View
214
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 1 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
LINEAMIENTOS PARA LA VIGILANCIA POR
LABORATORIO DE
TOS FERINA Y SINDROME COQUELUCHOIDE
InDRE – RNLSP 2012
México, DF.
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 2 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
SECRETARIA DE SALUD
SALOMÓN CHERTORIVSKI WOLDENBERG SECRETARIO DE SALUD
DR. PABLO KURI MORALES
SUBSECRETARIO DE PREVENCIÓN Y PROMOCIÓN DE LA SALUD
DR. JESÚS FELIPE GONZÁLEZ ROLDÁN DIRECTOR GENERAL DE EPIDEMIOLOGÍA
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ DIRECTOR GENERAL ADJUNTO
DRA. MA. DEL CARMEN GUZMÁN BRACHO DIRECTORA DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA
QFB. LUCÍA HERNÁNDEZ RIVAS DIRECTORA DE SERVICIOS Y APOYO TÉCNICO
LIC. JESÚS OMAR CASTILLO HERNÁNDEZ SUBDIRECTOR DE OPERACIÓN
QBP. IRMA HERNÁNDEZ MONROY JEFA DEL DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍA
M EN C IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE VIROLOGÍA
QFB. ROBERTO VÁZQUEZ CAMPUZANO JEFE DEL DEPARTAMENTO DE ENFERMEDADES EMERGENTES Y URGENCIA
QC. ISRAEL PARRA ORTEGA JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA
DRA. CLARA GORODEZKY LAUFERMAN JEFA DEL DEPARTAMENTO DE INMUNOLOGÍA
M EN C JUDITH ESTÉVEZ RAMÍREZ JEFA DEL DEPARTAMENTO DE CONTROL DE MUESTRAS Y SERVICIOS
DR. ERNESTO RAMÍREZ GONZÁLEZ JEFE DEL DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y
VALIDACIÓN DE PRUEBAS
Q.B.P. MONICA GUADALUPE VIVEROS TERRAZAS JEFE DEL LABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS
Y PERTUSSIS
Q.B.P. GUADALUPE ADRIANA GALICIA JEFE DE LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA MOLECULAR
M EN C. ILIANA ALEJANDRA CORTÉS ORTIZ JEFA DEL LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO Y TIPIFICACIÓN MOLECULAR
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 3 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
Contenido
1. Introducción
2. Objetivo General
3. Vigilancia de la Tos ferina y Síndrome coqueluchoide por el laboratorio
4. Situación Actual y organización de la RNLSP para el Diagnóstico de la tos ferina
5. Consideraciones generales para el diagnóstico por laboratorio de la tos ferina
6. Diagnóstico por laboratorio de la tos ferina
7. Uso de la reacción en cadena de la polimerasa para detectar B. pertussis a partir de muestras
clínicas.
8. Nuevo Algoritmo para el Diagnóstico de tos ferina por PCR
9. Análisis de la información
10. Recursos
11. Evaluación del desempeño
12. Colección de cepas
13. Sistema de información
14. Referencias
15. Anexos
1. Introducción
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 4 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
La tos ferina es una enfermedad con tasas de morbilidad del 90 al 100% en contactos domésticos
que no han sido vacunados, se presenta en cualquier época del año especialmente en niños, donde
los lactantes menores de un año de edad ocupan el 41% de los casos declarados de tos ferina y el
78% de los fallecimientos debido a esta enfermedad. Entre adolescentes y adultos cercanos a casos
de tos ferina el 40 al 80% de los miembros de la familia desarrollan anticuerpos contra B. pertussis y
estos solo el 50% presentan signos y síntomas compatibles con esta enfermedad. En la actualidad se
acepta que adolescentes y adultos sintomáticos no diagnosticados, representan una fuente de
transmisión a lactantes y niños, así como un mecanismo de perpetuación de la enfermedad en la
población en general.
Por otra parte, en estudios realizados en brotes de tos ferina, sugieren que la inmunidad protectora
inducida por la vacuna tiene una duración determinada, de tal forma que el biológico elaborado con
la bacteria completa solo ofrece protección, aproximadamente durante 12 años, esto hace necesario
que en las zonas endémicas se mantenga una vigilancia epidemiológica permanente.
En México, como producto de la aplicación de la vacuna anti-pertussis, la morbilidad de la tos ferina
ha tenido una baja significativa, así en 1950 la tasa de morbilidad era de 130 por 100,000
habitantes, a 1980 disminuyó a menos de 10 por 100,000 habitantes, sin embargo a partir del año
2008 se ha presentado un notable incremento en el número de casos y en este año se presentaron
162 casos de este padecimiento a nivel nacional con una incidencia global de 0,15 por 100,000
habitantes. Durante el 2009 se confirmaron por laboratorio 185 casos (21%) de 879 estudiados y se
estudiaron un total de 2060 contactos y en 76 (3.8%) se detectó la presencia de Bordetella pertussis
y en 2010 se estudiaron un total de 722 casos de los cuales 46 (6.37%) fueron confirmados por el
laboratorio como positivos, de ahí la importancia de la búsqueda de portadores que son los que
favorecen la transmisión de esta enfermedad, a pesar de existir, la prevención a través de la
vacunación.
2. Objetivo general
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 5 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
Establecer las directrices para realizar el diagnóstico por laboratorio de la tos ferina y el Síndrome
coqueluchoide a través de la RNLESP de forma estandarizada, estableciendo los flujos de
información adecuados de los datos generados por el laboratorio en apoyo a la vigilancia
epidemiológica.
3. Vigilancia de la Tos ferina.
La Vigilancia Epidemiológica de la tos ferina y el Síndrome coqueluchoide consiste en producir y
difundir la información generada en el laboratorio, que contribuya a la prevención y control de estos
padecimientos; mediante el estudio y confirmación de casos probables o sospechosos así como el
de sus contactos intradomiciliarios,
El principal objetivo es caracterizar la etiología del síndrome coqueluchoide bacteriana y determinar
la frecuencia con que se presenta Bordetella pertussis y B. parapertusis, como agentes etiológicos
de este síndrome, y que al encontrar la presencia de estas bacterias deja de llamarse como tal y se
confirma como Tos ferina.
Las actividades a realizar para esta vigilancia son las siguientes:
Análisis de las muestras de exudado nasofaríngeo para la búsqueda de Bordetella
pertussis y B. parapertussis.
( anexo 1).
Envío del 100% de los aislamientos de Bordetella pertussis , B. parapertussis, u otras
especies de Bordetella spp, que se aíslen de los casos y sus contactos, al Instituto de
Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos que provienen de los diferentes niveles de salud
y de todas las Instituciones que forman parte del sistema Nacional de salud.
Envío del 100% de muestras positivas a Bordetella pertussis, B. parapertussis u otras
especies de Bordetella spp por PCR Tiempo Real (TR) o PCR Punto final (PF) de casos
de Tos ferina y sus contactos para control de calidad al Laboratorio de IRAs bacterianas
del InDRE
Envío del 10% de muestras negativas a Bordetella pertussis, B. parapertussis u otras
especies de Bordetella spp, por PCR TR o PCR PF de casos con Sx coqueluchoide para
control de calidad al Laboratorio de IRAs bacterianas del InDRE.
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 6 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
Informe de los resultados al epidemiólogo de la unidad solicitante del estudio
(dependiendo del nivel).
4. Situación Actual y organización de la RNLSP para el Diagnóstico de Tos ferina
La Red para el diagnóstico de tos ferina está formada por 26 laboratorios: Aguascalientes, Baja
California, Baja California sur, Chiapas, Chihuahua, Coahuila, Colima, Edo de México, Guanajuato,
Guerrero, Hidalgo, Jalisco, Michoacán, Morelos, Nayarit, Nuevo león, Oaxaca, Puebla, Querétaro,
Quintana roo, San Luis Potosí, Sinaloa, Sonora, Tabasco, Tlaxcala, Veracruz, y Zacatecas, los
cuales declaran en su marco analítico que realizan el cultivo para Bordetella pertussis y otras
especies, la mayoría de los LESP (83.8%) ya realizan este diagnóstico sin embargo, es necesario que
el 100% de los laboratorios participen en esta Red para fortalecer la vigilancia epidemiológica
continua de la tos ferina a nivel Nacional.
Los 26 laboratorios que pertenecen a la Red de Tos ferina realizan solamente la técnica de
aislamiento por cultivo e identificación bioquímica.
Los LESP de los estados de Campeche, Colima, Durango, Tamaulipas y Yucatán no están
incorporados a la Red.
Analizando la participación de estos 26 LESP, en el Programa Caminando a la Excelencia, que nos
permite evaluar el desempeño de los estados en relación a los programas prioritarios en salud; en los
últimos tres años tenemos que, de los 26 laboratorios que realizan el diagnóstico de Tos ferina,
específicamente en el indicador de Concordancia del Boletín Caminando a la Excelencia solo 10 de
26 laboratorios (38.46%) envían cepas para control de calidad de Bordetella pertussis y desde esta
perspectiva es difícil comparar la concordancia obtenida en las cepas enviadas para confirmar al
InDRE (control de calidad indirecto) y la concordancia obtenida en el panel de eficiencia, dado que la
mayoría de los participantes a pesar de tener muy buena correlación en el panel de eficiencia, no
envían cepas para el control de calidad, esto habla de que los laboratorios si tienen la infraestructura
suficiente, tanto en recursos humanos y materiales para llevar a cabo con calidad este diagnóstico,
sin embargo por la complejidad en el manejo de estos microorganismos “fastidiosos” y por el costo
que esto representa, aunado a la baja demanda de éste diagnóstico en los estados, se dificulta aún
más su implementación.
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 7 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) para el Diagnóstico de tos ferina
La red la integran 26 Laboratorios
Faltan de integrarse a la red de tos ferina
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 8 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
5. Consideraciones generales para el diagnóstico por laboratorio de la tos ferina
El diagnóstico en el laboratorio se basa en métodos directos e indirectos. El diagnóstico directo
consiste en identificar a B. pertussis, B. parapertussis, u otras especies de Bordetella spp por cultivo
o por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
El diagnóstico indirecto esencialmente es por serología y consiste en detectar anticuerpos específicos
contra los componentes de la bacteria de un paciente infectado.
El cultivo es considerado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) como el estándar de oro
para la confirmación de casos por laboratorio. Sin embargo este método es poco sensible desde el
punto de vista de recuperación del microorganismo que no va más allá del 60%. Se ha reportado que
la mayor recuperación se da en infantes y niños no vacunados. El éxito del cultivo que es un
diagnóstico más específico se basa en la oportunidad de la toma de la muestra, que debe ser dentro
de las dos a tres primeras semanas de iniciada la tos. La PCR es más sensible que el cultivo
bacteriano y ofrece resultados en menor tiempo, sin embargo es importante seguir realizando el
cultivo, para analizar la evolución de este patógeno y vigilar eventuales variantes que puedan ser
antigénicamente diferentes a las cepas vacunales. Las tinciones de inmunofluorescencia directa con
anticuerpos específicos a partir de secreciones nasofaríngeas no es recomendada por la alta
frecuencia de resultados falsos positivos y negativos.
El diagnóstico indirecto (serología) consiste en la detección de anticuerpos específicos en el suero de
individuos infectados y por mucho tiempo se había requerido de una muestra inicial en la fase aguda
de la enfermedad y de una segunda muestra en la fase de convalecencia. Sin embargo hoy en día
existen diferentes inmuno ensayos dirigidos contra diferentes factores de virulencia de B. pertussis
entre ellos están la Hemagluitinina filamentosa, la pertactina, y la toxina Pertussis, este último
antígeno ,ha demostrado en diferentes investigaciones realizadas por el CDC de Atlanta, ser el
inmunógeno más sensible y específico comparado con los otros factores de virulencia de B. pertussis
La presencia de altos niveles de anticuerpos IgG anti-toxina pertussis en el suero de pacientes no
vacunados indica infección.
Inicialmente las pruebas serológicas para la tos ferina fueron diseñadas para la evaluación de la
respuesta de anticuerpos contra diferentes componentes de las vacunas, pero actualmente estos
inmunoenyayos son de gran utilidad para confirmar el diagnóstico de tos ferina, especialmente
cuando los resultados de PCR y /o cultivos no son determinantes para el diagnóstico, sobre todo
cuando se da tratamiento con antibióticos previo a la toma de la muestra situación que impacta
directamente la recuperación de B. pertussis por cultivo , por esta razón la serología puede ser
empleada como una herramienta diagnóstica en individuos incluso que tienen como antecedente
haber recibido vacunación reciente, un año previo, debido a que la cantidad de IgG en contra de la
toxina pertussis tiene un patrón único alcanzando su máximo nivel rápidamente justo a las dos
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 9 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
semanas de iniciada la tos y luego decae, por lo tanto se puede dar un diagnóstico de una infección
reciente siempre y cuando la toma de la muestra se realice en el momento oportuno.
Sin embargo existen grupos de edad más vulnerables menores de dos meses en donde la serología
no es ampliamente recomendable por su sensibilidad en infantes, debido a que su sistema inmune
es inmaduro y existe la interferencia de anticuerpos maternos adquiridos vía transplacentaria..
El criterio para la elección de la técnica diagnóstica dependerá la evolución de la enfermedad, de la
edad del paciente y de su estado inmunológico: de tal forma que en
menores de 2 meses: Se recomienda más el cultivo y el PCR .
En niños ≥ de 2 meses: Se debe hacer Cultivo y/o PCR en niños con o sin vacunación reciente, pero
la toma debe ser dentro los primeros días de iniciada la tos.
Adultos: el cultivo se recomienda si la muestra es tomada en la fase catarral o hasta la primera
semana de la fase paroxística; el PCR y la Serología se recomienda para aquellos pacientes que se
encuentran ya en fases tardías de la enfermedad.
6. Diagnóstico por laboratorio de la tos ferina
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 10 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
Para la toma de muestras es importante considerar las definiciones operacionales de caso
probable, caso sospechoso y portador asintomático ( Anexo 4 ),
La obtención de las muestras se hará en todos aquellos pacientes con evidencia clínica de Tos
ferina en el laboratorio de la unidad hospitalaria, centro de salud o jurisdicción correspondiente. Las
muestras deben ser tomadas durante el episodio agudo de la enfermedad a fin de tener la mayor
posibilidad de aislamiento del agente etiológico.
El laboratorio del hospital, del centro de salud o jurisdiccional procesará las muestras clínicas y todos
los aislamientos presuntivos de Bordetella spp y los remitirá al Laboratorio Estatal de Salud Pública.
Solo en caso de que el hospital no cuente con laboratorio o recursos para procesar las muestras
clínicas, deberá tomar las muestras y enviarlas al Laboratorio Estatal de Salud Pública.
Los Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP) recibirán las muestras clínicas o los aislamientos
sugestivos de Bordetella pertussis o Bordetella spp procedentes de las unidades hospitalarias a fin
de que se realice el diagnóstico o se confirmen las cepas. Los LESP se encargaran de transportar las
cepas confirmadas como positivas (en medio de transporte de AMIES con carbón) al Instituto de
Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (InDRE) con la información solicitada (formato único de
envío de muestras con los resultados obtenidos y formato acional de estudio Epidemiológico de
caso). Los LESP deberán apoyar a los laboratorios de las unidades hospitalarias y jurisdiccionales en
aquellas situaciones en que se requiera y de acuerdo a los recursos disponibles a fin de realizar los
estudios de las muestras y enviará los resultados al laboratorio correspondiente.
El InDRE será el laboratorio responsable de recibir las muestras para diagnóstico de los hospitales
del área metropolitana ó las cepas de Bordetella pertussis o Bordetella spp. procedentes de los
LESP.
En el InDRE se llevará a cabo el estudio de confirmación y enviará los resultados por RED a los
LESP y a la Dirección General Adjunta de Epidemiología.
6.1 Cultivo
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 11 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
El aislamiento de Bordetella pertussis por cultivo bacteriano, es la prueba más específica para
confirmar un caso de tos ferina. Todos los pacientes con cultivo positivo a B. pertussis, que
presentan tos con más de 14 días de evolución o inclusive menos, deben reportarse como casos
confirmados.
6.1.2. Recolección y transporte de muestras clínicas.
La recolección y transporte de muestras clínicas es muy importante para el diagnóstico de los
agentes bacterianos causantes de la tos ferina.
Bordetella pertussis y B. parapertussis se adhieren a los cilios del epitelio que recubre la nasofaringe
y estas bacterias pueden aislarse a partir de exudados nasofaríngeos o aspirados nasofaríngeos.
Por la dificultad y el tipo de material para la toma del aspirado nasofaríngeo, en la mayoría de los
casos se prefiere la toma del exudado nasofaríngeo (ExNF).
6.1.3. Toma de exudado nasofaríngeo para cultivo y PCR
Exudado Nasofaríngeo (ExNF)
Esta es la muestra de elección para el estudio de casos probables y sospechosos de tos ferina, así
como de sus contactos para la búsqueda de Bordetella en portadores asíntomáticos; debido a que
esta bacteria se adhiere a los cilios del epitelio del tracto respiratorio superior del hombre.
Se utiliza un hisopo rayón o dacrón con mango flexible (alambre de aluminio o plástico) para no
lastimar al paciente. Si el estudio solicitado es cultivo la toma de la muestra puede ser con hispo de
alginato de calcio, rayón o dacrón.
Para el estudio de PCR la muestra debe ser tomada con hisopo de rayón o dacrón, nunca de
alginato de calcio ya que este inhibe la actividad de la Taq polimerasa y se pueden obtener
resultados falsos negativos.
Si se van a solicitar cultivo y PCR se deben tomar dos muestras, la muestra destinada para cultivo
debe ser depositada en el medio de transporte Regan Lowe y la muestra para PCR en el medio de
transporte solución salina con cefalexina a una concentración final de 40µg/mL, cada tubo debe ser
perfectamente etiquetado con la solicitud del estudio “Para cultivo”, para PCR y las dos muestras
deben transportarse en red fría.
6.1.4. Condiciones para la toma de las muestras
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 12 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
La toma se hace con el paciente sentado, la cabeza ligeramente hacia atrás y se introduce el hisopo
de mango flexible por cada una de las fosas nasales perpendicularmente a la nariz hasta
aproximadamente 10cm, cuidando tocar sólo el extremo posterior del mango y evitar tocar los
cornetes. Una vez tocado el fondo de la nasofaringe se frota suavemente el hisopo, se pide al
paciente que tosa y se retira con cuidado para que no se contamine. (Figura 1)
Depositar la muestra cultivo en el medio de transporte Regan Lowe y cortar con tijeras el excedente
del mango de aluminio que queda fuera del tubo, el mango de aluminio no debe enrrollarse dentro del
tubo para evitar contaminación de la muestra; si la muestra se va a procesar de inmediato dejar los
hisopos en el medio de transporte durante 15 a 30 minutos para inhibir la flora asociada y después
sembrar la muestra por duplicado en Agar Bordet Gengou (ABG) y en Agar Bordet Gengou con
cefalexina o también puede utilizarse Agar charcoal con sangre de carnero al 15% o sangre de
caballo al 10% (Agar Regan Lowe) (ARL) y también se utilizan dos placas una sin antibiótico y otra
con antibiótico e incubar en aerobiosis y en bolsas plásticas las placas sembradas, (para evitar la
desecación del medio de cultivo) a 37°C. Realizando una primera lectura a las 72 horas de
incubación. En caso de que no se pueda inocular inmediatamente la muestra, en los medios de
cultivo para el primoaislamiento; depositarla en el en medio de transporte y trasladarla lo más
pronto posible al laboratorio, en red fría, para que se procese la muestra. Anexo 1
Las muestra destinadas para el PCR debe introducirse en el medio de transporte de solución salina
con cefalexina y transportarse en red fría. El área donde se toman las muestras para el cultivo en el
caso de los centros de salud u hospitales debe ser un área independiente del área en donde se
aplican las vacunas contra la Tos ferina (DPT o la vacuna acelular contra Pertussis)
Figura 1.- Toma de Exudado nasofaríngeo
Fuente: Centers for Disease Control and Prevention. Manual for the surveillance of vaccine-
preventable diseases. Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, 2008. http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/surv-manual/
7. Uso de la reacción en cadena de la polimerasa para detectar B. pertussis a partir de
muestras clínicas.
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 13 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
La detección específica de los ácidos nucleicos de B. pertussis y B. parapertussis presentes en
muestras clínicas se describió desde 1985, desde entonces se han empleado diferentes iniciadores
para esta detección, hoy en día se emplean diferentes oligonúcleótidos para la detección de este
patógeno que derivan de cuatro regiones cromosómicas del genoma de B. pertussis, estás incluyen
1) la región promotora que codifica para la toxina pertussis (PT), 2) una región upstream del gen
porina, 3) las secuencias de inserción repetitiva IS481 para B.pertussis e IS1001 para B.
parapertussis y 4) la región que codifica para la producción de la toxina adinilato ciclasa (ACT), con
excepción del gen ACT estas sondas son específicas de especie, algunas pruebas de PCR son
específicas para B. pertussis, otras permiten la detección de B. pertussis y B. parapertussis y otras la
detección de estas últimas dos además de B. bronchiséptica, a pesar de esta gran diversidad de
iniciadores disponibles, la sensibilidad reportada para cada una de ellas es similar.
La técnica de la PCR a partir de exudados y aspirados nasofaríngeos es un método alternativo más
sensible y rápido que el cultivo para el diagnóstico de la tos ferina por el laboratorio.
Otras consideraciones importantes son:
a) La PCR ofrece mayor posibilidad que el cultivo y la serología en la detección de infección en
pacientes con sintomatología no definida o en los asintomáticos, incluyendo aquellos individuos
previamente inmunizados, lo que permitirá definir con más claridad la epidemiología de la tos ferina.
b) La PCR permite detectar la infección por B. pertussis inclusive en aquellos individuos que ya
tienen tratamiento antimicrobiano previo.
Diferentes organismos internacionales como la OMS y el CDC recomiendan el empleo de esta
técnica, sin dejar de realizar el cultivo, por qué un aislamiento representa la posibilidad de realizar
pruebas de sensibilidad y la tipificación molecular.
La recomendación internacional es que la PCR no se realice a partir del mismo hisopo, con el que se
realiza el cultivo, esta práctica puede generar resultados falsos positivos, debido a que el hisopo
puede estar expuesto a una contaminación ambiental con el ADN de B. pertussis, que se produce
en la inoculación de los medios de cultivo empleados para el primo aislamiento.
8. Nuevo Algoritmo para el Diagnóstico de tos ferina por PCR en la RNLSP
Numerosos estudios a nivel internacional, han demostrado el gran potencial de ésta técnica molecular
para mejorar la sensibilidad del diagnóstico de la tos ferina, por esta razón, la propuesta de incluir la
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 14 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
PCR PF y PCRTR para el diagnóstico de Tos ferina dentro del marco analítico de la RNLESP, está
fundamentada en dos aspectos importantes:
1) Mejorar el porcentaje de casos confirmados por laboratorio con respecto a los casos probables
2) La necesidad de mejorar el estándar de servicio, disminuyendo el tiempo en la emisión de
resultados, para mejorar la vigilancia epidemiológica basada en la evidencia generada por el
laboratorio, la cual apoyará en la mejor toma de decisiones para el manejo y control de esta
enfermedad.
Actualmente el InDRE cuenta con dos técnicas moleculares las cuales estarán a disposición de la
Red de acuerdo a la disponibilidad de su infraestructura y recursos.
1.- La PCR TR o la PCR PF se debe realizar en todos los casos clínicos que cumplen con la
definición operacional de casos probables o sospechosos de tos ferina y en sus contactos.
La PCR PF utilizada en el InDRE detecta la presencia de un elemento repetidor de 424 pares de
bases (pb) éste, es una región específica repetitiva del genoma de Bordetella pertussis, y se utilizan
los siguientes iniciadores:
Bp168 5’ – GACTTCGTCTTCGTGGCCAT- 3’
Bp169 , 5’ – TCGTCCAGGTTGAGTCTGGA- 3’
El producto esperado es una banda de aproximadamente 424 pares de bases, y solo en las muestras
en la que se detecta esta banda se les realiza el análisis de restricción con la enzima Alu 1.
Esperando la amplificación de dos bandas de 200 y 224 pb.
Las muestras aceptadas para realizar la PCR TR y PF son exudado o aspirado nasofaríngeo, el
medio de transporte debe ser solución salina con cefalexina a una concentración final de 40µg/mL., y
la muestra debe ser tomada con hisopo de rayón o dacrón. (No emplear hisopos de alginato de
calcio debido a que se inhibe la acción de la DNA polimerasa y se pueden obtener resultados
falsos negativos).
2.- El tiempo de transporte no debe exceder más de 3 días.
3.-Las muestras deben ser tomadas de la misma forma en la que se realiza para el cultivo y deben
ser transportadas en red fría. La muestra de exudado nasofaríngeo puede ser almacenada en:
refrigeración por 0 – 7 días, más de 7 días en congelación a -20°C.
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 15 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
Negativo a: B. pertussis
* Muestra clínica (ExNF para el diagnóstico *molecular de Bordetella pertussis
Extracción de ADN( QiaAmp)
Secuencia de inserción repetitiva de Bordetella pertussis.
(primers Bp 168 y Bp 169) producto esperado de aproximádamente 400 pb
Amplificación positiva
Reportar Positivo a B.
pertussis
Análisis de restricción con Enzima Alu1 producto esperado: dos bandas
de aproximadamente 200 y 224 pb
Dx . difer encial con virus respiratorios:
Reportar positivo
Positivo Negativo
Reportar negativo
Reportar negativo
Amplificación del producto esperado
4.- En el laboratorio de IRAs bacterianas se reciben las dos muestras, se les asigna el número
de identificación PR correspondiente, y una se lleva al área de proceso de cultivos y la otra al área de
extracción de DNA.
6.- La extracción se realiza empleando las columnas de QIAamp® DNA Mini and Blood Kit de la
marca QIAGEN.
7.- Una vez realizada la extracción del DNA, es canalizada al laboratorio de Bacteriología molecular,
en donde se hace el corrimiento de la PCR PF y el análisis de restricción correspondiente.
Las muestras que no amplifican se reportan como negativo a Bordetella pertussis.
8.- Las muestras que amplifican un producto de aproximadamente 400pb, son tratadas con la enzima
de restricción Alu 1 y aquellas que amplifican dos bandas de 200 y 224 pb se reportan como
positivas a Bordetella pertussis (Anexo 6)
Las muestras que no amplifican se reportan como negativas a Bordetella pertussis y se sugiere
hacer diagnóstico diferencial para determinar si la etiología es viral.
Algoritmo para el diagnóstico de Tos ferina por PCR punto final
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 16 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
Existen otras pruebas moleculares como la PCR TR que ofrecen mayores ventajas sobre las pruebas
moleculares convencionales. En cuanto sensibilidad, rapidez y seguridad para el operador.
La PCR TR utilizada en el InDRE es una PCR TR múltiple “multi-target” en donde se utilizan
iniciadores y sondas específicos, trazable al CDC de Atlanta. En esta se emplean dos “targets”:
IS481 y ptX1 que son positivos para B. pertussis. La secuencia IS481 es una secuencia de inserción
que se encuentra en múltiples copias (50 a 238) por cada célula de B. pertussis. El amplicon
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 17 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
generado es de 66 pares de bases. El ensayo de ptx1 es específico para una región de
aproximadamente 400 pares de bases que codifica para la subunidad 1 de la toxina pertussis,
conocida como el gen ptxA y genera un amplicón de 55 pares de bases y solo se encuentra una copia
por cada célula de B. pertussis, estas dos targets nos permiten detectar a B. parapertussis como se
muestra en la siguiente tabla:
Criterios de interpretación:
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 18 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
*ptxS1 PCR:CT<40 ciclos es considerado como una reacción positiva.
** Requiere confirmación por otras pruebas (cultivo, serología o vinculación epidemiológica)
Algoritmo para el diagnóstico de Tos ferina por PCR TR
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 19 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
9. Análisis de la información
Todos los casos se deben de notificar inmediatamente a la DGE (dentro de las primeras 24 horas de
conocido el caso incluso antes de tener resultados de laboratorio), de acuerdo con la NOM-017-
SSA2-1994 y la Ley General de Salud a través del correo electrónico epv@dgepi.salud.gob.mx.
-El correcto y oportuno intercambio de información, es la base de la interacción interna de la RNLSP y a la que debe tener con sus respectivos niveles técnico-administrativos. -Los resultados de laboratorio del InDRE se envían directamente al LESP de la entidad federativa de la que proviene la muestra, la que a su vez es el responsable de hacer llegar el resultado al destinatario final y a la jurisdicción correspondiente. Este mismo procedimiento es aplicable a los resultados de los estudios que realiza cada LESP o laboratorio local.
Muestra clínica
Extracción de ADN, manual o automatizada
PCR en tiempo real “multiplex” Resultado
Reportar negativo
Diagnóstico diferencial con virus respiratorios
Reportar
PCR en tiempo real para toxina “ptx1”
Reportar de acuerdo al criterio de interpretación
Negativo
Positivo
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 20 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
-Los resultados producidos a nivel nacional o estatal deben ser enviados por este nivel a su homónimo de las otras instituciones del sector salud.
-En el nivel central la notificación de resultados de laboratorio la realiza el InDRE por vía electrónica al Centro Nacional de Vigilancia Epidemiológica, a la Dirección General de Epidemiología y a la máxima autoridad de salud en cada entidad federativa con la frecuencia establecida para cada padecimiento de las vías respiratorias ya mencionados. -Si las circunstancias lo ameritan, el informe de los resultados de los estudios realizados para el diagnóstico del Síndrome coqueluchoide y la tos ferina en cualquiera de los tres niveles de laboratorios deben ser enviados en forma inmediata y directa al responsable de la solicitud del examen, con el objeto de administrar el tratamiento oportuno y adecuado, llevando a cabo el seguimiento de los contactos y convivientes para evitar la posible aparición de brotes. Con la caracterización de la etiología de la Tos ferina y el Sx. coqueluchoide se podrá conocer su
distribución por grupo de edad, área geográfica, en el tiempo y de esta manera poder ofrecer
información útil a los servicios de salud para la elección de las mejores medidas de prevención y el
tratamiento adecuado de los casos.
10. Recursos
10.1 Infraestructura
Dependiendo del nivel, la unidad debe contar con las siguientes áreas: Toma o recepción de
muestras, área de bacteriología, área de pruebas moleculares que esté separada del área de
cultivos bacterianos, área de lavado y acondicionamiento de material de laboratorio, área de
preparación de medios de cultivo, área de almacenamiento temporal de residuos peligrosos
biológico infecciosos (RPBI), entre otras.
10.2 Funciones de los diferentes niveles
Nivel Local: Este nivel incluye los laboratorios de centro de salud, jurisdiccionales y algunos
laboratorios de hospitales de primer nivel.
Estos laboratorios deberán realizar la toma y manejo y transporte de muestras
-Los laboratorios locales tienen las siguientes funciones:
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 21 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
-Realizar las pruebas mínimas para el diagnóstico en muestras humanas que requieren únicamente equipo básico de laboratorio. -Referir muestras al LESP de su entidad para el control de calidad y para la realización de pruebas generales y especializadas o de referencia que no realicen. -Llevar a cabo la toma de muestras de los contactos de un caso probable o sospechoso de tos ferina. -Notificar al órgano normativo jurisdiccional correspondiente los casos confirmados de tos ferina. -Mantener el flujo de información a los niveles estatal y nacional (LESP e InDRE).
PROCEDIMIENTOS DE MANEJO Y ANALISIS DE MUESTRAS EN LA RNLSP. -El envío de cada muestra, junto con el formato correspondiente, debe ser directamente del responsable de la toma al laboratorio que la va a procesar, debe mandar copia del formato al responsable de la unidad de vigilancia epidemiológica y debe notificar al nivel inmediato superior de acuerdo a los procedimientos especificados en la Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-1994, para la vigilancia epidemiológica. -La toma, el manejo, el envío de muestras y los procedimientos de laboratorio para el estudio de los casos de tos ferina sujetos a vigilancia epidemiológica deben cumplir los requisitos mínimos de definición operacional y las condiciones de calidad (temperatura, esterilidad, cantidad, etc.) descritas en estos lineamientos. -La clasificación de las pruebas que se realizan en apoyo a la vigilancia epidemiológica las define el InDRE según su nivel de complejidad en pruebas mínimas, generales y especializadas o de referencia. -Las muestras que no cumplan con los requisitos anteriores técnicos y administrativos correspondientes no se procesarán y se dará aviso a las instancias correspondientes, para que anexen los requisitos faltantes o envíen nuevamente la muestra adecuada, en los condiciones solicitadas. -Los LESP y laboratorios locales que no tengan capacidad técnica para el aislamiento y caracterización de los microorganismos causantes de los casos de tos ferina y S{indrome coqueluchoide, pueden solicitar el apoyo total o parcial en cualquiera de las fases de un estudio al InDRE, especialmente en lo que se refiere a la confirmación de el microorganismo involucrado en el proceso infeccioso estudiado.
Nivel Estatal
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 22 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
Constituido por los LESP y son sus funciones: -Participar en actividades de vigilancia epidemiológica mediante la realización de pruebas mínimas y generales en el diagnóstico de la tos ferina -Centro de referencia de la Red Estatal de Laboratorios Locales de Salud Pública. -Coordinar, asesorar y supervisar las actividades de la red estatal de laboratorios de diagnóstico. -Participar en el diseño de programas de vigilancia epidemiológicas y de diagnóstico por el laboratorio a nivel estatal. -Realizar investigaciones seroepidemilógicas y bacteriológicas sobre la prevalencia de la tos ferina a nivel estatal. -Colaborar en el seguimiento y control de casos y contactos de pacientes con infecciones respiratorias sujetas a vigilancia epidemiológica. -Promover la utilización adecuada de las pruebas diagnósticas ya estandarizadas , así como la interpretación de los resultados obtenidos en apoyo a las actividades de vigilancia epidemiológicas de la tos ferina y la aplicación de medidas de prevención y control correspondientes al ámbito estatal. -Diseñar programas de capacitación al personal de la red de laboratorios locales para lel manejo de muestras, así como en el aislamiento y caracterización de Bordetella pertussis y B. parapertussis. -Promover y apoyar programas de control de calidad para el mejoramiento integral de los laboratorios locales. -Participar en la elaboración y actualización de los manuales de procedimientos referente al diagnóstico y temas especializados (bioseguridad, manejo de residuos peligrosos biológico-infecciosos, etc.). -Notificar al órgano normativo correspondiente los casos confirmados de Tos ferina -Coordinar el flujo de información de la red estatal al nivel nacional
Nivel Nacional
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 23 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
El InDRE, para el estudio de la tos ferina, es la institución de referencia a nivel nacional y desempeña las siguientes funciones: -Llevar a cabo actividades de diagnóstico y análisis diversos en muestras de seres humanos en apoyo a la vigilancia epidemiológica. -Participar en el desarrollo, estandarización, adaptación y validación de técnicas y procedimientos de laboratorio para pruebas mínimas, generales y especializadas. -A nivel nacional realizar estudios de referencia y control de calidad de los LESP. -Participar en el diseño de programas de vigilancia epidemiológica y diagnóstico de la tos ferina a nivel nacional. -Realizar investigaciones seroepidemiológicas y bacteriológicas que permitan conocer directa o indirectamente la prevalencia de la tos ferina en poblaciones que viven en zonas endémicas del país. -Establecer la utilización de las pruebas estandarizadas y validadas por el InDRE , en apoyo a la vigilancia epidemiológica de la tos ferina. -Capacitar al personal de los LESP (Químicos y técnicos) en las técnicas y procedimientos para el diagnóstico de la tos ferina en las instalaciones del InDRE. -Establecer programas de supervisión continua a las actividades de la red -Orientar a los LESP en la preparación, compra de reactivos y de patrones de referencia para el aislamiento de los agentes etiológicos del síndrome coqueluchoide y la tos ferina. -Elaborar y mantener actualizados los manuales de procedimientos y técnicas de laboratorio para el diagnóstico de estas enfermedades. -Organizar y participar en reuniones científicas donde se aborden temas relacionados con procesos infecciosos de las vías respiratorias. -Coordinar el flujo de información de la RNLSP y notificar al órgano normativo de vigilancia epidemiológica correspondiente los casos confirmados de los padecimientos ya señalados que se presenten.
11. Evaluación del desempeño
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 24 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
La evaluación del desempeño se hará dos veces al año a través de paneles de cepas o muestras. El
InDRE enviará paneles al LESP y éste a su vez a los laboratorios de hospital. Cuando sea necesario
se realizará la supervisión en cascada.
A partir de la introducción del Programa de Evaluación Externa del Desempeño en la RNLSP , el
Laboratorio de IRAs bacterianas y Pertussis a enviado ocho paneles de eficiencia; de 2005 a 2010,
inicialmente se envió un panel por año y en 2008 considerando los resultados obtenidos por la red de
laboratorios para el diagnóstico de IRAS Bacterianas en este periodo, se propuso hacer una
modificación de este esquema (un panel por año) y privilegiar el envío de paneles de eficiencia como
una mejor herramienta para la evaluación del desempeño.
Para evaluar el desempeño de la RNLESP se propuso comparar la concordancia de los resultados
obtenidos en la identificación bacteriana obtenida por los laboratorios participantes con los
resultados del Laboratorio coordinador considerando los siguientes criterios a partir del 2010:
a) Aquellos laboratorios que hayan obtenido de manera constante en los dos años de evaluación
entre 9.0 y 10.0 en el PEED, se clasifican como SOBRESALIENTES
b) Aquellos laboratorios que hayan obtenido de manera constante en los dos años de evaluación
entre 8.0 y 8.9 en el PEED, se clasifican como SATISFACTORIOS
c) Aquellos laboratorios que hayan obtenido de manera constante en los dos años de evaluación
entre 6.0 de 7.9 en el PEED, se clasifican como MINIMOS
d) Aquellos laboratorios que hayan obtenido de manera constante en los dos años de evaluación
menos 5.9 en el PEED, se clasifican como PRECARIOS
Es importante mencionar que los criterios empleados durante los años 2005 al 2009 que se
emplearon para evaluar el desempeño de los paneles del primero al séptimo, fueron modificados a
partir del 2010 con el fin de mejorar el desempeño de los LESP participantes
La clasificación del desempeño se realizó empleando los criterios que se especifican en la siguiente
tabla:
CONCORDANCIA
(%) 2005-2009
CONCORDANCIA
(%) 2010
CLASIFICACIÓN
DEL
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 25 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
DESEMPEÑO
90-100 90-100 SOBRESALIENTE
70-89 80-89 SATISFACTORIO
50-69 60-79 MINIMO
< 50 < 59 PRECARIO
Atendiendo a estos criterios de clasificación, de los 26 laboratorios que integran esta red para el
diagnóstico de Tos ferina conforme a los resultados del PEED 2010, 17 fueron clasificados como
sobresalientes, cuatro como mínimo y como 5 como precarios.
Estados que envían cepas de B. pertussis y B. parapertussis para control de calidad 7/26 que integran la red
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 26 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
12. Colección de cepas
Una vez caracterizadas las cepas aisladas y enviadas al InDRE, y después de la emisión del
informe correspondiente; se conservarán a mediano y a largo plazo el 100% de las cepas de B.
pertussis y B. parapertussis o alguna otra especie aislada de casos probables de tos ferina, con el
objetivo de crear un banco biológico para:
● El monitoreo de cambios fenotípicos o genotípicos de cepas circulantes a nivel Nacional, en
apoyo a la Vigilancia epidemiológica de este padecimiento
● Evaluar impacto de las vacunas disponibles en el país.
● Desarrollar proyectos de investigación en colaboración con instituciones que permita un
fortalecimiento de los participantes de la RNLESP, manteniendo cada Estado la propiedad de
sus colecciones.
Todas las cepas serán conservadas, a excepción de las que no cumplan los criterios de inclusión
para ingresar a la colección de cepas del InDRE.
Criterios de inclusión:
Cepas caracterizadas que han sido aisladas y relacionadas con la aparición de brotes
Cepas resistentes a los antibióticos primera elección (mácrolidos) que se emplean para el
tratamiento de la tos ferina
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 27 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
REFERENCIAS
1.-Koneman, E.W.; Allen, S.D.; Janda, W.M.; Schreckenberger, P.C.; Winn, W.C. Diagnóstico Microbiológico, Texto y Atlas color. 5a ed. Ed Panamericana . 2003 pp. 416-424
2.-Harrison. Principios de Medicina Interna. 14ª. Ed. Mc Graw-Hill. Interamericana de España. SAU.1998. pp. 1066-1070.
3.- Nennig M.E. Prevalence and Incidence of Adult Pertussis in an urban Population. JAMA.1996. 275:1672
4.-NOM-024-SS2-1994. Para la Prevención y Control de las Infecciones Respiratorias Agudas en la Atención primaria a la Salud. Diario Oficial de la Federación. 11 de Abril de 1996.
5.-NOM-017-SSA2.1994. Para la Vigilancia Epidemiológica. Diario Oficial de la Federación. 11 de Octubre de 1999. 6. Gilligan,P.H. Importance of culture in Laboratory Diagnosis of Bordetella pertussis infections.J of clinical
Microbiol.vol 20 no 5,1984 . pp 891-893.
7. -Manual para el control de enfermedades transmisibles. Publicación científica No. 564. Organización Mundial de la Salud. Abram S. Benenson. Editor, Decimosexta edición. Washington, D. C. 1997. pp. 90, 307, 312, 335, 446.
8. - Publicación Técnica del InDRE No. 5 Bordetella pertussis. Microbiología y Diagnóstico. InDRE/SSA. 1991.
9. - Manual de Técnicas de Laboratorio. Vol. I Virología y Bacteriología. InDRE/SSA. 1995. pp. 49-78. 10. -Infecciones Respiratorias Agudas 2008. Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica. Epidemiología. No. 52, Vol. 17, Semana 52. 200. 10.- Kristin Brown, MPH; Pam Cassiday, MS; Maria Lucia Tondella, PhD; Amanda Cohn, MD; Kris Bisgard, DVM, MPH. Pertussis: Chapter 10-1 in VPD Surveillance Manual, 4th Edition, 2008.
11.-Hallander HO, Reizenstein E, Renemar B, Rasmuson G, Mardin L, Olin P. Comparison of nasopharyngeal aspirates with swabs for culture of Bordetella pertussis. J Clin Microbiol 1993;31:50–2.
12.- Halperin SA, Bortolussi R, Wort AJ. Evaluation of culture, immunofluorescence, and 13. serology for the diagnosis of pertussis. J Clin Microbiol 1989; 7:752–7.
13.- Morrill WE, Barbaree JM, Fields BS, et al. Effects of transport temperature andmedium on recovery of Bordetella pertussis from nasopharyngeal swabs. J Clin. Microbiol 26:1814-7. 14.- Meade BD, Bollen A. Recommendations for use of the polymerase chain reaction in the diagnosis of Bordetella pertussis infections. J Med Microbiol 1994;41:51-5.
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 28 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
15.- Preston NW. Technical problems in the laboratory diagnosis and prevention of whooping-cough. Lab Pract 1970;19:482-6. 16.- Trudy Murphy, MD, Kris Bisgard, DVM, MPH, and Gary Sanden, MS, PhD Revised June 2000 Chapter 2 Diagnosis and Laboratory Methods in Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Guidelines for the Control of Pertussis Outbreaks. CDC, 2000. 17.- Hewlett EL: Bordetella species. En: Mandel GL, Bennett JE, Dolin R, eds. Principles and Practice of Infectious Diseases (5ª edición). Philadelphia. Churchill Linvinsgtone. 2000: 2414-2422). 18.- Benenson AS. Manual para el control de las enfermedades transmisibles. AS Benenson Ed. 16 º. Ed. Washington DC.: OPS, 1997. 19.- Centers for Disease Control and Prevention. Manual for the surveillance of vaccine-preventable diseases. Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, 2008. http://www.cdc.gov/vaccines/pubs/surv-manual/
20.- World Health Organization , Department of immunization, Vaccins and Biologicals. Laboratory Manual for
Diagnosis of Whooping cough caused by Bordetella pertussis /Bordetella parapertussis. WHO/IVB/04.14. CH-
1211 Geneva 27, Switzerland.March 2007
21.- World Health Organization , Department of Vaccins and Biologicals. Generic protocol for estimating the
burden of pertussis in young children. WHO/IVB/05.15. CH-1211 Geneva 27, Switzerland.March 2005.
22.- McLaffferty M, Harcus D, Hewlett E. Nucleotide Sequence and Characterization of a Repetitive DNA Element from the Genome of Bordetella pertussis with Characteristics of an Insertion Sequence. J Gen Micro 1988; 134:2297-2306. 23.- Baughman, A. L., K. M. Bisgard, K. M. Edwards, D. Guris, M. D. Decker, K. Holland, B. D. Meade, and F. Lynn. 2004. Establishment of diagnostic cutoff points for levels of serum antibodies to pertussis toxin, filamentous hemagglutinin, and fimbriae in adolescents and adults in the United States. Clin Diagn Lab Immunol 11:1045-53. 24.- Marchant, C. D., A. M. Loughlin, S. M. Lett, C. W. Todd, L. H. Wetterlow, R. Bicchieri, S. Higham, P. Etkind, E. Silva, and G. R. Siber. 1994. Pertussis in Massachusetts, 1981-1991: incidence, serologic diagnosis, and vaccine effectiveness. J Infect Dis 169:1297-305. 25.- Meade, B. D., A. Deforest, K. M. Edwards, T. A. Romani, F. Lynn, C. H. O'Brien, C. B. Swartz, G. F. Reed, and M. A. Deloria. 1995. Description and evaluation of serologic assays used in a multicenter trial of acellular pertussis vaccines. Pediatrics 96:570-5. 26.- Tondella, M. L., G. M. Carlone, N. Messonnier, C. P. Quinn, B. D. Meade, D. L. Burns, J. D. Cherry, N. Guiso, E. L. Hewlett, K. M. Edwards, D. Xing, A. Giammanco, C. H. Wirsing von Konig, L. Han, L. Hueston, J. B. Robbins, M. Powell, C. M. Mink, J. T. Poolman, S. W. Hildreth, F. Lynn, and A. Morris. 2009. International Bordetella pertussis assay standardization and harmonization meeting report. Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, Georgia, United States, 19-20 July 2007. Vaccine 27:803-14.
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 29 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
ANEXO 1
CONDICIONES DE CONSERVACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA SU ENVÍO AL LABORATORIO.
Exudado Nasofaríngeo
Muestras de Exudado nasofaríngeo para la búsqueda de Bordetella pertussis Estas muestras se
procesarán de acuerdo al algoritmo del Anexo 3. Este tipo de muestra se recomienda para el
diagnóstico de Tos ferina y la búsqueda de contactos intradomiciliarios..
Condiciones para la toma del exudado nasofaríngeo:
Se utiliza un hisopo de rayón o dacrón (para cultivo y/o PCR) con mango flexible (alambre de aluminio
pero de preferencia de plástico) para no lastimar al paciente y evitar interferencia con la PCR.
La toma se hace con el paciente sentado, la cabeza ligeramente hacia atrás y se introduce el hisopo
de mango flexible por cada una de las fosas nasales perpendicularmente a la nariz hasta
aproximadamente 10 cm, cuidando tocar sólo el extremo posterior del mango y evitar tocar los
cornetes. Una vez tocando el fondo de la nasofaringe se frota suavemente el hisopo y se retira con
cuidado para que no se contamine.
Volumen: Se recomienda que el volumen del medio de transporte no sea mayor de 1 ml para evitar
la dilución de los microorganismos presentes en la muestra.
Transporte: Depositar el hisopo con la muestra en medio de transporte de solución salina con
cefalexina a una concentración de 40 µg/ml y trasladarlo lo más pronto posible al laboratorio en red
f`ría sin congenlar
Nota: El tiempo de viabilidad de este microorganismo en la muestra en red fría es de 48 a 72 hrs.
Información requerida: La muestra debe de venir perfectamente bien etiquetada, con el nombre del
paciente, edad, fecha de toma, tipo de muestra, si es primera o segunda toma y diagnóstico
solicitado.
Las muestras deben ser enviadas con el oficio de solicitud del estudio, acompañada de él formato
único de envío de muestras biológicas del InDRE, formato de laboratorio de estudio de caso de tos
ferina y contactos intradomiciliarios (IRAB-F-89), o copia del Formato del Sistema Nacional de Salud
de estudio epidemiológico de caso de tos ferina.
La falta de alguno de estos documentos o las condiciones inadecuadas de la muestra, causa el
rechazo definitivo. sin embargo si el rechazo es de índole administrativo e notificará al usuario y
contará con un periodo de 2 días, para enviar la documentación complementaria, pero si el rechazo
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 30 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
es debido a la calidad de la muestra se solicitará la nueva muestra en las condiciones adecuadas, de
no ocurrir así, se rechazará definitivamente y se notificará al usuario responsable del envío.
Las muestras de suero y exudados nasofaríngeos, de casos y contactos serán resguardadas durante
un periodo de dos meses como máximo, para efectos de cualquier repetición que sea requerida y
con el fin de crear un banco de muestras positivas para la creación de paneles.
Suero Condiciones: Volumen: Se requiere de 1 a 3 ml para la prueba, el suero, no debe estar hemolizado, lipémico ó contaminado. Transporte: Estas muestras deben ser recolectadas en un tubo estéril, sin anticuagulante y deben transportarse en red fría. Información requerida: La muestra debe de venir perfectamente bien etiquetada, con el nombre del paciente, edad, sexo, fecha de toma, tipo de muestra, y con la fecha de inicio de tos, es muy importante que la muestra serológica sea tomada a partir de las dos semanas o más de iniciada la tos , pero no antes. Las muestras deben ser enviadas con la solicitud de estudio. La falta de alguno de estos documentos o las condiciones inadecuadas de la muestra, causa el rechazo. Se notificará al usuario y contará con un periodo de ocho días, para enviar la documentación complementaria, de no ocurrir así, se rechazará definitivamente y se notificará al usuario responsable del envío.
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 31 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
ANEXO 2
Criterios para aceptación y Rechazo de muestras o cepas para el diagnóstico, control de
calidad y Referencia de Tos ferina
CRITERIOS PARA LA ACEPTACIÓN DE MUESTRAS EXUDADO NOSOFARÍNGEO
1. Se aceptarán las muestras que cumplan con las definiciones operacionales caso para el
diagnóstico de tos ferina ( caso probable, caso sospechoso, caso atípico y contacto)
2. Muestras registradas en el InDRE
3. Muestras con volumen suficiente 1 ml de solución salina con cefalexina para PCR y medio de
transporte Regan Lowe con 5 mL y perfectamente etiquetadas
4. Muestras de casos que hayan sido tomadas dentro de las primeras 4 semanas de iniciados
los síntomas en pacientes.
5. Muestras de contactos para búsqueda de portadores tomadas dentro de los 10 días primeros
días de iniciado el estudio de caso probable o sospechoso.
6. Muestras que no excedan las 72 horas de transporte.
7. Muestras almacenadas a 4 -8 ºC
8. Muestras que cumplan los lineamientos del manual de toma y envío de muestras editado por
el InDRE
CRITERIOS DE RECHAZO
1. Se rechazaran las muestras que no cumplan con las definiciones operacionales caso para
el diagnóstico de tos ferina (caso probable, caso sospechoso, caso atípico y contacto)
2. Muestras sin oficio o sin alguno de los siguientes formatos (formato único de envío de
muestras biológicas del InDRE, formato de laboratorio de estudio de caso de tos ferina y
contactos intradomiciliarios (F-IRAB- 89), copia del Formato del Sistema Nacional de Salud
de estudio epidemiológico de caso de tos ferina).
3. Muestras de referencia y control de calidad que no tengan resultado en formato
4. Muestras con volúmen insuficiente (menos de 1 mL) y que no están etiquetadas
adecuadamente.
5. Muestras que sean tomadas con hisopo de algodón
6. Muestras que excedan los 2 días de tránsito en áreas locales y 3 días en áreas foráneas.
7. Muestras derramadas
8. Muestras no etiquetadas.
9. Muestras que no sean enviadas con refrigerantes
10. Muestras de referencia o control de calidad que no cuenten con formatos de envío
11. Muestras de referencia o control de calidad con datos incompletos en formatos de e
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 32 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
ANEXO 3
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGIA ALGORITMO MAESTRO 2011 PARA EL DIAGNÓSTICO, REFERENCIA Y CONTROL DE
CALIDAD DE Bordetella pertussis y OTRAS ESPECIES Las muestras se reciben en la sección de Recepción de Muestras y son recogidas por el Laboratorio de IRAs Bacterianas en dónde se les asigna el número de registro correspondiente
Siembra en placas con medio selectivo
Positivo
Identificación por coaglutinación con antisuero específico
MUESTRAS RECIBIDAS
Exudado nasofaríngeo y/o cepas para Diagnóstico, Referencia o control de calidad
Caracterización bioquímica
Negativo
Conservación de cepas de Bordetella en congelación
Captura de resultados en INFOLAB, revisión e impresión de resultado para entrega en la sección de Recepción
de Muestras, mínimo 7 días por cultivo posterior a la recepción de la misma, 2 días para PCR PF y1 día para
PCR TR
Sin desarrollo bacteriano Con desarrollo presuntivo
muestras de exudado nasofaríngeo o cepas para extracción de DNA) para PCR PF y PCR TR, ver algoritmos
“
Prolongación de Carpio No. 470, 3er. Piso, Col. Santo Tomas, Delegación Miguel Hidalgo, C.P. 11340, México, D.F. Tel.(55)53411101, 53964416 fax. 53413264, Conm. 53 42 75 50 Ext. 2020 y 206 www.salud.gob.mx
Página 33 de 50
EPIDEMIOLOGÍA
InDRE
ANEXO 4
DEFINICIONES OPERACIONALES DE CASO
PARA EL DIAGNOSTICO DE TOS FERINA
a. CASO SOSPECHOSO DE TOS FERINA: persona de cualquier edad con tos, sin importar los
días de duración y con asociación con otros casos probables o confirmados. Esta definición se usa
para la búsqueda activa de casos adicionales ante la presencia de casos probables, confirmados o
atípicos, portadores, defunciones y en brotes.
b. CASO PROBABLE DE TOS FERINA: persona de cualquier edad, con tos de 14 o más días
de evolución y dos o más de las siguientes características; tos paroxística, en accesos, espasmódica
o estridor laríngeo inspiratorio y uno o más de los siguientes datos: tos cianosante, hemorragia
(conjuntival, petequias, epistaxis), leucocitosis con predominio de linfocitos; o historia de contacto con
casos similares en las últimas 2 a 4 semanas previas al inicio del padecimiento. Nota: En esta
definición se incluyen a los MENORES DE 3 MESES que pueden manifestar sólo episodios de apnea
o cianosis con o sin tos.
c. CASO CONFIRMADO DE TOS FERINA: todo caso probable que tenga aislamiento de
Bordetella pertussis por cultivo o PCR en el caso o cualquiera de sus contactos, convivientes o
personas con asociación epidemiológica.
d. CASO DE TOS FERINA CLÍNICA: todo caso probable que no cuenta con muestra,
independientemente de sus cinco contactos.
e. CASO DE TOS FERINA ATÍPICO: todo caso sospechoso que tenga aislamiento de Bordetella
pertussis.
f. PORTADOR DE Bordetella pertussis: toda persona sin signos o síntomas de enfermedad
respiratoria a quien se tomó muestras por tener asociación epidemiológica con un caso probable o
confirmado y cuyos resultados de cultivo o PCR son positivos a Bordetella pertussis.
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
Prolongación de Carpio 470, Col. Casco de Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo, México, DF, 11340 t. +52 (55) 5342 7550 | f. +52 (55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html
ANEXO 5
FORMATO PARA LA VIGILANCIA POR LABORATORIO DE LA TOS FERINA
-
HOSPITAL NOTIFICANTE DEL CASO:_______________________________________________________________ JURISDICCIÓN CORRESPONDIENTE:________________________________ F-IRAB-89
TOS
PRODUCTIVA /
TOS SECA
RINORREA ACCESOS DISNEA EMETIZANTE CIANOSIS FIEBREPERDIDA DE
CONOCIMIENTO
FECHA DE
TRATAMIENTO
CON
ERITROMICINA
1a. 2a. 3a. SIN VACUNAEXUDADO
NASOFARINGEO
SANGRE O
SUEROLEUCOCITOS
LINFOCITOS
(%)
FECHA DE VACUNACIÓN CON DPT O PENTAVALENTE OBSERVACIONES
TOS
PRODUCTIVA /
TOS SECA
RINORREA ACCESOS DISNEA EMETIZANTE CIANOSIS FIEBREPERDIDA DE
CONOCIMIENTO
FECHA DE
TRATAMIENTO
CON
ERITROMICINA
1a. 2a. 3a. SIN VACUNAEXUDADO
NASOFARINGEO
SANGRE O
SUERO
No DE EXPEDIENTE CLINICO DEL CASO:____________________________________________________
DOMICILIO DEL CASO:___________________________________________________________________________________________________________________________ TELEFONO: ___________________
_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
RESPONSABLE DE LA TOMA DE MUESTRAS DEL CASO:________________________________________________________________________ TELEFONO: ___________________
RESPONSABLE DE LA TOMA DE MUESTRAS DE LOS CONTACTOS:__________________________________________________ TELEFONO: ___________________
FECHA DE INICIO DE SINTOMAS
FECHA DE
NACIMIENTO
FECHA DE
NACIMIENTO
EDAD
EDAD
FECHA DE INICIO DE SINTOMAS
BIOMETRÍA HEMÁTICAFECHA DE VACUNACIÓN CON DPT O PENTAVALENTE
ESTUDIO DE CASO DE TOS FERINA Y CONTACTOS INTRADOMICILIARIOS
NOMBRE DEL CASO
CONTACTOS FAMILIARES
NOMBRE Y PARENTESCO
FECHA DE TOMA DE MUESTRAS
FECHA DE TOMA DE MUESTRAS
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGÍALABORATORIO DE INFECCIONES RESPIRATORIAS AGUDAS BACTERIANAS Y
PERTUSSIS
EPIDEMIOLOGÍAInDRE
Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
Prolongación de Carpio 470, Col. Casco de Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo, México, DF, 11340 t. +52 (55) 5342 7550 | f. +52 (55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html
ANEXO 6
DESARROLLO DE PCR PUNTO FINAL PARA LA DETECCIÓN DE
DE Bordetella perutussis, EN MUESTRAS CLÍNICAS Y CEPAS
1. PRINCIPIO La amplificación de una secuencia de inseción presente en varias copias exclusivamente
en el genoma de Bordetella pertussis por la técnica de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) en ácido desoxirribonucléico (DNA) extraído de muestras de exudado
nasofaríngeo o cultivo puro. La especificidad de la amplificación se confirma usando la
enzima de restricción Alu I.
2. OBJETIVOS
Detección de Bordetella pertussis en casos de tosferina y sus contactos utilizando la
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
3. MATERIALES Y EQUIPO
EQUIPO
Termociclador
Gabinete de bioseguridad tipo II clase 2A
Cabina para PCR
Cámara de electroforesis horizontal
Fotodocumentador
Fuente de poder
Congelador vertical
Refrigerador vertical
Termoagitador
Sistema de purificación de agua
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
Prolongación de Carpio 470, Col. Casco de Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo, México, DF, 11340 t. +52 (55) 5342 7550 | f. +52 (55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html
Balanza analítica
Aire acondicionado
Horno de microondas
MATERIALES
Micropipeta 1-10 µL
Micropipeta 2-20 µL
Micropipeta 20-200 µL
Micropipeta 100-1000 µL
Guantes desechables
Tubos tipo eppendorf de 0.2 ml, 0.5 ml y 1.5 ml
Puntas para micropipeta 10, 200 y 1000 µL
Tubos para centrifuga de 50 ml
Pipetas desechables 5 y 10 ml
Marcadores indelebles
Gradillas para tubos eppendorf
Bolsas de polipropileno
Contenedores para desecho de puntas
Gasas
REACTIVOS Y MATERIALES BIOLÓGICOS
Reactivos y Materiales biológicos Marca
dNTP´s (A, T, C, G) 100µM Roche
Taq polimerasa 5U/µL Roche
Bp168 5'-GAC TTC GTC TTC GTG GCC AT-3' (1) Applied biosystems
Bp169 5'- TCG TCC AGG TTG AGT CTG GA -3' (1) Applied biosystems
Endonucleasa de restricción Alu I Roche
MgCl2, 25mM Applied biosystems
Regulador 10 X Applied biosystems
Solución amortiguadora TBE
Agarosa Sigma
Bromuro de etidio
Agua destilada y desionizada MILLIPORE
Marcador de peso molecular
Naranja G
Alcohol etílico al 70%
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
Prolongación de Carpio 470, Col. Casco de Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo, México, DF, 11340 t. +52 (55) 5342 7550 | f. +52 (55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html
1) Ewanowich CA, Linda W. Chui, Paranchych, Pepler, Marusyk G, Albrition W, Major Outbreak of Pertussis in Northern Alberta, Canada: Analysis of Discrepant Direct Fluorescent-Antibody and Culture Results by Using Polymerase Chain Reaction Methodology. Journal of Clinical Microbioly, 1993, 31: 1715-1725
4. METODOLOGÍA
1. El DNA de las muestras llegará al laboratorio en tubo para microcentrifuga de 1.5mL
tipo eppendorf a temperatura ambiente cuando se ha extraído recientemente y
congelado cuando tenga más de 2h de haberse extraído.
2. El almacenamiento de la muestra de DNA debe será a -20ºC
CONSIDERACIONES ANTES DE INICIAR LA PCR.
1. Antes de empezar a trabajar descontaminar el gabinete de bioseguridad utilizando
el sanitizante asignado.
2. Colocarse el equipo de seguridad. (Ver punto 6).
3. Mantener las muestras en hielo listas para la PCR.
4. Descongelar previamente los reactivos para la PCR.
5. Rotular los tubos de acuerdo al número y tipo de muestra a trabajar.
PREPARACIÓN DE LA MEZCLA DE REACCIÓN.
1. Esta se hará en el área Blanca del laboratorio.
2. El volumen de los reactivos se calculará de acuerdo al número de muestras a
diagnosticar, siguiendo el formato de trabajo para PCR. Una vez preparada la
mezcla de reacción homogenizar suavemente con pipeta aproximadamente 30
veces, finalmente adicionar 20 µL de esta mezcla en el fondo de cada tubo.
3. En el área de templados, adicionar 5 µL del DNA extraído de cada muestra en el
tubo correspondiente.
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
Prolongación de Carpio 470, Col. Casco de Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo, México, DF, 11340 t. +52 (55) 5342 7550 | f. +52 (55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html
FORMATO DE TRABAJO PARA PCR
FECHA: ANALISTA:
NUMERO DE TUBO
CLAVE DE LA MUESTRA
COMENTARIOS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA MOLECULAR
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
Prolongación de Carpio 470, Col. Casco de Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo, México, DF, 11340 t. +52 (55) 5342 7550 | f. +52 (55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html
HOJA DE TRABAJO DE PCR PARA Bordetella pertussis FECHA:___________________ ANALISTA:_________________
NUMERO DE TUBO
CLAVE DE LA MUESTRA OBSERVACIONES
1
2
3
4
5
6
7
8
SOLUCIÓN MADRE I
FECHA:___________________ ANALISTA:_________________ uientes cantidades de
reactivos y solucion s tampón:
REACTIVOS [ Stock ] [ final ]
Volumen por
muestra (
Volumen total (
dH2O estéril 7.25
Buffer 10 X 1 X 2.5
MgCl2 25 mM 3 mM 4.0
Bp 168 1:50 1.0
Bp 169 1:50 1.0
dNTP´s 4.0
Taq polimerasa 0.25 0.5
Vaselina ---- 10 ---- --------
DNA 5 50
Multiplicar las cantidades señaladas por el número de muestras a procesar más una, para qu los volúmene no queden excesivamente ajustados. n + 1 = _____ n = número de muestras
Digestión:
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
Prolongación de Carpio 470, Col. Casco de Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo, México, DF, 11340 t. +52 (55) 5342 7550 | f. +52 (55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html
FECHA:___________________ ANALISTA:
Enzima de restricción:______________ Temperatura de incubación:
Muestras a digerir
Inicio a:__________________ Termino a:
Comentarios:
ANALISTA:
Electroforesis en gel de agarosa al 2%:
FECHA: ANALISTA:
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
Prolongación de Carpio 470, Col. Casco de Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo, México, DF, 11340 t. +52 (55) 5342 7550 | f. +52 (55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html
Correr el gel a 80 volts durante 1hora y 30 minutos
Inicio: Termino:
Peine I Peine II
N° Pozo
N° de tubo
Clave Resultado Comentario
N° Pozo
N° de tubo
Clave Resultado Comentario
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
7 7
8 8
9 9
10 10
11 11
12 12
13 13
POSITIVO= Positivo a Bordetella pertussis
NEGATIVO= Negativo a Bordetella pertussis.
Marcador de Peso Molecular (PM):_______________________________
CONTROLES
En el área de controles. Adicionar 5 µL de control positivo y negativo respectivamente.
Control negativo: Colocar una muestra de DNA confirmada como Bordetella
bronchiseptica.
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
Prolongación de Carpio 470, Col. Casco de Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo, México, DF, 11340 t. +52 (55) 5342 7550 | f. +52 (55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html
Control negativo: Colocar una muestra de DNA confirmada como Bordetella
parapertussis.
Control positivo: Colocar una muestra de DNA confirmada como Bordetella pertussis.
Control de reactivos: Utilizar 5 µL de agua inyectable o milliQ.
NOTA. Asegurarse de que todos los tubos queden bien tapados, para evitar que el
contenido se evapore.
Colocar los tubos en el Termociclador, seleccionar el programa para Bordetella
pertussis y dar inicio a la corrida
Los productos de DNA obtenidos se someten a 120V por 30 minutos a electroforesis en
un gel de agarosa al 2% en regulador Tris-EDTA-ácido acético. (Ver punto 7)
Finalizada la electroforesis evidenciar la presencia de las bandas (productos) con luz UV
Las muestras amplificadas que presenten una banda fluorescente correspondiente al
tamaño esperado de aproximadamente 424pb comparando con el marcador de peso
molecular, deberán digerirse con la enzima de restricción Alu I por 2 horas a 37ºC para
confirmar la presencia de DNA de Bordetella pertussis. (Ver punto 8)
Al terminar el tiempo de restricción del DNA se analizará por electroforesis en gel de
agarosa al 2.5%, en el área de electroforesis se tomaran 6µL de cada muestra y controles
y se mezclaran con 2µL de Naranja G y se correra a 120V/40min.
Finalizada la electroforesis evidenciar la presencia de las bandas (productos) con luz UV
5. INTERPRETACIÓN POR EL LABORATORIO Positivo: Presencia de la secuencia de inserción existente en varias copias exclusivas
del genoma de Bordetella pertussis digeridos con la enzima Alu I muestra bandas de 224
y 200pb
Negativo: Ausencia de DNA de Bordetella pertussis
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
Prolongación de Carpio 470, Col. Casco de Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo, México, DF, 11340 t. +52 (55) 5342 7550 | f. +52 (55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html
Ausencia de bandas de 224 y 200pb después de la restricción.
6. MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD
a. Todas las muestras y controles deben manejarse como potencialmente infecciosos. Y
trabajarse en un Laboratorio de Bioseguridad Nivel 2 (BSL-2) dentro de un gabinete de
bioseguridad tipo II 2A.
b. El analista debe vestirse con su equipo de protección personal, bata (una para cada
área del proceso), guantes desechables (un par para cada proceso) y lentes de
seguridad.
c. Disponer de los contenedores y bolsas correspondientes para los desechos RPBI en
cada área.
d. Descontaminar las micropipetas, gabinetes y cabinas antes y después de trabajar con
etanol al 70% ó benzal-metanol 1:1 v/v.
e. Todo el material a utilizar deberá estar esterilizado.
f. El personal que realice la electroforesis no podrá hacer mezcla para PCR en la misma
jornada.
g. El área limpia ó área blanca está libre de toda contaminación por DNA por lo que solo
podrán manejarse reactivos.
h. El área de templados será la única donde se podrán abrir los tubos que contienen el
DNA de las muestras.
i. El área de controles será la única permitida para la colocación de el DNA control.
j. Solo en el área sucia o de electroforesis se podrán abrir los tubos con cDNA y
cargarse en los geles.
k. Cada área deberá estar separada físicamente para evitar contaminaciones.
l. Es muy importante que cada área cuente con su material propio (puntas, guantes,
agua, etc), y éste no deberá compartirse entre áreas.
m. Los equipos deberán descontaminarse antes de una reparación, mantenimiento o
antes de ser removidos del laboratorio.
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
Prolongación de Carpio 470, Col. Casco de Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo, México, DF, 11340 t. +52 (55) 5342 7550 | f. +52 (55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html
n. El analista debe lavar sus manos antes y después de trabajar.
7. ELECTROFORESIS EN GEL PREPARACION DEL GEL DE AGAROSA AL 2.0% EN CHAROLA DE 15 X 25 cm2
FUNDAMENTO: La electroforesis en gel se encuentra entre los métodos más resolutivos y convenientes
empleados en la separación macromolecular, los geles más ampliamente utilizados son
los de poliacrilamida y agarosa los cuales se utilizan para separar, identificar y purificar
fragmentos
de ARN o ADN; estos tienen las características de formar poros de dimensiones
moleculares una vez que han polimerizado, en la electroforesis en gel, los ácidos
nucléicos que tienen carga negativa debido a su esqueleto de grupo fosfato se aleja del
polo negativo (cátodo) y se dirigen hacia el polo positivo (ánodo), los fragmentos
pequeños de ADN se mueven más rápido que los grandes, las bandas resultantes de la
separación por electroforesis necesitan teñirse para visualizarse, el reactivo ampliamente
utilizado es el colorante de bromuro de etidio el cual se incorpora en la solución de
agarosa.
Para lograr la separación adecuada de los fragmentos de ADN se toma en cuenta la
composición porcentual de acrilamida o agarosa para determinar que tan fácil migrarán en
el gel el ADN de diferentes tamaños, por lo tanto, la composición porcentual del gel
determinará el nivel de resolución (capacidad de separar uno del otro) de los fragmentos
de ADN.
REACTIVOS
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
Prolongación de Carpio 470, Col. Casco de Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo, México, DF, 11340 t. +52 (55) 5342 7550 | f. +52 (55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html
TBE 10X (Sol. Stock)
TBE 1 X
Bromuro de Etidio
Buffer de colorante de corrida.
Marcador de peso molecular ΦX174
Agarosa en polvo
Naranja G
MATERIAL Y EQUIPO Matraz Erlenmeyer de 500 ml
Cámara de electroforesis
Balanza analítica
Fotodocumentador
Micropipeta 0.5 - 10 µL.
Puntas 1- 200 µL.
PROCEDIMIENTO
1. Pesar en la balanza analítica, previamente calibrada, 2g. de agarosa. y mezcle en
100 mL. de TBE 1X en un matraz de Erlenmeyer con tapón de rosca.
2. Calentar el matraz en horno de microondas en ciclos de 20 segundos y agitar
hasta la completa dilución de la agarosa, (utilice guantes de carnaza para evitar
quemaduras), deje ligeramente flojo el tapón del matraz.
3. Permita enfriar por varios minutos.
4. Agregar a la agarosa 3.0 µL de bromuro de etidio.
5. Agitar el matraz suavemente con el tapón sellado, y vacíe la agarosa lentamente
para evitar la formación de burbujas en la charola previamente nivelada, con el
peine colocado en el lugar correspondiente.
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
Prolongación de Carpio 470, Col. Casco de Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo, México, DF, 11340 t. +52 (55) 5342 7550 | f. +52 (55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html
6. Deje solidificar el gel a temperatura ambiente por espacio de 30 minutos.
7. Ya solidificado el gel retire el peine y coloque el gel en la cámara de electroforesis
con los pozos orientados al lado izquierdo de la cámara.
8. Llene la cámara de electroforesis con 1.800 mL de TBE 1X hasta cubrir el gel.
9. Prepare el ΦX174 en un pozo de una placa falcón flexible colocando 5 µl de
ΦX174.
10. En una superficie plástica y plana (parafilm) mezcle 8µL de muestra más 2 mL de
colorante de buffer, homogenice y deposite en el pozo correspondiente del gel, así
procesará todas sus muestras de acuerdo a la capacidad del No. de pozos de su
gel.
11. Coloque la tapa de la cámara ajustando los electrodos, el color negro polo (+) del
lado derecho y el color rojo polo (-) lado izquierdo.
12. Los pozos del gel deben estar orientados hacia el polo (-) el gel correrá a 120
voltios por espacio de 30 minutos.
13. Coloque su gel en un fotodocumentador de luz UV y observe sus bandas de
acuerdo a su marcador y compare sus resultados para un análisis posterior.
Nota. Durante la manipulación del gel siempre deberá usar guantes ya que el bromuro de
etidio es altamente cancerígeno.
8. ANÁLISIS DE RESTRICCIÓN.
1) Pipetear 10µL de muestra proveniente de cada tubo de producto de PCR en tubos
de 500µL rotulados.
2) Adicionar 2.5µL de buffer 10X y 2.5µL de enzima Alu I (10U/ µL) a cada tubo y
10µL de agua grado PCR.
3) Asegurarse de tapar bien los tubos y mezclar.
4) Incubar a 37ºC por 2 horas.
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
Prolongación de Carpio 470, Col. Casco de Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo, México, DF, 11340 t. +52 (55) 5342 7550 | f. +52 (55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html
5) Almacenar las muestras digeridas a 4ºC hasta corrimiento en gel de agarosa al
2.5%.
FORMULACIÓN DE REACTIVOS PARA EL ANÁLISIS MOLECULAR TBE 10X Tris base 108.0g Ácido bórico 27.5g EDTA 6.8g EDTA = Etilen-Diamino-Tetra-Acetato Aforar a 1L pH = 8.3
Disolver los reactivos en 950mL de agua destilada y ajustar el volumen a 1000mL
TBE 1X Diluir 100mL de TBE 10X a 1000mL con agua destilada. Colorante de carga (electroforesis)
Buffer de muestra 10X (listo para su uso)
Naranja G 0.25%
Bromuro de etidio (EtBr) 10mg/mL Pesar 50mg de bromuro de etidio y disolver en 5mL de agua destilada. Almacenar en un frasco ambar para protegerlo de la luz. PRECAUCIÓN: El bromuro de etidio es mutagénico y cancerígeno. Usar guantes cuando maneje el polvo o la solución.
9. FUENTES DE VARIABILIDAD La prueba se realizará en un laboratorio entre 18-25°C. Las diferentes áreas deberán
estar separadas y selladas para evitar el paso de aire con polvo y evitar así la
contaminación. Ninguna otra condición ambiental afecta la PCR, puesto que toda la
reacción se realiza en el Termociclador.
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
Prolongación de Carpio 470, Col. Casco de Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo, México, DF, 11340 t. +52 (55) 5342 7550 | f. +52 (55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html
INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS
Prolongación de Carpio 470, Col. Casco de Santo Tomás, Del. Miguel Hidalgo, México, DF, 11340 t. +52 (55) 5342 7550 | f. +52 (55) 5341 3264 | www.cenavece.salud.gob.mx/ indre/ interior/ intd_index.html
ALGORITMO PARA LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) PARA LA IDENTIFICACIÓN DE CEPAS DE Bordetella pertussis.
Negativo Ausencia de banda
característica
Positivo
Presencia de una banda de 424pb
Digestión con enzima AluI 37ºC/2 horas
Negativo
Ausencia de bandas carácterísticas
confirmación
Positivo
Presencia de secuencia de inserción evidenciada por 2 bandas características en cepas de Bordetella pertussis
INSTITUTO DE DIAGNOSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLOGICOS
DEPARTAMENTO DE BACTERIOLOGIA LABORATORIO DE BACTERIOLOGIA
MOLECULAR
NOM-017-SSA2-1994: Para la vigilancia epidemiológica. NOM-024-SSA2-1998, para la prevención y control de las Infecciones Respiratorias Agudas en la atención primaria a la Salud
Electroforesis en gel de agarosa
RESULTADO
Fotodocumentar Amplificación de secuencia con
iniciadores correspondientes de inserción exclusiva de Bordetella pertussis
Preparar el gel de agarosa
al porcentaje requerido
Revelar bajo luz UV
10.ALGORITMO
Recommended