p504 Calrretinina HPV

Linfoides

CD45 CD68 (KP-1) ALK-1

CD3 CD34 Bcl-6

CD20 CD138 LMP1 (EBV)

CD43 CD1a Mieloperoxidasa

CD15 CD21 PAX5

CD30 Kappa

CD23 Lambda

CD10 Bcl-2

CD56 Ciclina D1

No Epiteliales

CD99 S-100 PLAP GFAP

CD117 HMB-45 Inhibina alfa PBM

CD31 Mart-1 HCG Neurofilamentos

Sinaptofisina Alfa-fetoproteína

Enolasa neuronal

Vimentina

Cromogranina A

Desmina

Actina músculo liso

Actina musculo específica

Miogenina

WT-1

Anticuerpo primario

Anticuerpo secundario

EstreptavidinaFosfatasa alcalina

1)

2)

3)

• Obtención de la muestra• Preservación (formol pH 7.4)• Técnica histológica (deshidratación-

parafina)• Recuperación antigénica• Bloqueo de substancias endógenas (perox)• Aplicación de anticuerpos y cromógenos• Análisis histológico y diagnóstico

Estandarización• Selección de controles • Bloqueadores (tipo y dilucion)• Anticuerpo primario (poli, mono, ratón,

conejo, cabra)• Anticuerpos secundarios (caballo, conejo,

cabra)• Amplificadores de señal (ABC, polímeros)• Tipo de cromógeno (DAB, FALK)

GFAP

E-Cadherina

Her2/ neu

HHV-8

Anti-Mitocondrias Oncocitoma RenalDiaminobencidina Nueva Fuscina

HMB-45

DOBLE INMUNOMARCACION

CD3 / CD20

Linfoma B rico en células T/H

Oscar /CK5/6

Carcinoma Basal-Like

INMUNOHISTOQUIMICA

• Especificidad / Sensibilidad• Aplicación en material de rutina• Correlación con la morfología• Compatible con fijadores de rutina• Material descalcificado• Material congelado

CDX2

Ki-67

MARCACIÓN NUCLEAR

PAX-5

CD30

E-Cadherina

MARCACIÓN MEMBRANA

Membrana y Golgi

Distrofina

S-100

Mitocondrias

MARCACIÓN CITOPLASMICA

CD68

Citoplasma y núcleo

INMUNOHISTOQUIMICA APLICADA AL DIAGNOSTICO

HISTOPATOLÓGICO

Q-1028-10

• H 44 años tumor de base de lengua

• Dx: Neoplasia maligna poco diferenciada (carcinoma poco diferenciado vs linfoma)

Neoplasia maligna poco diferenciada

Sarcoma

Linfoma Carcinoma

MelanomaVarios S-100,

HMB45, Melan-A

CKAE1/3CD20CD3

CKAE1/3

CD3

CD20

Q-1028-10

• Biopsia de tumor de base de lengua

• Linfoma No Hodgkin difuso de células grandes con inmunofenotipo B (CD20)

Biopsia de Estómago. Gastritis xantomatosa vs Adeno Ca. poco dif Macrógafos? o Ca. con moco?

CD68 vs Citoquertina

Queratina (AE1-3)

Dx: Adenocarcinoma poco diferenciado

Mujer de 67 años de edad con lesión en duodeno. ¿Ca. Poco diferenciado ?

CK AE1-3HMB-45

Tumores Caracterizados por Inmunohistoquímica

• Tumores del estroma del tubo digestivo

• Tumor desmoplásico intra abdominal

• Linfomas • TNEP/ Sarcoma de

Ewing

• Tumor rabdoide• Tumor fibroso solitario• Tumor de células

granulares.• Neuroma Apendicular• Tumor adenomatoide

Nódulo Gástrico

CD34 CD-117 (c-kit)

Actina

• Linfoma• TNEP/ Sarcoma de Ewing• Rabdomiosarcoma

“Tumor de Células Redondas, Pequeñas y Azules”

Tumor de CélulasRedondas, Pequeñas y Azules.

• Linfoma CD45 / CD20 / CD3• TNEP/ Sarc de Ewing

CD99 / CD56 / Sinaptofisina• Rabdomiosarcoma Desmina / Miogenina / MyoD1

TdTCD10

INMUNOFENOTIPO CD45 Positivo CD20 Negativo CD3 Positivo TdT Positivo CD10 PositivoDx: Linfoma linfoblástico de precursores T

CD45

INMUNOHISTOQUIMICA EN LA METASTASIS DEL

PRIMARIO DESCONOCIDO

Nódulo pulmonar en una mujer de 45 años de edad

Queratina Positivo = carcinoma

Dx. Metastasis de Ca. Papilar del tiroides

TIROGLOBULINA

Q7 + / 20+ Q7- / Q20- Q7+ / Q20- Q7- / Q20+Ca UrotelialCa PáncreasCa mucinosos de ovario

Ca HepatocelularCa PróstataCa EscamosoCa NeuroendocrínoCarcinoide pulmonar

Ca MamarioCa Pulmón ( No células pequeñas)Ca BronquioloalveolarCa seroso de OvarioCa EndometrialMesotelioma

Ca de ColonCa de célula de MerkelCa Gástrico 60%

QUERATINAS 7/20 Metástasis de primario desconocido

CK7

CK20

Tumor Pulmonar

CDX-2

Q7 + / 20+ Q7- / Q20- Q7+ / Q20- Q7- / Q20+Ca UrotelialCa PáncreasCa mucinosos de ovario

Ca HepatocelularCa PróstataCa EscamosoCa NeuroendocrínoCarcinoide pulmonar

Ca MamarioCa Pulmón ( No células pequeñas)Ca BronquioloalveolarCa seroso de OvarioCa EndometrialMesotelioma

Ca de ColonCa de célula de MerkelCa Gástrico 60%

QUERATINAS 7/20 Metástasis de primario desconocido

CK7 (-)

CK20 (-)

Hombre de 56 años de con lesiones lítica en vértebras

AE1-3

Q7 + / 20+ Q7- / Q20- Q7+ / Q20- Q7- / Q20+Ca UrotelialCa PáncreasCa mucinosos de ovario

Ca HepatocelularCa PróstataCa EscamosoCa NeuroendocrínoCarcinoide pulmonar

Ca MamarioCa Pulmón ( No células pequeñas)Ca BronquioloalveolarCa seroso de OvarioCa EndometrialMesotelioma

Ca de ColonCa de célula de MerkelCa Gástrico 60%

QUERATINAS 7/20 Metástasis de primario desconocido

CK7

CK20PSA

CK7

CK20

Ganglio linfático axilar, mujer de 68 años

Q7 + / Q20+

Q7- / Q20- Q7+ / Q20- Q7- / Q20+

Ca UrotelialCa PáncreasCa mucinosos de ovario

Ca HepatocelularCa PróstataCa EscamosoCa NeuroendocrínoCarcinoide pulmonar

Ca MamarioCa Pulmón ( No células pequeñas)Ca BronquioloalveolarCa seroso de OvarioCa EndometrialMesotelioma

Ca de ColonCa de célula de MerkelCa Gástrico 60%

QUERATINAS 7/20 Metástasis de primario desconocido

CK7

CK20RE

IHQ. Predicción al TxHerceptinHer2/neu

VEGF Avastin

EGFR IresaTarceva

CD117

LMC

GIST

Gleevec

CD20

Rituximab

Resumen• Proceso de estandarización es muy

importante• Selección de controles adecuados• Personal entrenado – constante revisión y

ajuste• Saber por qué, para qué • Correlación morfológica imprescindible

IHQ es una técnica complementaria

INMUNOHISTOQUIMICA CON FACTOR

PRONÓSTICO Y PREDICTIVO

Johns Hopkins 1884 William Halsted

Factores Pronósticos en Carcinoma de la Glándula Mamaria

MORFOLOGÍA• Pronóstica favorable: Ca Tubular, Ca

Cribiforme, Ca Medular Ca. Mucinoso, Ca Papilar, Ca Adenoideo quístico, Ca Juvenil secretor

• Pronóstico desfavorable Ca de células con anillo de sello, Ca Escamoso, Ca metaplásico, Ca neuroendocríno

Inmunohistoquímica como factor pronóstico y predictivo

• Receptores de Estrógenos y Progesterona

• Gen supresor p53• Ki-67• Her2/neu (cerbB2)• Angiogénesis• Fascina / Bcl-2 / Ciclina D1 / otros

RESPUESTA A TX. HORMONAL

RECEPTORES RESPUESTA A TX RE+ /RP+ 75%RE+ / RP+/- 50%RE+ / RP- 25%RE- / RP- 10-25%

RE RP

* E+RE+DNAc-myc, c-jun,c-fos

RNA m

Estrógeno Prot Membrana

Ribosomas Factores de crecimiento EGF / IGF

E

E

* E+RE+DNAc-myc, c-jun,c-fos

RNA m

Estrógeno Prot Membrana

Ribosomas Factores de crecimiento EGF / IGF

Anti-estrógeno

DISMINUCION• Síntesis de DNA• Timidina cinasa• DNA Polimerasa• Proliferación celular

HER2/neuHuman Epidermal Growth Factor Receptor 2 Gen neu (ratón / neuroblastoma)

• Proteína transmembrana 185 kD / Tirosina-cinasa cromosoma 17q21

• Factor de crecimiento Epidérmico :

- EGFR (Her1) / Her2 / Her3 / Her4• Movilidad, adhesión celular

HERCEPTIN Baselga J, Tripathy D, Mendelsohn J, Baughman S, Benz CC, Dantis L, Sklarin NT, Seidman AD, Hudis CA, Moore J, Rosen PP, Twaddell T, Henderson IC, Norton L.

Phase II study of weekly intravenous recombinant humanized anti-p185HER2 monoclonal antibody in patients with HER2/neu-overexpressing metastatic breast cancer. J Clin Oncol 1996 Mar;14(3):737-44

MSKCC

Lab Invest 2007;87;403-408

Biopsia nodulo cervial en paciente de 25 años

• La paciente mas probablemente es una mujer y tiene un carcinoma metástasico• El tumor primario está localizado en la tiroides, lo mas probable en el lóbulo ipsilateral y muy posiblemente sea pequeño y no detectable clínicamente pero… créanme ahí está!• El tumor está formado por células foliculares, y seguramente hay tumor en diversos focos de la glándula y si la paciente recibió radioterapia de niña, podemos asumir una relación causal con el tumor.

• Otros ganglios cervicales, muy probablemente estén afectados y,… cuidado con el pulmón de esta paciente por que es en este sitio donde se pueden encontrar metástasis• Estas células tienen la capacidad de incorpora yodo por lo que si se encontrara algún otro foco tumoral, con una dosis grande de yodo radioacivo, puede haber regresión.•Y, a pesar de que estas células son malignas, muy probablemente la paciente estará viva y bien los siguientes 10 años.

Biopsia nodulo cervial en paciente de 25 años

Metástasis de ca papilar del tiroides

Manuel Toussaint Vargas

El uso del microscopio en el diagnóstico de enfermedades ha adquirido en nuestros días tal incremento, que no existe en el arsenal del médico otro recurso que tenga tan variada y múltiples aplicaciones… Unas veces nos revela , al primer golpe de vista, el agente patógeno de una enfermedad; otras hace accesible a nuestra mirada el mecanismo íntimo de un estado patológico… preciosos elementos para formular pronóstico y conducir tratamiento… 1898

Gac Med Mex 1898;373-378

Q7 + / 20+ Q7- / Q20- Q7+ / Q20- Q7- / Q20+Ca UrotelialCa PáncreasCa mucinosos de ovario

Ca HepatocelularCa PróstataCa EscamosoCa NeuroendocrínoCarcinoide pulmonar

Ca MamarioCa Pulmón ( No células pequeñas)Ca BronquioloalveolarCa seroso de OvarioCa EndometrialMesotelioma

Ca de ColonCa de célula de Merkel (Sinaptofisina)Ca Gástrico 60%

QUERATINAS 7/20 Metástasis de primario desconocido

Cortesía Dr. Schnider

Diagnóstico diferencialLinfoma cutáneo vs Células de Merkel

Diagnóstico diferencialLinfoma cutáneo vs. Células de Merkel

CD45 QUERATINA

Linfoma + -

Ca de células de Merkel

- +

CK 20 AE1-3

Cromogranina A Sinaptofisina

Juan Rosai

INMUNOHISTOQUÍMICA

MiogeninaRE

Q7

Q5/6 Trombomodulina

Mesotelioma

TdT

CD10

Leucémia Linfoblástica Aguda

Líquido Cerfalorraquídeo