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TÉCNICAS PARA MEDICIÓN DE BIOMASA
IVIS HERAZO MURILLO
YULY PETRO NEGRETEJUEN QUINTERO MERCADO
Presentado a:
Ing. CARLOS GARCIA
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRÍCOLAS
PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
BERASTEGUI
2008
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INTRODUCION
El crecimiento microbiano se define como el aumento del numero de individuos
(microorganismos) y constituye una variable de gran importancia en el
desarrollo biotecnológico; su medición permite en muchas ocasiones evaluar la
eficiencia de los bioprocesos. Existen diversas técnicas para medir la cantidad
de células de un cultivo, cada una de las cuales presenta una serie de ventajas
y desventajas con respecto a los demás, pero por lo general todas reportan
datos que se aproximan a la realidad (con mayor o menor exactitud).
En el presente informe se estudiaran 3 técnicas para la medición de biomasa:
peso seco, densidad óptica y recuento total directo (cama de Neubauer). Se
analizaran los resultados obtenidos mediante dichas técnicas, así como
también las ventajas y desventajas que ofrece cada una de ellas. De igual
manera se reportaran otras técnicas para la medición de biomasa.
Para tales objetivos se realizaron consultas en textos afines e Internet.
Todo lo anterior permitirá ampliar los conocimientos sobre el tema, lo cual es
de suma importancia para el desempeño del ingeniero de alimentos en el área
de la Biotecnología.
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OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Estudiar las técnicas para medición de biomasa
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Analizar los resultados obtenidos mediante las técnicas de medición de
biomasa: peso seco, densidad óptica, y recuento total directo.
• Comparar los resultados obtenidos por cada técnica para la medición de
biomasa.
• identificar las ventajas y desventajas de las técnicas de medición de
biomasa.
• Describir otros métodos para la medición de biomasa celular
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MEDICIÓN DE BIOMASA CELULAR
El cálculo del número de células que existen en una suspensión se puede
llevar a cabo mediante el recuento celular (microscopía, número de colonias),
masa celular (peso seco, medida del nitrógeno celular, turbidimetría) o
actividad celular (grado de actividad bioquímica con relación al tamaño de la
población). Todos estos métodos se clasifican en dos apartados: métodos
directos y métodos indirectos.
Métodos directos:
• Recuento del número de células en una cámara Thoma
• Peso seco celular
• Determinación de nitrógeno o de proteínas totales
• Determinación de DNA
Métodos indirectos:
• Recuento de colonias en placa
•
Recuento sobre filtro de membrana• Consumo de oxígeno
• Liberación de dióxido de carbono
• Concentración de un enzima constitutivo
• Decoloración de un colorante
• Incorporación de precursores radiactivos
• Medida de la turbidez
PESO SECO CELULAR
El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se
encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un
horno a 105°C hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes
volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos
representan el peso de un gran número de bacterias. La desventaja de este
método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse por elsecado y puede existir alguna degradación. También la muestra seca puede
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recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una
humedad relativa alta.
"El aumento de volumen con la humedad tiene un límite. Este va creciendo
hasta que la célula alcanza un porcentaje de humedad que corresponde al
punto de saturación de la pared celular, aproximadamente del 30 % para todas
las especies en cálculos técnicos. A partir de éste valor el volumen permanece
constante, ya que el agua que penetra en el volumen de las células no produce
hinchamiento de la pared celular. Por lo tanto, el valor del 30 % es un valor
para utilizarlo prácticamente, si bien cada especie tiene su punto de saturación
de la pared celular" (2). No sucede así con el peso, cuyo valor sigue
aumentando hasta alcanzar el contenido máximo de agua para la especie
correspondiente. Como consecuencia de lo anteriormente expuesto, se
definen, para una célula los siguientes pesos específicos:
Peso específico anhidro
Peso específico a H % de humedad
Peso seco volumétrico saturado
Peso seco volumétrico húmedo.
DENSIDAD ÓPTICA
Esta técnica se basa en el principio de que la cantidad de luz dispersada es
proporcional a la masa de células presentes en la trayectoria de la luz. Se
refiere a la medida de cantidades relativas de luz absorbida por una muestra,
en función de la longitud de onda.
Cada componente de la solución tiene su patrón de absorción de luz
característico. Comparando la longitud de onda y la intensidad del máximo de
absorción de luz de una muestra versus soluciones standard, es posible
determinar la identidad y la concentración de componentes disueltos en lamuestra (solución incógnita).
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Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de
diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamaño celular, tienen
casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco. Esto
quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente
proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del
microorganismo.
Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partícula o por
UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaños de las células
bacterianas son diferentes. Por esta razón, para estimar el número de
microorganismos totales o el número de microorganismos viables de una
suspensión bacteriana debe realizarse una "curva de calibración" con cada tipo
de microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia
(Densidad Óptica) con el número de microorganismos totales o con UFC.
Fig. Absorbancia en función de la concentración de células
CONTEO DIRECTO (CAMARA DE NEUBAUER)
Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un equipamiento fácilmente
disponible en un laboratorio. La cámara de Neubauer. Tiene dos cámaras de
conteo.
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Detalle de la cámara de conteo, con cuatro áreas de 1 mm2 (marcadas con L)
La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener reproductibilidad en el
llenado de la cámara con líquido. Otra dificultad es la adsorción de las células
en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas.
Esta adsorción es crítica en el proceso de dilución de la muestra y se minimiza
al realizar las diluciones en medios de alta fuerza iónica (solución fisiológica o
medios mínimos sin fuente de carbono).
Una de las mayores ventajas del recuento microscópico es brindar información
adicional sobre el tamaño y la morfología de los objetos contados.
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DATOS DE PARTIDA
• SOLUCIÓN MADRE
1g de célula en 1L = 1000mg/L = 1000ppm
• PESO SECO
Para determinar la concentración final se aplicó la ecuación C1V1 = C2V2
Tubo Nº 1
C1 = 1000ppm*0 ml / 10 ml = 0 ppm
Tubo Nº 2
C2 = 1000ppm x 2 ml / 10 ml = 200 ppm
Tubo Nº 3
C3 = 1000ppm x 4 ml / 10 ml = 400 ppm
Tubo Nº 4
C4 = 1000ppm x 6 ml / 10 ml = 600 ppm
Tubo Nº 5
C5 = 1000ppm x 8ml / 10 ml = 800 ppm
Tubo Nº 6
C6 = 1000ppm x 10 ml / 10 ml = 1000 ppm
Tabla Nº 1TUBO 1 2 3 4 5 6ml de agua 10 8 6 4 2 0ml de cultivo 0 2 4 6 8 10
[ppm] 0 200 400 600 800 1000
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Tabla Nº 2
Tubo 1 2 3 4 5 6Peso
Tubos(g)18.9066 18.3760 18.4472 15.4872 18.5931 18.3880
• DENSIDAD ÓPTICA
Para calcular las nuevas concentraciones, se partió de las diluciones realizadas
en la técnica de peso seco (0, 200, 400, 600, 800, 1000 respectivamente).
C1V1 = C2V2
C2 (tubo1) = 0 ppm x 1 ml / 9 ml = 0 ppm
C2 (tubo2) = 200 ppm x 1 ml / 9 ml = 22.2ppm
C2 (tubo3) = 400 ppm x 1 ml / 9 ml = 44.4 ppm
C2 (tubo4) = 600 ppm x 1 ml / 9 ml = 66.67 ppm
C2 (tubo5) = 800 ppm x 1 ml / 9 ml = 88.89 ppm
C2 (tubo6) = 1000 ppm x 1 ml / 9 ml = 111.1 ppm
Tabla 3
Tubo1 Tubo2 Tubo3 Tubo4 Tubo5 Tubo6V1(ml) 1 1 1 1 1 1C1(ppm) 0 200 400 600 800 1000V2(ml) 9 9 9 9 9 9C2(ppm) 0 22.2 44.4 66.67 88.89 111.1
• CONTEO DIRECTO (Cámara de Neubauer)
Para este ensayo, se tomaron 0.5ml de cada tubo empleado en el ensayo de
densidad óptica.
CALCULOS Y RESULTADOS
1. PESO SECO
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Tabla Nº 4
Tubo Peso (tubo+muestra seca)g1 18.90662 18.3885
3 18.51654 16.67745 18.66126 18.4163
Peso Seco (Ps) = peso (muestra seca + tubo) – peso del tubo
Se debe multiplicar por el factor de dilución Fd = 1/9 para que el resultado de
en g de células / ml. El peso de los tubos se observan en la tabla 2.
Tubo Nº 1
Ps = 18.9066 g – 18.9066g = 0
Tubo Nº 2
Ps = 18.3777g – 18.3760g = 0.0017 g/ml x Fd = 1.88 x 10-4 g de célula/ml
Tubo Nº 3
Ps = 18.4507g – 18.4472g = 0.0035 g/ml x Fd = 3.88x10-4 g de célula/ml
Tubo Nº 4
Ps = 15.4929g – 15.4872g = 0.0057 g /ml x Fd = 6.33x10-4g de célula/ml
Tubo Nº 5
Ps = 18.6002g – 18.5931g = 0.0071 g/ml x Fd = 7.88x10-4g de célula/ml
Tubo Nº 6
Ps = 18.3980g – 18.3880g = 0.01 g/ml x Fd = 1.11x10-3g de célula/ml
Reporte Final
Tabla Nº 5TUBOS
1 2 3 4 5 6g de
cel/ml0 1.88 x 10-4 3.88x10-4 6.33x10-4 7.88x10-4 1.11x10-3
g de cel/L 0 0.188 0.388 0.633 0.788 1.11
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2. DENSIDAD OPTICA
Los resultados de la absorbancia para las concentraciones de 0, 22.2, 44.4,
66.67, 88.89 y 111.1 ppm medidas a una longitud de onda de 540nm fueron los
siguientes:
Tabla Nº 6
Tubo [ppm]Absorbancia
540 nm1 0 02 22.2 0.0143 44.4 0.028
4 66.67 0.0535 88.89 0.0866 111.1 0.1220
3. CONTEO DIRECTO
El conteo de células en los cuadros sombreados fue el siguiente para cada
tubo
1 4
2 5
Tabla Nº 7
CUADRO NºNumero de células
1 2 3 4 5 6
1 0 1 4 13 3 122 0 2 4 6 3 143 0 4 2 7 9 114 0 3 2 4 10 115 0 1 3 6 6 10
Total células/0.1mm3 0 11 15 36 31 58
El factor de conversión a utilizar será:
Células/L= (total células/5)x25= (cel./0.1mm3)x1000mm3/1cm3= cel./ml x
1000ml/1L= Cel/L*Fd
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Tubo Nº 2
(11 cel/5) x 25 = 55 cel/0.1mm3 (10) = 550cel/mm3 x (1000mm3/1ml) x
(1000ml/1L) = 55X107 Cel/L x Fd
Tubo Nº 3
(15cel/5) x 25 = 75 cel/0.1mm3 (10) = 750cel/mm3 x (1000mm3/1ml) x
(1000ml/L) = 75x107cel/L x Fd
Tubo Nº 4
(36 cel/5) x 25 = 180 cel/0.1mm3 (10) =1800cel/ml x (1000mm3/1ml) x
(1000ml/L) = 1.8x109cel/L x Fd
Tubo Nº 5
(31 cel/5) x 25 = 175 cel/0.1mm3 (10) = 1750 cel/mm3 x (1000mm3/1ml) x
(1000ml/L) = 1.75x109 cel/L x Fd
Tubo Nº 6
(58cel/5) x 25 = 290 cel/0.1mm3 (10) = 2900 cel/mm3 x (1000mm3/1ml) x
(1000ml/L) = 2.9x109 cel/L x Fd
GRAFICAS
Nº cel/mil. vs Absorvancia
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,00E+00 1,00E+06 2,00E+06 3,00E+06 4,00E+06
Nº cel/mil
A b s o r v a c
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Gr celulas/L vs Absorvancia
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012
Gr cel/L
A b s o r v a n
ANÁLISIS DE RESULTADOS
Las técnicas mencionadas anteriormente y que estudiamos en el transcurso del
laboratorio son técnicas sencillas de fácil aplicación, que ofrecen ventajas pero
que también tienen sus limitaciones pero que una adecuada aplicación de
estas conducen a resultados confiables.
De acuerdo con los resultados se puede concluir que la técnica de peso secofue el método mas exacto, pues se acerco mas a los datos reales, sin embargo,
se observa que en el tubo # 4 y el tubo #6 los g de célula/L fueron mucho
mayor a las concentraciones de las diluciones madres (600 y 1000ppm) lo que
indica que hubo errores en la aplicación de la técnica en cuanto que se sobre
manipularon los tubos de ensayos, permitiendo que estos ganaran humedad;
también se atribuye un margen de error a las mediciones realizadas en la
balanza analítica la cual no se pudo calibrar adecuadamente e igual con lasmediciones volumétricas realizadas aumentaron el margen de error. Existe sin
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embargo la posibilidad de que no se evaporara el agua de la biomasa por
completo permitiendo de esta forma que se aumentara el peso. Para el resto de
tubos existe la posibilidad de que se volatilizaran componentes de la célula o
que igualmente repercutieran los errores de medición.
Los resultados obtenidos a través de el método de densidad óptica permiten
establecerlo como uno de los mas confiables, rápidos y sencillos, sin embargo,
las desviaciones que se observan al momento de graficar concentración de
células/L Vs absorbancia nos permite inferir que hubo errores leves en la
aplicación de la técnica en lo que corresponde a mediciones al momento de
realizar las diluciones lo que pudo haber limitado el método sin embargo la
correlación de 0.98 es aceptable, e indica que con un mejor manejo de las
condiciones optimas de aplicación la exactitud de los datos puede ser mayor .
Con el método de conteo directo se logró hacer una aproximación del número
de células/L que había en la muestra en estudio, no obstante se debe
mencionar que las principales fuentes de error en la aplicación de la técnica
obedecen a factores como la falta de habilidad y dominio de la técnica para
realizar el conteo requerido. De igual manera los procedimientos de limpieza u
enjuague de la cámara permitieron que los resultados se alteraran en cierto
margen.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
A partir del estudio de las técnicas para medición de biomasa y los resultados
obtenidos a través de su aplicación, se puede concluir que:
La medición de biomasa celular es un indicativo del crecimiento celular por lo
que es de gran importancia conocer y aplicar correctamente las técnicas que
permiten su realización; técnicas como el peso seco, densidad óptica y conteo
directo permiten una aproximación a la medida real de biomasa, sin embargo
son métodos que requieren del control de ciertos parámetros para su aplicación
y además del manejo adecuado de la técnica.
Los resultados obtenidos por medio de este laboratorio permite resaltar la
exactitud de los resultados obtenidos a través de la técnica de peso seco,motivo por el que se ratifica su utilización a nivel de laboratorio de igual manera
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la rapidez y confiabilidad de la técnica de densidad óptica respalda su uso para
la determinación de biomasa celular en el área de biotecnología; no obstante
los principales inconvenientes se presentaron en la aplicación de conteo directo
en cámara de Neubauer debido principalmente a la falta de habilidad en el
manejo de la técnica.
Una recomendación para mejorar la exactitud de las técnicas es el manejo de
las condiciones óptimas bajo las cuales se deben aplicar éstas, además de
realizarse un reconocimiento y calibración previa de los equipos e
instrumentos a utilizar todo con la finalidad de obtener resultados reproducibles
y confiables.
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PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS
1. Consulte y explique otros métodos utilizados para la medición de la
biomasa microbiana.
Absorción: Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una
partícula en suspensión, parte de la luz es reflejada, parte es
diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometría
mide la luz dispersada por una solución de partículas. La turbidimetría
mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a
través de la solución. Con relación a la longitud de onda y al tamaño de
la partícula pueden existir tres tipos de dispersión. Los métodos de
dispersión de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el
crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy útiles y poderosos pero
pueden llevar a resultados erróneos. Principalmente, dan información
sobre el peso seco (contenido macromolecular).
Turbidimetría: La turbidimetría mide la reducción de la transmisión de
luz debido a partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual
transmitida.Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de
diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamaño celular, tienen
casi la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco. Esto
quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente
proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del
microorganismo.
Peso húmedo: Se obtiene a partir de una muestra en suspensión quees pesada luego de la separación de las células por filtración o
centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra.
La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio
intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de líquido
retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células
bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular
que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma ydeformación celular. Para corregir el peso húmedo se determina la
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cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego
de una centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no
iónicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular
pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.
Volumen de células empacadas y número de células: El crecimiento
de una población bacteriana puede ser entendido desde diferentes
perspectivas y de acuerdo a éstas se puede llegar a determinar la
medida del crecimiento mediante diversas metodologías. Para algunos,
el crecimiento es la capacidad para multiplicarse que tienen las células
individuales, esto es iniciar y completar una división celular. De esta
forma, se considera a los microorganismos como partículas discretas y
el crecimiento es entendido como un aumento en el número total de
partículas bacterianas. Existen dos formas para determinar el número
total de microorganismos en una muestra:
a) Recuento microscópico de partículas
b) Recuento electrónico de partículas
Recuento microscópico: Es una técnica común, rápida y barata que
utiliza un equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio de
microbiología. Para estos recuentos se utilizan generalmente cámaras
de recuentos, aunque también pueden realizarse a partir de muestras
filtradas en membranas y transparentizadas o teñidas con colorantes
fluorescentes (Naranja de acridina).
La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener reproductibilidad en el
llenado de la cámara con líquido. Otra dificultad es la adsorción de las células
en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorción es crítica en el
proceso de dilución de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en
medios de alta fuerza iónica. Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley
y la de Petroff-Hausser . La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada
con objetivos de inmersión, aunque la mayoría de los recuentos se realizan con
objetivos secos. Una de las mayores ventajas del recuento microscópico es
brindar información adicional sobre el tamaño y la morfología de los objetos
contados.
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Cámara de recuento de Petroff-Hausser
Recuento electrónico: Los contadores electrónicos permiten realizar
recuentos de bacterias, levaduras no filamentosas y protozoarios, pero
no de hongos y microorganismos filamentosos o micelares. Estos
instrumentos constan básicamente de dos compartimientos
comunicados a través de un pequeño conducto. En ambos
compartimientos hay electrodos que miden la resistencia eléctrica del
sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeño y su resistencia
es muy alta, la resistencia eléctrica de cada compartimiento es
independiente.
Determinación de ácidos nucleicos: Es una técnica que permite
determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. Se
determina la cantidad existente de un determinado ácido nucleico
(generalmente DNA) y a partir de este dato se estima la masa de la
población.
Determinación de nitrógeno: Es una técnica que permite determinar
indirectamente la masa de una población bacteriana. Existen distintas
técnicas para determinar la cantidad de nitrógeno que contiene una
muestra con relación al compuesto que se quiera determinar. Puede
analizarse el nitrógeno no proteico mediante el NO2-, NO3
-, NH4+, el
nitrógeno proteico mediante absorción en UV, Reacción de Biuret,
Reacción de Lowry, o el nitrógeno total mediante la Digestión de
Kjeldahl.
Incorporación de precursores radiactivos: Es una técnica que
permite determinar indirectamente la masa de una población bacteriana. En
esta técnica se adiciona al medio un compuesto marcado radiactivamente que
puede ser incorporado a la célula, y luego se determina la cantidad de marca
incorporada por toda la población.
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2. ¿Qué son los colorantes supravitales?
Los colorantes supravitales son sustancias que colorean las partes internas de
las células sin necesidad de ser destruida, por lo general estos son compuestos
de color intenso que permite un resalte envidiable facilitando el conteo.
Son varios, como el azul de cresilo, violeta cristal, azul de Prusia, verde Jano
entre otros
3. Establecer un comparativo entre las tres técnicas estudiadas
Técnica Ventajas Desventajas
Densidadóptica
• Es rápida, precisa yversátil
• fácil de usar y eficienteen costo.
•
• Exacto en condicionesoptimas de aplicación deesta técnica.
• Se limita cuando se tienen en
el medio de fermentación otrossólidos en suspensión.•
• No diferencia células viables decélulas muertas.
•
• Es limitado paraconcentraciones muy elevadasde células en el medio defermentación
Peso seco
Esta técnica es útil paragrandes volúmenes demuestra, debido a quediferencias del orden de losmiligramos.•
• Representan el peso deun gran número debacterias
• Es económico y fácil deaplicar
Componentes volátiles de la célulapueden perderse por el secado•
• puede existir algunadegradación de la estructuracelular y/o componentescelulares.
•
• la muestra seca puede recobrar humedad durante el pesado,principalmente si el ambiente
tiene una humedad relativaalta.
•
• Se limita para células difícilesde centrifugar
•
• Requiere de mucho tiempo encomparación con los otrosmétodos
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Conteo directo(cámara deNeubauer)
• permite observar directamente lamorfología y tamaño delas células estudiadas.
•
• Indica condicionessubóptimas decrecimiento o presenciade un genotipo ofenotipo alterados
•
• utiliza un equipamientofácilmente disponible enun laboratorio debiotecnología
• Algunas células por su tamañono se pueden contar
•
• Se requiere tiempo y habilidad•
No es eficiente ensuspensiones poco densas.•
• Una dificultad es obtener reproductibilidad en el llenadode la cámara con líquido.
•
• Se presenta la adsorción de lascélulas en las superficies delvidrio, incluyendo pipetas.
BIBLIOGRAFIA
www.monografias.com
AURELIO HERNÁNDEZ MUÑOZ, "MICROBIOLOGÍA", EDITORIAL
PARANINFO, MADRID, 1997.
http://www.microbiología.com
http://www.geocities.com
STAINER, R. MICROBIOLOGÍA. BARCELONA: ED REVERTÉ S.A.
http://www.monografias.com/trabajos10/10cincrec/10cincrec.shtml?
relacionados http://www.uamenlinea.uam.mx/materiales/licenciatura/diversos/AQUIAH
UATL_RAMOS_MARIA_DE_LOS_ANGELES_Manual_de_practicas_de.
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