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Investigación en arbovirosis en el CISA:
Avances en el reconocimiento y control del virus de la fiebre del
Valle del Rift
Alejandro Brun Centro de Investigación en Sanidad Animal
INIA
II Jornadas sobre zoonosis y enfermedades emergentes: enfermedades virales transmitidas por mosquitos Barcelona. 23-24 de mayo de 2013
Findlay, G.M, 1932
Transmisión transovárica
Transmisión transovárica
Zoonosis
Mosquitos periurbanos
¿Roedores?
mosquitos
mosquitos
Epizootía Periodo interepizoótico
Líneas de investigación sobre FVR en el CISA-INIA
• Reconocimiento: Desarrollo de herramientas para la detección del virus, detección de infección (anticuerpos), clínica y patología en animales.
• Control: Desarrollo de estrategias de vacunación en modelos animales y su validación en rumiantes
RVFV (fam. Bunyaviridae): componentes estructurales
Glicoproteinas (Gn y Gc)
Nucleoproteina (N)
S M
L
SN P mock
Gc Gn
N
Polimerasa (L)
Envuelta lipídica
ssRNA(-) L,M, S
80-120nm
RVFV: genoma viral
S M
L
ssRNA(-) L,M, S •RNA tri segmentado, polaridad negativa •Circular 5’-3’ NCRs “panhandle” •Variabilidad del genoma (total: 5%) •Seg M más variable entre aislados
Detección e identificación molecular de aislados del RVFV
CGGACTTGGAGACTTTGCATCA
...G.................. W
.................T.... SA-75
..................G... Zimbabwe 70
S-segment
ACGTTGCACCTCCACCAGCGAAGC
...................A.... SEC
.T.................A.... Wf
G..................A.... KenyaIB8/65
ACAAGGTTCCCCAATCTGAAAGAA
.................A...... SEC
...................G.... ArD38388
.......................G 2269/74
TTCTTTGCTTCTGATACCCTCTG
....................T.. ArD38388
..............C........ SECa
........A.............. SECb
.....C................. SECc
.....C........C........ SECd
AGGGGCCTGTGTGGACTTGTGCAA
......................G. SECe
......................T. ArD38388
CAGATGATGCAAGGAAGTGGAAC
................A...... SA-51
L-segment
Fwd primer FAM-probe (rc) Rev primer (rc)
Rev primer (rc) Cys5-probe Fwd primer
Aed
es-L
Man
sonia
-L
Aed
es-S
Man
sonia
-S
102
103
104
105
106
107
108
109
GE
C/m
l
Mwaengo et al., 2012
Detección de RVFV en mosquitos mediante RT-qPCR
cDNA RVFV-Segmento M (amplicón 480nt)
MRV1(ag) Emfwd(ag) Emrev(g) cDNA primer
1 2 3 4 C- C+ 2 3 4 C- C+ 2 3 4 C- C+ 1 1
0.5kb
secuenciación
Amplificación de la region 3’ del cDNA segmento M
Mosquito pooles
0.96
1
1
1
0.99
0.29
1
1
1
0.82
0.28
1
0.96
1
1 1
0.98
1 0.93
0.96
1
0.95
1
0.28
0.36
0.06
1
Mwaengo et al., 2012
Detección de RNA viral mediante PCR en tiempo real Específica para cada segmento de RNA viral Permite cuantificación de nº de copias de RNA Sonda del segmento L/S para detección de RNA viral en mosquitos Amplificación (PCR convencional) de una región variable del segmento M Establecimiento de relaciones filogenéticas entre aislados
Detección e identificación molecular de aislados del RVFV (resumen)
RVFV: nucleoproteína N
Nucleoproteina (N)
S M
L
ssRNA(-) L,M, S •Altamente conservada entre aislados •Muy abundante e inmunogénica •Anticuerpos anti-N en suero: evidencia de infección en animales
Desarrollo de tests serológicos
El-Harrak et al., 2011
Detección de anticuerpos anti-RVFV en sueros de camellos en el Norte de Africa
PLACA ANTIGENADA
LAVADO
NEGATIVO POSITIVO
LAVADO
Proteína N
ADICIÓN MUESTRA Sueros 1/5 1h 25ºC
IgM
IgG
PROTEÍNA- PEROXIDASA 1h 25ºC
SUBSTRATO 15 MIN
Proteína
N+PO
Utilización de la proteína N recombinante en ELISA anti-FVR DE DOBLE RECONOCIMIENTO DR (Ingezym FVR-DR, Ingenasa)
Expresión y purificación De Trx-N en E.coli
Van der Vaal et al., 2012
Empleo de proteínas N y Gn recombinantes para la detección simultánea de anticuerpos mediante técnica Luminex
5.6um
Gn N
Fluorescencia roja e infrarroja
Fluorescencia verde
Detección de RNA viral mediante PCR en tiempo real Específica para cada segmento de RNA viral Permite cuantificación de nº de copias de RNA Sonda del segmento L/S para detección de RNA viral en mosquitos Amplificación (PCR convencional) de una región variable del segmento M Establecimiento de relaciones filogenéticas entre aislados
Detección e identificación molecular de aislados del RVFV
Desarrollo de test serológicos (resumen)
Desarrollo de un ELISA de competición mediante AcMo Detección de anticuerpos anti-N en cualquier especie Desarrollo de ELISA comercial de “doble reconocimiento” Detección de anticuerpos anti-N en cualquier especie Mejora la detección de IgMs o IgAs específicas Desarrollo de ELISA Luminex Detección simultánea de anticuerpos anti Gn y N Discriminación de animales vacunados /infectados
FVR: necesidad de nuevas vacunas
• Mejorar la eficacia y seguridad de las vacunas actuales
• Varias opciones de éxito: vectores virales, genetica reversa, virus atenuados..
• Antígenos diana: glicoproteinas GnGc
• Vacunas animales y humanas necesarias
Desarrollo de vacunas experimentales para RVF
Vacunas de ADN
• Facilidad de producción y conservación y transporte
• Expresión intracelular de antígenos (virus-like)
• Excelentes resultados en modelos de infección en ratón
• Vacunas DNA comerciales para WNV (USA) y IPNV
Vacunas basadas en el vector viral MVA
• Vector muy atenuado (pérdida de factores de virulencia)
• Bajos niveles de replicación en células de mamífero
• Altamente inmunogénico
• Buen inductor de respuestas T
• Aplicación en ensayos clínicos humanos
Mecanismos de presentación de antígenos tras una vacunación ADN/Vector
Muscle/ skin cell
Secreted/Released antigen
APC
B-cell
IMMUNE RESPONSE
T-cell
T cell
Antigen Presenting Cell
Plasmid/Viral vector
21 480 2091 3614 1103 1842
1 1198 691 154 RVFV M segment cDNA
pCMV-M4 Gn Gc
nt
aa
Met4
pCMV-M4 pCMV
Construcción de vectores vacunales pCMV-M4 y MVA-GNGc
tPA leader
VV p7.5
pb9 V5 tag
VV p11 gfp TKL TKR
250 150 100 75
50
37
25
20
15
Mr
anti-Gn anti-Gc
MVA-GnGc Gn Gc
Met4
Esquema de immunización y desafío en ratones Balb/c
Desafío RVFV cepa 56/74
Prime: pCMV-M4
Boost: pCMV-M4 ó MVA GnGc ¿Morbilidad?
¿Mortalidad?
0 15 30 50 Días post inmunización
Días post desafío 0 20
Signos clínicos: 5/7
0 5 10 15 200
20
40
60
80
100pCMV (control)
pCMV-M4
DIA PI
su
perv
iven
cia
(%
)
contr
ol
pCM
V-M
4
0
1
2
3
4
5
6
vaccine groupslo
g 1
0 T
CID
50
pCM
V-M
4
0
100
200
300
400
500
VN
T 5
0“prime-boost” homólogo: pCMV-M4 + pCMV-M4
supervivencia
neutralización
Viremia 3dpi
(López-Gil et al, 2013)
Mejoría en los signos clínicos tras prime boost
contr
ol
pCM
V-M
4
pCM
V-M
4 +
MVA-G
n/Gc
0
1
2
3
4
5
6
vaccine groups
log
10 T
CID
50
Signos clínicos: pCMV- MVA: 2/7 pCMV-M4: 5/7
pCM
V-M
4+M
VA-G
n/Gc
pCM
V-M
4
0
100
200
300
400
500
VN
T 5
0
supervivencia
neutralización
Viremia (3dpi)
“prime-boost” heterólogo: pCMV-M4 + MVA GnGc
0 5 10 15 200
20
40
60
80
100pCMV-M4+ MVAGnGc
pCMV+MVA (control)
DIA PI
su
perv
iven
cia
(%
)
(López-Gil et al, 2013)
pCM
V-M
4+M
VA-G
n/Gc
pCM
V-M
4
MVAGnG
c
0
100
200
300
400
500
VN
T 5
0
contr
ol
pCM
V-M
4
pCM
V-M
4 +
MVA-G
n/Gc
MVA-G
n/Gc
0
1
2
3
4
5
6
vaccine groups
log
10 T
CID
50
Signos clínicos a 3dpi: pCMV- MVA: 2/7 pCMV-M4: 5/7 MVA GnGc: 0/7
0 5 10 15 20 250
20
40
60
80
100MVA (control)
MVA-GnGc
DIA PI
su
perv
iven
cia
(%
)MVA GnGc 1X (dosis única)
supervivencia
neutralización
Viremia (3dpi)
Sin clínica aparente
(López-Gil et al, 2013)
Identificación de péptidos MHC-I en la secuencia de las glicoproteínas Gn y Gc
peptide GnGc peptides
1 LYRALKAII
2 PPHKKRVGI
3 TYAGACSSF
4 SYAHHRTLL*
5 CSHANGSGI
6 LVLGNPAPI
7 SYASACSEL
8 CGGWGCGCF
9 CFNVNPSCL
10 SCLFVHTYL
11 SGSNSFSFI
12 ESPGKGYAI
13 SYKPMIDQL
14 GGPLKTILL
15 LYVALSIGL
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15pb9
pha
0
50
100
150
200
250
GnGc peptide #sfu
/10
6cells
4 SYAHHRTLL
13 SYKPMIDQL
14 GGPLKTILL
IFN-g ELISPOT
(López-Gil et al, 2013)
4 13 14 150.0
0.5
1.0
1.5
2.0
peptide #
% IF
N- g
secre
tin
g C
D8
+
4 13 14 150.0
0.5
1.0
1.5
2.0
peptide #
% IF
N- g
secre
tin
g C
D8
+
4 13 14 150.0
0.5
1.0
1.5
2.0
peptide #
% IF
N- g
secre
tin
g C
D8
+
P=0.0028 MVAGnGc MVAGnGc (2x)
pCMV-M4 + MVA GnGc pCMV-M4
4 13 14 150.0
0.5
1.0
1.5
2.0
peptide #
% IF
N- g
secre
tin
g C
D8
+
P=0.0005
P=0.1713 P=0.0492
**
* * ***
* *
Cuantificación de linfocitos T CD8+ específicos estimulados por péptidos clase I (ICCS)
(López-Gil et al 2013)
• Tanto la vacunación con DNA como MVA inducen protección en ratones tras un desafío letal.
• El prime-boost heterólogo reduce la aparición de signos clínicos con respecto al homólogo
• La protección conferida por una dosis de MVAGnGc se produce en ausencia de signos clínicos y viremia
• En todos los casos se produce una respuesta modesta de anticuerpos neutralizantes
• Se han descrito péptidos restringidos por clase I que podrían ser importantes en la inducción de respuestas CD8+ (citotóxicas y de memoria)
Desarrollo de vacunas experimentales para RVF
0
Inmunización: 400ug de pCMV-M4 ID (oreja) IM (pata trasera)
16 30
1ª inmunización
26 10
Suero
38
Esquema de inmunización de ovejas con plásmido pCMV-M4
días
Boost RVFV MP12 (atenuado)
113
2ª inmunización 3ª inmunización
Suero Suero
Aplicación de las vacunas en modelos de infección ovinos
10 26 38
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200pCMV M4
pCMV (control)
dias post primera inmunización
VN
T 5
0
“DNA prime”
“MP12 boost”
> 2 meses
0 1 2 3 4 5 7 9 11 14 16 18 21 28 381
2
3
4
pCMV M4
pCMV (control)
dias post MP12 boost
log
VN
T5
0
pCMV-M4 en ovejas: anticuerpos neutralizantes
Lorenzo et al , unpublished
Esquema de inmunización de ovejas MVA GnGc
Aplicación de las vacunas en modelos de infección ovinos
rMVA 108 pfu
rMVA-GnGc 108 pfu G1 n=6
RVFV 56/74
105 TCID50
Inoculación s.c Desafío (sc) Necropsia
14
G2 n=6
0 30
Control saline G3 n=7
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1338
39
40
41
42
43
rMVAGnGc
MVA control
non-vaccinated
Mean temperatures
days postchallenge
tem
pera
ture
ºC
rMVA-GnGc
14 23 300
1
2
3
4
days post immunization
log
VN
T 5
0
rMVA control
14 23 300
1
2
3
4
days post immunization
log
VN
T 5
0
Non-vaccinated control
14 23 300
1
2
3
4
days post immunization
log
VN
T 5
0
MVA GnGc en ovejas: pirexia, anticuerpos neutralizantes
Hisopo nasal
3 5 70
2
4
6
8MVA GnGc
MVA control
Non-vaccinated
dias post desafío
log
TC
ID50
Sangre
3 5 7 90
2
4
6
8MVAGnGc
MVA (control)
Non vaccinated control
log
TC
ID50
Hisopo bucal
3 50
2
4
6
8MVAGnGc
MVA control
Non-vaccinated
log
TC
ID50
Busquets et al , unpublished
desafío
Agradecimientos • Elena López (CISA, Madrid) • Gema Lorenzo (CISA, Madrid) • Raquel Martin (UNED, Madrid) • Esther Hevia (Ingenasa, Madrid) • Hani Boshra (NCFAD, Winnipeg) • Paco Mateos (CISA, Madrid) • Belén Borrego (CISA, Madrid) • Sarah Gilbert (Jenner Institute, Oxford) • Matt Cottingham (Jenner Institute, Oxford) • George Warimwe (Jenner Institute, Oxford) • Gertrude Gerdes (OVI, Onderstepoort) • Shirley Smith (OVI, Onderstepoort • Clarence J. Peters (UTMB, Galveston) • Bob Tesh (UTMB, Galveston) • Paz Sánchez Seco (ISCIII, Majadahonda) • Ramón Soriguer (EBD, Doñana) • Jeroen Koortekaas (CVI, Lelystad) • Rob Moormann (CVI Lelystad) • Friedemann Weber (Phillipps University, Marburg) • Michele Bouloy (Institut Pasteur) • Martin Eiden (FLI, Insel Reims) • Martin Groschup(FLI, Insel Reims) • Mariano Domingo (CReSA, Barcelona) • Xavier Abad (CReSA, Barcelona)
• Nuria Busquets (CReSA, Barcelona) • Fernando Rodríguez (CReSA, Barcelona) • Raquel Rivas (CReSA, Barcelona) • Albert Bensaid (CReSA, Barcelona) • Nicola G Abrescia (CIS-Biogune, Bilbao) • Richard P. Bishop (ILRI, Nairobi) • Rosemary Sang, KEMRI, Nairobi • Dufton Mwaengo (ILRI, Nairobi) • Antonio López Sebastian (INIA, Madrid) • Pilar Pallarés (INIA, MAdrid) • Mónica Morales (UNED, Madrid) • Jesús Bermejo (Hospital Clínico, Valladolid) • Antonio Sanz (Ingenasa, Madrid) • Gerónimo Fernandez (Fac Quimicas, Alcalá) • Dolores Rodríguez (CNB, Madrid)
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