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La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y Seguimiento de la
Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN)
Amparo Sempere
Servicio de Hematología
H.U. La Fe
III Reunión Anual de la Asociación Valenciana de Hematología y
HemoterapiaCastellón, 27 de febrero de 2009
HPNHPNDefiniciónDefinición
• Enfermedad clonal adquirida de la célula hematopoyética pluripotencial
• Mutación somática en el gen PIG-A (fosfatidil-inositol-glucano de clase A) implicado en la síntesis de glucosilfosfatidilinositol (GPI)– Carencia total o parcial de la expresión de
proteínas ancladas a la membrana a través del componente GPI en parte de la células hematopoyéticas
HPNHPNAlteración genética: Gen PIG-AAlteración genética: Gen PIG-A
• Uno de los más de 20 genes implicados en la síntesis de las proteínas ancladas a GPI
• Se encuentran mutaciones del gen PIG-A en todos los casos en que se ha interrumpido la síntesis de GPI
• Como consecuencia de la mutación se reduce o falta la expresión de proteínas ancladas a la superficie de la célula por moléculas de GPI
Bloqueo en la HPN
PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK
HPNHPNProteínas ancladas a GPIProteínas ancladas a GPI
Hernández-Campo et al. Med Clin. 2008; 131: 617-630
• Enzimas: acetilcolinesterasa, fosfatasa alcalina granulocítica
• Moléculas de adhesión: CD48, CD58, CD66b-c• Proteínas reguladoras del complemento:
CD55: factor que acelera la degradación de las convertasas del complemento (DAF)
CD59: inhibidor de membrana de la lisis reactiva (MIRL)
• Receptores: CD14, CD16, CD87, CD90• Antígenos de grupos sanguíneos eritrocitarios• Antígenos del neutrófilo• Otros: CD24, CD52
CD59, CD90, CD109
CD55CD58CD59 CD48CD52PrPcCD16
CD24 CD55CD58 CD59 CD48 PrPC CD73 CD108
CD55CD58CD59CD109PrPCGP500Gova/b
CD55CD58CD59PrPCAChEJMH AgDombroch HG Ag
CD55 CD58*CD59 CD14CD16 CD24CD48 CD66bCD66c CD87CD109 CD157LAPNB1 PrPCp50-80 GPI-80ADP-RT NA1/NA2
CD14 CD55CD58*CD59 CD48 CD52CD87 CD109CD157Grupo 8 PrPC GPI-80CD16
CD55 CD58*CD59 CD48CD52 CD87 CD108 PrPcADP-RT CD73CD90 CD109CD16*
Células progenitoras hematopoyéticas
Plaquetas
Hematíes
PMN
Células B
Monocitos
Células T
Células NK
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((Cortesía de Lucio Cortesía de Lucio Luzzatto)Luzzatto)
PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK
Distribución de las proteínas Distribución de las proteínas ancladas a GPIancladas a GPI
Déficit de proteínas GPI: Déficit de proteínas GPI: hemólisis intravascularhemólisis intravascular
• La reducción o ausencia de CD55 y CD59 en la superficie de los eritrocitos los hace muy vulnerables a la acción del complemento y provoca su destrucción
• CD55 (DAF): previene la formación de complejos C3-C5-convertasa esenciales para la amplificación de la secuencia de activación de las proteínas del sistema de complemento
• CD59 (MIRL): inhibe la formación del complejo de proteínas del sistema del complemento C5b-C9 de ataque de membrana
• Déficit de CD59: formación de poros en la membrana y muerte celular
HPNCascada del Complemento
Vía alternativa
Vía clásicaCD59
Complejo de ataque a lamembrana
CD59
CD59
PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK
HPNHPNTipos de hematíes según Tipos de hematíes según
sensibilidad al complemento sensibilidad al complemento
• HPN tipo I: sensibilidad normal a la acción del complemento
• HPN tipo II: sensibilidad intermedia (3-5 veces superior a la normal). Déficit parcial de CD59
• HPN tipo III: sensibilidad elevada (15-25 veces superior a la normal). Déficit total de CD59
Rosse WF, Dacie JV. J. Clin Invest 1966, 45: 736-748
Rosse WF, Dacie JV. J. Clin Invest 1966, 45: 749-757
HPNHPNIncidencia y prevalenciaIncidencia y prevalencia
• Enfermedad rara, pero grave
• Incidencia: 1,3 casos por 1.000.000 habitantes y año
• Prevalencia: 7-16 casos por 1.000.000 habitantes
• Afecta igual a hombres y mujeres
Hill A et al. Blood 2006; 108: A985
HPNHistoria Natural
Gran Bretaña
Francia USA Japón
Referencia Hillmen, 1995
Peffault de Latour, 2008
Nishimura, 2004
Nishimura,
2004
Pacientes 80 460 176 209
Edad mediana (años)
42 34 30 45
Supervivencia mediana (años)
10 22 23 25
AA previa 29% 23% 29% 38%
Trombosis 39% 31% 32% 4%
Transformación a leucemia/SMD
0% 8% 4% 7%
HPNHistoria Natural
• Amplio espectro de manifestaciones clínicas• Mediana de edad al diagnóstico 40 años• Mortalidad atribuible 50% (trombosis y
citopenias)– La trombosis es la principal causa de mortalidad y de
morbilidad
• Mediana de supervivencia: 10-25 años• Remisión espontánea: 15%
HPN Clínica
Hemoglobinuria
Hemólisis intravascular– síntomas 1
- dolor abdominal- disfagia- disfunción eréctil- letargia
Trombosis
Trombosis2,3
- hepática, cerebral
50% de pacientes
Anemia aplásica
Insuficiencia medular- puede preceder a la HPN4,5
1. Rother et al. JAMA 2005;293:1653-627. 2. Hillmen P, Lewis SM, Bessler M et al. N Engl J Med 1995;333:1253-8. 3. Socie G, Mary JY, Gramont A et al. Lancet 1996;348:573-7. 4. Wang et al. Blood
2002;100:3897–902. 5. Dunn et al. Ann Int Med 1999;131:401–8.
HPNHPNClasificaciónClasificación
• HPN clásica: hemólisis intravascular, % elevado de granulocitos deficientes en proteínas GPI y una población mayoritaria de hematíes tipo III. Sin otra enfermedad medular asociada
• HPN asociada a otras hemopatías: hemólisis intravascular en el contexto de otra enfermedad medular como AA y SMD
• HPN subclínica: sin evidencia clínica ni analítica de hemólisis. Mediante citometría de flujo se detectan pequeños clones de células de HPN. Asociación frecuente con insuficiencia medular (AA y SMD)
Parker C et al. Blood 2005;106:3699-709
¿HPN sintomática o ¿HPN sintomática o molecular?molecular?
• Mosaicismo: células progenitoras normales y patológicas• Enfermos con pequeños clones raramente tendrán
síntomas relacionados con la HPN • En pacientes con clones de granulocitos HPN < 10% la
clínica de hemólisis será mínima o nula (AA y anemia refractaria)
• Un clon de granulocitos HPN superior a 50%: mayor riesgo de trombosis
• El tamaño del clon puede variar con el tiempo y un 15% de enfermos con HPN hemolítica pueden tener remisión espontánea
• El tratamiento va a depender, en gran medida, de la presentación clínica y del tamaño del clon HPN
HPNHPNTratamientoTratamiento
• Sintomático (transfusiones, anticoagulación oral, corticoides, ácido fólico, hierro,…)
• Trasplante de progenitores hematopoyéticos: único tratamiento curativo
• Eculizumab (anti-C5): nuevo tratamiento específico de la HPN (Registro Internacional de HPN)
Complementarity determining regions(murine origin)
Human IgG4 heavy chainconstant regions 2 and 3
Human framework regions
Human IgG2 heavy chainconstant region 1 and hinge
CH1
CH
3C
H2
Hinge
CL
Rother et al. Nature Biotech 2007;25:1265–73
Eculizumab: Anticuerpo anti-C5
HPNCascada del Complemento
Vía alternativa
Vía clásicaCD59
Complejo de ataque a lamembrana
CD59
CD59
Eculizumab
PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK
HPNHPN¿Quién debería ser estudiado?¿Quién debería ser estudiado?
• Hemoglobinuria• Hemólisis intravascular no inmune (Coombs negativo,
LDH elevada) especialmente si ferropenia• Trombosis de localización infrecuente: síndrome de Budd-
Chiari, venas abdominales, cerebrales o dérmicas • Anemia aplásica• SMD: Anemia refractaria • Disfagia o dolor abdominal y hemólisis intravascular• Citopenias mantenidas de origen desconocido
Parker C, Omine M, Richards S et al. Blood, 2005; 106: 3699-709
HPNHPNEvaluación inicialEvaluación inicial
• Estimar el grado de hemólisis: hemograma,
reticulocitos, LDH sérica, bilirrubina fraccionada y haptoglobina
• Determinar el grado de insuficiencia medular: aspirado y biopsia de médula ósea y citogenética
• Establecer el déficit de proteínas asociadas a GPI: detección de poblaciones de células de sangre periférica (hematíes, neutrófilos y monocitos) deficientes en antígenos asociados a grupos GPI
Parker C, Omine M, Richards S et al. Blood, 2005; 106: 3699-709
HPNHPNMétodos DiagnósticosMétodos Diagnósticos
• Pruebas clásicas: aumento de la sensibilidad de los hematíes a la lisis mediada por el complemento
• Citometría de flujo (CMF): ausencia de proteínas asociadas a grupos GPI
• Análisis molecular: secuenciación e identificación de mutaciones del gen PIG-A
HPNHPNPruebas ClásicasPruebas Clásicas
Pruebas de Ham-Dacie y de sacarosa
• Técnicas laboriosas • Difícil estandarización• Restringidas a hematíes• Falsos negativos (especialmente en pacientes
transfundidos) • Requiere un 5% de células tipo III (déficit total) o un
20% de tipo II (déficit parcial) para dar resultados positivos
• Interés histórico
Suero fresco
Suero fresco acidificado inactivado por calor
Salino + hematíes
SacarosaControl de sacarosa
Suero fresco acidificado +
magnesio
Suero fresco acidificado
PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK
HPNHPNAnálisis MolecularAnálisis Molecular
• Secuenciación del
gen PIG-A• No aplicable como
técnica de rutina• Laboratorios de
investigación
HPNHPNCitometría de FlujoCitometría de Flujo
• Nicholson-Weller, 1985: aplicación de la CMF al diagnóstico de la HPN
• Van der Schoot, 1990: superioridad de la CMF sobre la prueba de Ham
• Hall & Rose, 1996: CMF como método de elección• Brodsky, 1999, 2000: método diagnóstico alternativo,
proaerolisina conjugada con fluoresceína (FLAER, de fluorescein-labelled AERolysin)
Vidriales M. B. Haematologica (ed. esp.) 2008; 93 (Supl.2); 9-11
Citometría de FlujoCitometría de FlujoVentajasVentajas
• Rapidez (1 hora)• Sensibilidad (clones <1%)• Marcaje múltiparamétrico: con tres anticuerpos la
sensibilidad puede llegar a 0,01%• Análisis de diferentes líneas celulares• Detección de clones de hematíes tipo I/II/III• Cuantificación y monitorización del tamaño del clon
HPN
HPNHPNCitometría de FlujoCitometría de Flujo
• El análisis por citometría de flujo es el método de elección para el diagnóstico y seguimiento de la HPN
Citometría de FlujoCitometría de FlujoCélulas Células
Analizar un mínimo de dos líneas celulares:
• Hematíes
• Neutrófilos y monocitos
• Linfocitos: discrepancias en el tamaño clonal respecto a los neutrófilos
• Plaquetas: expresión débil y variable de proteínas GPI en controles sanos
Citometría de Flujo Tamaño del clon HPN
• Tamaño del clon de hematíes
- Tipos de hematíes: I/II/III
- Proporción de hematíes HPN en relación a la última transfusión
• Tamaño del clon de neutrófilos: refleja mejor el tamaño del clon HPN
• Tamaño del clon de monocitos: valida el tamaño del clon HPN (puede tener discrepancias con los neutrófilos)
Citometría de FlujoCitometría de FlujoEstudio de hEstudio de hematíesematíes
• Análisis multiparamétrico con marcaje directo• Adquisición con SSC/FSC en escala logarítmica • Estudio de dos antígenos GPI diferentes: CD55 y CD59 (permite
descartar deficiencias congénitas aisladas)• Incluir un AcMo frente a un antígeno eritroide no asociado a GPI
para seleccionar los hematíes (CD235a)• CD59: discrimina hematíes tipo I, II y III • Las transfusiones afectan el tamaño del clon de hematíes (realizar
estudio tras un mínimo de un mes desde la última transfusión) • El estudio puede realizarse hasta 2 semanas tras la extracción de la
muestra (mantener los hematíes a 4º C)• Incubación mínima de 15 min y un solo lavado• Incluir un control de sangre normal
Hematíes: análisis multiparamétrico
CombinaciónCD59 FITC/CD55PE/CD235a PE-Cy5
Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK
CD59: Identificación y cuantificación de clones HPN
Tipo I: células con expresión normal de CD59Tipo II: células con deficiencia parcial de CD59Tipo III: células con deficiencia completa de CD59
PNH
Co
un
t
CD59 FITC-A
PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK
HPN clásica: hematíes
SANTIAGO JOSE ALBA T7 CD55.007CD55 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
SANTIAGO JOSE ALBA T8 CD59.008CD59 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD55 CONTROL T3.003CD55 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD59 CONTROL T4.004CD59 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Control Control
HPN clásica
HPN clásica
Tipo III
Tipo II
Tipo I
HPN CD59: hematíes
T4 FRANCISCO M RUIZ SORIA.006CD59 FITC ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
SANTIAGO JOSE ALBA T8 CD59.008CD59 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD59 CONTROL T4.004CD59 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Control
HPN AA
HPN clásica
Tipo III
Tipo II
Tipo I
T-4 QIAOLI YE CD59 HEMATIES.007CD59 FITC ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
HPN subclínica
<1%
12,2%
84%
Citometría de FlujoCitometría de FlujoEstudio de lEstudio de leucocitoseucocitos
• El análisis en granulocitos es superior al de hematíes para
establecer el tamaño del clon HPN • El estudio debe ser multiparamétrico lo que permite detectar
de forma simultánea la deficiencia de antígenos GPI e identificar clones de HPN de pequeño tamaño
• Es muy importante la selección de los AcMo contra antígenos GPI (alta expresión en células normales, específicos de una línea celular, baja afinidad por uniones inespecíficas y combinables en un marcaje múltiple)
• Es recomendable utilizar AcMo no asociados a GPI para seleccionar la población diana
• La técnica de FLAER permite detectar pequeños clones HPN
Citometría de FlujoCitometría de FlujoNeutrófilos y monocitosNeutrófilos y monocitos
• Sangre periférica en EDTA (<24 horas) • Análisis multiparamétrico con marcaje directo • Neutrófilos: CD16, CD24, CD55, CD59 y CD66b• Monocitos: CD14, CD52, CD55, CD59 • Selección de la población: CD15, CD33 • Se debe valorar la presencia de formas inmaduras y
displasia (citología/CMF). • Adquisición de 100.000 eventos• Incluir un control normal de forma paralela• CD55 y CD59: lisar y marcar • Análisis inicial de neutrófilos y monocitos (CD16/CD14), si
compatible con HPN analizar hematíes
P1+P3 = granulocitos P2+P4 = monocitos
Estrategia de análisis: Estrategia de análisis: neutrófilos y monocitosneutrófilos y monocitos
Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK
Neutrófilos: CD16
0 256 512 768 1024
PRUEBA HPN .001FSC-Height ->
PRUEBA HPN .001CD16 FITC ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
PRUEBA HPN .001CD16 FITC ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
ENRIQUE BISBAL FORES 6C_1.fcsCD16 FITC-A ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Control
HPN Subclínica
HPN Clásica
Neutrófilos: CD55
T-6 SANTIAGO J.ALBA CD55.006CD55 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
0 256 512 768 1024
PRUEBA HPN .001FSC-Height ->
Control HPN clásica: 92%
T2 CD55 QIAOLI YE.011CD55 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
HPN AA 3,5%
T4 CD55 CONTROL.013CD55 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Neutrófilos: CD55
T6CD55 RUT LUCAS DOMINGUZ.015CD55 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
T-6 SANTIAGO J.ALBA CD55.006CD55 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
T4 CD55 CONTROL.013CD55 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
ControlHPN clásica:
92%
HPN AA: 6,5%
T2 CD55 QIAOLI YE.011CD55 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
HPN subclínica:
1,2%
Monocitos: CD14
CONTROL HPN_1.fcsCD14 APC-Cy7-A ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
SANTIAGO J ALBA LOPEZ 6C_1.fcsCD14 APC-Cy7-A ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
RUT LUCAS DOMINGUEZ 6C_1.fcsCD14 APC-Cy7-A ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4Control
HPN AA: 7%
HPN clásica:
93%
Monocitos: CD55
T-2 CD55 ENRIQUE BISBAL F..004CD 55 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
0 256 512 768 1024
T-3 CD59 ENRIQUE BISBAL F..005FSC-Height ->
T-4 CONTROL CD55.002CD 55 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
T6CD55 RUT LUCAS DOMINGUZ.015CD55 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
HPN AA: 6%
HPN clásica:
93%Control
Citometría de FlujoCitometría de Flujo FLAERFLAER
• La aerolisina es una toxina secretada por la La aerolisina es una toxina secretada por la Aeromonas Aeromonas
hydrophilahydrophila, que produce hemólisis mediante la unión a la , que produce hemólisis mediante la unión a la molécula GPI molécula GPI
• La proaerosilina es una variante inactiva de la proteína bacteriana que está conjugada con fluoresceína (FLAER) y que mantiene la capacidad de unión a GPI sin causar lisis
• Restringida a leucocitos, permite la identificación y cuantificación de pequeños clones de HPN (<0,02%)
• Puede utilizarse sola o en combinación con más anticuerpos dirigidos frente antígenos GPI
• Permite el análisis de pacientes con SMDBrodsky RA, et al. Blood 1999; 93: 1749-1756. Brodsky RA, et al. Blood 1999; 93: 1749-1756.
Brodsky RA, et al. Am J Clin Pathol 2000;114:459–466
Citometría de FlujoCitometría de Flujo FLAER FLAER
FL
AE
R A
lexa
488
Brodsky RA, et al. Am J Clin Pathol 2000;114:459–466
Células HPN
Células normales
Células normales
FLAER: análisis de los clonesFLAER: análisis de los clones
Clon de granulocitos HPN = 8,9% Clon de monocitos HPN = 8,1%
HPN
HPN
FLAER/ CD24 /CD16 /CD33/CD15/CD14
Cullen M. PNH Masters. October 15-17, 2008. Leeds, UK
HPNHPNCMF: SeguimientoCMF: Seguimiento
• El seguimiento y la monitorización del clon de HPN es esencial en el manejo clínico del enfermo
• En los enfermos en tratamiento con eculizumab aumenta el clon de hematíes y se iguala al de neutrófilos en unos 6 meses de media
• Monitorizar el clon de granulocítos es importante por el riesgo de trombosis
• En HPN subclínica se recomienda controlar el tamaño del clon tras iniciar tratamiento con inmunosupresores
• El tamaño del clon puede variar con el tiempo y pacientes con un clon de HPN estable y de tamaño intermedio peden tener una remisión espontánea
Richards SJ et al. Cytometry 2007; 72B: 291-298
Citometría de Flujo Citometría de Flujo Seguimiento del clon HPNSeguimiento del clon HPN
Controles mínimos (Registro Internacional de HPN):• Pacientes con HPN clásica sin eculizumab y en HPN
asociada o subclínica: anual• Enfermos con HPN con eculizumab: al inicio del
tratamiento, a los 6 meses y después anual• Reevaluación si cambios clínicos
Richards SJ et al. Cytometry 2007; 72B: 291-298
T4 CD59 ENRIQUE BISBAL.006CD59 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
CD59 CONTROL T4.004CD59 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
ENRIQUE BISBAL FORES 59 T6.006CD59 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
SeguimientoSeguimientoClon de hematíes con eculizumabClon de hematíes con eculizumab
Células control
HPN clásica: 60% diagnóstico
HPN clásica: 95% 1 año con eculizumab
SeguimientoSeguimientoClon de neutrófilos con eculizumabClon de neutrófilos con eculizumab
T-2 CD55 ENRIQUE BISBAL F..004CD 55 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
T-4 ENRIQUE BISBAL CD55.004CD55 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
Células control
HPN clásica: 94%, diagnóstico
HPN clásica: 98%, 1 año con eculizumab
T-4 CONTROL CD55.002CD 55 ->
10 10 10 10 100 1 2 3 4
HPN HPN CMF: Temas pendientesCMF: Temas pendientes
• El Registro Internacional de HPN requiere que los
datos aportados sean lo más homogéneos posible • El uso de diferentes técnicas complica la
estandarización de los resultados• No se dispone de criterios inmunofenotípicos
validados para el diagnóstico de HPN• Falta de consenso en la estrategia de análisis y en la
selección de los anticuerpos• Necesidad de reuniones de consenso
Citometría de Flujo Reunión de Consenso
Madrid, 27 de enero 2009
• Objetivo principal: intentar llegar a un consenso en los puntos esenciales del diagnóstico de HPN por CMF, para tratar de disminuir, en lo posible, las diferencias técnicas e intentar homogeneizar los resultados entre distintos laboratorios
Citometria de Flujo: Reunión de Consenso
Madrid, 27 de enero 2009
• Deben analizarse al menos dos líneas celulares con al menos dos antígenos asociados a GPI
• Marcaje multiparamétrico• Se recomienda el estudio de neutrófilos y hematíes• Cálculo del tamaño del clon
Granulocitos: CD16, CD66, CD24 o CD55
Hematíes: CD59 o CD55/CD59 en marcaje combinado
Monocitos: CD14 y CD55• En el estudio de HPN subclínica, se recomiendan técnicas de
CMF de alta resolución y llegar a una sensibilidad de 0,1% • Realizar el estudio de hematíes y leucocitos de forma
independiente• Necesidad de disponer de un control de calidad externo
La Citometría de Flujo en el Diagnóstico y Seguimiento de la
Hemoglobinuria Paroxística Nocturna (HPN)
Amparo Sempere
Servicio de Hematología
H.U. La Fe
III Reunión Anual de la Asociación Valenciana de Hematología y
HemoterapiaCastellón, 27 de febrero de 2009
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