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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
EFEITOS DE Schinus terebintifolius Raddi E Cassia occidentalis Linn EM MODELO EXPERIMENTAL DA
DOENÇA DE HUNTINGTON
JUCIENE BEZERRA RODRIGUES DA SILVA
RECIFE
2011
JUCIENE BEZERRA RODRIGUES DA SILVA
EFEITOS DE Schinus terebintifolius Raddi E Cassia occidentalis Linn EM MODELO EXPERIMENTAL DA
DOENÇA DE HUNTINGTON
Dissertação submetida ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Farmacêuticas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Profa. Dra. Simone Sette Lopes Lafayette
RECIFE
2011
Silva, Juciene Bezerra Rodrigues da Efeitos de Schinus terebintifolius Raddi e Cassia occidentalis Linn em modelo experimental da doença de Huntington / Juciene Bezerra Rodrigues da Silva. – Recife: O Autor, 2011. 108 folhas: il., fig, ; 30 cm.
Orientador: Simone Sette Lopes Lafayette Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2011.
Inclui bibliografia.
1. Doença de Huntington. 2. Ácido 3-nitropropiônico. 3. Estresse oxidativo. 4. Schinus terebintifolius. 5. Cassia occidentalis. I. Lafayette, Simone Sette Lopes. II.Título.
UFPE 615.32 CDD (20.ed.) CCS2011-072
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Reitor
Amaro Henrique Pessoa Lins
Vice-Reitor
Gilson Edmar Gonçalves e Silva
Pró-Reitor para Assuntos de Pesquisa e Pós-Graduação
Anísio Brasileiro de Freitas Dourado
Diretor do Centro de Ciências da Saúde
José Thadeu Pinheiro
Vice-Diretor do Centro de Ciências da Saúde
Márcio Antonio de Andrade Coelho Gueiros
Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Dalci José Brondani
Vice-Chefe do Departamento de Ciências Farmacêuticas
Antonio Rodolfo de Farias
Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Pedro José Rolim Neto
Vice-Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Beate Saegesser Santos
Dedico em especial ao meu pai José
Rodrigues da Silva (in memoriam) por todo
amor, incentivo e confiança e a minha mãe
Maria José.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por está sempre guiando minha vida.
À Profa. Dra. Simone Sette, pela confiança, orientação, incentivo, amizade e
disponibilidade durante todo o desenvolvimento desse trabalho. Por ter aturado
todas as minhas loucuras e brincadeiras desde a iniciação científica.
À Profa. Dra. Soraya Smaili, do Laboratório de Farmacologia da Unifesp por ter
incentivado nosso trabalho e nos ajudado a desenvolvê-lo.
À Profa. Dra. Belmira Lara, do Laboratório de Neurofisiologia do Departamento de
Fisiologia e Farmacologia, pela amizade, disponibilidade e confiança. Apesar de
todos os seus compromissos, sempre disposta a me ajudar.
À Profa. Dra. Beate Saegesser por ter aberto as portas de seu laboratório. E seu
aluno Clayton por toda ajuda.
Aos Profs. Drs. Pedro Rolim, Haroudo Satiro e Edvaldo, pelo auxilio para
desenvolvimentos dos experimentos
Ao Prof. Dr. Almir Gonçalves Wanderley pela colaboração no desenvolvimento da
pesquisa.
A todos que fazem parte do Laboratório de Farmacologia e Toxicologia.
Aos meus irmãos Geraldo e Gabriela, pelo amor e apoio incondicional mesmo longe.
A minha sobrinha e afilhada Sabrina, pelo amor tão puro, e por ter me mostrado que
a vida sempre continua.
Ao meu cunhado e amigo Giuliano Lyra, pelo amor e incentivo. Pela ajuda na
construção de alguns equipamentos utilizados nos experimentos.
Aos meus sogros Adelson e Cida, por todo amor e incentivo. Em especial ao meu
sogro pela construção do rotarod. A dona Izabel pelo apoio durante todos esses
anos.
Ao meu amado namorado (“namorido”) Anderson, por esta sempre ao meu lado
apoiando minhas decisões, incentivando a conclusão de mais essa etapa em minha
vida, pela paciência ao escutar meus desabafos, pela ajuda nos finais de semana
medindo água e ração...
À Rejane, Zenira e a Sr. Fredson, pelo apoio, pelos momentos de descontração e
acima de tudo pelo incentivo.
Às amigas Rafaella e Jamilka, que me acompanharam em todos os experimentos.
Vocês foram fundamentais para a conclusão desta pesquisa.
Aos meus novos amigos Cybelle e Hilton, que mal chegaram e já foram escalados
para trabalhar, obrigada!
À Mirtes e Ticiana, minhas precursoras que tanto me incentivaram.
Em especial, a minha amiga Germana, pela amizade, companheirismo e parceria
durante os experimentos. Pelos momentos de descontração, pelas compras, pelos
conselhos, pelas pizzas, por me escutar...
A Mário pelo apoio e realização de alguns experimentos.
Aos amigos da Farmácia do Hospital da Restauração, pelo apoio e por entender a
minha ausência. Em especial ao meu amigo Robson pelo incentivo.
À todos que fazem partem do Laboratório de Neurofisiologia. Em especial à
Henriqueta, agradeço pelo apoio e a colaboração para realização de alguns
experimentos.
A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
A FACEPE pela concessão da bolsa de estudo.
“Não importa onde você parou... em que momento da vida você cansou...
O que importa é que sempre é possível e necessário recomeçar.
Recomeçar é dar uma nova chance a si mesmo...
É renovar as esperanças na vida e, o mais importante...
Acreditar em você de novo. Se desejarmos fortemente o melhor e...
Principalmente, lutarmos pelo melhor...
O melhor vai se instalar em nossa vida.
Porque sou do tamanho daquilo que vejo. E não do tamanho da minha
altura.”
Carlos Drummond de Andrade
RESUMO O aumento na incidência de doenças neurodegenerativas em todo o mundo tem proporcionado um interesse cada vez maior nos estudos que visam novas estratégias para a prevenção e cura destas patologias. Várias evidências têm demonstrado que alterações mitocondriais e elevados níveis de estresse oxidativo estão fortemente associados ao desenvolvimento de muitas doenças típicas do envelhecimento como Alzheimer, Parkinson e Huntington. Vários modelos animais vêm sendo utilizados para estudar as características neuropatológicas e bioquímicas dessas doenças e determinar novas abordagens terapêuticas. O ácido 3-nitropropiônico (3-NP) é uma neurotoxina que inibe a succinato desidrogenase (SDH), uma enzima do complexo II da cadeia respiratória mitocondrial, que leva a déficit energético, liberação de cálcio mitocondrial, estresse oxidativo e morte celular, mimetizando muitos dos sintomas motores, cognitivos e psiquiátricos da doença de Huntington (DH). Embora não tenha sido encontrada uma terapêutica que cure ou impeça, de forma efetiva, a progressão destas doenças, compostos naturais com atividade antioxidante têm demonstrado efeito neuroprotetor. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade neuroprotetora do extrato seco da casca do caule de Schinus terebinthifolius (ST) e do extrato seco de caules e folhas de Cassia occidentalis (CO) sobre parâmetros comportamentais e bioquímicos induzidos pela administração intraperitoneal de 3-NP. Avaliações comportamentais foram realizadas utilizando os modelos de campo aberto, rotarod e labirinto em cruz elevado. A atividade antioxidante in vitro foi determinada através do método de captura do radical livre DPPH˙. A atividade antioxidante in vivo, por meio da peroxidação lidipídica (dosagem das substancias reativas ao ácido tiobarbitúrico – TBARS), e da atividade enzimática da superóxido dismutase (SOD) foi avaliada na região estriatal após os testes comportamentais. A administração intraperitoneal de 3-NP (30 mg/kg por 5 dias) causou significativa perda de peso corporal, déficit motor (performance no campo aberto e rotarod) e perda de retenção de memória (performance no labirinto em cruz elevado) quando comparado aos animais controle. Além disso, análises bioquímicas revelaram significativo aumento na peroxidação lipídica e diminuição da atividade da SOD na região estriatal. O tratamento diário com ST (300 e 600 mg/kg, oral) e CO (400 e 800 mg/kg, oral) por um período de 14 dias melhorou significativamente o peso corporal, o desempenho motor e cognitivo quando comparado ao grupo doente (3-NP). Além disso, o tratamento com ST e CO significativamente atenuou a peroxidação lipídica e a diminuição da atividade da SOD. Foi observado que ST e CO apresentaram expressiva atividade antioxidante in vitro (IC50 8,81 e 53,66 µg/ml) em comparação com o padrão (BHT- butil-hidroxi-tolueno). Estes resultados sugerem que o efeito protetor do extrato de Schinus terebinthifolius e Cassia occidentalis contra degeneração induzida pela neurotoxina 3-NP seja mediado por sua atividade antioxidante, relacionada provavelmente à presença de polifenóis, sendo por isso um possível agente terapêutico para a DH. Palavras-chave: Doença de Huntington; ácido 3-nitropropiônico; estresse oxidativo; Schinus terebinthifolius; Cassia occidentalis
ABSTRACT
The increased incidence of neurodegenerative disorders in the world has provided an growing interest in studies that aim new approaches for prevention and cure of diseases. Several evidences have been shown that mitochondrial alterations and high levels of oxidative stress are strongly associated with the development of many diseases typical of aging such as Alzheimer's, Parkinson's and Huntington. Several animal models have been used to study the biochemical and neuropathological characteristics of these diseases and identify new therapeutic approaches. 3-nitropropionic acid (3-NP) is a neurotoxin that inhibits succinate dehydrogenase (SDH), an enzyme complex II mitochondrial respiratory chain, which leads to energy deficit, release of mitochondrial calcium, oxidative stress and cell death that simulated many of the motor symptoms, cognitive and psychiatric disorders of Huntington's disease (HD). Although not found a treatment that cure or prevent, effectively, the progression of these diseases, natural compounds with antioxidant activity have been shown neuroprotective effects. The aim of present study was to assess the neuroprotective activity of dry extract of stem bark of Schinus terebinthifolius (ST) and the dry extract of stems and leaves of Cassia occidentalis (CO) on behavioral and biochemical parameters induced by intraperitoneal administration of 3-NP . Behavioral assessments were performed using the models of open field, rotarod and elevated plus maze. The antioxidant activity in vitro was measured by the method of capture of free radical DPPH ˙. The antioxidant activity in vivo through the peroxidation lidipídica (measurement of thiobarbituric acid reactive substances - TBARS) and the enzymatic activity of superoxide dismutase (SOD) was assessed in the striatal region after the behavioral tests. The intraperitoneal administration of 3NP (30 mg/kg for 5 days) caused significant weight loss, motor impairment (performance in the open field and rotarod) and loss of memory retention (performance in the elevated plus maze) compared to control animals. Furthermore, biochemical analysis shows a significant increase in lipid peroxidation and decreased SOD activity in the striatal region. Daily treatment with ST (300 and 600 mg/kg, oral) and CO (400 and 800 mg/kg, oral) for a period of 14 days significantly improved the body weight, motor and cognitive performance as compared to group 3-NP. In addition, treatment with ST and CO significantly attenuated the lipid peroxidation and decrease in SOD activity. Has been observed that ST and CO showed stronger antioxidant activity in vitro (IC50 8.81 and 53.66 mg/ml) compared with the standard (BHT-butylated hydroxy toluene). These results suggest that the protective effect of extract of Schinus terebinthifolius and Cassia occidentalis against degeneration induced by the neurotoxin 3-NP is mediated by its antioxidant activity, probably related to the presence of polyphenols, and is therefore a potential therapeutic agent for HD. Keywords: Huntington's Disease, 3-nitropropionic acid, oxidative stress, Schinus terebinthifolius, Cassia occidentalis
LISTA DE FIGURAS
ARTIGO I: Protective effect of Schinus terebintifolius Raddi against 3-nitropropionic acid-induced neurotoxicity
Figure 1. Effect of Schinus terebinthifolius (300 and 600 mg/kg, p.o.) on body weight
in 3-nitropropionic acid (30 mg/kg, i.p.) treated rats 78
Figure 2. Effect of Schinus terebithifolius (300 and 600 mg/kg, p.o.) on locomotor
activity in 3-nitropropionic acid (30 mg/kg, i.p.) treated rats as assessed by open field.
Frequencies of locomotion (A), rearing (B) and time of resting (C) 79
Figure 3. Effect of Schinus terebinthifolius (300 and 600 mg/kg, p.o.) on fall off time in
3-nitropropionic acid (30 mg/kg, i.p.) treated rats on Rota-rod performance 80
Figure 4. Effect of Schinus terebithifolius (300 and 600 mg/kg, p.o.) on memory
performance (% retention) in elevated plus maze task in 3-nitropropionic acid (30
mg/kg, i.p.) treated rats _____________________81
ARTIGO II: Efeito neuroprotetor de Cassia occidentalis Linn sobre a
neurotoxicidade induzida pelo ácido 3-nitropropiônico em ratos
Figura 1. Efeitos de Cassia occidentalis (CO 400 e 800 mg/kg, v.o.) sobre o peso
corporal de ratos após o tratamento com ácido 3-nitropropiônico (3-NP 30 mg/kg,
i.p.) _____________________________________84
Figura 2. Efeitos de Cassia occidentalis (CO 400 e 800 mg/kg, v.o.) sobre a atividade
locomotora de ratos no teste de campo aberto após o tratamento com ácido 3-
nitropropiônico (3-NP 30 mg/kg, i.p.) __________________85
Figura 3. Efeitos de Cassia occidentalis (CO 400 e 800 mg/kg, v.o.) sobre o tempo
de queda no teste de rota Rod após o tratamento com ácido 3-nitropropiônico(3- NP
30 mg/kg, i.p.) ______ _____________________86
Figura 4. Efeitos de Cassia occidentalis (CO 400 e 800 mg/kg, v.o.) sobre a
porcentagem de retenção de memória no teste do labirinto em cruz elevado após o
tratamento com ácido 3-nitropropiônico (3-NP 30 mg/kg, i.p.) ____________87
LISTA DE TABELAS
ARTIGO I: Protective effect of Schinus terebintifolius Raddi against 3-nitropropionic acid-induced neurotoxicity
Table 1. Effect of Schinus terebithifolius treatment-against 3-NP induced biochemical
changes in the striatum of rat brain 82
Table 2. Effect of Schinus terebithifolius treatment-against 3-NP induced biochemical
changes in the striatum of rat brain 83
ARTIGO II: Efeito de Cassia occidentalis sobre a neurotoxicidade induzida pela administração do ácido 3-nitropropiônico em ratos
Tabela 1. Efeitos de Cassia occidentalis sobre a peroxidação lipídica na região
estriatal após o tratamento com ácido 3-nitropropiônico 88
Tabela 2. Efeitos de Cassia occidentalis sobre a atividade da sueroxido dismutase
na região estriatal após o tratamento com ácido 3-nitropropiônico _____89
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
3-NP Ácido 3-nitropropiônico
CAG Citosina-Adenina-Guanina
CO Cassia occidentalis
DH Doença de Huntington
DPPH˙ 2,2-difenil-1-picrilidrazil
EDTA Ácido etilenodiamo tetracético
EROs Espécies Reativas do Oxigênio ()
FDA Food and Drug Administration
GABA Ácido gama-amino-butírico
H2O2 Peróxido de Hidrogênio
i.p. Intraperitoneal
MDA Malonaldeído
NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo
NMDA N-metil-D-aspartato
O2- Aniôn Superóxido
OH- Radical Hidroxila
SDH Succinato desidrogenase
sec Segundos
SNC Sistema Nervoso Central
SOD Superóxido dismutase
ST Schinus terebinthifolius
v.o. Via oral
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 19
2. REVISÃO DA LITERATURA 23
2.1 Doença de Huntington 24
2.1.1 Caracteríticas gerais 24
2.1.2 Etiologia 25
2.1.3 Caracteristicas neuropatológicas 28
2.1.4 Modelos animais 29
2.1.5 Terapêutica 31
2.2 PLANTAS MEDICINAIS 32
2.2.1 Schinus terebinthifolius Raddi 32
2.2.2 Cassia occidentalis Linn 35
3. OBJETIVOS 40
3.1 Geral 41
3.2 Específicos __________ 41
4. ARTIGO I: Protective effect of Schinus terebintifolius Raddi against 3-nitropropionic acid-induced neurotoxicity 42
Abstract _____ 43
Introduction ______ 44
Material and Methods ________ 45
Results 50
Discussion _______ 52
Acknowledgements ______ 54
References ______ 54
5. ARTIGO II: Efeito neuroprotetor de Cassia occidentalis Linn sobre a neurotoxicidade induzida pelo ácido 3-nitropropiônico em ratos 60
Resumo _____ _____ 61
Introdução _____ 62
Materiaisl e Metódos _____ 63
Resultados _______ 68
Discussão 70
Referências ______ _____73
6. CONCLUSÃO 90
7. REFERÊNCIAS 91
19
1. Introdução
20
1. INTRODUÇÃO
Nos últimos anos, o crescimento da expectativa de vida média da população
mundial tem levado a um grande aumento na prevalência de doenças que são
características do processo de envelhecimento. Por isso os sistemas de saúde terão
de fazer frente a uma crescente demanda por procedimentos diagnósticos e
terapêuticos das doenças crônicas não transmissíveis, principalmente as
cardiovasculares e as neurodegenerativas, e a uma demanda ainda maior por
serviços de reabilitação física e mental (Lima-Costa; Veras, 2003; Veras, 2003).
Diante disto, fica clara a necessidade de investimento em condições de saúde para
essa população, bem como no desenvolvimento de novos agentes que melhorem a
qualidade de vida, que curem ou impeçam, de forma efetiva, a progressão dessas
doenças crônicas degenerativas.
A doença de Huntington (DH) é uma desordem neurodegenerativa progressiva
associada com seletiva degeneração de neurônios estriatais. Sendo caracterizada
por distúrbios motores, cognitivos e psiquiátricos (Aubeeluck; Wilson, 2008; Ross;
Shoulson, 2009). Desde que a causa genética da DH foi descoberta em 1993,
muitas hipóteses tem sido apresentadas para elucidar a patogênese molecular,
dentre elas, a desregulação transcricional, a excitoxicidade, o aumento do estresse
oxidativo, metabolismo energético alterado, o prejuízo do transporte axonal e a
disfunção da transmissão sináptica (Rosenstock et al., 2004; Wang; Qin, 2006; Roze
et al., 2008). Por isso vários modelos animais e genéticos vêm sendo utilizados para
estudar as características neuropatológicas e bioquímicas dessa doença, bem como
determinar novas abordagens terapêuticas (Ferrante, 2009).
Várias evidências têm demonstrado que elevados níveis de estresse oxidativo,
alterações mitocondriais, inflamação e apoptose (morte celular programada) estão
fortemente associados ao desenvolvimento de muitas doenças típicas do
envelhecimento como Alzheimer, Parkinson e Huntington (Schapira, 1999; Lopes et
al., 2004; Halliwell, 2006). Apesar de até momento não ter sido encontrada uma terapêutica definitiva que
cure ou impeça, de forma efetiva, a progressão dessas doenças e levando em
consideração que as drogas utilizadas atualmente no tratamento são apenas
21
sintomáticas (Halliwell, 2006), a utilização de substâncias naturais ou sintéticas que
atuem protegendo as células desses eventos, são fortes candidatas no
desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas de neuroproteção. O uso de plantas medicinais ou seus compostos ativos na prevenção ou
tratamento de doenças crônicas é baseado fundamentalmente na medicina
tradicional de vários grupos étnicos e em dados etnofarmacológicos. Inúmeras
substâncias químicas obtidas de plantas e microorganismos têm proporcionado à
indústria farmacêutica uma das mais importantes fontes de componentes para a
pesquisa de novos medicamentos, sendo que, nas últimas décadas, houve um
grande incentivo às pesquisas que têm como objetivo identificar produtos naturais
com propriedades terapêuticas (Silva Júnior, 1997).
Diversos produtos naturais são reconhecidos por possuírem características
antioxidantes, razão pela qual têm sido bastante empregados, seja na conservação
de alimentos seja na formulação de fármacos, visando um potencial efeito
neutoprotetor. Entre estes compostos, destacam-se as vitaminas C, E e A, terpenos,
taninos, carotenóides e flavonóides (Bianchi; Antunes 1999; Gilgun-Sherki et al.,
2001; Mandel; Youdim, 2004; Singh et al., 2004).
Estudos em humanos e animais evidenciaram que os flavonóides, um grande
grupo de compostos fenólicos presentes em frutas e vegetais, têm ação protetora
contra os efeitos do estresse oxidativo, atuando em ambos os compartimentos
celulares, lipofílicos e hidrofílicos, e, portanto, capazes de inibir a peroxidação
lipídica (Bianchi; Antunes 1999; Bastianetto et al., 2000). Os flavonóides também
possuem efeitos antitrombótico, anti-inflamatório, antihepatotoxico, antiulcerativo,
antiapoptótico e são capazes de inibir a agregação plaquetária e o crescimento de
certos tumores (Dajas et al., 2003; Singh et al., 2004).
Embora o efeito benéfico neuroprotetor de compostos naturais antioxidantes
tenha sido amplamente comprovado in vitro, estudos clínicos têm apresentado
resultados controversos (Dajas et al., 2003). Por um lado, estes resultados podem
estar relacionados ao caráter multifatorial das doenças neurodegenerativas, o que
demanda diversos níveis de proteção. Por outro lado, estariam relacionados à
capacidade dos compostos antioxidantes de cruzar ou não a barreira
hematoencefálica em quantidades suficientes para proteger o SNC (Bianchi;
Antunes 1999; Dajas et al., 2003; Mandel; Yuodim, 2004). Conseqüentemente há um
22
crescente interesse em desenvolver novas estratégias terapêuticas e dietas,
enfocando a ingestão combinada de antioxidantes de diversas naturezas, que
possam atuar sinergicamente para combater do estresse oxidativo induzido no SNC
e, desta forma, exercer um efeito neuroprotetor protegendo no caso de diversas
doenças neurodegenerativas, como doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington.
Neste trabalho foi avaliado o efeito neuroprotetor das espécies Schinus
terebinthifolius Raddi e Cassia occidentalis Linn, popularmente conhecidas como
aroeira e fedogoso, respectivamente, as quais são descritas na literatura como
detentoras de diversas propriedades medicinais, inclusive antioxidante e anti-
inflamatória (Mourelle et al, 1993; Jain et al, 1995; Velásquez et al, 2003; Degáspari
et al, 2004) . Considerando os poucos relatos sobre a atividade in vivo dessas
espécies, principalmente relacionado à neuroproteção, este estudo avaliou a
atividade neurocomportamental e bioquímica dos extratos em modelo animal da DH,
utilizando o ácido 3-nitropropiônico (3-NP) como neurotoxina, baseando-se na
capacidade protetora das espécies frente ao estresse oxidativo promovido pela
administração do 3-NP.
23
2. Revisão da Literatura
24
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Doença de Huntington
2.1.1 Características Gerais
A doença de Huntington (DH) também conhecida como Coréia de Huntington,
foi primeiramente descrita na literatura médica em 1872 por George Huntington, de
Long Island, Nova Iorque. A doença afeta homens e mulheres indiscriminadamente,
atingindo cerca de 1/10.000, tendo maior incidência em indivíduos da raça
caucasiana. É uma doença de origem hereditária autossômica dominante e
progressiva, caracterizada por movimentos involuntários coreiformes, distúrbios
emocionais e demência (Ryu et al., 2004). O aparecimento dos primeiros sintomas
ocorre normalmente entre os 30 – 50 anos de idade e progridem inexoravelmente
para morte. Dez a 25 anos após o aparecimento dos primeiros sintomas, os
pacientes geralmente vêm a óbito por pneumonia, problemas cardíacos ou outras
complicações da doença (Aubeeluck; Wilson, 2008).
Os pacientes com DH exibem uma grande variedade de sinais clínicos e
sintomas, os quais podem ser agrupados em 3 categorias: sinais motores, sintomas
cognitivos e psiquiátricos:
a) Sinais motores: contorções, torções, espasmos musculares, tiques, rigidez,
quedas, dificuldade física de iniciar um diálogo e, nos estágios mais avançados da
doença, dificuldade de deglutição;
b) Sintomas cognitivos: alteração da organização e lentidão do processamento
da informação. Isto, por sua vez, pode levar ao prejuízo na memória, na aquisição
de novos aprendizados bem como na percepção de espaço e na dificuldade de
planejamento e priorização, realização de multitarefas e organização das palavras
(gerando problemas de comunicação);
c) Sintomas psiquiátricos: depressão é a alteração mais comum; outros
sintomas incluem alterações de personalidade, apatia, ansiedade, irritabilidade,
obsessão com certas atividades, delírio, mania e negação (Bellé, 2008).
Além desses sinais e sintomas também são observados sintomas metabólicos
como perda de peso, disfunção endócrina e distúrbio do sono (Novak; Tabrizi, 2010).
25
2.1.2. Etiologia
A DH está relacionada a uma mutação no gene que codifica a proteína
huntintina (htt), localizado no braço curto do cromossomo 4 (Cardoso, 2009). Nos
pacientes com DH uma seqüência repetida do trinucleotídio citosina-adenina-
guanina (CAGn), está expandido além da taxa normal, levando a uma tradução
excedente de glutaminas na proteína huntintina (Ferrante, 2009). O gene normal da
htt tem menos que 36 repetições, sendo considerado anormal, ou expandido se tiver
36 ou mais repetições. A presença de mais de 40 repetições sempre causará a
doença de Huntington e quanto maior a quantidade de repetições do trinucleotídio
mais cedo será o aparecimento dos primeiros sintomas (Novak; Tabrizi, 2010).
A huntintina, uma proteína de aproximadamente 350 kDa é encontrada na
maioria dos neurônios (dendritos, corpos celulares e terminais nervosos) e parece
estar associada a vesículas da membrana e proteínas do citoesqueleto (DiFiglia et
al., 1995). Apesar de sua função permanecer desconhecida vários estudos tem
relacionado à huntintina ao controle intracelular de processos dinâmicos, incluindo
secreção, tráfico de vesículas a partir do complexo de golgi, transferência vesicular
entre actina e microtúbulos no citoesqueleto, transporte ao longo de microtubulos
nos axônios e eventos sinápticos endo e exocíticos. Em especial, a proteina
huntintina esta associada a um complexo motor molecular que transporta organelas
juntamente com os microtúbulos nos axônios (Roze et al., 2008).
Embora a causa exata da morte neuronal na DH permaneça desconhecida
tem sido postulado que a proteólise da huntintina mutante tem um papel importante,
formando agregados protéicos nos neurônios. Sabe-se que a agregação protéica
desencadeia uma série de ventos bioquímicos progressivos, como o aumento do
estresse oxidativo, alterações mitocondriais e processos inflamatórios que levam à
morte neuronal (Roze et al., 2008). A hipótese de que as mitocôndrias podem
desempenhar um papel nas doenças neurodegenerativas surgiu a partir da
observação que os defeitos mitocondriais e o estresse oxidativo pode ser detectado
em materiais biológicos de pacientes com doenças neurodegenerativas (Lin; Beal,
2006; Mattson, 2006). A huntintina mutante pode possivelmente interagir
diretamente com a membrana interna miocondrial e aumentar a sensibilidade do
26
poro de transição de permeabilidade mitocondrial (PTPm) ao íon cálcio ou outros
estímulos apopitóticos (Damiano et al., 2010).
A relação entre o estresse oxidativo com produção excessiva de radicais
livres e doenças neurodegenerativas tem sido descrita na literatura (Mandel;
Youdim, 2004). O estresse oxidativo é uma característica proeminente da doença de
Huntington, devido à disfunção mitocondrial e o consequente excesso na produção
de radicais livres (Stack et al., 2010)
Os radicais livres são espécies químicas, altamente instáveis e extremamente
reativas, que, por terem um número ímpar de elétrons na sua órbita externa, são
ávidos por interagir com outras substâncias em busca de um elétron para atingir a
estabilidade. Em sistemas biológicos, a maioria destes radicais são espécies
reativas do oxigênio (EROs), sendo as mais comuns o radical aniônico superóxido
(O2-) e o radical hidroxila (OH-) (Ferreira; Matsubara, 1997). No organismo humano,
a formação de EROs é decorrente de vários processos metabólicos fisiológicos
gerados no citoplasma, na mitocôndria ou na membrana celular como a respiração
mitocondrial, a fagocitose, o metabolismo do ácido araquidônico, a ovulação e a
fertilização (Bianchi; Antunes, 1999; Singh et al., 2004). Embora as EROs possam
ser formadas em vários níveis no interior das células, a principal fonte é a cadeia
respiratória mitocondrial, que faz parte do processo de fosforilação oxidativa e
catalisa o transporte de elétrons do NADH (nicotinamida adenina dinucleotídeo) e da
ubiquinona para o oxigênio, que resulta na liberação de energia para a produção de
ATP. As EROs são formadas como passos intermediários deste processo que
termina com a redução completa do O2, devido à entrada de 4 elétrons na reação e
formação da H2O (Ferreira; Matsubara, 1997).
As EROs são fundamentais para a sobrevivência dos organismos vivos por
participarem de processos de defesa, entretanto, seu excesso pode produzir danos
celulares irreversíveis. Para proteger-se dos danos produzidos pelo excesso de
EROs, as células possuem mecanismos enzimáticos de defesa antioxidante como a
superóxido dismutase, que catalisa a reação de O2- em H2O2, a catalase e a
glutationa peroxidase, que catalisam a degradação de H2O2 em H2O, que são
capazes de neutralizar os agentes oxidantes e mantê-los em níveis adequados no
organismo (Traber, 1997). Quando há um excesso de EROs nas células e,
consequentemente, um desbalanço dos processos pró-oxidantes e antioxidantes do
27
organismo, em favor da atividade pró-oxidante, há um aumento no dano celular que,
quando não reparado, acaba comprometendo o funcionamento da célula levando-a
a morte (Sies, 1993; Halliwell, 2001). As EROs estão particularmente aumentadas
em situações patológicas, e podem ser induzidas por fatores exógenos, tais como a
exposição a produtos químicos, tabagismo, radiações ionizantes e solares, consumo
de gorduras, estresse e poluentes. Em excesso, estes agentes oxidantes podem
interagir com o DNA das células, promovendo alterações gênicas e estimulando uma
proliferação celular desordenada. Eles também podem interagir com proteínas,
promovendo inativação e alterações enzimáticas, bem como interagir com os lipídios
da membrana plasmática (lipoperoxidação), promovendo mudanças na estrutura e
na permeabilidade da membrana e assim induzir à morte celular (Gilgun-Sherki, et
al., 2001).
Embora múltiplos fatores possam precipitar o estresse oxidativo nas células, o
neurotransmissor excitatório glutamato é o maior indutor deste processo no Sistema
Nervoso Central (SNC). O glutamato é um neurotransmissor excitatório essencial
que ativa diferentes receptores, entre os quais o receptor NMDA (N-metil-D-
aspartato), que é um receptor ionotrópico e cuja estimulação provoca a abertura do
canal de cálcio e aumento do cálcio intracelular. Em situações em que há aumento
excessivo deste íon devido a estimulação do receptor NMDA, pode ocorrer um
aumento na formação de EROs e o processo conhecido por excitotoxicidade
(Gilgun-Sherki et al., 2001).
Apesar dos avanços recentes na neurosciência, as bases moleculares para
diversas doenças neurológicas, incluindo a DH, ainda não estão totalmente
compreendidas. Vários mecanismos têm sido propostos para explicar os eventos
que culminam com a morte neuronal nas doenças neurodegenerativas. Os principais
mecanismos estão relacionados com excitotocicidade mediada por aminoácidos
excitatórios (glutamato); formação de agregados protéicos; alterações da função
mitocondrial e diminuição do metabolismo energético com aumento intraneuronal de
cálcio e de proteínas próapoptóticas; excesso na produção de EROS; mutações no
DNA mitocondrial; acumulação de ferro em áreas específicas do cérebro; bem como
inibição da succinato desidrogenase da cadeia respiratória mitocondrial (Gu et al.,
1996; Scahpira, 1999; Mandel; Youdim, 2004; Halliwell, 2006; Schapira, 2006;
Whitton, 2007). Além disso, o envolvimento de processo neuroinflamatório com
28
ativação de células da glia e liberação de citocinas e óxido nítrico também têm sido
frequentemente associados às doenças neurodegenerativas (Whitton, 2007). Estes
resultados indicam claramente que o processo de neurodegeneração é multifatorial.
Não se sabe ainda qual o evento inicial determinante deste processo e segundo
Halliwell (2001, 2002 e 2006), estes eventos constituem um ciclo vicioso que poderia
ser iniciado por qualquer um deles tendo como resultado final a morte neuronal
(Halliwell, 2006).
2.1.3 Características neuropatológicas
Conforme descrito anteriormente, embora não se saiba o significado
patogênico da agregação da huntigtina mutante, sabe-se que a mesma desencadeia
um serie de eventos bioquímicos progressivos e deletérios nos neurônios, levando
ao estresse, disfunções fisiológicas e respostas compensatórias, entre outros
eventos que levam a neurodegeneração e, eventualmente, à morte celular (Hersch;
Hersch; Rosas, 2008; Ferrante, 2009).
A neurodegeneração ocorre de maneira seletiva em algumas áreas cerebrais,
nas quais algumas populações vulneráveis de neurônios degeneram, enquanto
outras populações menos vulneráveis são poupadas (Rosas et al., 2008). As
primeiras e mais marcantes alterações neuropatólogicas na DH são encontradas no
estriado, com atrofia dos núcleos da base (principalmente caudado e putamem),
acompanhada por perda neuronal seletiva de neurônios GABAérgicos e astrogliose
(Revilla, 2008). Com a progreção da doença pode ocorrer atrofia de outras regiões,
incluindo o globo pálido, tálamo, núcleo subtalâmico, substância negra, cerebelo e
atrofia generalizada do córtex (Revilla, 2008; Hersch; Rosas, 2008; Krobitsch;
Kazantsev, 2010).
A primeira população a degenerar na DH são os neurônios que projetam
GABA/encefalina para o globo palido externo e GABA/substancia P para substancia
negra (Reiner et al., 1988). Esta sequência de degeneração induz uma perda incial
da inibição talâmica e subsequente aumento da excitação no córtex motor (coréia),
seguido por um aumento da inibição do tálamo e do córtex (rigidiz) (Margolis; Ross,
2001). Os sintomas característicos da doença de Huntington são resultantes dessa
vulnerabilidade neuronal, por exemplo, a perda estriatal de saídas GABAérgicas dos
29
núcleos dos gânglios basais levam a distúrbios motores, já os sintomas cognitivos e
a demência são atribuídos a mudanças degenerativas corticais e subcorticas
(Hersch; Rosas, 2008).
Estudos em cérebros posmortem mostraram que o conteúdo de dopamina no
estriado era normal ou levemente elevado, havendo uma perda de 75% na atividade
da L-glutamato descarboxilase, enzima responsável pela síntese do GABA, a partir
do aminoácido e neurotransmissor excitatório glutamato. Acredita-se que a perda da
atividade inibitória mediada pelo GABA nos gânglios basais, possa, como
conseqüência, produzir uma hiperatividade nas sinapses dopaminérgicas. Também
foi verificada uma diminuição nos níveis da enzima colinacetilase responsável pela
síntese de acetilcolina, produzindo assim, uma diminuição da atividade colinérgica
central (MAcMillan; Quarrell, 1996).
Apesar de grandes avanços terem sido feitos no entendimento da
patogênese da DH, há ainda uma compreensão incompleta dos mecanismos da
doença, por isso o estudo de modelos animais que mimetizam os sintomas
neurobiológicos e clínicos da doença é muito importante, pois pode fornecer
informações fundamentais para a compreensão da patogênese e de novas
abordagens terapêuticas (Ferrante, 2009).
2.1.4 Modelos Animais
Modelos animais da DH são amplamente utilizados para estudar a patologia
da doença a partir de diferentes pontos de vista, levando em consideração possíveis
tratamentos (Vonsattel, 2008). Os modelos animais que mimetizam os sintomas
neurobiológicos e clínicos da doença podem fornecer uma abordagem alternativa
para o estudo da patogênese molecular , o refinamento dos tratamentos existentes e
o desenvolvimento de novas terapias para o Huntington. Portanto, os modelos
animais são uma parte crucial do rápido avanço da área de pesquisa da DH (Wang,
Qin, 2006). Diversos modelos experimentais de neurodegeneração têm sido sugeridos
por sua relevância para doença de Huntington (Wang; Qin, 2006; Ferrante 2009;
Perez-De La Cruz et al., 2009; Guncová et al., 2010). Dentre eles podemos citar os
modelos excitotóxicos e de inibição metabólica, que podem causar seletiva
30
degeneração neuronal como visto em humanos com DH. As tóxinas mais utilizadas
para indução da DH em animais incluem agonistas do receptor NMDA, como o ácido
quinolínico (AQ) e inibidores da enzima succinato dehidrogenase, como o ácido 3-
nitropropônico (Kumar, 2007; Gil; Rego, 2008; Braidy et al., 2009; Ferrante, 2009). O ácido 3-nitropropiônico (3-NP) é uma neurotoxina largamente produzida
por várias espécies de fungos e naturalmente presente em plantas leguminosas.
Arthrinium fungi, uma das maiores fontes naturais de 3-NP, desenvolve-se em cana
de açúcar, amendoim e coalhada, havendo inúmeros relatos de envenenamento por
consumo destes produtos nos Estados Unidos. Crianças expostas ao 3-NP
desenvolvem distúrbios gastrointestinais seguidos por encefalopatia e coma, com a
presença de distonia e movimentos coreiformes nas sobreviventes (Beal et al.,
1993). Também é comum a intoxicação de animais de pastagem alimentados com
ração contaminada por 3-NP, os quais apresentam diminuição do desempenho
motor (Ahuja et al., 2008). O 3-NP interfere com a produção de ATP ao inibir a
succinato desidrogenase (SDH), enzima do complexo II da cadeia respiratória
mitocondrial, com consequente liberação de cálcio mitocondrial, estresse oxidativo e
morte neuronal (Gu et al., 1996; Tabrizi et al., 1999; Rosenstock et al., 2004 e 2009).
A administração crônica sistêmica de 3-NP produz lesão bilateral na região estriatal,
em roedores e primatas, com características semelhantes às da Doença de
Huntington (Beal et al., 1993; Borlongan et al., 1995).
Vários estudos demonstram que o aumento do estresse oxidativo é dos
principais eventos deletérios do processo neurodegenerativo induzido pelo 3-NP.
Além disso, a inflamação decorrente do tratamento sistêmico com 3-NP também age
como um importante fator na neurodegeneração e formação dos radicais livres
(Villarán et al., 2008; Ahuja et al., 2008; Mutairy et al., 2010). Fontaine e
coloboradores (2000) observaram que o tratamento com 3-NP em ratos produz
anormalmente espécies reativas de oxigênio tal como radicais superóxido e
hidroxilas, moléculas reativas derivadas a partir da formação do oxido nítrico, bem
como depleta os níveis das enzimas antioxidantes SOD e Catalase e aumenta os
níveis da peroxidação lipídica.
Os modelos animais oferecem portanto uma oportunidade para testar
potenciais tratamentos e explorar a tradução para seres humanos (Wang; Qin,
2006).
31
2.1.5 Terapêutica
Existem várias drogas que podem ser usadas para o tratamento das doenças
neurodegenerativas, porém conseguem unicamente proporcionar alívio dos
sintomas. No caso da DH, são usados antagonistas da dopamina (clorpromazina) e
agonistas do GABA (baclofen) para redução dos movimentos involuntários
coreiformes, relacionados a hiperfunção dopaminérgica, decorrente da
neurodegeneração dos neurônios GABAérgicos (Haddad, 1995). A tetrabenazina,
medicamento aprovado pelo FDA (Food and Drud Administration), é também
indicado para suprimir os movimentos involuntários (Coréia) (Poon et al., 2010).
O tratamento dos sintomas psiquiátricos é extremamente importante e pode
melhorar muito a qualidade de vida desses pacientes. A depressão na DH é tratada
com medicamentos antidepressivos tricíclicos convencionais (imipramina,
nortriptilina ou amitriptilina) ou com inibidores seletivos da recaptação de serotonina
(sertralina). Sintomas psicóticos, quando presentes, podem ser tratados com
neurolépticos, mas a resposta nem sempre é satisfatória. Já alterações de humor,
ansiedade e irritabilidade excessiva podem ser tratados com benzodiazepínicos
(Haddad, 1995)
Outras medidas para melhorar a qualidade de vida e manter função dos
pacientes com DH incluem fisioterapia, avaliação da fala e deglutição, terapia, e as
intervenções na dieta, incluindo o aumento das calorias para manutenção do peso
(Anderson, 2005)
A utilização de espécies vegetais e compostos bioativos com potencial
terapêutico nas doenças neurodegenerativas, como o Parkinson e Huntington, tem
sido bastante estudadas (Kim et al., 2005; Chaturvedi et al., 2006; Milioli et al.,
2007). Estudos com humanos e animais sugerem que os flavonóides, um grande
grupo de polifenóis, encontrados em frutas e vegetais, têm um importante papel em
prevenir o declínio motor e cognitivo provenientes da idade, protegendo o cérebro de
injúrias (Schroeter et al., 2001; Dajas et al., 2003; Spencer et al., 2009). Alguns
desses estudos demonstraram que o potencial efeito neuroprotetor das espécies é
decorrente da atividade antioxidante dos extratos, com conseqüente diminuição do
estresse oxidativo.
32
Entretanto, até momento não foi encontrada uma terapêutica definitiva que
cure ou impeça, de forma efetiva, a progressão das doenças neurodegenerativas.
Assim, as drogas utilizadas no tratamento são apenas sintomáticas, uma vez que
nenhuma delas faz desaparecer a degeneração neuronal. Portanto, as pesquisas
desenvolvidas nesta área são de extrema importância, pois permitirão o
conhecimento mais detalhado da fisiopatologia destas doenças, levando ao
desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas de neuroproteção, em busca da
cura e prevenção.
2.2 ESPÉCIES VEGETAIS
A procura de novos agentes farmacologicamente ativos obtidos de plantas
tem levado à descoberta de muitas drogas clinicamente ativas. Diversas plantas da
flora brasileira são utilizadas na medicina popular, mas muitas delas ainda
necessitam de estudos que dêem suporte científico ao seu uso na terapêutica
(Souza Brito; Souza Brito, 1993).
2.2.1 Schinus terebintifolius Raddi
A espécie Schinus terebinthifolius Raddi é um membro da família
Anacardiaceae, nativa da América do Sul, especialmente do Brasil, Paraguai e
Argentina. Ocorre no Brasil desde os estados de Minas Gerais e Bahia até o Rio
Grande do Sul, em várias formações vegetais. Apresenta várias sinonímias
botânicas: S. acutifólia Engl., S. glazioviana Engl., S. pohliana Engl., S. raddiana
Engl., S. aroeira Vell. e S. mucronulatus M. (Corrêa, 1978b), No Brasil é
popularmente conhecida por aroeira e “pink peper” e “pink berries”, nos Estados
Unidos (Pieribattest et al., 1981; Pires et al., 2004).
A Schinus terebenthifolius Raddi é uma árvore de médio porte, com tronco
curto, normalmente escondido pelos galhos entrelaçados. Apresenta folhas verde-
escuras, flores brancas ou de cor amarelo-pálido, frutos do tipo drupa com coloração
verde e semente única com cor marrom escura (Bornhausen, 2002).
Aparentemente todas as partes dessa árvore tropical – folhas, cascas, frutos,
sementes, resina e óleo resínico ou bálsamo - foram utilizadas medicinalmente
33
devido às suas propriedades: adstringente, antidiarréica, antiinflamatória, depurativa,
diurética, antipirética, antibacteriana, colírio, medicamento estomacal, tônico e
antivirótico (Bornhausen, 2002; Clemente, 2006).
No Brasil é popularmente utilizada por sua ação cicatrizante e
antiinflamatória, em especial na região nordestina (Borio, 1973). O chá da casca e
da folha é usado como estimulante e antidepressivo (Clemente, 2006). As folhas
produzem uma tintura amarela que é utilizada para cólicas intestinais, hemorragias
internas e externas. As cascas são adstringentes, tônicas diuréticas, uteis contra
inflamações, feridas e tumores, tendo sido empregadas contra Cholera morbus. A
resina terenbinthácea já foi muito preceituada contra reumatismo e ínguas (Côrrea,
1978b).
Devido ao grande uso popular dessa espécie (Bornhausen, 2002; Clemente,
2006) várias pesquisas vêm sendo conduzidas com objetivo de identificar seus
constituintes, sua atividade farmacológica e seu potencial tóxico.
Análises fitoquímicas realizadas durante as décadas de 60 e 70 revelaram a
presença de diversos compostos químicos, incluindo triterpenos, alcoóis, cetonas,
monoterpenos e sesquiterpenos na casca, folhas e frutos da aroeira.
Estudos fitoquímicos realizados por Lima e colaboradores (2006) no extrato
etanólico obtido da entrecasca da espécie, identificaram fenóis, triterpenos
pentaciclicos e antraquinonas; em extração hexânica utilizando a mesma parte da
planta, evidenciou-se a presença de flavonas, flavonóides, xantonas e esteróides
livres. A analise fitoquímica da fase em acetato de etila obtida do extrato etanólico
das folhas de Schinus terebinthifolius conduziu ao isolamento de cinco compostos
fenólicos: galato de etila, miricetrina, quercetina, galato de metila; supostamente
responsáveis pela potente atividade antioxidante desta espécie (Ceruks et al., 2007).
A partir da investigação realizada com as folhas da aroeira, foi possível isolar
alguns triterpenos como o ácido masticadienóico, acido 3α-hidroximasticadienóico,
sitosterol e simiarenol (Campelo; Marsaioli, 1974). Posteriormente, os mesmos
autores isolaram bauerenona, α-amirina, α-amirenona e ácido terebintifolico –
compostos presentes na casca de Schinus terebinthifolius. Nos frutos foram isolados
ainda os seguintes componentes terpênicos: ácido masticadienóico,
hidroximasticadienóico e ácido ursólico (Lloyd et al, 1977).
34
Análise obtida a partir do extrato metanólico das cascas do caule da aroeira
foi encontrada uma predominância de compostos polifenólicos e terpenóides. Dentre
os polifenóis, confirma-se a existência de forte concentração de taninos
catequéticos, sendo atribuída a estes, boa parte da bioatividade dessa planta
(Araujo, 2002).
Uma grande variedade de propriedades farmacológicas tem sido
demonstrada por meio do uso de diferentes modelos farmacológicos.
No modelo de granuloma induzido por algodão em dorso de rato, verificou-se
que o extrato aquoso obtido das folhas da aroeira apresentou atividade
antiinflamatória do tipo não-esteroidal (Mourelle et al.,1993). Jain e colaboradores
(1995) demonstraram que os triterpenos, ácido masticadienóico e ácido 3-β-
masticadienóico (schinol), presentes nos frutos da aroeira apresentavam atividade
antiinflamatória ao inibir de forma competitiva mais de 80% da atividade catalítica da
fosfolipase A2.
A emulsão preparada a partir do extrato hidroalcoólico obtido da entrecasca
da espécie demonstrou significativa atividade cicatrizante e antiinflamatória, frente
aos modelos de ferida aberta em dorso de rato e de edema de pata induzido por
carragenina, respectivamente (Da Silva, 1999). Também foi evidenciado que
Schinus terebinthifolius apresenta ação cicatrizante, respectivamente, em feridas
cirúrgicas de bexiga, estômago e pele de ratos (Lucena et al., 2006, Santos et al.,
2006; Castelo-Branco Neto et al., 2006).
O extrato hidroalcoólico obtido das folhas da aroeira apresentou significativa
atividade antimicrobiana frente às bactérias Gram positivas (Staphylococcus aureus)
e Gram negativas (Escherichia coli e Pseudemonas aeruginosa), além de uma ação
antifúngica contra a Candida albicans (Martinez et al., 1996 e 2000; Johan et al.,
2007). Amorim e Santos (2003) constataram que o gel vaginal produzido com
aroeira demonstrou-se seguro e eficaz no tratamento da vaginose bacteriana,
promovendo 84% de cura nas pacientes tratadas.
Muitas das propriedades ou efeitos curativos atribuídos pela medicina popular
à aroeira estão associadaos à presença de polifenóis na planta, como apigenina,
ácido elagico e naringina (Queires; Rodrigues, 1998; Degáspari et al., 2004), os
quais conferem à planta propriedades antioxidantes. Segundo Velásquez e
35
colaboradores (2003) a atividade antioxidante da aroeira é decorrente da inibição da
peroxidação lipídica.
Em relação à avaliação toxicológica, poucas informações são descritas na
literatura. Em trabalho realizado por Ruiz e colaboradores (1996) foi verificada a
ausência de efeitos genotóxicos no extrato hidroalcoólico das folhas da aroeira.
O fruto quando ainda não está maduro pode ser fatal para cavalos e, quando
maduro, pode intoxicar pássaros, se consumido em grande quantidade. Para o
homem, o fruto da aroeira pode causar irritações de pele, problemas respiratórios e
vômitos (Bornhausen, 2002).
Em uma análise preliminar da toxicidade aguda e da dose letal mediana
(DL50) dos frutos da aroeira em camundongos, foi determinada uma DL50 acima de
5,0 g/kg na administração por via oral. Já pela via intraperitoneal o valor obtido foi de
3,5 g/kg (Pires et al., 2004). Em estudo realizado por Araújo (2002) avaliando a
toxicidade aguda do extrato metanólico bruto obtido das cascas da aroeira em ratos,
não foi revelado qualquer sinal de toxicidade ou morte relacionada ao tratamento.
Em nosso laboratório, em estudo realizado por Lima e colaboradores (2009),
o extrato seco da casca de Schinus terebinthifolius foi oralmente administrado nas
doses de 0,625-5,0 g/kg no teste de toxicidade aguda, e durante 45 dias (ensaio de
toxicidade subaguda) nas doses diárias de 0,25; 0,625 e 1,5625 g/kg de massa
corporal. Os resultados do estudo de toxicidade aguda indicaram que Schinus
terebinthifolius por via oral com as doses até 5,0 g/kg não apresentou qualquer sinal
de toxicidade ou morte dos animais, sugerindo uma DL50 superior a 5,0 g/kg por via
oral. Similarmente, no ensaio de toxicidade subaguda não foi observado mortes ou
sinais clínicos de toxicidade.
Há poucos relatos na literatura sobre a atividade in vivo dessa espécie,
principalmente relacionado ao SNC, porém estudos com espécie do mesmo genêro
demostrou ativadade antidepressiva dependente de sua interação com os sitemas
serotoninérgicos, noradrenérgicos e dopaminérgicos (Machado et al., 2007). O que
demosntra potencial atividade de espécies do mesmo gênero sobre o SNC.
2.2.2 Cassia occidentalis L.
36
A espécie Cassia occidentalis L. é encontrada em todo o Brasil, sendo
popularmente conhecida como fedegoso, manjerioba, folha-de-pajé, maioba,
fedegoso-verdadeiro, fedegosa, mamangá, tararucu, mata-pasto, rioba, majerioba,
lava-pratos, lava-prados e ibixuma (Di Stasi; Hiruma-Lima, 2002).
É um arbusto da família das leguminosas de caule herbáceo que atinge pouco
mais de um metro de altura. Os ramos são cilíndricos ou ligeiramente angulosos, as
folhas alternadas são verde-escuras e as inflorescências, axilares ou terminais,
possuem flores grandes e amarelas. O fruto, na forma de uma vagem marrom,
contém sementes ovóides, castanho-escuro, duras e lisas (Corrêa, 1984).
As plantas do gênero Cassia são largamente utilizadas na medicina
tradicional em todo o mundo para uma ampla variedade de propósitos, sendo
algumas espécies usadas, desde a antiguidade, como potente purgativo e laxativo,
devido à presença na sua composição química de glicosídeos antraquinônicos
(Akomolafe et al., 2003).
No Peru, as raízes da Cassia occidentalis são empregadas como diurético e
sua decocção é usada como antipirético (Soukur, 1970). As sementes são
fermentadas em uma bebida e usadas no tratamento da asma enquanto a infusão
da flor é usada no tratamento da bronquite. No Panamá, o chá das folhas é usado
para cólicas estomacais e as folhas esmagadas são usadas como antiinflamatório
(Nagaraju et al., 1990). A raiz, fortemente amarga, é usada como antídoto de vários
venenos e como potente abortivo (Corrêa, 1984).
No Brasil, raízes, folhas e caule além de serem empregadas como
antitérmico, laxante, diurético e colagogo, também são amplamente utilizadas para o
tratamento da tuberculose, gonorréia, dismenorréia, anemia, gripes, dores de barriga
e de cabeça e também no tratamento de doenças hepáticas e do trato urinário
(Emperaire, 1982; Gavilanes et al., 1982; Grandi et al., 1982; Coimbra, 1994; Cruz,
1995). Com base principalmente no amplo uso popular, Cassia occidentalis L. vem
sendo comercializada por alguns laboratórios farmacêuticos (TROPILAB®INC, RAIN-
TREE NUTRITION INC). Em Pernambuco, o Laboratório Pernambucano (LAPERLI)
comercializa o extrato de Cassia occidentalis L. há mais de 50 anos com o nome de
CASSIA VIRGÍNICA®, indicado para o tratamento de gripes, febres, úlceras
varicosas e erisipelas.
Do ponto de vista bioquímico, vários estudos utilizando espécies do gênero
37
Cassia revelaram uma grande diversidade de substâncias inéditas e bioativas, com
padrões moleculares variados. A literatura relata o isolamento de mais de 350
metabólitos secundários em espécies deste gênero distribuídas em regiões tropicais
e subtropicais de várias partes do mundo. Estes estudos evidenciaram a ocorrência
de substâncias de várias classes, sendo as antraquinonas, flavonóides e outros
compostos fenólicos os constituintes mais freqüentes na maioria das espécies
(Viegas et al., 2006).
Vários constituintes de Cassia occidentalis já foram identificados em diversas
partes da planta. Foram isolados das sementes de Cassia occidentalis ácidos
cáprico, mirístico, palmítico, esteárico e oléico (Tewari; Gupta, 1953; Di Stasi;
Hiruma-Lima, 2002; Miralles; Gaydou, 1986), triglicerídeos, ácidos monoenóico,
dienóico e trienóico (Di Stasi; Hiruma-Lima, 2002), além do ácido graxo cet(Z)-7-oxo-
11-octadecenóico (Daulatabad et al., 1996). Também foram detectados derivados
antraquinônicos (Rai; Shok, 1983; Lal, 1973 e 1974) e o conteúdo de óleo,
carotenóides e tocoferóis foi avaliado durante o desenvolvimento das sementes (Di
Stasi; Hiruma-Lima, 2002). Da raiz foram isolados pinselina, 1,7-dihidroxi-3-
metilxantona, 1,8-dihidroxiantraquinona (Wader; Kudav, 1987), bis (tetrahidro)
antraceno, occidentalo-1, occidentalol-2, crisofanol, emodina, pinselina, questina,
germicrisona, metilgermitorosona e singueanol-1 (Kitanaka; Takido, 1989). Já das
folhas vários derivados antraquinônicos (Chauhan et al., 2001). A concentração de
compostos fenólicos totais foi estimada em folhas e caules de Cassia occidentalis
em diferentes estágios de desenvolvimento (Ambasta et al., 1990).
Recentemente, estudos com extrato metanólico de Cassia occidentalis (raiz,
caule e folha), utilizando técnica de cromatografia em camada delgada,
demonstraram a presença de flavonóide, triterpeno e antraquinona. Não foram
identificados alcalóides e apenas uma pequena quantidade de saponina foi
encontrada (Aragão, 2008). A contínua identificação de novos metabólitos de Cassia
occidentalis, aliada a novos métodos de avaliação farmacológica e biológica está
sendo determinante na descoberta de compostos ativos que apresentem
seletividade por determinados alvos biológicos (Viegas et al, 2006).
Entretanto, apesar de ser amplamente utilizada na medicina popular, muitos
dos efeitos de Cassia occidentalis ainda não foram comprovados. Desde a década
de 70, vários grupos de pesquisa em todo o mundo têm se dedicado ao estudo
38
farmacológico desta espécie. Por meio de ensaios in vitro as propriedades
antibacteriana, antiviral, antifúngica, antiparasitária, antimalária e inseticida do
fedegoso estão sendo pesquisadas (Sama et al., 1976; Cáceres et al., 1991;
Hussain, 1991; Schmeda-Hirschmann, 1992; Gasquet et al., 1993). Além disso, por
meio de estudos com animais de laboratório, algumas propriedades farmacológicas
vêm sendo analisadas, como as atividades: antiinflamatória, hepatoprotetora,
antiulcerogênica, laxativa, relaxante muscular e hipotensiva (Sadique et al., 1987;
Elujoba et al., 1989; Saraf et al., 1994; Jafri et al., 1999; Ajagbonna et al., 2001; Lira
et al., 2005).
Estudos realizados no nosso Laboratório indicaram que o extrato seco de
Cassia occidentalis possui atividades antiedematogênica, analgésica e antipirética
com a vantagem de não apresentar propriedade irritante de mucosa gástrica, pelo
contrário, possuir um efeito gastroprotetor (Aragão, 2008). Mais recentemente,
Sreejith e colaboradores (2010) demonstraram que o extrato etanólico produzido
com Cassia occidentalis (toda a planta) é capaz de inibir a degranulação de
mastócitos e estabilizar a membrana de hemácias podendo atuar como potente
agente antiinflamatório e antialérgico. Além disso, uma potente atividade
antioxidante tem sido observada por meio de diferentes metodologias (Yen et al.,
1998; Usha et al., 2007; Sreejith et al., 2010; Yadav et al., 2010). O flavonóide
emodina, identificado em extratos do gênero Cassia, tem sido relacionado à
presença de forte atividade antioxidante da espécie (Yen et al., 1998).
Apesar do amplo uso desta espécie na medicina popular, poucos são os
trabalhos disponíveis na literatura sobre seu potencial toxicológico. A maioria dos
artigos toxicológicos utilizando Cassia occidentalis refere-se à toxicidade de suas
sementes. Estudos com roedores têm demonstrado que a ingestão de grandes
quantidades de sementes produz sintomas como ataxia, apatia, diarréia, dispnéia,
anorexia e morte com degeneração dos músculos esqueléticos e cardíacos
(Barbosa-Ferreira et al., 2005). Uma substância encontrada nas sementes de
espécies do gênero Cassia e identificada como diantrona (derivada de glicosídeos
antraquinônicos), tem sido relacionada aos efeitos tóxicos observados,
característicos de miopatia mitocondrial (Haraguchi et al., 1996; Barbosa-Ferreira et
al., 2005). Entretanto, Medoua e Mbofung (2003 e 2007) observaram que a bebida
preparada com as sementes de Cassia occidentalis não apresenta nenhum risco de
39
toxicidade para o consumo. Isso ocorre devido ao processo tradicionalmente usado
pela população de torrar as sementes.
As espécies do gênero Cassia em geral, devido à presença de glicosídeos
antraquinônicos em sua composição, são amplamente utilizadas e comercializadas
como laxativos. Entretanto, o uso indiscriminado da planta, pode produzir um quadro
de sintomas tóxicos caracterizado por náuseas, vômitos, cólicas abdominais e
acentuada diarréia, acompanhado de distúrbios hidroeletrolíticos em casos graves.
As espécies usadas para essa finalidade devem ser consumidas com cuidado,
especialmente por crianças (Di Stasi; Hiruma-Lima, 2002).
Estudos realizados em camundongos com as raízes de Cassia occidentalis,
demonstraram ausência de efeitos tóxicos com doses de até 500mg/kg por via
intraperitoneal e 1000mg/kg por via oral (Lira et al., 2005). Alem disso, estudos de
toxicologia reprodutiva, realizados em nosso laboratório com o extrato seco de
Cassia occidentalis demonstraram ausência de efeitos tóxicos em parâmetros
reprodutivos, porém constataram a presença de fetos mortos com as doses de 250
mg/kg e 500mg/kg sugerindo que mais estudos precisam ser realizados para
esclarecer o preciso potencial toxicológico reprodutivo da espécie e que seu uso não
deve ser recomendado para mulheres gestantes (Aragão et al., 2009). Assim,
embora a toxicidade das sementes de Cassia occidentalis esteja bem determinada,
o potencial toxicológico das demais partes da planta ainda não foi adequadamente
avaliado, sendo necessários mais estudos para determinar a segurança de uso
desta espécie.
A investigação científica sobre Cassia occidentalis sugere um enorme
potencial biológico da planta, porém estudos mais aprofundados sobre suas
atividades farmacológicas são de fundamental importância (Yadav et al., 2010).
Apesar de existirem vários estudos sobre a constituição química e a
toxicologia de ambas as espécies, poucos relatos são encontrados sobre a atividade
farmacológica, principalmente relacionada à neuroproteção. Baseando-se na
elevada atividade antioxidante das espécies, utilizou-se um modelo de estresse
oxidativo, evento intimamente relacionado com várias patologias
neurodegenerativas, para avaliar um possível efeito de proteção.
40
3. Objetivos
41
3. OBJETIVOS
3.2 Geral
O presente trabalho tem como objetivo geral investigar um possível efeito
neuroprotetor das espécies Schinus terebinthifolius e Cassia occidentalis sobre
alterações deletérias induzidas pela administração sistêmica do ácido 3-
nitropropiônico em ratos machos adultos.
3.3 Específicos
- Pesquisar a atividade antioxidante in vitro dos extratos de Schinus terebinthifolius e
Cassia occidentalis pelo método de captura de radicais 2,2-difenil-1-picrilidrazil
(DPPH˙);
- Investigar o efeito da administração dos extratos de Schinus terebinthifolius e
Cassia occidentalis sobre o comportamento de animais tratados com ácido 3-
nitropropiônico e animais controle, através dos testes comportamentais de campo
aberto (avaliação motora e comportamental), rotarod (coordenação motora) e
labirinto em cruz elevado (avaliação da memória);
- Mensurar os produtos de peroxidação lipídica e a atividade da enzima antioxidante
superóxido dismutase (SOD) no estriado de animais tratados com ácido 3-
nitropropiônico e tratados com os extratos de Schinus terebinthifolius e Cassia
occidentalis bem como de seus respectivos controles;
42
4. Artigo I Artigo submetido ao Períodico Pharmacology
Biochemistry and Behavior
43
Protective effect of Schinus terebintifolius Raddi against 3-nitropropionic acid-
induced neurotoxicity
Juciene B. R. Silvaa, Germana F. R. Caldasa, Rafaella F. da Nóbregaa, Belmira L. S. A. Costab, Soraya S. Smailic, Almir G. Wanderleya,b and Simone S. L.
Lafayettea,b* aDepartment of Pharmaceutical Sciences, Federal University of Pernambuco, Zip
Code 50740-521, Recife - PE, Brazil bDepartment of Physiology and Pharmacology, Federal University of Pernambuco,
Zip Code 50670-901, Recife - PE, Brazil cDepartment of Pharmacology, Federal University of Sao Paulo, Zip Code 04044-
020, São Paulo - SP, Brazil
*Corresponding author at: Department of Physiology and Pharmacology, CCB,
University Federal of Pernambuco, Av. Prof. Moraes Rego, s/n, CEP 50670-901 –
Cidade Universitária, Recife, PE, Brazil – Tel.: +55 81 21268530; fax.: +55 81
21268976. E-mail address: simonesette@terra.com.br
ABSTRACT
Huntington's disease (HD) is a neurodegenerative disorder characterized by motor
impairment, cognitive decline and psychiatric symptoms. Systemic administration of
3-nitropropionic acid (3-NP), an irreversible succinate dehydrogenase inhibitor,
causes selective striatal degeneration similar to that seen in HD. Although the
precise cause of neuronal cell death in HD is unknown, recent studies clearly
demonstrate that increased oxidative stress is one of the major deleterious events in
the 3-NP-induced neurodegenerative process. Schinus terebinthifolius (ST) has been
studied for its antioxidant properties. The present study examines the effects of ST
on behavioral and biochemical alterations induced by the administration of 3-NP to
rats. Systemic administration of 3-NP (30mg/kg, i.p. for 5 days) produced
hypolocomotion, muscle incoordination and memory deficit. ST administration (300
and 600 mg/kg p.o. for 7 and 14 days) improved 3-NP-induced dysfunctional
44
behavior (locomotor, rotarod and memory retention). Biochemical analysis of the
striatum revealed that systemic 3-NP administration significantly increased lipid
peroxidation and decreased superoxide dismutase activity, which was attenuated by
daily treatment with ST. These results suggest that the protective effects of ST
against 3-NP-induced rat striatal degeneration are mediated through its antioxidant
activity and suggest that it could be a therapeutic agent for the treatment of HD.
Keywords: Huntington's disease; 3-nitropropionic acid; Oxidative stress; Schinus
terebinthifolius; Behavioral parameters
1. Introduction
Huntington's disease (HD) is a progressive neurodegenerative disorder
characterized by motor impairment, cognitive decline and psychiatric symptoms that
worsen as the disease progresses (Rosenstock et al., 2010; Stack et al., 2010). The
most striking neuropathology in HD occurs within the striatum, in which gross atrophy
of the caudate nucleus and putamen is accompanied by selective neuronal loss of
the medium spiny GABAergic neurons and astrogliosis. Other regions, including the
cerebral cortex, globus pallidus, thalamus, subthalamic nucleus, substantial nigra
and cerebellum, show varying degrees of atrophy depending on the pathologic grade
(Vonsattel, 2008). Despite the discovery of the genetic mutation of HD (Huntington's
Disease Collaborative Research Group, 1993), the mechanisms of the pathogenesis
of HD are still not understood. Oxidative stress, mitochondrial dysfunction (Trushina
and McMurray, 2007; Teles et al., 2008) and neuroinflammation (Bonelli et al., 2004)
have been proposed as contributing factors for the appearance of motor alterations
and cognitive decline (Coyle and Puttfarcken, 1993; Browne et al., 1999;
Turrens,1997; Barja, 2004; Smaili et al., 2009). A consistent defect in the
mitochondrial respiratory chain complex II–III has been found in the caudate nucleus
of patients with HD (Browne et al., 1997).
3-nitropropionic acid (3-NP) is a mitochondrial toxin, produced by the fungus
Arthrinium spp that irreversibly inhibits the activity of the mitochondrial metabolic
enzyme succinate dehydrogenase (SDH), which participates in both the TCA cycle
45
and the electron transport chain complex II–III (Andreassen et al., 2000). Lesions
produced by systemic administration of 3-NP are bilateral, striatal specific, develop
spontaneously and the changes are similar to those described in the striatum in HD
(Beal et al., 1993; Brouillet et al., 2005).
In HD patients and animal models, mitochondrial dysfunction results in the
overproduction of reactive oxygen species (ROS), which leads to oxidative and
nitrosative stress. This stress contributes to neuronal dysfunction by damaging DNA,
proteins, and lipids (Stack et al., 2010). Recent studies clearly demonstrate that
increased oxidative stress is one of the major deleterious events in a 3-NP-induced
neurodegenerative process (Mutairy et al., 2010). In normal cells, oxidative stress is
combated by endogenous antioxidant pathways and free radical scavengers. The
pretreatment of animals with antioxidants has been shown to exert a protective effect
against a variety of neurotoxins (Ahuja et al., 2008; Stack et al., 2010; Mutairy et al.,
2010).
Schinus terebinthifolius Raddi (Anacardiaceae) is a native plant of South
America (Corrêa, 1974). In Brazil it is popularly called Aroeira (Pires et al., 2004). In
folk medicine it has been used because of its properties as: astringent, antidiarrheal,
diuretic, antibacterial, anti-viral, antipyretic, anti-inflammatory and antioxidant. Many
of its properties or healing effects attributed by folk medicine are associated to the
presence of polyphenols in the plant, such as apigenin, ellagic acid and naringin,
which give the plant its antioxidant properties. (Queires and Rodrigues, 1998;
Veslázquez et al., 2003; Degáspari et al., 2004; Medeiros et al., 2007). This study
was undertaken to test the hypothesis that Schinus terebinthifolius being a highly
potent antioxidant may protect rats against the 3-NP model of HD.
2. Materials and methods
2.1 DPPH radical scavenging activity
Antioxidant radical scavenging activities in plant extracts were evaluated using
DPPH (2.2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radicals (Brand-Williams et al., 1995). 1.0 ml of
DPPH solution (30 mM, in 95% ethanol) was incubated with 2.5 mL of varying
concentrations of Schinus terebinthifolius extract (2.5-250 µg/mL). The reaction
46
mixture was shaken well and incubated for 30 min at room temperature, and the
absorbance of the resulting solution was read at 515 nm against a blank. The radical
scavenging activity was measured as an absorbance decrease of DPPH and was
calculated using the following equation:
(Absorbance of control - Absorbance of test) x 100
Absorbance of control
The synthetic antioxidant butylated hydroxytoluene (BHT) was included in
experiments as a positive control.
2.2 Experimental animals
Male Wistar rats (Rattus norvegicus var. albinus) weighing between 250-300g
were used for neuroprotective experiments. The animals were obtained from the
Department of Physiology and Pharmacology from the Federal University of
Pernambuco (UFPE). They were maintained under standard environmental
conditions (12 h dark/light cycle) and temperature (22 ± 2 °C). Water and
industrialized dry food (Labina®, Purina, Brazil) were available ad libitum. All
experiments were carried out between the hours of 09:00 and 15:00. The protocol
was approved by the Animal Experimentation Ethics Committee of the Biological
Science Center - UFPE, under license no. 23076.017121/2008-12 in accordance with
the National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
2.3 Drugs
3-Nitropropionic acid (3-NP), purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA),
was dissolved in saline (adjust pH 7.4) one day before beginning treatment. On
subsequent days, solutions remained in the refrigerator (4 °C). Stem bark of the
Schinus terebinthifolius was collected in the town of Limoeiro, Pernambuco, Brazil.
The hydroalcoholic extract used in the present study was supplied by LAPERLI
(Laboratório Pernambucano Ltda, Pernambuco – Brazil). In the laboratory, the
ethanolic extract of Schinus terebinthifolius (ST) was evaporated to dryness under
47
reduced pressure for the total elimination of alcohol, followed by lyophilization. The
lyophilized extract was kept at room temperature until use and suspended in distilled
water. Butylated hydroxytoluene (BHT), 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH),
malondialdehyde (MDA), thiobarbituric acid (TBA), Epinephrine and 1,1,3,3-
tetrametoxipropane (TMP), used in biochemical analysis, were also purchased from
Sigma.
2.4 Drug treatment
Rats were randomly divided into four groups (n=8/group). Rats in Group 1
served as the control group and received intraperitoneal (i.p.) pretreatment for 5 days
with a vehicle (NaCl 0.9% i.p.) and water per oral (p.o.) route for 14 days (10 mL/kg);
Group 2 received 3-NP (30 mg/kg, i.p.) for 5 days and water orally for 14 days (10
mL/kg); Group 3 and 4 were treated with 3-NP as in group 2. In addition, after the 3-
NP treatment for 5 days, the animals received ST by gavage in daily doses of 300
and 600 mg/kg for 14 days, respectively. After the final dose of 3-NP, the rats were
tested for behavioral parameters on days 1, 7 and 14. After behavioral assessments,
animals were used for biochemical assays.
2.5 Measurement of body weight change
The body weights of animals were recorded before starting the experiment
and then prior to behavioral assessment. Percentage body weight changes were
calculated in comparison to the initial body weight on the first day of experimentation.
2.6 Experimental procedures
After the fifth day of intraperitoneal treatment with 3-NP or vehicle, all animals
were submitted to behavioral tests on days 1, 7 and 14.
2.6.1 Locomotor activity
48
To quantify general activity, rats were placed individually in the center of an
open-field arena (a circular wooden box 100 cm in diameter and 40 cm high, with a
floor divided into 19 regions). Locomotion frequency (number of floor units entered by
the animal with four paws), rearing frequency (the number of times the animal stood
on its hind legs) and time at rest (time that the animal stood still without showing any
movements) were measured for 5 min. The device was cleaned with a 5% alcohol–
water solution before placement of the animals to eliminate a possible bias effect due
to odor clues left by previous rats.
2.6.2 Rotarod activity
All animals were evaluated for grip strength by using the rotarod. Each rat was
given a prior training session before initialization of therapy to acclimatize them to a
rotarod apparatus. The animal was placed on the rotating rod with a diameter of 7 cm
(speed 25 rpm). Two separate trials were performed by each rat at 5 min intervals
and a cut off time (180) was maintained throughout the experiment. The average
results were recorded as fall of time (Kulkarni, 1999).
2.6.3 Elevated plus maze test for spatial memory
The experiment was performed according to the Puneet et al. (2006) method.
Briefly, the elevated plus maze consists of two opposite open arms (50×10 cm),
crossed with two closed arms of the same dimensions with 40 cm high walls. The
arms are connected with a central square (10×10 cm). After 5 days of 3-NP
treatment, memory acquisition was assessed on days 1, 7 and 14. . The animals
were placed individually at one end of an open arm facing away from the central
square and the time taken by the animal to move from the open arm and enter one of
the closed arms was recorded as initial transfer latency (ITL). The rat was allowed to
explore the maze for 30s after recording the initial acquisition latency and returned to
its home cage. Retention latency was noted again on days 2, 8 and 15, after 5 days
of 3-NP treatment.
Percentage memory retention was calculated by the formula –
49
Transfer latency (first analysis − second analysis) × 100
Transfer latency (first analysis)
2.7 Biochemical studies
2.7.1 Dissection and homogenization
After days 2, 8 and 15, the animals were sacrificed by decapitation
immediately after the behavioral assessment, for the biochemical analysis. Brains
were removed, and the forebrains were dissected out and the cerebellum discarded.
Brains were put on ice and the striata were separated. A 10% (w/v) tissue
homogenate was prepared in PBS 1X, to which was added BHT (0.004% w/v) to
prevent autoxidation of the samples. The homogenate was centrifuged at 10.000 g
for 15 min and an aliquot of supernatant was separated.
2.7.2 Measurement of lipid peroxidation
The quantitative measurement of lipid peroxidation in the brain was performed
according to the method described by Buege and Aust (1978). The amount of
malondialdehyde (MDA) as a measure of lipid peroxidation, was measured by
reaction with thiobarbituric acid. Briefly, aliquots (500 µL) of supernatant were placed
in test tubes and added to 1 mL of TBA reagent: TBA 0.38% (pv), 250 mL of 1N
hydrochloride acid (HCl), trichloroacetic acid (TCA 15%) and 20 mL of ethanoic BHT
(2%). The solution was shaken and heated to 100 ° C for 15 minutes, followed by
cooling in an ice bath. 1.5 mL of n-butanol was added, shaken and centrifuged to
3000 x g. After centrifugation, the upper layer was collected and assessed with a
spectrophotometer (CARY 3E - UV - Visible Spectrophotometer Varian) at 532 nm.
All determinations were made in triplicate and contained only white n-butanol. For
calculations, a standard curve was constructed with TMP. Results were expressed as
nmol MDA/mg protein.
2.7.3 Superoxide dismutase activity (SOD)
50
Superoxide dismutase enzyme activity was determined according to the
method by Misra and Fridovich (1972). One hundred microliters of supernatant was
added to 880 µl (0.05 M, pH 10.2, 0.1 mM EDTA) carbonate buffer. Twenty
microliters of epinephrine (30 mM in 0.05% acetic acid) was added to the mixture at
480 nm f or 4 min on spectrophotometer. The enzyme activity was expressed as the
amount of enzyme that inhibits the oxidation of epinephrine by 50%, which is equal to
1 unit.
2.8 Protein estimation
Protein was assessed by the Bradford method (1976) using bovine serum
albumin as a standard.
2.9. Statistical analysis
Data were computed in Prism software (Version 5) and expressed as means ±
SEM. Differences between the experimental groups were analyzed by one-way
analysis of variance (ANOVA) followed by post hoc Tukey’s multiple comparison
tests to determine the significance level. P values less than 0.05 were considered
statistically significant.
3. Results
3.1 Reduction of 2.2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical
Significant DPPH radical scavenging activity was evident in all concentrations
tested. The preparation was able to reduce the stable free radical DPPH to the
yellow-colored 1.1-diphenyl-2-picrylhydrazyl with an IC50 8.5 µg/mL. Under similar
conditions, the synthetic antioxidant BHT showed IC50 73.8 µg/mL.
3.2 Effect of Schinus terebithifolius on body weight in 3-NP-treated rats
51
There was no change in the initial and final body weights of vehicle treated
animals. However, 3-NP treatment caused a significant decrease in body weight on
the last day when compared to the vehicle-treated group. Treatment with ST (300
and 600 mg/kg p.o.) significantly protected body weight loss in 3-NP-treated rats after
7 and 14 days of treatment (p<0.05) (Fig. 1).
3.3 Effect of Schinus terebinthifolius on locomotor activity in 3-NP
Administration of 3-NP for 5 days significantly reduced the locomotor activity of
rats (p<0,05). Treatment with ST (300 and 600 mg/kg, p.o.) for 7 and 14 days
significantly improved locomotor activity in 3-NP-treated rats (Fig. 2). Daily treatment
with ST increased ambulatory and rearing movements, and decreased time at rest.
3.4 Effect of Schinus terebithifolius on rotarod activity in 3-NP-treated rats
Treatment with 3-NP (30 mg/kg., i.p. for 5 days) significantly decreased
muscle grip strength and significantly decreased the fall-off time when compared to
control animals (Fig. 3). Daily treatment with ST (300 and 600 mg/kg, p.o.) for 7 and
14 days, significantly increased the fall-off time when compared to the group treated
only with 3-nitropropionic acid.
3.5 Effect of Schinus terebithifolius on memory performance in elevated plus maze
Treatment with 3-NP (30 mg/kg., i.p. for 5 days) caused a marked memory
loss as shown by a significant decrease in the % retention of memory in rats when
compared to the vehicle control group (Fig. 4). Daily administration of ST (300 and
600 mg/kg, p.o.) for 14 days after 3-nitropropionic acid increased the % retention
memory in rats when compared to the group treated only with 3-nitropropionic acid.
3.6 Biochemical parameters
The administration of 3-NP resulted in significant changes within biochemical
parameters when compared to the control animals. The administration of 3-NP for 5
52
days induced oxidative stress as indicated by a significant increase in the striatum
MDA levels and a decrease in the superoxide dismutase levels when compared to
the vehicle control group. Schinus terebithifolius treatment (600 mg/kg, p.o.) for 7 and
14 days after 3-nitropropionic acid, attenuated the increase in lipid peroxidation in the
striatum as shown by a significant decrease in MDA levels (Table 1). Similarly, daily
treatment with ST (300 and 600 mg/kg p.o.) for 7 and 14 days after 3-NP, restored
the decreased levels of SOD (Table 2).
4. Discussion
The main finding of this study was that treatment with Schinus terebinthifolius
protected the animals from toxicity caused by systemic administration of 3-NP. ST
significantly improved motor deficits and cognitive functions and prevented oxidative
stress induced by systemic 3-NP administration. 3-Nitropropionic acid (3-NP), a
mitochondrial toxin, causes preferential neuronal degeneration in the striatum and
produces anatomical changes similar to Huntington’s disease in experimental
animals (Beal et al., 1993). The primary mechanism of 3-NP-caused neurotoxicity
involves the irreversible inhibition of mitochondrial succinate dehydrogenase (SDH)
and leads to the inhibition of ATP synthesis (Alston et al., 1977; Coles et al., 1979;
Rosenstock et al., 2009).
In the present study, 3-NP treatment produced significant weight loss when
compared to vehicle-treated animals. Treatment with ST caused significant
improvement in body weight in 3-NP-treated animals. Huntington's disease patients
often present a degeneration of hypothalamic neurons and a loss of body weight that
may be considered an indicator of 3-NP neurotoxicity (Kumar and Kumar, 2009a). It
has been reported that striatal lesions and bradykinesia are responsible for reducing
rat appetite and food intake (Kumar et al., 2007). However, reduction in body weight
could be related to the impairment of energy metabolism, the mobilization of energy
stores and lipid peroxidation, which constitute peripheral affects (Ahuja et al., 2008).
A dose of 3-nitropropionic caused significant alterations in locomotor activity
(hypoactivity), impaired motor coordination (rotarod performance) and cognitive
impairment, as seen in Huntington disease patients. Daily treatment with ST for 7 and
14 days attenuated 3-NP-induced hypolocomotion and motor incoordination. Studies
53
have reported that the administration of 3-NP acid is associated with both hypo- and
hyperactivity depending upon frequency and time of dosing (Borlongan et al., 1997).
Animals which received 3-NP for 7 days exhibited significant hypoactivity along with
a marked neuronal loss in the dorsolateral striatum depicting that rigidity and
movement disorders are related to basal ganglia lesions (Beal et al., 1993). Effects of
3-NP on gait abnormalities and body movements are further supported by the
evidence that an interstitial injection of 3-NP causes reductions in markers for both
striatal intrinsic neurons such as GABA, substance P, somatostatin, and
neuropeptide Y, as well as a decrease in markers for striatal afferents such as
dopamine and its metabolites (Nam et al., 2005). Striatal neurodegeneration could be
due to the generation of free radicals because of impaired mitochondrial functions
and the selective, high vulnerability of dopaminergic neurons (Backman; Farde,
2001; Treatment with 3-nitropropionic acid produced memory deficit in rats and the
daily treatment of Schinus terebinthifolius improved memory retention in 3-NP.
Cognitive impairment is one of the major symptoms of Huntington's disease and can
be associated with selective striatal damage and certain hippocampal neuronal
damage (Borlongan et al., 1995; Duan et al., 2000; Kumar and Kumar, 2009b).
The hypothesis that mitochondria could play a role in neurodegenerative
diseases arises from the observation that mitochondrial defects and oxidative stress
can be detected in biological materials from patients with neurodegenerative
conditions (Damiano et al., 2010). Shinomol Muralidhara (2008) observed that
mitochondria isolated from various brain regions exposed to 3-NP showed a
significant concentration-dependent elevation in all the markers viz., ROS, MDA and
hydroperoxide levels, suggesting the induction of oxidative stress. In the present
study, there was an increase in brain MDA levels (an indicator of lipid peroxidation
due to free radicals) and a decrease in superoxide dismutase levels following 3-NP
administration, which was attenuated by ST extract, suggesting the antioxidant action
of Schinus terebinthifolius. The antioxidant activity of the extract was also measured
in the DPPH radical assay, which primarily evaluates proton radical-scavenging
ability. Furthermore, it is well established that DPPH-free radical scavenging by
antioxidants is due to their hydrogen-donating ability (Shinomol Muralidhara, 2008).
Oxidative stress due to an increase in free radical generation or an impaired
endogenous antioxidant mechanism is an important factor that has been implicated
54
in various neurodegenerative diseases (Beal et al., 1995). The brain is highly
susceptible to free radical damage because of its high utilization of oxygen and the
presence of a relatively low concentration of antioxidant enzymes and free radical
scavengers. Consequently, there is growing interest in establishing therapeutic and
dietary strategies to combat oxidative stress induced damage to the central nervous
system. Administration of various antioxidant agents has been shown to improve
oxidative stress and injury produced by 3-NP (Rosenstock et al., 2004; Kim et al.,
2005; Kumar and Kumar, 2009b; Mutairy et al., 2010). Studies in humans and
animals have suggested that flavonoids, a large group of polyphenolic compounds
found in fruits and vegetables are capable of counteracting neuronal injury, thereby
delaying the progression of neurodegenerative diseases. The benefits of flavonoids
are generally thought to be due to their antioxidant properties (Dajas et al., 2003;
Spencer et al., 2009).
This is the first report that highlights the effect of Schinus terebinthifolius in
neurodegenerative disease. This species shows a high antioxidant activity probably
related to its flavonoid content (Veslázquez et al., 2003, Degáspari et al., 2004; Lima
et al., 2009), therefore it can be used in diseases in which oxidative stress may play
a key role.
In conclusion, the results of this study confirm that the administration of 3-NP
in rats induces neurobehavioral and biochemical changes mimicking those observed
in HD. Treatment of rats with Schinus terebinthifolius produced significant
neuroprotection probably mediated through its antioxidant activity. This would
suggest that it may be a therapeutic agent. However, the clinical relevance of ST for
the treatment of HD warrants further studies.
Acknowledgements
The author thanks Rejane de Souza Silva for excellent technical assistance
and to the Laboratório Pernambucano Ltda. (LAPERLI) for providing the extract of
Schinus terebinthifolius. This study was funded by FACEPE.
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60
5. Artigo II Artigo a ser submetido ao Períodico Pharmacology
Biochemistry and Behavior
61
Efeito neuroprotetor de Cassia occidentalis Linn sobre a neurotoxicidade
induzida pelo ácido 3-nitropropiônico em ratos
Juciene B. R. Silvaa, Germana F. R. Caldasa, Jamilka L. Silvaa, Belmira L. S. A. Costab, Soraya S. Smailic, Almir G. Wanderleya,b and Simone S. L. Lafayettea,b*
aDepartamento de Ciências Farmacêuticas, Universidade Federal de Pernambuco,
Recife – PE, Brasil bDepartamento de Fisiologia e Farmacologia, Universidade Federal de Pernambuco,
Recife – PE, Brasil cDepartamento de Farmocologia, Universidade Ferderal de São Paulo, São Paulo –
SP, Brasil
*Autor para correspondência: Simone Sette Lopes Lafayette, Departamento de
Fisiologia e Farmacologia, CCB, Universidade Federal de Pernambuco, Av. Prof.
Moraes Rego, s/n, CEP: 50670-901-Cidade Universitária, Recife, PE, Brasil – Email:
simonesette@terra.com.br
RESUMO
A Doença de Huntington (DH) é uma desordem neurodegenerativa caracterizada por
prejuízo motor, declínio cognitivo e sintomas psiquiátricos. Um modelo animal que
mimetiza muitos dos sintomas observados na DH utiliza a neurotoxina mitocondrial
ácido 3-nitropropiônico (3-NP). Neste trabalho avaliou-se a atividade neuroprotetora
do extrato de caules e folhas de Cassia occidentalis (CO) sobre parâmetros
comportamentais e bioqímicos induzidos pela administração intraperitoneal do ácido
3-nitropropiônico, um inibidor seletivo da enzima succinato desidrogenase.
Avaliações comportamentais foram realizadas utilizando os modelos de campo
aberto, rotarod e labirinto em cruz elevado. A atividade antioxidante in vitro foi
determinada através do método de captura do radical livre DPPH˙. A atividade
antioxidante in vivo, por meio da peroxidação lidipídica (dosagem das substancias
reativas ao ácido tiobarbitúrico – TBARS), e da atividade enzimática da superóxido
dismutase (SOD) foi avaliada na região estriatal após os testes comportamentais. A
62
administração intraperitoneal de 3NP (30 mg/kg por 5 dias) causou significativa
perda de peso corporal, déficit motor e perda de retenção de memória quando
comparado aos animais controle. Além disso, análises bioquímicas revelaram
significativo aumento na peroxidação lipídica e diminuição da atividade da SOD na
região estriatal. O tratamento diário com CO (400 e 800mg/kg, oral) melhorou
significativamente o peso corporal, o desempenho motor e cognitivo quando
comparado ao grupo doente (3-NP). Além disso, significativamente atenuou a
peroxidação lipídica e a diminuição da atividade da SOD. Observou-se uma IC50 de
53,66 µg/ml mo teste de captura do radical DPPH, sugerindo que o efeito protetor do
extrato Cassia occidentalis contra seja mediado por sua atividade.
Palavras-chave: antioxidante; Cassia occidentalis; Huntington; neuroproteção;
1. Introdução
A doença de Huntington (DH) é uma desordem neurodegenerativa
progressiva associada à seletiva degeneração de neurônios GABAérgicos na região
do estriado. Com o progredir da doença outras regiões cerebrais também podem ser
afetadas, como: córtex, globo pálido, tálamo, núcleo subtalâmico, substancia nigra e
cerebelo (Vonsattel, 2008). A DH é caracterizada por distúrbios motores, cognitivos
e psiquiátricos (Aubeeluck et al. 2008; Ross; Shoulson, 2009).
Desde que a causa genética da DH foi descoberta em 1993, muitas hipóteses
têm sido apresentadas para elucidar sua patogênese molecular, dentre elas:
excitoxicidade, aumento do estresse oxidativo, alteração do metabolismo energético,
prejuízo do transporte axonal e disfunção da transmissão sináptica (Roze et al.,
2008). Modelos experimentais que utilizam animais e que mimetizam os sintomas
neurobiológicos e clínicos da doença são muito importantes, pois podem fornecer
informações fundamentais para a compreensão da patogênese e de novas
abordagens terapêuticas (Ferrante, 2009).
O ácido 3-nitropropiônico (3-NP) é uma neurotoxina largamente produzida por
várias espécies de fungos e naturalmente presente em plantas leguminosas. O 3-NP
atua interferindo com a produção de ATP ao inibir a succinato desidrogenase (SDH),
enzima do complexo II da cadeia respiratória mitocondrial, com consequente
liberação de cálcio mitocondrial, estresse oxidativo e morte neuronal (Beal, 1993;
63
Beal et al., 1995; Rosenstock et al., 2004 e 2009). A administração crônica sistêmica
de 3-NP produz lesão bilateral na região estriatal, em roedores e primatas, com
características semelhantes às da DH (Beal et al., 1993; Borlongan et al., 1995).
Estudos demonstraram que o aumento do estresse oxidativo é um dos
principais eventos deletérios observado após a administração de 3-NP. Além disso,
a inflamação decorrente do tratamento sistêmico com 3-NP também age como um
importante fator na neurodegeneração e formação dos radicais livres (Ahuja et al.,
2008; Mutairy et al., 2010). O estresse oxidativo contribui para disfunção neuronal
devido ao dano causado ao DNA, proteínas e lipídios (Stack et al., 2010).
Normalmente esse estresse é combatido por meio de antioxidantes endógenos e por
captura dos radicais livres. Por isso o tratamento com antioxidantes tem
demonstrado efeito protetor contra uma variedade de neurotoxinas (Ahuja et al.,
2008; Stack et al., 2010; Mutairy et al., 2010).
Cassia occidentalis, é um arbusto da família de Leguminosae, encontrado em
muitas áreas tropicais da América do Sul, inclusive na região amazônica. Na
medicina popular, suas raízes, folhas e cascas têm sido extensamente usadas como
laxante, diurético, hepatoprotetor, analgésico, antipirético, antiinflamatório e
antioxidante (Coimbra, 1994; Di Stasi; Hiruma-Lima, 2002; Yadav et al., 2010).
Muitas das propriedades observadas na espécie estão relacionadas à sua
composição química. Vários componentes já foram identificados, como
antraquinonas (Lal; Gupta, 1974), óleos gordurosos, flavonóides (Purwar et al.,
2003), polissacarídeos e taninos (Kudav; Kulkarni, 1974). O presente trabalho
avaliou o efeito de Cassia occidentalis contra o efeito neurotóxico induzido pela
administração sistêmica do 3-NP em modelo experimental da DH.
2. Materiais e Métodos
2.1 Avaliação da atividade antioxidante in vitro
A atividade antioxidante das espécies vegetais foi determinada através do
ensaio de captura de radicais DPPH˙ (2,2-difenil-1-picrilidrazil) de acordo com o
método de Brand-Williams e colaboradores (1995). Para avaliação da atividade antioxidante dos extratos, alíquotas de 1 mL de solução etanólica de DPPH˙ (30mM)
64
foram adicionadas a 2,5 mL de solução contendo diferentes concentrações do
extrato (2,5-250µg/mL). As soluções foram homogeneizadas e incubadas por 30 min
a temperatura ambiente, e a leitura da absorbância foi realizada em
espectofotômetro a 515nm. A queda na leitura da densidade ótica das amostras e do
controle positivo BHT foi correlacionada ao controle, estabelecendo-se a
porcentagem de descoloração do radical DPPH˙, conforme fórmula abaixo:
% proteção = (Abscontrole - Absamostra)* 100
Abscontrole
Foi calculado o valor da EC50 (concentração da amostra necessária para inibir
50% do radical).
2.2 Animais
Foram utilizados ratos machos Wistar adultos (Rattus novergicus, var.
albinus), pesando entre 250 a 300g. Os animais foram provenientes do biotério do
Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal de
Pernambuco (UFPE). Os mesmos foram mantidos em condições controladas de
temperatura (20 ± 3°C) e iluminação (ciclo 12h claro/12h escuro), e alimentados com
ração comercial (Labina ®) e água “ad libitum”. Todos os experimentos foram
realizados entre 09:00 e 15:00 horas. Os protocolos experimentais foram aprovados
pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal do Centro de Ciências Biológicas
da UFPE, sob licença nº 23076.017121/2008-12 de acordo com as normas
sugeridas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal e com normas
internacionais.
2.3 Ragentes
O ácido 3-nitropropiônico (3-NP) foi adquirido a partir da Sigma (St. Louis,
MO, USA), e dissolvido um dia antes do inicio do tratamento com salina (pH 7,4).
Nos dias subseqüentes, as soluções foram armazenads em refrigerador (4°C).
Caules e folhas de Cassia occidentalis (CO) foram coletados na cidade de Limoeiro,
65
Pernambuco – Brasil. O extrato hidroalcoolico utilizado foi fornecido pelo LAPERLI
(Laboratório Pernambucano Ltda). No laboratório, o extrato hidroalcoolico foi
evaporado em evaporador rotativo a pressão reduzida para eliminação total do
álcool, seguido de liofilização. O extrato liofilizado foi armazenado a temperatura
ambiente até o uso, e ressuspendido em água desltilada . Butilaldeido hidroxitolueno
(BHT), 2,2-difenil-1-picrilidrazil (DPPH), ácido tiobarbitúrico (TBA), epinefrina e 1,1,3,3-tetrametoxipropano (TMP), usados nas análises bioquímicas foram também
adquiridos da Sigma.
2.4 Grupos experimentais
Os animais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos experimentais
(n=8/grupo). Os ratos do grupo 1 serviram como controle, e foram prétratados
intraperitonealmente (i.p.) por 5 dias com veiculo (NaCl 0.9% i.p.) e água por via oral
(10 ml/kg, v.o.) durante 14 dias; Grupo 2 – recebeu 3-NP (30mg/kg, i.p.) por 5 dias e
água (v.o.) por 14 dias; Group—3 e 4 foram tratados com 3-NP do mesmo modo que
o grupo 2. Adicionalmente os animais receberam por via oral CO nas doses de 400 e
800mg/kg durante 14 dias, respectivamente, diariamente depois do tratamento com
3-NP por 5 dias. Vinte quarto horas, 7 e 14 dias após a última dose de 3-NP os ratos
foram avaliados nos testes comportamentais. Apos os testes comportamentais os
animais foram usados para os ensaios bioquímicos.
2.5 Avaliação do peso corporal
O peso corporal dos animais foi registrado no inicio do experimento e após a
avaliação comportamental. A porcentagem de mudança no peso foi calculada em
comparação ao peso corporal inicial no primeiro dia de experimento.
2.6 Procedimentos experimentais
Vinte quatro horas, 7 dias e 14 dias após os cinco dias de tratamento com 3-
NP ou veículo, por via intraperitoneal, todos os animais foram submetidos a testes
comportamentais.
66
2.6.1 Atividade locomotora
Para quantificar a atividade geral os ratos foram colocados individualmente no
centro de uma arena circular (uma caixa de madeira com 100 cm de diâmetro e 40
cm de altura, dividida em 19 regiões). A freqüência de locomoção (número de
unidades adentradas pelo animal com as quatro patas), freqüência de levantar
(número vezes que o animal se apóia somente nas patas traseiras, com o tronco
perpendicular ao chão da arena) e o tempo de imobilidade (tempo que o animal ficou
parado sem demonstrar qualquer movimento) foram avaliados durante 5 min. A
limpeza da arena após a saída de cada animal foi feita com álcool a 5%.
2.6.2 Teste do eixo giratório
Todos os animais foram avaliados quanto à habilidade motora e equilíbrio
utilizando o rotarod. Para execução deste protocolo o animal foi colocado com as
quatro patas sobre uma barra de 7,0 cm de diâmetro, elevado a 25 cm do piso, em
uma rotação de 25 rpm. Cada animal foi submetido a duas sessões de 180
segundos de treinamento antes do início do tratamento para aclimatização. Os
animais foram colocados nas barras giratórias e o tempo de permanência foi
registrado. Utilizou-se como tempo de corte 180 segundos (Kulkarni, 1999).
2.6.3 Teste do labirinto em cruz elevado para memória espacial
O experimento foi realizado de acordo com o método de Kumar et al. (2006).
O labirinto em cruz elevado, consiste em dois braços abertos opostos (50x10cm),
dois braços fechados de mesma dimensão com paredes de 40cm e uma área
central (10x10cm) conectando os braços. A aquisição de memória foi avaliada 24
horas, 7 e 14 dias após o inicio do tratamento com 3-NP. Os ratos foram colocados
individualmente no final do braço aberto com a face voltada para área central. O
tempo levado pelo animal para se mover do braço aberto e entrar em um dos braços
fechados foi registrado como transferência de latência inicial. Aos ratos foi permitido
explorar o labirinto por 30 segundos após o registro inicial da aquisição de latência e,
67
em seguida, eles foram recolocados em suas gaiolas. A retenção de latência foi
avaliada novamente no dia seguinte, ou seja, após 48 horas, 8 e 15 dias do
tratamento com os extratos.
A porcentagem de retenção de memória foi calculada a partir da fórmula:
Transferência de latência dia 1- Transferência de latência da repetição x100
Transferência de latência dia 1
2.7 Avaliações bioquímicas
2.7.1 Dissecação e homogeneização
Após as avaliações comportamentais os animais foram imediatamente
decapitados, os cérebros removidos, colocados sob gelo e o estriado dissecado.
Esta região foi pesada e homogeneizada, em homogeneizador tipo Potter Elvehjem,
com tampão PBS 1X (10% p.v.), ao qual foi adicionado BHT (0,004% p.v.) para
prevenir a autooxidação das amostras. O homogeneizado foi centrifugado a 10.000 x
g, por 15 minutos, à 4°C, e uma alíquota do sobrenadante foi separado paraanálises
bioquímicas.
2.7.2 Medida da lipoperoxidação
A medida quantitativa da peroxidação na região estriatal foi avaliada de
acordo com o método de Buege e Aust (1978). A quantidade de malonaldeído
(MDA) presente nas amostras foi medida através da reação com ácido tiobarbitúrico.
Alíquotas de 500 µL do sobrenadante foram colocadas em tubos de ensaio aos
quais se adicionou 1 mL do reagente ácido tiobarbitúrico (TBA): TBA 0,38% (p.v),
250 µL de HCl 1N, TCA 15% (p.v) e 20 µL de BHT etanóico (2% p.v). A solução foi
agitada e aquecida à temperatura de 100º C durante 15 minutos, seguindo-se o
resfriamento em banho de gelo. Adicionou-se 1,5 mL de álcool n-butanol, agitou-se e
centrifugou-se a 3000 x g. Após a centrifugação, coletou-se a fase superior que foi
analisada espectofotometricamente a 532 nm. Para realização dos cálculos, foi
68
realizada uma curva padrão com 1,1,3,3-tetrametoxipropano. Os resultados foram
expressos em nmoles MDA/mg de proteína.
2.7.3 Atividade da Superoxido dismutase
A atividade da Superoxide dismutase (SOD) foi avaliada na região estriatal de
acordo com o método de Misra e Fridovich (1972). Este método é baseado na
capacidade da SOD em inibir a auotoxidação da adrenalina. Em pH básico (10,2) a
adrenalina se autooxida através de um mecanismo gerador de radical superóxido
que por sua vez ativa a reação de autooxidação. Para avaliação da atividade
enzimática 100 µL do homogeneizado foi adicionado a 880 µl (0.05 M, pH 10.2,
0.1 mM EDTA) de tampão carbonato. Vinte microlitros de adrenalina (30 mM em
ácido acético 0.05%) foram adicionados à mistura e a leitura foi realizada a 480 nm
em espectrofotômetro (CARY 3E - UV - Visible Spectrophotometer Varian). A
atividade enzimática foi expressa como a quantidade de enzima que inibe a
oxidação da adrenalina em 50%.
2.8 Dosagem de proteínas
A determinação do conteúdo de proteínas presente nos homogenatos foi
realizada conforme o método de Bradford (1976).
2.9 Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (E.P.M.).
Para comparação dos grupos experimentais, empregaram-se a análise de variância
(ANOVA) seguida pelo teste de Tukey, usando software Prisma 5,0 (GraphPad).
Adotou-se o nível de significância de 5% de probabilidade (p<0,05).
3. Resultados
3.6 Redução do radical 2,2-difenil-1-picrilidrazil
69
Os resultados obtidos demonstram que as todas as concentrações testadas
foram capazes de promover a captura do radical DPPH. O extrato de CO foi capaz
de reduzir o radical livre DPPH a sua forma com coloração amarelada 1,1-difenil-2-
picrilidrazil com uma EC50 53,66 µg/mL. O antioxidante sintético BHT em condições
similares demonstrou EC50 de 73,8 µg/mL.
3.7 Efeito de Cassia occidentalis sobre o peso corporal de ratos tratados com 3-
NP
Nenhuma mudança foi observada entre o peso corporal inicial e o final dos
animais tratados com veiculo. Porém, os animais tratados com 3-NP apresentaram
significativa perda de peso quando comparado com o controle. O tratamento com
CO (400 e 800 mg/kg, v.o.) significativamente protegeu a perda de peso dos ratos
doentes, tratados somente com 3-NP, após sua administração diária, por 7 e 14 dias
(Fig. 1).
3.8 Efeito de Cassia occidentalis sobre atividade locomotora de ratos tratados
com 3-NP
A administração de 3-NP por 5 dias significativamente reduziu a atividade
locomotora dos animais. O tratamento com CO (400 e 800 mg/kg, v.o.) por 7 e 14
dias melhorou significativamente a atividade locomotora após o tratamento com 3-
NP (Fig. 2). O tratamento diário com CO aumentou a deambulação e a frequencia de
levantar, bem como diminuiu o tempo de imobilidade.
3.9 Efeito de Cassia occidentalis sobre atividade no rotarod de ratos tratados com
3-NP
O tratamento com 3-NP significativamente diminuiu o tempo de queda quando
comparado aos animais controle (Fig. 3). A administração diária de CO (400 e 800
mg/kg, v.o.) por 7 e 14 dias aumentou o tempo de queda quando comparado ao
grupo doente, tratado somente com o 3-NP.
70
3.10 Efeito de Cassia occidentalis no teste do labirinto em cruz elevado para
memória espacial
A administração intraperitoneal de 3-NP por 5 dias causou marcante perda de
memória como demonstrado pela diminuição da percentagem de retenção de
memória quando comparado aos animais controle (Fig. 4). O tratamento diário com
CO (400 e 800 mg/kg, v.o.) por 7 e 14 após a administração de 3-NP promoveu um
aumento na % de retenção de memória, quando comparado aos animais doentes,
tratados somente com 3-NP.
3.11 Parâmetros bioquímicos
A administração de 3-NP promoveu significativas mudanças nos parâmetros
bioquímicos quando comparados aos animais controles. A injeção intraperitoneal de
3-NP por 5 dias induziu aumento do estresse oxidativo, como indicado pelo aumento
dos níveis de MDA no estriado, e diminuição da atividade da SOD quando
comparado ao grupo controle. O tratamento com CO (400 e 800 mg/kg, v.o.) por 7 e
14 dias depois da injeção com 3-NP, atenuou o aumento da peroxidação lipídica no
estriado como observado pela significativa diminuição dos níveis de MDA (Tabela 1).
Similarmente, o tratamento diário com CO por 7 e 14 dias atenuou a diminuição dos
níveis de SOD decorrente do tratamento com 3-NP (Tabela 2).
4. Discussão
No presente estudo, o tratamento com 3-NP por 5 dias (i.p.) produziu
alterações motoras e comportamentais, incluindo bradicinesia, fraqueza e rigidez
muscular, além de marcante redução no peso corporal. Estes achados estão em
concordância com estudos anteriores que também observaram uma variedade de
anormalidades neurocomportamentais e motoras em ratos após administração de 3-
NP (Borlongan et al., 1995 e 1997). A redução de peso observada após a injeção de
3-NP pode ter sido decorrente do comprometimento metabólico causado pelo 3-NP,
ou seja, prejuízo no metabolismo energético, mobilização de reservas energéticas e
peroxidação lipídica que constituem efeitos periféricos da administração. No entanto,
71
não se pode descartar, que a lesão estriatal e a bradicinesia possam atuar como
fatores centrais para a perda de peso (Beal et al, 1993; Fontaine et al., 2000;
Kumar; Kumar, 2009a). O tratmento com CO (400 e 800mg/kg, v.o. por 7 e 14 dias)
melhorou significativamente a perda de peso quando comparado ao grupo tratado
somente com 3-NP (30mg/kg; i.p. por 5 dias).
A administração diária de CO por 7 e 14 dias atenuou significativamente a
hipolocomoção (perfomance no campo aberto), a incoordenação motora
(perfomance no rotarod) e o prejuizo cognitivo (perfomance no labirinto em cruz
elevado) ocasionado pela injeção intraperitoneal de 3-NP. Segundo Seaman (2000),
o prejuizo locomotor e cognitivo produzido pelo 3-NP pode estar relacionado a
redução dos níveis de energéticos e consequente mudanças no processamento
neural. As alterações motoras observadas após a administração do 3-NP são
atribuidas principalmente à degeneração de neurônios do estriado, uma região
funcionalmente ligada por aferências do córtex motor (Brown, 1992; Sgambato et al.,
1997). A neurodegeneração estriatal após a injeção de 3-NP pode estar associada à
geração de radicais livres, decorrente do comprometimento da função mitocondrial,
e à vulnerabilidade seletiva de neurônios motores dopaminérgicos (Borlongan et al,
1995;. Duan et al., 2000;. Kumar; Kumar, 2009b).
No presente estudo, após a administração do 3-NP, houve aumento no nível
estriatal de MDA (indicador de peroxidação lipídica devida aos radicais livres) e
diminuição da enzima antioxidante superóxido dismutase, sugerindo um aumento do
estresse oxidativo central. Estes efeitos foram atenuados pelo tratamento, por 7 e 14
dias com CO, indicando uma ação antioxidante do extrato. Além disso, a atividade
antioxidante de CO também foi demonstrada in vitro, pelo ensaio do radical DPPH,
que basicamente avalia a capacidade de captura de prótons.
Está bem estabelecido que a captura de radicais livres por antioxidantes é
devido à sua capacidade de doar hidrogênio (Shinomol e Muralidhara, 2008).
Villarán et al. (2008) relata que o tratamento com 3-NP significativamente reduz os
níveis de enzimas antioxidantes (SOD, catalase) e aumenta a de oxidantes
(peroxidação lipídica, nível de nitrito), sugerindo o papel do estresse oxidativo no
processo neurodegenerativo. Estudos anteriores demonstram claramente que o
aumento estresse oxidativo pode ser um dos principais eventos deletérios na DH
(Borlongan et al., 1997;. Beal et al., 1998).
72
Recentes hipóteses relatam que a etiologia da DH pode estar relacionada
com o compromentimento da produção de energia mitocondrial e/ou a presença de
especies reativas de oxigênio, que pode levar a excitoxicidade neuronal (Pandey et
al., 2008). Um significativo número de trabalhos tem sugerido que a geração de
radicais livres pode estar subjacentes aos efeitos neurotóxicos dos inibidores da
succinato de desidrogenase como o 3-NP e ácido metilmalônico (Beal et al, 1993;.
Fighera et al, 1999, 2003, 2004). A administração sistêmica da toxina mitocondrial 3-
NP leva a depleção celular de ATP e induz lesões estriatal-específicas que se
assemelham à doença de Huntington (Borlongan et al, 1996;. Beal, 1998).
Normalmente o extresse oxidativo é combatido por meio de atioxidantes endogenos
e por seuqestradores de radicais livres (Stack et al., 2010). Por isso a administração
de vários agentes antioxidantes têm demonstrado melhorar o estresse oxidativo e
lesões produzidas por 3-NP (Rosenstock, 2004;. Kim et al, 2005; Kumar; Kumar,
2009b; Mutairy et al., 2010).
Os flavonóides, um grande grupo de compostos polifenólicos encontrados em
frutas e vegetais são capazes de neutralizar a lesão neuronal, atrasando assim a
progressão de doenças neurodegenerativas. Esses benefícios são geralmente
atribuídos às suas propriedades antioxidantes (Dajas et al, 2003;. Spencer et al.,
2009), o que os torna potenciais alvos para tratamento de diversas potologias nas
quais os radicais livres estejam envolvidos.
A Cassia occidentalis é uma espécie bastante utilizada na medicina popular
por suas propriedades antibateriana, antifúngica, laxativa, diurética, analgésica,
antiiflamatória e antioxidante (Coimbra, 1994; Di Stasi; Hiruma-Lima, 2002; Aragão,
2008; Yadav et al., 2010). Com relação a sua composição química, a espécie já foi
relativamente bem estudada, tendo sido encontrados senosideos (Christ et al.,
1978), antraquinonas (Lal; Gupta, 1974), flavonoídes (Purwar et al., 2003),
polisacarideos e taninos (Kudav; Kulkarni, 1974), aos quais são atribuídos muitas
das propriedades da espécie.
Os resultados obtidos no presente estudo demonstram o potencial uso de
Cassia occidentalis como neuroprotetora, provavelmente correlacionado a sua
elevada atividade antioxidante (Gow-Chin, Y. et al., 1998; Usha et al., 2007; Yadav
et al., 2010).
73
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78
Fig.1. Effect of Schinus terebinthifolius (300 and 600 mg/kg, p.o.) on body weight in
3-nitropropionic acid (30 mg/kg, i.p.) treated rats. Each value represents the
mean±S.E.M. *p<0.05 as compared to vehicle treated control group; #p<0.05 as
compared to 3-nitropropionic acid treated group (One-way ANOVA followed by
Tukey's test).
1st day 7th day 14th day
-30
-20
-10
0
10
20Control3-NP3-NP+ST 300mg/kg3-NP+ST 600mg/kg
** *
*
*##
#
#%
cha
nge
in b
ody
wei
ght
79
Fig. 2. Effect of Schinus terebithifolius (300 and 600 mg/kg, p.o.) on locomotor
activity in 3-nitropropionic acid (30 mg/kg, i.p.) treated rats as assessed by open
field. Frequencies of locomotion (A), rearing (B) and time of resting (C). Each
value represents the mean±S.E.M. *p<0.05 as compared to vehicle treated control
group; #p<0.05 as compared to 3-nitropropionic acid treated group (One-way
ANOVA followed by Tukey's test).
1st day 7th day 14th day
0
20
40
60Control3-NP3-NP+ST 300mg/kg3-NP+ST 600mg/kg
** *
*
# #
*
##
(A)
Tota
l am
bula
tory
act
ivity
1st day 7th day 14th day
0
10
20
30
** *
* *
# #
# #
(B)
Tota
l rea
ring
act
ivity
1st day 7th day 14 th day
0
100
200
300* * *
*# #
*##
(C)
Dur
atio
n of
imm
obili
ty (s
)
80
Fig. 3. Effect of Schinus terebinthifolius (300 and 600 mg/kg, p.o.) on fall off time
in 3-nitropropionic acid (30 mg/kg, i.p.) treated rats on Rotarod performance. Each
value represents the mean±S.E.M. *p<0.05 as compared to vehicle treated control
group; #p<0.05 as compared to 3-nitropropionic acid treated group (One-way
ANOVA followed by Tukey's test).
1st day 7th day 14th day
0
50
100
150
200Control3-NP3-NP+ST 300mg/kg3-NP+ST 600mg/kg
* * **
# ## #
*
Fall
of ti
me
(s)
81
Fig. 4. Effect of Schinus terebithifolius (300 and 600 mg/kg-, p.o.) on memory
performance (% retention) in elevated plus maze task in 3-nitropropionic acid (30
mg/kg, i.p.) treated rats. Each value represents the mean±S.E.M. *p<0.05 as
compared to vehicle treated control group; #p<0.05 as compared to 3-
nitropropionic acid treated group (One-way ANOVA followed by Tukey's test).
2nd day 8th day 14th day
0
20
40
60
80
100Control3-NP3-NP+ST 300mg/kg3-NP+ST 600mg/kg
* * *
**
##%
Mem
ory
rete
ntio
n
82
Table 1 Effect of Schinus terebithifolius treatment-against 3-NP induced biochemical changes in the striatum of rat brain.
Malondialdehyde levels(nmol/mg protein)
Treatments 24 hours 7th day 14th day
Control 0,071 ± 0,005 0,096 ± 0,008 0,070 ± 0,004
3-NP 0,119 ± 0,010* 0,171 ± 0,022* 0,142 ± 0,013*
3-NP+300mg/kg 0,102 ± 0,005* 0,119 ± 0,013 0,084 ± 0,004#
3-NP+600mg/kg 0,105 ± 0,004* 0,107 ± 0,012# 0,087 ± 0,010#
Each value represents the mean±S.E.M. *p<0.05 as compared to vehicle treated control group; #p<0.05 as
compared to 3-nitropropionic acid treated group (One-way ANOVA followed by Tukey's test).
83
Table 2 Effect of Schinus terebithifolius treatment-against 3-NP induced biochemical changes in the striatum of rat brain.
Superoxide dismutase (units/mg protein)
Treatments 24 hours 7th day 14th day
Control 0,077 ± 0,007 0,087 ± 0,004 0,080 ± 0,007
3-NP 0,050 ± 0,001* 0,051 ± 0,001* 0,049 ± 0,002*
3-NP+300mg/kg 0,056 ± 0,003* 0,065 ± 0,001# 0,071 ± 0,001#
3-NP+600mg/kg 0,057 ± 0,001* 0,068 ± 0,002# 0,073 ± 0,001#
Each value represents the mean±S.E.M. *p<0.05 as compared to vehicle treated control group; #p<0.05 as
compared to 3-nitropropionic acid treated group (One-way ANOVA followed by Tukey's test).
84
Fig. 1. Efeitos de Cassia occidentalis (CO 400 e 800 mg/kg, v.o.) sobre peso
corporal de ratos após o tratamento com ácido 3-nitropropiônico (3-NP 30 mg/kg,
i.p.). Os resultados expressam a média±E.P.M. *Estatisticamente significante em
relação ao grupo controle: p<0,05. #Estatisticamente significante em relação ao
grupo 3-NP: p<0,05. (ANOVA, seguida pelo teste de Tukey).
24 horas 7 dias 14 dias
-20
-10
0
10
20Água3-NP3-NP+CO 400mg/kg3-NP+CO 800mg/kg
* * *
*
# *###
% V
aria
ção
de p
eso
85
Fig. 2. Efeitos de Cassia occidentalis (CO 400 e 800 mg/kg, v.o.) sobre a atividade
locomotora de ratos no teste de campo aberto após o tratamento com ácido 3-
nitropropiônico (3-NP 30 mg/kg, i.p.). (A) frequencia de locomoção, levanter (B) e
tempo de imobilidade (C). Os resultados expressam a média±E.P.M.
*Estatisticamente significante em relação ao grupo controle: p<0,05. #Estatisticamente significante em relação ao grupo 3-NP: p<0,05. (ANOVA, seguida
pelo teste de Tukey).
24 horas 7 dias 14 dias
0
20
40
60
80Á gua3-NP3-NP+ C O 400mg/kg3-NP+ C O 800mg/kg
*
#
* *
* *
# # #
(A)
Ativ
idad
e am
bula
tória
tota
l
24 horas 7 dias 14 dias
0
10
20
30
40
* * *
**
## # #
(B )
Freq
üênc
ia d
e Le
vant
ar
24 horas 7 dias 14 dias
0
100
200
300* * *
* *# # # #
(C )
Tem
po d
e Im
obili
dade
(s)
86
Fig. 3. Efeitos de Cassia occidentalis (CO 400 e 800 mg/kg, v.o.) sobre o tempo de
queda no teste de rota Rod após o tratamento com ácido 3-nitropropiônico(3-NP 30
mg/kg, i.p.). Os resultados expressam a média±E.P.M. *Estatisticamente significante
em relação ao grupo controle: p<0,05. #Estatisticamente significante em relação ao
grupo 3-NP: p<0,05. (ANOVA, seguida pelo teste de Tukey).
24 horas 7 dias 14 dias
0
50
100
150
200Água3-NP3-NP+CO 400mg/kg3-NP+CO 800mg/kg
* * * *
*
# ## #
Tem
po d
e qu
eda
(s)
87
Fig. 4. Efeitos de Cassia occidentalis (CO 400 e 800 mg/kg, v.o.) sobre a
porcentagem de retenção de memória no teste do labirinto em cruz elevado após o
tratamento com ácido 3-nitropropiônico (3-NP 30 mg/kg, i.p.). Os resultados
expressam a média±E.P.M. *Estatisticamente significante em relação ao grupo
controle: p<0,05. #Estatisticamente significante em relação ao grupo 3-NP: p<0,05.
(ANOVA, seguida pelo teste de Tukey).
24 horas 7 dias 14 dias
0
20
40
60
80
100Água3-NP3-NP+CO 400mg/kg3-NP+CO 800mg/kg
* * *
**
### #
% R
eten
ção
de m
emór
ia
88
Tabela 1
Efeitos de Cassia occidentalis sobre a peroxidação lipídica na região estriatal após o tratamento com ácido 3-
nitropropiônico.
Malonaldeído nmol/mg de proteína
Tratamentos 24 horas 7 dias 14 dias
Controle 0,076 ±0,002 0,096 ±0,003 0,080 ±0,004
3-NP 0,155 ±0,016* 0,178 ±0,003* 0,155 ±0,002*
3-NP+400mg/kg 0,167 ±0,006* 0,076 ±0,003# 0,088 ±0,001#
3-NP+800mg/kg 0,156 ±0,021* 0,068 ±0,009# 0,083 ±0,007#
Os resultados expressam a média±E.P.M. * Estatisticamente significante em relação ao grupo controle:
p<0,05.#Estatisticamente significante em relação ao grupo 3-NP: p<0,05. (ANOVA, seguida pelo teste de
Tukey).
89
Tabela 2 Efeitos de Cassia occidentalis sobre a atividade da sueroxido dismutase na região estriatal após o tratamento
com ácido 3-nitropropiônico.
Superoxido dismutase (U/mg de proteína)
Tratamentos 24 horas 7 dias 14 dias
Controle 0,077 ±0,007 0,087 ±0,004 0,080 ±0,007
3-NP 0,050 ±0,001* 0,051 ±0,001* 0,049 ±0,002*
3-NP+400mg/kg 0,053 ±0,002* 0,070 ±0,001# 0,067 ±0,002#
3-NP+800mg/kg 0,056 ±0,003* 0,079 ±0,002# 0,070 ±0,002#
Os resultados expressam a média±E.P.M. * Estatisticamente significante em relação ao grupo controle:
p<0,05.#Estatisticamente significante em relação ao grupo 3-NP: p<0,05. (ANOVA, seguida pelo teste de
Tukey).
90
6. Conclusão
91
6. CONCLUSÃO
Com base nos resultados obtidos, conclui-se que:
- O extrato de Schinus terebinthifolius e Cassia occidentalis na avaliação da
atividade antioxidante in vitro apresentou expressiva atividade no teste de captura do
radical DPPH˙, demonstrando a capacidade dessas espécies em combater os
radicais livres, provavelmente relacionada à elevada quantidade de compostos
fenólicos encontrados em ambas as espécies como descrito por vários autores.
- Os animais tratados durante 5 dias com ácido 3-nitropropiônico (30 mg/kg, i.p.)
apresentaram significativa perda de peso, prejuízo motor e cognitvo, além de
aumento da peroxidação lipídica e diminuição da atividade da superóxido dismutase.
- O tratamento diário com ST (300 e 600 mg/kg, v.o.) por 7 e 14 dias após a
administração sistêmica de 3-NP atenuou as alterações comportamentais induzidas
por essa neurotoxina. Adicionalmente, também foi observado que o extrato melhorou
a peroxidação lipídica e a atividade da superóxido dismutase.
- Assim como o extrato de ST, a CO (400 e 800 mg/kg, v.o.) diminui as alterações
metabólicas, neurocomportamentais e bioquímicas induzidas pelo tratamento com 3-
NP.
- A partir destes estudos, ST e CO surgem como potencias agentes neuroprotetores
com perspectiva de uso no tratamento de doenças neurodegenerativas, como a
Doença de Huntington.
92
7. Referências
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