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Introducción al estudio de las Proteínas. Introducción al estudio de las proteínas. Mulder (1838): Describe un material presente en todos los seres vivos, con la siguiente composición porcentual en peso: C: 55 %H: 6.5 %O: 22 %N: 15 %S: 0.5 %. - PowerPoint PPT Presentation
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Introducción al estudio de las Proteínas
Introducción al estudio de las proteínas
Mulder (1838):
Describe un material presente en todos los seres vivos, con la siguiente composición porcentual en peso:
C: 55 % H: 6.5 % O: 22 % N: 15 % S: 0.5 %
Dado el contenido en azufre (0.5 %) el peso molecular mínimo dedicho material debería ser 32*100/0.5 = 6400
Las proteínas son susceptibles de hidrólisis ácida:
HCl 6N, 90ºC, 18 horas
En el hidrolizado aparecen aminoácidos, compuestos quecontienen una función amino -NH2 y una función carboxilo,-COOH
En las proteínas hay 20 aminoácidos distintos: los llamadosaminoácidos proteicos
Hay asimismo muchos otros aminoácidos que no forman partede proteínas, los aminoácidos no proteicos
Con frecuencia los aminoácidos proteicos aparecen modificados:son las modificaciones postraduccionales
H2N C
H
R1
COOH H2N C
H
COOH
R2
H2N C
H
COOH
R3
H2N C
H
R1
CO NH C
H
CO
R2
NH C
H
R3
COOH + 2H2O
Teoría del Enlace Peptídico
H2NC
CN
CC
NC
COOH
R1
O
H
Ri
O
H
Rn
HH
H
n-2
N-término
C-término
Teoría del Enlace Peptídico - Pruebas experimentales, 1
1. Las proteínas nativas tienen relativamente pocos gruposácido-base titulables. A medida que progresa su hidrólisis, van apareciendo grupos -NH2 y -COOH en cantidad equimolar
2. En hidrolizados parciales se encuentran di- y tripéptidos cuya estructura puede determinarse directamente
3. Las enzimas que hidrolizan proteínas (tripsina, quimotripsina,pepsina, papaína) atacan al enlace -CO-NH-, tal como puede observarse en compuestos sintéticos (p.e. BAPNA)
4. Las proteínas dan positiva la reacción de biuret
Funciones biológicas de las proteínas
- Biocatalizadores (enzimas)- Receptores de señales químicas- Transportadores- Estructurales (citoesqueleto, colágeno)- Defensa (inmune, restricción bacteriana, etc.)- Motilidad (motores moleculares)- Transducción- Adherencia celular y organización tisular- Plegamiento correcto de otras proteínas- Otras: anticongelante
Clasificación de las proteínas
I. Según solubilidad (obsoleta): Albúminas, Globulinas, Prolaminas, Gliadinas, Escleroproteínas, etc.
II. Según presencia o no de un grupo prostético: Proteínas simples y Proteínas conjugadas Holoproteína = Apoproteína + Grupo prostético
III. Según presencia o no de subunidades: Proteínas monoméricas y proteínas oligoméricas
IV. Según estructura global: Proteínas fibrosas y proteínas globulares
Aminoácidos
COO-
C
R
H3N+ H
AminoácidosGrupo carboxilo
(disociado)
Grupo amino(protonado)
Cadenalateral
Carbono
L-Alanina L-Gliceraldehido
Aminoácidos: estereoisomería
CH2N H
COOH
R
CHO H
CHO
CH2OH
L-Alanina D-Alanina
Aminoácidos: estereoisomería
C
COO-
+H3N H
CH3
C
COO-
CH3
NH3+H
COO-
C+H3N H
CH OH
CH3
COO-
C+H3N H
CH CH3
CH2
CH3
L-Treonina L-Isoleucina
COO-
CH3N+ H
H
COO-
CH3N+ H
CH3
COO-
CH3N+ H
CHH3C CH3
GlicinaGly, G
NE
AlaninaAla, A
NE
ValinaVal, V
E
Aminoácidos alifáticos o neutros, 1
Aminoácidos alifáticos o neutros, 2
COO-
CH3N+ H
CH2
CHH3C CH3
COO-
CH3N+ H
CHH3C CH2
CH3
LeucinaLeu, L
E
IsoleucinaIle, I
E
Aminoácidos alifáticos
Su característica fundamental es la hidrofobicidad dela cadena lateral (con excepción de G)
Suelen ocupar el interior de las proteínas globulares, donde contribuyen a la estructura global de la proteínadebido al efecto hidrofóbico (“micela proteica”)
Reactividad química muy escasa
Glicina tiene un destacado papel estructural: suele serinvariante en series filogenéticas
COO-
CH3N+ H
CH2
COO-
CH3N+ H
CH2
OH
COO-
CH3N+ H
CH2
NHFenilalanina
Phe, FE
TirosinaTyr, Y
NETriptófano
Trp, WE
Aminoácidos aromáticos
Aminoácidos aromáticos
La presencia de sistemas aromáticos hace que absorbanluz UV en torno a 280 nm; la absorción UV de las proteínasse debe a su contenido en estos aminoácidos
F y W son hidrofóbicos
COO-
CH3N+ H
CH2OH
COO-
CH3N+ H
C OHH
CH3
SerinaSer, S
NE
TreoninaThr, T
E
Hidroxiaminoácidos
Hidroxiaminoácidos
El grupo -OH de la serina es fundamental en el centroactivo de muchas enzimas (serin proteinasas, p.e.)
Forma enlaces glicosídicos con oligosacáridos en ciertasglicoproteínas
El grupo -OH tanto de S como de T es susceptible defosforilación: importante modificación postraduccionalque regula la actividad de muchas proteínas
COO-
CH3N+ H
CH2
SH
COO-
CH3N+ H
CH2
CH2
S
CH3
CisteínaCys, C
NE
MetioninaMet, M
E
Tioaminoácidos
Tioaminoácidos
Importante papel estructural de la cisteína por la posibilidad de formar enlaces disulfuro con otro residuo de cisteína
La cisteína participa en el centro activo de muchasenzimas
La metionina es el aminoácido iniciador de la síntesisde proteínas (codon AUG)
Aminas secundarias (“Iminoácidos”)
ProlinaPro, P
NE
NH2+
COO-
Prolina
Importante papel estructural: su presencia dificultala formación de estructura secundaria
Por esa misma razón suele ser invariante en seriesfilogenéticas
Como tal o modificado por hidroxilación (4-hidroxi-prolina) es muy abundante en el colágeno
COO-
CH3N+ H
CH2
COO-
COO-
CH3N+ H
CH2
CONH2
COO-
CH3N+ H
CH2
CH2
COO-
COO-
CH3N+ H
CH2
CH2
CONH2
Ác.AspárticoAsp, P
NE
AsparraginaAsn, N
NE
Ác.GlutámicoGlu, E
NE
GlutaminaGln, Q
NE
Aminoácidos dicarboxílicos y amidas
Aminoácidos dicarboxílicos y sus amidas
Todos ellos son importantísimos intermediarios en elmetabolismo nitrogenado, sobre todo E y Q
Forman parte del centro activo de las glicosidasas y de las serin enzimas (tríada SHD)
Proveen a la proteína de superficies aniónicas quesirven para fijar cationes (p.e., Ca++)
COO-
CH3N+ H
CH2
CH2
CH2
CH2
NH3+
COO-
CH3N+ H
CH2
CH2
CH2
NH
C+H2NNH2
COO-
CH3N+ H
CH2
HNNH+
LisinaLys, K
E
ArgininaArg, RE(?)
HistidinaHis, H
E
Aminoácidos dibásicos
Aminoácidos dibásicos
Lisina sirve para formar intermediarios covalentes encatálisis enzimática (bases de Schiff)
Lisina es el aminoácido que une determinadas coenzimasa la estructura de la proteína
Arginina es un importante intermediario en el ciclo dela urea
Histidina forma parte del centro activo de muchas enzimas,debido al carácter nucleófilo del imidazol
Histidina contribuye al tamponamiento de los medios biológicos por tener un pKa cercano al pH intracelular
Aminoácidos apolares o hidrofóbicos:
- A, V, L, I, F, W, M, P
Aminoácidos polares sin carga eléctrica:
- G, Y, S, T, C, N, Q
Aminoácidos polares con carga eléctrica:
- Aniónicos (-): D, E- Catiónicos (+): K, R, H
Clasificación de aminoácidos según polaridad
C
COO-
+H3N H
CH2
OH
HO
Aminoácidos no proteicos: DOPA
L-DOPA(dihidroxifenilalanina)
Catecolaminas
Hormonastiroideas
Melanina
COO-
CH2
CH2
NH3+
COO-
CH2
CH2
CH2
NH3+
-Aminoácidos
-Alanina GABA-Aminobutirato
Propiedades de las proteínas
Base añadida (uu.arbitrarias)
0 20 40 60 80 100
pH
0
2
4
6
8
10
12
14
Titulación ácido-base de una proteína
pI
Carga positiva neta
Carga negativa neta
Grupos disociables de una proteína
Ácidos(aniónicos, - )
Asp 3.86Cys 10.78Glu 4.25Tyr 10.07
Básicos(catiónicos, + )
Arg 12.48His 6.00Lys 10.53
Aniónicos: carga negativa neta por encima de su pKa
Catiónicos: carga positiva neta por debajo de su pKa
(Se indica el pKa de la cadena lateral en cada caso)
Proteínas ácidas: punto isoeléctrico (pI) inferior a 7Ricas en Asp y Glu; al pH celular presentancarga negativa neta.
Proteínas básicas: punto isoeléctrico (pI) superior a 7Ricas en Arg y Lys; al pH celular presentancarga positiva neta.
En el medio biológico, son, porlo general, más abundantes lasproteínas ácidas.
Electroforesis
1. Se realiza sobre un soportesólido o semisólido, para mini-mizar efectos de difusión
Muestra
+-2. Se somete el conjunto aun campo eléctrico constante, a un pH fijo; las proteínas migranconforme a su carga eléctrica
3. Terminada la carrera electro-forética, las proteínas se tiñencon un colorante adecuado(p.e., Azul de Coomassie)
Fundamento de la cromatografíaMuestra:
tres componentesmezclados
Fase móvil
Faseestacionaria
Se hace fluir una fasemóvil sobre la estacionaria
Dependiendo de la afinidadrelativa por ambas fases, loscomponentes de la mezcla
primitiva se separan
Se dispone una mezclasobre una fase estacionaria
1. Intercambio iónico- Separa según carga eléctrica- Fase estacionaria: grupos cargados unidos a un soporte insoluble- Fase móvil: gradiente de sal o de pH
2. Partición- Separa según solubilidad en solventes- Fase estacionaria: Un solvente sobre un soporte sólido- Fase móvil: El otro solvente fluyendo
Tipos de cromatografía
3. Afinidad- Separa según la afinidad de la proteína por un ligando inmovilizado- Fase estacionaria: ligando unido a soporte insoluble- Fase móvil: (1) solución sin ligando (2) solución con ligando libre
4. Hidrofóbica- Separa según hidrofobicidad- Fase estacionaria: grupos hidrofóbicos unidos a un soporte insoluble- Fase móvil: gradiente inverso de sal
5. Exclusión molecular- Separa según tamaño molecular- Fase estacionaria: dextrano o agarosa entrecruzados- Fase móvil: solución tamponada
+
+
+
+
++
+
+
+
---
-
----
--
-
+
+
+
+
++
+
+
+
-
--
-
---
---
- -- -
-
-
--
-
+
+
+
+
++
+
+
+
-
-
--
-
-
---
-
-
---
-
- -
--
-
Proteínas adsorbidasal intercambiador
iónico
A baja concentraciónde sal, se desprenden las proteínas menos
electronegativas
A mayor concentraciónde sal se desprenden
las proteínas máselectronegativas
Intercambio iónico
O
OH
HOCH2
OHH
H
HOO
O
OH
HOCH2
OH
O
H
H
H
H
nCelulosa
O
O
H
H
OH
CH2
O
H
O
O
OH
OH
HOCH2
H
O
H
H
n
AgarosaO
OH
CH2
OH
H
HOH
O
OH
OH
H
H
CH2
O
H
O
H
H
OH
H
O
n
Dextrano
Soportescromatográficos
CH2 CH2 NH+CH2
CH2 CH3
CH3
Dietilaminoetil (DEAE)
CH2 CH2 N+ CH2 CH3
CH2
CH3
CH2
CH3
Trietilaminoetil (TEAE)
CH2 CH2 N+ CH2
CH2
CH3
CH2
CH3
CHOH CH3
Dietil 2-hidroxipropil aminoetil (QAE)
CH2 COO-
Carboximetil (CM)
CH2 CH2 S
O
O
O-
Sulfoetil (SE)
CH2 CH2 CH2 S
O
O
O-
Sulfopropil (SP)
O P
O
O-
O-
Fosfo (P)
Bo m b a p e ristá ltic a
G e ne ra d o rd e g ra d ie nte
C o lum na
C o le c to r d efra c c io ne s
Re sina d einte rc a m b ioió nic o
Cromatografía deintercambio iónico
O
O HN NH
SO3-
N
N
N
NH
SO3-
O CH2
Cibacron Blue F3GA
Matriz de agarosa
Cromatografía de adsorción a colorantes
1 2 3
Cromatografía de afinidad
Solubilidad
pHpI
Punto isoeléctrico
Solubilidad
Fuerzaiónica, (M)
Salting in
Salting out
Solubilidad,g/L
Temperatura, ºC
00 100
100
Peso molecular de las proteínas
1. Métodos primitivos: presión osmótica, ultracentrifugación analítica, etc.
2. Cromatografía de exclusión molecular
3. Electroforesis SDS-PAGE
4. Cálculo directo a partir de estructura primaria
Cromatografía de exclusión molecular
Glucagon
Citocrom o c
Ribonucleasa
Seroalbúm ina
IgGTiroglobulina
Volumen
Peso molecular
280
240
200
160
120
80
40
103
104
105
106
BSDS
M ovilidad (cm)
Pesom olecular
Electroforesis en poliacrilamida-SDS (PAGE)
+
-
+
-
+
-
Método de Kjeldahl
Digestión ácida total de la proteína y conversión cuantitativa de nitrógeno
a NH3, que se valora por titulación.
Poco sensible. En desuso. Se sigue empleando para análisis
elemental (p.e., alimentos)
Proteína total= N x 100/16
Absorción a 280 nm
Se fundamenta en la absorción a 280 nm producidapor los aminoácidos aromáticos Phe, Tyr y Trp
- Sensible y fácil de practicar- Requiere soluciones puras de proteína; no es aplicable a mezclas- Distintas proteínas dan diferente grado de absorción, dependiendo de su contenido en aa. aromáticos
H2N C
O
NC
O
NH2
H O
C
NH
C
O
HN
HN
-O
C
HN
C-O
NH
NH
Cu++
OHH
OHH
BiuretComplejo cúprico coloreado
Reacción del biuret
Al tratar con Cu++ en medio alcalino, los compuestoscon grupos -CO-NH- dan una coloración violeta.Muy específica; relativamente poco sensible
Método de Lowry
Reacción en dos fases:
1. Reacción del biuret2. Tratamiento con reactivo de fenoles de Folin-Ciocalteu
- Muy sensible (muestras de 10 g) y sencillo- Resultados variables con distintas proteínas, pues depende del contenido en aminoácidos aromáticos
400 500 600
0.2
0.3
0.4
400 500 600
0.2
0.3
0.4
700
Colorante Colorante + proteína
Método de Bradford
La fijación de un colorante (Azul de Coomassie) a una proteínamodifica las características de absorción visible de aquél.
Sensible, fácil de practicar y resultados muy constantes
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