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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Co nta cto :Co nta cto : digital@bl.fcen.uba.ar
Tesis Doctoral
Mecanismo de activación de laMecanismo de activación de laproteína quinasa A dependiente deproteína quinasa A dependiente de
cAMP: proteínas sustrato y decAMP: proteínas sustrato y deanclaje de PKA de Saccharomycesanclaje de PKA de Saccharomyces
cerevisiaecerevisiae
Galello, Fiorella Ariadna
2011
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.
Cita tipo APA:
Galello, Fiorella Ariadna. (2011). Mecanismo de activación de la proteína quinasa A dependientede cAMP: proteínas sustrato y de anclaje de PKA de Saccharomyces cerevisiae. Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
Cita tipo Chicago:
Galello, Fiorella Ariadna. "Mecanismo de activación de la proteína quinasa A dependiente decAMP: proteínas sustrato y de anclaje de PKA de Saccharomyces cerevisiae". Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 2011.
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de Química Biológica
Mecanismo de activación de la proteína quinasa A dependiente
de cAMP: proteínas sustrato y de anclaje de la PKA de
��������������� ��
�
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la
Universidad de Buenos Aires en el área Química Biológica
Fiorella Ariadna Galello
Directora: Silvia Graciela Rossi
Consejera de estudios: Silvia Margarita Moreno de Colonna
Lugar de trabajo: Laboratorio de Biología Molecular y Transducción de Señales,
Departamento de Química Biológica, Facultad Ciencias Exactas y Naturales,
Universidad de Buenos Aires.
Buenos Aires, 2011
Resumen 2 �
Mecanismo de activación de la proteína quinasa A dependiente de cAMP:
proteínas sustrato y proteínas de anclaje de la PKA
de�������������� ��
RESUMEN
La especificidad en la vía de transducción de señales de cAMP4PKA está
determinada por el reconocimiento de la secuencia blanco en el sustrato y por
la localización de la quinasa en compartimentos subcelulares. En
��������������� � los determinantes de la especificidad de la proteína
quinasa A (PKA) están menos caracterizados que en mamíferos. Analizamos el
comportamiento de los sustratos y los determinantes de secuencia alrededor
del sitio de fosforilación de tres proteínas sustrato: Piruvato quinasa 1 (Pyk1),
Piruvato quinasa 2 (Pyk2) y Trehalasa neutra (Nth1). La proteína Nth1 es mejor
sustrato que la proteína Pyk1 y ambas son fosforiladas tanto por Tpk1 como
por Tpk2, dos de las isoformas de la subunidad catalítica de la PKA de
levaduras. Las tres proteínas contienen uno o más motivos consenso de PKA,
Arg4Arg4X4Ser, pero no todos ellos son fosforilados. Análisis de esos sitios
permitieron determinar que los residuos ácidos en la posición P+1 o en el
extremo N4terminal son deletéreos para la reacción catalítica, mientras que los
residuos positivos presentes más allá de las posiciones P42 y P43 la favorecen.
Un residuo hidrofóbico voluminoso en posición P+1 no resulta crítico, a
diferencia de lo que ocurre con los sustratos de la PKA de mamíferos. El mejor
sustrato tiene en la posición P+4 un residuo ácido, equivalente al que se
encuentra en la secuencia inhibitoria de Bcy1, la subunidad regulatoria de la
PKA de levaduras.
Se analizó también el efecto del sustrato sobre la activación de la holoenzima y
demostramos que tanto los sustratos peptídicos como las proteínas enteras
sensibilizan en diferentes grados, dependiendo de sus secuencias, a la
holoenzima para la activación por cAMP. Los resultados también sugieren que
las proteínas enteras son mejores co4activadores que los péptidos.
Resumen 3 �
Se determinaron los ����� � ����������������de las isoformas Tpk1 y Tpk2, y
ambas enzimas mostraron el mismo valor, 3 seg41, diez veces menor que el
valor determinado para las subunidades C de mamíferos.
La compartimentalización de la señal del cAMP, otro punto de regulación de la
especificidad, es mantenida por el agrupamiento de las enzimas de la vía de
señalización en unidades discretas a través de las proteínas de anclaje de la
proteína quinasa A (AKAPs), las cuales interactúan con la subunidad
regulatoria de la holoenzima. Hasta el momento no habían sido identificadas
proteínas de anclaje en levaduras. Definimos, utilizando abordajes �� � ��� �
bioquímicos de copurificación e identificación por espectrometría de masa,
proteínas que hacen interacción con Bcy1, entre ellas: ����� ��� ��� ���
���� � 2 (Ira2), ��� �� (Myo2), ���� ����� ���� � 60 (Hsp60) and ���� ��
���� ���������� 1 (Ptp1). Utilizando ����� de péptidos se identificaron
los residuos críticos para la interacción en las proteínas de anclaje. Los
dominios definidos como claves de la interacción presentan una estructura
posible de α4hélice con residuos cargados positivamente que son importantes
para la interacción. Usando mutantes de deleción se definió que las proteínas
estudiadas hacen interacción con la región N4terminal de Bcy1. Se verificó la
interacción ��� ��� por ensayos de �����������e ��� �� por inmunoprecipitación.
También se demostró que Bcy1 e Ira2 localizan en la misma fracción subcelular
y que péptidos derivados de Ira2 son fosforilados por las Tpks �� � ���. Se
analizó la relevancia fisiológica de la interacción entre Bcy1 y Hsp60 y se
observó que la actividad quinasa de PKA disminuye en ausencia de la
chaperona, indicando que la Hsp60 tendría una función estabilizadora sobre las
Tpks y además que frente a un estrés térmico Bcy1, Tpk1 y Hsp60 aumentan
su localización en la fracción mitocondrial, lo que permitiría modular el
transporte de proteínas mitocondriales por fosforilación.
Palabras clave: PKA, cAMP, ������������ ��� �, Bcy1, sustratos,
AKAPs
Abstract 4 �
Activation mechanism of cAMP%depedent protein kinase A: substrates
and anchoring proteins of PKA from Saccharomyces cerevisiae
ABSTRACT
The specificity in the cAMP4PKA signaling pathway is determined by the
molecular recognition of the substrate target sequence and by the kinase
subcelullar localization. In ������������ ��� � the protein kinase A
(PKA) specificity determinants are less studied than in mammalian PKA. We
analyzed the substrate behavior and sequence determinants around the
phosphorylation site of three protein substrates, Pyruvate kinase 1 (Pyk1),
Pyruvate kinase 2 (Pyk2) and Neutral Trehalase (Nth1). Nth1 protein is a better
substrate than Pyk1 protein and both are phosphorylated by either Tpk1 or
Tpk2, two o three isoforms from the catalytic subunits of yeast PKA. Both
enzymes have also the same selectivity toward the protein substrates and the
peptides derived from them. The three proteins contain one or more Arg4Arg4X4
Ser consensus PKA motif but not all of them are phosphorylated. The
determinants for specificity were studied using peptide arrays. Acidic residues in
position P+1 or in the N4terminal flank are deleterious and positive residues
present beyond P42 and P43 favors the catalytic reaction. A bulky hydrophobic
residue in position P+1 is not critical, unlike what happens in mammalian. The
best substrate has in position P+4 an acidic residue, equivalent to the one in the
inhibitory sequence of Bcy1, the yeast regulatory subunit of PKA. The substrate
effect in the holoenzyme activation was analyzed and we demonstrated that
peptides and protein substrates sensitized the holoenzyme to activation by
cAMP in different degrees, depending on their sequences. The results also
suggest that protein substrates are better co4activators than peptide
substrates.The catalytic turnover numbers of the catalytic subunits isoforms,
Tpk1 and Tpk2, were determined and both enzymes are shown to have the
same value of 3 sec41.
Common challenges to any cell are the processing of the extracellular stimuli it
receives into intracellular signaling cascades that initiate a multitude of diverse
Abstract 5 �
biological functions. Subcellular targeting through the association with adaptor
and scaffolding proteins has emerged as a key mechanism by which cells
maintain signaling specificity. Compartmentalization of cAMP signaling is
maintained by the clustering of cAMP signaling enzymes in discrete units by the
scaffolding protein A4kinase anchoring proteins (AKAPs) through their
interaction with regulatory subunit � No anchoring proteins had been
characterized up to now in yeast. Using �� � �� and biochemical approaches,
like co4inmunoprecipitation and mass spectrometry, we defined proteins that
interact with Bcy1, including: the GTPase activating protein 2 (Ira2), Myosin 2
(Myo2), Heat shock protein 60 (Hsp60) and Protein Tyrosine Phosphatase 1
(Ptp1). Using peptide arrays we identified the critical residues in the protein
domain from the interacting proteins. The key domains for the interaction
present a possible α4helix structure with hydrofobic residues exposed over a
hydrofobic face and positive charged residues that resulted important for the
interaction. Using deletion mutants we defined that Bcy1 binds the interacting
proteins through its N4terminal domain. Using pull4down and
inmunoprecipitation assays we corroborated that these proteins interact ��� ��
We also demonstrated that Bcy1 and Ira2 localize in the same subcellular
fraction and that Tpks can phosphorylate peptides derived from Ira2 sequence
��� ���. We shown PKA kinase activity decreases in absence of Hsp60. Also we
were able to demonstrate that Bcy1, Tpk1 and Hsp60 increase their
mitochondrial localization during heat shock.
Key words: PKA, cAMP, ��������������� �, Bcy1, substrates, AKAPs.
�
�
�
�
Agradecimientos 6
A mi directora, Sil Rossi, por enseñarme con paciencia infinita todo lo que aprendí en
estos años. Por transmitirme tu energía y tu empuje. Por incentivarme a ir un poco
más allá siempre. Por estar tan presente en todo, hasta en el último detalle de cada
experimento. Por tu cariño, tu preocupación y tus retos de madre. Y porque siempre,
siempre, siempre, el tiempo te da la razón.
A Sil Moreno, por trasmitir con pasión todo lo que sabés. Porque es un placer oírte
hablar del último trabajo de PKA hasta de cómo preparaste la cena del día anterior.
Por tu sencillez, tu naturalidad y por estar atenta y presente en todo y para todos.
A Pauli, por tus aportes siempre pertinentes a mi trabajo, por la pasión, la energía y la
garra que le ponés a todo día a día. Por lo códigos y gustos culinarios compartidos, por
hacerme reír tanto, por estar dispuesta a darme una mano siempre, y por tu cariño y
consejos de hermana mayor.
A Jose, compañera de mesada, escritorio y quinasas. Por darme ánimo para seguir
adelante, ponerme la oreja tantas veces, y permitirme escucharte otras tantas. Por el
contrabando de recetas y tips de ama de casa. Por tu naturalidad y dulzura. Por
ayudarme y estar siempre.
A Rich, por hacerme reír hasta las lágrimas. Por querer responder todas mis dudas,
dándome más información de la que puedo procesar. Por tus aguditos, tus videos, tus
fotos, tus anécdotas, tus enojos. Por ser único e irrepetible….por suerte!
A Vane, por tu energía y cariño concentrados en un envase tan chiquitito. Por hacer
más llevaderos esos días de verano encerradas en el cuarto del cultivo, cuando
preparábamos y procesábamos con nuestras propias manos las muestras para MALDI.
Por estar siempre tan atenta a lo que me pasa y por hacer causa común tantas veces.
A Cons, Coti, Cotita loca, Cotita linda, por haberme ayudado cuando la panza no
dejaba verme los pies. Por acurrucarte en un costado de la mesada para que yo trabaje
cómoda, por salvarme tantas veces cuando se me hacían las 5 y tenía que volar hasta
el Jardín. Por ser tan dulce y generosa, y por mimarme tanto.
A Nico (Holaaaaaammmmmmmmmm!), por el intercambio de información sobre las
AKAPs. Por responder mis dudas, y por confiar en mí para contestar las suyas. Por esas
graciosas charlas sobre los achaques de gente mayor, política, personas y personajes.
Por estar siempre tan presente.
A Leti, por esa linda sonrisa que transmite tanta energía. Por darme ánimos cuando
tengo un mal día, por esos ricos budines que nos hacen tan felices, por ser tan
compañera en lo laboral y en lo personal.
A Lucas, por estar dispuesto a ayudarme siempre, por salvarme cuando mi
computadora me jugó alguna mala pasada, por levantar tantos bidones de agua
destilada y tanques de nitrógeno. Por esos mates reconfortantes de la tarde, pero más
que nada por permitirme conocer cuán amplios son los límites de paciencia.
A Barby, por haberme ayudado en mis últimos experimentos. Por tu predisposición
para aprender, tus ganas y tu entusiasmo.
Agradecimientos 7
A Marce y Vicky, por aquellos primeros tiempos compartidos que recuerdo con mucho
cariño. A Jime, por ayudarme en mis primeras quinasas, por compartir con alegría mis
logros laborales y personales. A Pía, por estar siempre con la mejor predisposición para
todo y por ayudarme en mis primeros días en el labo, allá a lo lejos y hace tiempo.
A Gladys, Miriam y Juan, por colaborar desde su lugar con el funcionamiento del
laboratorio y por ser tan amables conmigo siempre. A Martín y Ayelén, por responder
mis dudas miles de veces.
A Eli, Sabri, Lu, Pau, Jose y Joaquín, por aqellos días de mates, libros y risas que me
empujaron hasta acá. Por la amistad que peurdura a pesar de los años y las distancias.
A los Sabatini y los Canales, por su hermosa amistad, por su apoyo y cariño.
A Sabri, por estar siempre al pie del cañón, por ser una gran compañera, una gran
amiga y un gran apoyo en todo momento. Por tantas alegrías y tristezas compartidas.
Por esas largas charlas telefónicas que tan bien me hacen.
A mis amigos, Marian, Hernán, Gaby, Diego, Seba, Noe, Sabri, Pitu, Topo, Ale, Lucho y
Luli, por quererme, por ayudarme, por soportarme y darme fuerzas. Los adoro.
A Estela, por estar siempre interesada en lo que hago y por ayudarme con Juli cuando
lo necesité.
A la Noni, por adoptarme como tu nieta, por ser tan generosa, dulce y atenta.
A mi hermano Adri, por resolver mis dudas informáticas en segundos y con poca
paciencia. Por estar siempre que te necesito, y por ser el mejor y único hermano que
tengo.
A mamá y papá, por haberme permitido elegir mi camino. Por aceptar mis decisiones,
festejar mis aciertos y acompañarme en mis equivocaciones. Por demostrarme con su
ejemplo que nunca es tarde para lograr lo que uno se propone, que el sacrificio vale la
pena, y que todo tiene solución. Por esa fuerza que tienen para levantarse y salir
adelante, y por contagiármela a mí. Por su ayuda infinita, su enorme sacrifico y su
amor incondicional.
A mi hija Julieta, por llenar mi vida de felicidad. Por invitarme a redescubrir el mundo a
través de tus ojitos curiosos. Porque tu sonrisa hace que todo valga la pena.
A Pablo, por ser mi pilar, por sacarme a flote, por llenarme de fuerzas. Por recordarme
todo el tiempo que esto es lo que me hace feliz, por permitirme lograr esta meta
ayudándome en todo lo que estuvo a tu alcance. Por cuidarme y por hacerme tan feliz.
Y a todos los que de alguna manera me han acompañado en este largo camino……..
……………….GRACIAS TOTALES!
A Pablo y Julieta
A mamá y papá
Publicaciones y Financiamiento 9
PUBLICACIONES
Esta tesis dio origen a la siguiente publicación:
“Characterization of substrates that have differential effect on
������������ ��� �� protein kinase A holoenzyme activation”
Galello F, Portela P, Moreno S and Rossi S.
(2010) ! �" �� �#�� 285, 29770429779.
Este trabajo fue financiado por:
•••• Agencia de Promoción Científica y Tecnológica
•••• Conicet
•••• UBA
Indice 10
ABREVIATURAS 12 INTRODUCCIÓN GENERAL 15 I. Transducción de señales por cAMP 16 II. Proteína quinasa A en mamíferos 17 II.1. Subunidad catalítica 17 II.1.2. Estructura 17 II.1.3. Reconocimiento del sustrato 20 II.2. Subunidad regulatoria 22 II.3. Holoenzima 26 II.4. Mecanismo de activación 29 II.5. Microdominios de cAMP y localización subcelular de la PKA 31 III. Proteína quinasa A de ��������������� �� 34� III.1. Subunidad catalítica 34 III.2. Subunidad regulatoria 35 III.3. Holoenzima 37 III.4. Localización subcelular de la PKA de levaduras 37 IV. Sustratos de la PKA 39 IV.1. Sustratos fisiológicos de la PKA 39 IV.2. Sitio consenso de fosforilación de la PKA 40 IV.3. Estructura secundaria y exposición a la superficie de los sitios de fosforilación 41 IV.4. Co4localización de la PKA con sustratos fisiológicos 42 IV.5. Especificidad de sustrato de la PKA de � ���� �� 43 V. Proteínas de anclaje de la PKA 43 V.1. Estructura y función de la unión de las AKAPs a la PKA 44 V.2. Diversidad dentro de la familia AKAP 52 OBJETIVOS GENERALES 54 MATERIALES Y MÉTODOS 57 1. Cepas utilizadas 58 1.1. Cepas de levaduras 58 1.1.1. Construcción de las cepas S331 BCY14TAP, S332 BCY14TAP y S330 BCY14TAP 58 1.1.2. Cepas cedidas por otros laboratorios 59 1.2 Cepas de bacterias 59 2. Plásmidos 60 3. Medios de cultivo 62 3.1. Medios de cultivo para levaduras 62 3.2. Medios de cultivo para bacterias 63 4. Transformación de levaduras 63 5. Preparación de extractos crudos 63 6. Expresión y purificación de proteínas 63 6.1. Expresión y purificación de las proteínas Pyk14His, Pyk24His y Nth14His 63 6.2. Expresión y purificación de la proteína Pyk1 64 6.3. Purificación de las proteínas Bcy1 salvaje y mutantes de deleción aminoterminales 64 7. Ensayos de actividad PKA 65
Indice 11
7.1. Preparación de enzima 65 7.1.1. Purificación de la holoenzima PKA 65 7.1.2. Purificación de la subunidad catalítica de levaduras 66 7.2. Cálculo de las unidades enzimáticas para las purificaciones de Tpk1 y Tpk2 66 7.3. Ensayos de actividad PKA ��� ���� 67 7.4. Ensayos de activación de PKA ��� ���� 68 8. ����� de péptidos 69 8.1. Revelado de ������de péptidos por auto radiografía 69 8.2. Revelado de ����� de péptidos por inmunoblot 69 9. Purificación e identificación de proteínas por espectrometría de masa 70 9.1. Purificaciones 70 9.1.1 Purificación TAP 70 9.1.2.Purificación por cAMP4agarosa 71 9.2. Identificación por espectrometría de masa 73 10. Ultracentrifugación en gradiente de sacarosa 73 11. ���������� ��� ���� 74 12. Inmunoprecipitación ��� ��� 75 13. Fraccionamiento subcelular 75 14. Preparación de fracción mitocondrial cruda 76 15. Ensayo de estrés térmico 77 16. Determinación de concentración de proteínas 77 17. ��������� 77 18. Inmunoblot o ���������� 77 19. Tinción con ����� ���� coloidal 78 CAPÍTULO I: Sustratos de la Proteína quinasa A de ����������� ��� � y su participación en la activación de la holoenzima 79 I.1. Introducción y objetivos específicos 80 I.2. Resultados y discusión 81 I.2.1. Los péptidos derivados de las proteínas Nth1, Pyk1 y Pyk2 son fosforilados por Tpk1 y Tpk2 82 I.2.2. Residuos determinantes para el reconocimiento del sustrato por Tpk 94 I.2.3. Participación de los péptidos sustratos en la activación de la Holoenzima 102 I.2.4. Las proteínas sustrato sensibilizan a la PKA hacia la activación por cAMP 105 I.3. Conclusiones 109 CAPÍTULO II: Identificación y caracterización de proteínas que interactúan con la subunidad regulatoria de la PKA de ������ �� 113 II.1. Introducción y objetivos específicos 114 II.2 Resultados y discusión 120 II.2.1. Identificación de proteínas que hacen interacción con Bcy1 120
Indice 12
II.2.2. El extremo amino terminal de Bcy1 se une ��� ��� a péptidos derivados de las proteínas interactoras 127 II.2.3. Los determinantes involucrados en la interacción con Bcy1 difieren de los presentes en las AKAPs de Mamíferos 136 II.2.4. Bcy1 e Ira2 están presentes en las mismas fracciones subcelulares e interactúan ��� ��� 146 II.2.5. Péptidos derivados de la proteína Ira2 son fosforilados por Tpks 150 II.2.6. Localización subcelular de Hsp60 y PKA 154 II.2.7. Relevancia fisiológica de la interacción Bcy14Hsp60 157 II.2.8. Red de interacción de Bcy1 161 II.3. Conclusiones 166 CONCLUSIONES GENERALES 173 PERSPECTIVAS 179 APÉNDICE 182 A.1.Tabla de AKAPs canónicas 183 A.2.Tabla de AKAPs no canónicas 201 A.3. Protocolo modificado de la purificación TAP para la obtención de fuente enzimática 202 A.4. Identificación de proteínas por espectrometría de masa 203 BIBLIOGRAFÍA 205
�
Abreviaturas 13
ABREVIATURAS
PKA Proteína quinasa dependiente de cAMP
cAMP Adenosin monofosfato cíclico
ATP Adenosin trifosfato
R Subunidad Regulatoria de PKA
C Subunidad Catalítica de PKA
AKAPs Proteínas de anclaje de PKA
PKI Péptido Inhibidor de PKA
PBC Casete de unión a fosfato
Epac Factor activador de guanina activado por cAMP
D/D Dominio de dimerización y anclaje
CNB Dominio de unión a cAMP
IS Secuencia inhibitoria
Bcy1 Subunidad Regulatoria de���������������� ��
Tpk Subunidad Catalítica de���������������� ��
Pyk1 Piruvato quinasa 1
Pyk2 Piruvato quinasa 2
Nth1 Trehalasa neutra 1
TAP �������$$ � ������ $ ��� ��
wt % ������
BSA Seroalbúmina bovina
Da Dalton
ADN Ácido desoxirribonucleico
mRNA Ácido ribonucleico mensajero
mtADN Ácido desoxirribonucleico mitocondrial
EDTA ÁcidoTetra Acético diamina etileno
EGTA ÁcidoTetra Acético etilenglicol bis
min Minutos
seg Segundos
ml Mililitro
Ml Microlitro
�m Micrómetro
Abreviaturas 14
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PMSF Fenil4Metil4Sulfonil fluoridro
SDS Dodecil sulfato de sodio
MALDI4TOF ���� &�' ���(���)���� ��*+�� ,�� �� � ��-$����
����������������������������������������.� ���
SDS4PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS
NMR Resonancia magnética nuclear
U Unidades enzimáticas
d.p.m. Desintegraciones por minuto
AC Adenilato ciclasa
PDE Fosfodiesterasa
n.d. No determinado
/�� � Constante de Michaelis4Menten � �
0��&� � Velocidad máxima
A0.5 50% de activación
/� Constante de especificidad
/���� Constante catalítica
r.p.m. Revoluciones por minuto
�
������ !!��""������##������������ ��$$��
Introducción General 16
I.Transducción de señales por cAMP
Las vías de señalización celular constituyen mecanismos de comunicación
entre y dentro de las células para asegurar un comportamiento coordinado de
los organismos y para regular los variados procesos biológicos.
Intracelularmente, los mecanismos de transducción de señales transmiten
información basados en modificaciones post4traduccionales finamente
controladas. La fosforilación de proteínas es una de las modificaciones post4
traduccionales más comunes.
Las proteínas quinasas son enzimas regulatorias claves que modifican las
propiedades de un determinado sustrato a través de la adición de un grupo
fosfato en un residuo de Serina, Treonina o Tirosina. Regulan numerosos
procesos celulares durante el crecimiento y el desarrollo, siendo una parte
integral de la maquinaria de respuesta a estrés, y encontrándose directamente
involucradas en los procesos de muerte celular.
Una de las vías de transducción de señales que se encuentra bien
caracterizada es el camino de señalización del cAMP, donde la unión de un
ligando a los receptores asociados a proteína G (GPCRs), vía proteínas G y
adenilato ciclasa (AC) conlleva a un aumento intracelular de los niveles del
segundo mensajero cAMP. Esto resulta en la activación de diferentes
moléculas efectoras como por ejemplo, la proteína quinasa dependiente de
cAMP (PKA) [143].
La holoenzima PKA en su forma inactiva es un tetrámero compuesto por dos
subunidades catalíticas (C) unidas a un dímero de subunidades regulatorias
(R). El aumento intracelular de los niveles de cAMP frente a un estímulo
determinado provoca la disociación y activación de la holoenzima. La unión de
cAMP a la subunidad regulatoria provoca una disminución en la afinidad entre
R y C, y como consecuencia, la holoenzima se disocia liberando las
subunidades catalíticas (Figura 1).
Introducción General 17
Figura 1. Mecanismo de activación de la PKA por cAMP [4].
II. Proteína quinasa A en mamíferos ���%������ ���������&� �������%�'�����������
�
Existen tres isoformas de la subunidad catalítica en mamíferos, Cα, Cβ y Cγ.
Entre Cα y Cβ las secuencias de aminoácidos difieren aproximadamente un
7%. La isoforma Cα se expresa constitutivamente en todos los tejidos, mientras
que Cβ es tejido específica; la presencia de Cγ sólo se ha demostrado en
testículos. Esta isoforma presenta una identidad del 79% y 83% con Cα y Cβ
respectivamente [5].
Las proteínas que pertenecen a la familia de las quinasas presentan un
dominio quinasa homólogo denominado dominio catalítico, compuesto por 2504
300 residuos de aminoácidos. Los distintos tipos de quinasas, como las
serina/treonina y tirosina quinasas, se clasifican en base al dominio catalítico,
su especificidad de sustrato y modo de regulación. Los miembros de los
distintos grupos y familias comparten propiedades estructurales y funcionales
básicas [6].
La PKA pertenece a la familia de las AGC quinasas, que es un grupo de
serina/treonina quinasas al cual también pertenecen PKC y PKG.
Introducción General 18
El dominio catalítico posee tres roles:
14 Unión de ATP (o GTP) en complejo con cationes divalente (Mg2+ o Mn2+)
y orientación del fosfato transferible.
24 Unión y orientación de la proteína o péptido sustrato.
34 Transferencia del fosfato γ al oxhidrilo aceptor.
El dominio catalítico se subdivide en 12 subdominios (I4XII), cada uno con una
secuencia primaria conservada (Figura 2). Los residuos aminoacídicos de los
subdominios se encuentran conservados en todas las familias de proteínas
quinasas, y en particular la secuencia aminoacídica de los subdominios VIB,
VIII, IX [6].
Figura 2. Secuencia de la subunidad Cαααα. Los subdominios indicados en colores son los
pertenecientes al ����catalítico conservado en todas las quinasas [7].
La subunidad catalítica presenta una estructura bilobular muy conservada en
todo el grupo de las quinasas. Esta estructura bilobular presenta dos
subdominios o lóbulos (Figura 3). El lóbulo menor, lóbulo N4terminal o lóbulo N,
Introducción General 19
está formado por cinco estructuras de hojas plegadas β y una α hélice
predominante llamada αC e incluye los subdominios I4IV. El lóbulo C es mayor
y se encuentra principalmente formado por α hélices e incluye los subdominios
VI a XI [8]. Este lóbulo contiene la mayor parte de la maquinaria catalítica así
como también los principales sitios de unión para el sustrato. Entre los dos
lóbulos se encuentra el sitio activo [3].
Figura 3. Estructura cristalográfica de la subunidad Cαααα bovina [9].
Al resolverse la estructura cristalográfica del complejo PKACα4PKI, se pudo
conocer la topología general de la estructura del ��� catalítico de una proteína
quinasa [10]. Con la posterior resolución de los complejos ternarios PKACα4PKI
con MgATP o MnAMP4PNP [11,12], se logró asignar un rol preciso a cada uno
de los residuos conservados y se determinó así que cada subdominio del ���
catalítico presenta residuos con una fuerte implicancia en el rol catalítico. Por
ejemplo en el subdominio I (en el lóbulo menor) está presente el motivo
consenso GxGxxGxV denominado� (���� �, que forma una estructura flexible
que une los fosfatos no transferibles del ATP y los coordina para la interacción
con las cadenas laterales de otros residuos. Esta interacción permite posicionar
Introducción General 20
al nucleótido para la catálisis. El sitio activo puede unir dos iones Mg2+ que
permiten la unión de ATP, y juegan un rol fundamental en regular la
fosfotransferencia y en limitar la velocidad de reacción. El resto de los
subdominios presentan residuos claves que permiten anclar y orientar el ATP,
hacer interacción con los residuos de la secuencia de reconocimiento del
sustrato y permitir la fosfotransferencia. La región presente en el subdominio
VIB, denominado ���� catalítico, presenta residuos que son necesarios para
que se produzca la fosfotransferencia. La activación de la PKA se logra por
fosforilación de un residuo Thr en posición 197 presente en el subdominio VIII
[6].
���%�(�� ����� � ��������������
�
Los requerimientos generales para el reconocimiento de los sustratos por la
subunidad C se han caracterizado utilizando péptidos sintéticos. El sustrato
proteico se une al ���� catalítico presente en el lóbulo mayor. Para que la
fosfotransferencia sea óptima se requiere que los residuos del dominio VIII se
encuentren en una disposición espacial determinada. Los sustratos de la PKA
son el ATP dador de fosfato y una proteína que actúa como aceptor del mismo.
Para que la subunidad C reconozca sus sustratos proteicos es imprescindible
la presencia de una secuencia consenso que incluya dos residuos básicos,
generalmente argininas, seguidos por un residuo pequeño que precede al sitio
fosfoaceptor (RRXS/T) [13415]. Luego del sitio fosfoaceptor, que puede ser una
serina o treonina, se encuentra un residuo hidrofóbico voluminoso. El péptido
sustrato clásico para la PKA deriva del sitio de fosforilación de la piruvato
quinasa de cerdo y se denomina kemptido [13]. �
La nomenclatura con la que se indica la posición de los residuos se basa en
designar el sitio fosfoaceptor como P0. Los aminoácidos que se ubican hacia el
extremo amino terminal de P0 se los designa con el signo – (Ej: P41), mientras
que los se ubican hacia el extremo carboxi terminal se los indica con el signo +
(Ej: P+1).
Introducción General 21
La cristalización de la isoforma Cα unida al péptido PKI permitió conocer más
en detalle las interacciones necesarias para el reconocimiento del sustrato. El
péptido inhibidor PKI deriva del inhibidor termoestable de proteína quinasa [16].
Este péptido contiene la secuencia consenso de fosforilación descripta
anteriormente y además presenta características adicionales que le confieren
alta afinidad de unión [17].
A partir del cristal del complejo Cα4PKI se observó que [18]:
• La cadena lateral de la fenilalanina en P411 es responsable de la alta
afinidad de unión del extremo amino terminal de PKI. El bolsillo
hidrofóbico sobre la superficie de la subunidad C complementa
perfectamente la cara hidrofóbica de la hélice formada por el péptido.
• La orientación de la región de unión de alta afinidad de PKI está
determinada por contactos iónicos que involucran la Arg en P46 (Figura
4A).
• Las interacciones electroestáticas dominan la porción del péptido
próximo al sitio fosfoaceptor, mientras que las interacciones hidrofóbicas
dominan la región carboxilo terminal al sitio fosforilable.
• Las argininas en P43 y P42 hacen interacción con las cadenas
carboxílicas laterales de distintos residuos de la subunidad C (Figura
4B).
• Los residuos Leu198, Pro202 y Leu205 forman un surco hidrofóbico que
rodea a la cadena lateral de la isoleucina en P+1. Esta región
hidrofóbica sería importante para la orientación correcta del sitio aceptor
de fosfato (Figura 4B).
• La Thr197, uno de los dos sitios de fosforilación estables de esta
enzima, también rodean al sitio P+1. El fosfato es sostenido por
múltiples interacciones electroestáticas lo cual contribuye a la estabilidad
conformacional del residuo hidrofóbico en P+1 y para la correcta
orientación del sitio fosfoaceptor (Figura 4C).
Introducción General 22
Figura 4. Estructura cristalina del complejo Cαααα%PKI [10]. (A) Interacciones de las
cadenas laterales de la Phe en P411 y la Arg en P46 con la subunidad C. (B) Interacciones
de las Arg en P43 y P42 y de la Ile en P+1 con los residuos de la subunidad C. La cadena
lateral de la Ile en P+1 se proyecta sobre el área hidrofóbica formada por Leu198, Pro202 y
Leu 205. (C) Las subunidades Cα se muestran en gris, los oxígenos en rojo y los nitrógenos
en azul. En amarillo se muestra la posición correspondiente a la Thr197 fosforilada.
Los sustratos se ubican en una conformación extendida a través del bolsillo de
unión al nucleótido, cerca del fosfato γ del ATP. El ���� de activación provee
una plataforma para el sustrato. El� ���� es fosforilado cuando la quinasa está
activa. Su fosforilación estabiliza la subunidad en una conformación extendida
que permite la unión del sustrato.
���'������� �����)������ ��
�
Las subunidades regulatorias de la PKA son proteínas que presentan multi4
dominios e interactúan con una gran variedad de proteínas además de actuar
como los principales receptores para el cAMP. Aunque existen distintas
Introducción General 23
isoformas (RIα y RIβ, RIIα y RIIβ), todas presentan la misma organización
estructural (Figura 5).
Figura 5. Organización de los dominios de las isoformas de la subunidad R [3]. D/D:
dominio de dimerización y anclaje; IS: sitio inhibitorio; Dominio A y Dominio B: dominios de
unión a cAMP (CNBs).
Todas las isoformas presentan un dominio de dimerización y anclaje (D/D) en
el extremo N4terminal, el cual actúa como sitio de unión para las proteínas de
anclaje denominadas AKAPs (ver más adelante). Si bien la estructura del D/D
se encuentra conservada entre RI y RII, la secuencia no se conserva. Ambas
contienen dos regiones helicoidales conservadas separadas por un giro. La
Hélice I, o subdominio 1, presenta los determinantes para el anclaje y la
dimerización, mientras que la Hélice II, o subdominio 2, presenta solo los
determinantes para la dimerización. En contraste a estas hélices conservadas,
existen diferencias importantes en la estructura secundaria del extremo amino
terminal en el pequeño segmento que precede a la Hélice I [19]. El dímero de
RIIα se pliega formando un grupo de cuatro hélices en forma de X que contiene
una interface de dimerización hidrofóbica así como también una superficie de
unión a AKAPs [20], mientras que el dímero de RIα presenta una estructura en
forma de Y [21] (Figura 6).
Introducción General 24
Otra diferencia entre RI y RII es que las subunidades RI se mantienen como
dímero debido a la presencia de dos uniones puente disulfuro intercatenarias
formadas por residuos de cisteínas presentes en el extremo N4terminal [15].
Posterior al dominio D/D se encuentra un sitio inhibitorio y dos dominios de
unión a cAMP en tándem (CNBs). Las estructuras de las subunidades RIα y
RIIβ en su conformación unidas a cAMP revelaron que los CNBs son motivos
conservados semejantes a la proteína activadora de los genes del catabolismo
(CAP) en bacterias [22,23]. Entre el dominio D/D y los dominios CNB se
encuentra un dominio desplegado llamado zona � ��� o bisagra que incluye al
sitio inhibitorio. El � ��� es una región desordenada que posee gran flexibilidad
[24]. El sitio inhibitorio de la subunidad RI presenta una alanina (sitio
pseudosustrato) mientras que el de la subunidad RII presenta una serina en la
misma posición (sitio sustrato) (Figura 5).
Introducción General 25
Figura 6. Dominios D/D de RIαααα y RIIαααα. (A) Alineamiento de secuencias de los dominios D/D
de RIα (bovina) y RIIα (murina). ����� ,1� ���: Los residuos críticos para la dimerización se
encuentran coloreados de la siguiente forma: verde, residuos conservados en RIIα y RIα; azul:
residuos no conservados. ����������: Los residuos críticos para la unión a las AKAPs se
encuentran coloreados siguiendo el mismo criterio utilizado para el panel izquierdo [19]. (B)
Estructura del dominio D/D de RIα y RIIα. ����� ��� ��: vista lateral; ����� �$� ��: vista
inferior desde la superficie de unión a la AKAP [25]. (C) Uniones disulfuro en el dímero RIα [26].
�
Introducción General 26
���(��*����+ ���
�
Existen cuatro isoformas de holoenzima de PKA que se denominan Iα, Iβ, IIα y
IIβ en función de la isoforma de R que acompaña a C.�
El cAMP se une cooperativamente a los sitios CNB4A y CNB4B de cada
subunidad R. En la holoenzima inactiva, solo el sitio B se encuentra expuesto y
disponible para la unión de cAMP. Cuando es ocupado, promueve la unión del
cAMP al sitio A a través de un cambio estérico intramolecular. La unión de
cuatro moléculas de cAMP, dos a cada subunidad R, conlleva a un cambio
conformacional y a la disociación de un dímero de subunidades R con cuatro
moléculas de cAMP unidas y dos monómeros de C activos [27]. �
La PKA de tipo I es más sensible al cAMP con una constante de activación
(/���) de 504100 nM de cAMP y es principalmente citosólica, mientras que cerca
del 75% de la PKA de tipo II, que se encuentra asociada a organelas y a
estructuras celulares específicas, presenta una /��� de 2004400 nM de cAMP
[28430]. Las distintas isoformas de las subunidades R codificadas por distintos
genes se expresan diferencialmente en diferentes tipos celulares. Mientras
que RIα y RIIα son de expresión ubicua [31,32], RII β se expresa
principalmente en tejido endócrino, cerebro, tejidos grasos y reproductivos, y
RIβ se encuentra mayormente en cerebro [33435].
Las diferencias en las afinidades por el cAMP y la localización entre las
isoformas de la PKA podrían contribuir a la especificidad en el camino de
señalización del cAMP [36]. RI y RII presentan otras diferencias además de las
mencionadas: las subunidades RI y RII aportan diferentes superficies que
participan en la interacción con la subunidad C [37] y además difieren en el
requerimiento de ATP para dicha interacción. Mientras que la PKA de tipo II
requiere del dominio CNB4B para la formación de la holoenzima, la PKA tipo I
requiere ATP4Mg2+ [38].
Para explicar cómo la subunidad C es inhibida por R, cómo el cAMP activa a la
holoenzima y cuáles son las diferencias estructurales que conllevan a la
regulación diferencial de las holoenzimas de tipo I y tipo II, se cristalizaron
distintas mutantes de deleción de RIα o RIIα en complejo con la subunidad Cα
(Figura 7A y B respectivamente). Para analizar en detalle la estructura de la
Introducción General 27
holoenzima de tipo I, se cristalizó la mutante RIα(914244) junto con la
subunidad Cα en presencia de un análogo no hidrolizable de ATP (AMP4PNP).
Una extensa superficie de la subunidad C está involucrada en la unión con la
subunidad R. Los principales puntos de contacto son: (1) el sitio activo; (2) el
���� de unión al sustrato (���� P+1) y la hélice αG hidrofóbica; (3) el ���� de
activación. La estructura reveló que la subunidad C presenta una conformación
completamente cerrada, con Mn2+AMP4PNP unido al sitio activo del bolsillo
catalítico y que sirve como una plataforma estable para el anclaje de la
subunidad RIα. La superficie de anclaje sobre la subunidad C se encuentra
localizada casi exclusivamente en el lóbulo mayor [39].
Las subunidad RIα presenta importantes cambios conformacionales luego de la
formación del complejo [39]:
i. La secuencia inhibitoria se ancla al sitio activo en el bolsillo
catalítico.
ii. Se ordena la región linker que conecta el sitio inhibitorio y el
dominio CNB4A.
iii. El dominio CNB4A se ancla sobre el lóbulo mayor de la subunidad
C.
La resolución de esta estructura cristalográfica permitió conocer en detalle los
puntos de contacto entre R y C, y puso en evidencia los cambios
conformacionales que debe atravesar la subunidad RI para liberar las
subunidades C y unirse al cAMP. Sin embargo, este complejo carece del
segundo sitio de unión a cAMP, el cual resulta crucial para la activación
alostérica de la PKA por el nucleótido cíclico. La activación de la holoenzima de
tipo I por cAMP es un proceso altamente ordenado, el dominio CNB4A es
inaccesible hasta que el cAMP ocupa el dominio CNB4B (ver más adelante).
Para responder este interrogante, se resolvió la estructura cristalográfica del
complejo formado por la mutante RIα(914379) (que contiene los dos sitios de
unión a cAMP) y Cα en presencia de AMP4PNP y dos iones Mn2+. A partir de
este nuevo cristal se definió un nuevo punto de contacto sobre la subunidad C,
el ���� catalítico, que interactúa únicamente con el dominio CNB4B de la
Introducción General 28
subunidad R. También se observó que la subunidad RIα pasa de una
conformación globular a una conformación extendida cuando se une a la
subunidad C para conformar la holoenzima, en donde los dos dominios de
unión a cAMP se separan a causa de la extensión de la hélice αB/C del
dominio CNB4A.
La mutante de RIIα, RIIα(904400) fue cristalizada junto con la subunidad Cα en
ausencia de ATP. La subunidad catalítica se encuentra en la conformación
abierta, el sitio activo está abierto y la cola C4terminal se encuentra
desordenada. Por otro lado, el sitio inhibitorio y la región � ���, los cuales se
encuentran desordenados en la subunidad RII libre, se ordenan en la
holoenzima, tal como ocurre en la holoenzima de tipo I. El anclaje del dominio
CNB4A sobre el lóbulo mayor de la subunidad C crea una interface extensa
donde el CNB4 B aporta un pequeño pero esencial motivo de anclaje que une al
���� catalítico de la subunidad C [23].
La subunidad RIIα sufre tres cambios importantes [23]:
iv. Se ordena el sitio inhibitorio y la región � ��� subsiguiente.
v. Se reorganizan los subdominios helicoidales del dominio A, lo
cual conlleva a la separación de los dominios A y B.
vi. Reorganización del subdominio helicoidal del dominio B para
acomodar el anclaje al ���� αH4αI de la subunidad C.
Introducción General 29
Figura 7. Estructuras cristalográficas de las holoenzimas de tipo I (A) y II (B). (A) En la
figura se observa la secuencia inhibitoria de la subunidad RIα(914379) unida al sitio activo de la
subunidad catalítica. Los recuadros indican los sitios de interacción entre R y C [22]. (B)
Estrucutura de la holoenzima formada por RIIα(904400) y Cα [23].
���,��-��� �������� ��� .��
Es ampliamente aceptado que el cAMP activa a la PKA causando la
disociación de las subunidades R y C. Este mecanismo ha sido validado por
diversos experimentos �� � ��� en dónde se demostró que a bajas
concentraciones de cAMP la PKA existe como holoenzima, pero a altas
concentraciones de este nucleótido las subunidades enzimáticas se disocian en
un homodímero de R (R2) y dos monómeros de C [40444].
Sin embargo se ha demostrado que el agregado de un exceso molar de cAMP
a la holoenzima de tipo I causa la disociación parcial de la misma. Sólo el
agregado de un péptido sustrato junto con el cAMP logra la disociación total.
En estas mismas condiciones, sin embargo, un porcentaje significante de
holoenzima de tipo II permanece sin disociar [45]. Por lo tanto, en el
mecanismo de activación de la holoenzima el sustrato juega un rol importante y
es diferencial en la activación de la PKA tipo I versus la de tipo II. Como se
mencionó anteriormente, las subunidades RI y RII comparten los mismos
Introducción General 30
dominios de organización pero presentan diferencias en cuanto a sus
propiedades bioquímicas. Una de estas diferencias es que la holoenzima de
tipo I necesita dos iones Mg2+ y altas concentraciones de ATP para que se
forme el complejo [38]. El efecto diferencial de estos cofactores sobre la
estabilidad de la holoenzima podría estar directamente relacionado con el
efecto diferencial del sustrato.
El mecanismo propuesto para la activación de la holoenzima de tipo I se
muestra en la Figura 8. La unión del cAMP a RIα provoca un cambio
conformacional alostérico en el subdominio del CNB4A, que interactúa con la
subunidad C, lo cual produce un debilitamiento de las interacciones. Si el
sustrato está presente, éste compite con el sitio inhibitorio y facilita la
disociación completa del complejo R4C. El hecho de que la adición del sustrato
en ausencia de cAMP no causa la disociación de la holoenzima ni provoca
cambios conformacionales, sugiere que el sitio activo de la subunidad C se
encuentra completamente bloqueado en la holoenzima inactiva. Sin embargo,
la unión del cAMP a la holoenzima provoca un cambio conformacional que
permite al sustrato competir con el sitio pseudosustrato por el sitio activo de la
subunidad C. El mecanismo de activación para la holoenzima de tipo II
parecería ser más complejo dado que el sustrato no es tan efectivo como
competidor de la región pseudosustrato de la RII [45].
Introducción General 31
Figura 8. Modelo propuesto para el mecanismo de activación por cAMP de la PKA [45].
Las subunidades catalíticas se representan en forma de “�������” en negro. Las subunidades
R se representan de la siguiente manera: los dominios A y B de unión a cAMP se representan
como elipses azules; el cuadrado verde representa el dominio D/D, y la línea roja la región
� ��� que incluye el sitio inhibitorio pseudosustrato. El sustrato se muestra como un rectángulo
celeste. (A) Conformación de la holoenzima a bajas concentraciones de cAMP. (B)
Conformación de la holoenzima luego de la unión del cAMP. (C) Participación del sustrato en la
activación. Ver detalles en el texto.
���/��- ������ � ������-��������� +�� .�����������������0��
Todas las vías de señalización que involucran al cAMP como segundo
mensajero se basan en un conjunto de componentes moleculares comunes. La
expresión tejido específica de las diferentes isoformas de cada uno de estos
componentes junto con su ensamblaje en localizaciones subcelulares discretas
facilitan la regulación específica de las funciones celulares. Los componentes
principales de estos complejos de señalización son la adenilato ciclasa (AC),
que genera el cAMP, y las fosfodiesterasas (PDEs) que lo degradan. La ACs y
las PDEs son las encargadas de generar los gradientes o microdominios de
Introducción General 32
cAMP en localizaciones celulares específicas. Estos gradientes de cAMP
actúan localmente siendo los principales efectores la PKA, las proteínas de
intercambio activadas por cAMP (Epacs) que actúan como factores
intercambiadores de GTP y, en algunos tipos celulares, los canales iónicos
gatillados por cAMP. La interpretación de la señal en localizaciones celulares
discretas es llevada a cabo por la ubicación de estos efectores en nodos de
señalización particulares, en donde las proteínas AKAPs juegan un rol
fundamental. Estas proteínas de andamiaje sitúan a la PKA en espacios
celulares específicos cerca de sus sustratos. Las AKAPs no solo anclan a la
PKA sino que también interactúan con las PDEs, los receptores asociados a
proteína G (GPCRs), ACs, Epacs y las proteínas sustrato de la PKA. De esta
manera la regulación de la vía del cAMP ocurre a diferentes niveles: la
generación del cAMP, el control de los efectores, y la terminación de la señal
(Figura 9).
�
Figura 9. Camino de señalización del cAMP [46]. cAMP: círculos rojos; 1) PKA; 2) PDEs; 3)
GEFs; 4) canales iónicos gatillados por cAMP.
Introducción General 33
La PKA de tipo I se encuentra principalmente localizada en el citosol, pero una
pequeña cantidad se halla anclada por las AKAPs en estructuras subcelulares
específicas [47]. La PKA de tipo II se ancla a estructuras subcelulares definidas
a través de la interacción con las AKAPs [46,48450]. Además de presentar una
localización diferencial, las distintas isoformas de R presentan una expresión
tejido específica: la isoforma RIα se expresa de manera ubicua mientras que
RIβ se expresa principalmente en las células del sistema nervioso central [35];
la expresión de RIIα es ubicua, mientras que RIIβ se encuentra
predominantemente en cerebro como así también en tejido neuroendocrino,
adiposo y reproductivo [36].
Por definición, la subunidad catalítica de la PKA colocaliza con los complejos
R4AKAPs. Luego de la disociación por cAMP la localización de C no está
restringida por la interacción con R y puede fosforilar sustratos preferentemente
cercanos. En células de mamíferos, la señalización nuclear vía cAMP requiere
del movimiento de subunidades C libres dentro del núcleo [51]. Por ejemplo, la
translocación de C es el paso limitante para la fosforilación del factor de
transcripción CREB. Dado que la entrada de C al núcleo es por difusión pasiva,
la fosforilación de CREB es relativamente lenta comparada con la disociación
de la holoenzima por cAMP en el citoplasma [52]. Se piensa que el tiempo
necesario para la translocación nuclear de C podría contribuir a diferencias
cinéticas en la fosforilación de sustratos citoplasmáticos y nucleares. A
diferencia de la entrada, la salida del núcleo de C depende de un mecanismo
de transporte activo. El inhibidor endógeno de la PKA (PKI) es una proteína
pequeña que contiene una secuencia pseudosustrato [53] la cual se une al sitio
de unión del sustrato de las subunidades C libres en el núcleo y de esta
manera previene la fosforilación de sustratos de la PKA. El PKI presenta una
señal de exportación nuclear (NES) que permite la exportación de las
subunidades C desde el núcleo hacia el citoplasma [54,55].
Las subunidades catalíticas también pueden interactuar con proteínas
denominadas AKIPs ('�� ��� ������ ��� ���� �), y esta interacción puede
afectar directamente la actividad quinasa. Varias de estas proteínas están
involucradas en el ����� �� de la subunidad C entre el citoplasma y el núcleo.
Introducción General 34
Por ejemplo, la AKIP1 interactúa con la hélice A del extremo amino terminal de
la subunidad C anclándola en el núcleo [56].
III. Proteína quinasa A de ��������������� ��
�
����%������� ���������&� ���
�
En levaduras, la subunidad catalítica está codificada por tres alelos
parcialmente redundantes en su función: TPK1, TPK2 y TPK3. Las tres
proteínas poseen una región carboxilo terminal (300 aminoácidos) que se
encuentra conservada en todas las quinasas dependientes de cAMP, y una
región amino terminal corta. En la región carboxilo terminal, Tpk1 y Tpk3
presentan aproximadamente 88% de identidad, mientras que Tpk2 presenta
76% de identidad respecto a los otros dos alelos. Las secuencias de las TPKs
tiene una identidad de alrededor del 50% con la subunidad C de mamíferos en
la región correspondiente al ��� catalítico de la enzima y al extremo C4terminal
[57].
Tanto Tpk2 como Tpk1 poseen mayor actividad que Tpk3 �� � ��. La baja
actividad quinasa de la isoforma Tpk3 podría deberse a la baja expresión de la
proteína [58]. La deleción de los tres genes que codifican para las TPKs resulta
letal para la célula, sin embrago la expresión de uno solo de ellos (cualquiera
sea) es suficiente para que la célula sea viable. Sin embargo se ha demostrado
que cada subunidad catalítica posee roles específicos [59].
De las tres isoformas, Tpk1 es la más estudiada hasta el momento. Esta
isoforma presenta muchas de las características estructurales y cinéticas
presentes en la PKA de mamíferos: alta identidad en el ��� catalítico [57],
selectividad por sustratos peptídicos desde el punto de vista cualitativo [60], y
la capacidad de unirse a la subunidad regulatoria y al péptido inhibitorio PKI
[61,62]. Además, las subunidades catalíticas de mamíferos pueden sustituir
funcionalmente a las TPKs ��� �� [63]. A pesar de estas similitudes, Tpk1 se
diferencia de la subunidad C de mamíferos en cuanto a la selectividad
cuantitativa de los sustratos. La mayor diferencia ocurre a nivel de la afinidad
de unión por los péptidos inhibitorios y en la /� aparente para el nucleótido y
Introducción General 35
los sustratos peptídicos [62,64]. La resolución de la estructura cristalina de la
proteína Tpk1� (carece de los primeros 80 aminoácidos) en ausencia de
ligandos reveló que la proteína presenta una estructura conservada formada
por dos lóbulos globulares y que los cambios conformacionales que ocurren
durante la unión del ligando y la catálisis se encuentran también conservados
entre especies [65].
����'������� �����)������ ��
�
La subunidad regulatoria de la PKA de levaduras está codificada por un único
gen, BCY1. La proteína Bcy1 presenta una identidad del 40% con las
subunidades regulatorias RI y RII de mamíferos, sin embargo existen
importantes diferencias estructurales en el extremo amino terminal: Bcy1
presenta 47 aminoácidos más en su extremo amino terminal que las
subunidades regulatorias de mamíferos. Tal como ocurre para RI y RII, la
subunidad regulatoria de levaduras también presenta una estructura modular
(ver Figura 5) [66]. El dominio amino terminal de Bcy1 es homólogo al N4
terminal de RI y RII e incluye un sitio de fosforilación en la Ser 145 [67]. Aún no
se conoce cuáles son los residuos involucrados en la dimerización de las
subunidades regulatorias de Bcy1 ni tampoco aquellos que participan en la
interacción con posibles proteínas de anclaje. Sin embargo, el análisis de
secuencia aminoacídica entre Bcy1 y RII indica que los residuos dentro de la
hélice I no se encuentran conservados en levaduras, mientras que sí lo hacen
los residuos de la hélice II y aquellos necesarios para la dimerización (Figura
10).
Introducción General 36
Figura 10. Alineamiento del dominio D/D (Adaptado Tesis Jimena Rinaldi). En la parte
superior del alineamiento se indica la estructura secundaria predicha para Bcy1, la cual
coincide con la estructura resuelta para las subunidades RI y RII de mamífero. Para cada
secuencia a izquierda y derecha se indica la numeración de aminoácidos. En la parte inferior se
indica la numeración del alineamiento. El sombreado negro, gris oscuro y gris claro
corresponde a 90, 66 y 56% de conservación de tipo de aminoácido, respectivamente. Los
residuos críticos para la dimerización y para la unión con las AKAPs para RI y RII se indican de
la siguiente manera: ��� ������2 residuos implicados en la dimerización; ��� �����3�:
residuos involucrados en la unión con las AKAPs.
Recientemente en nuestro laboratorio se resolvió la estructura cristalográfica de
los dominios CNBs de Bcy1 utilizando la mutante de deleción Bcy1(1684416)
unida a cAMP [68]. Las regiones de Bcy1 que difieren con las estructuras de
mamíferos son las mismas regiones en las que difieren RI y RII [69], lo cual
indica que la variabilidad está restringida a regiones específicas de la molécula.
La orientación relativa de los dominios es diferente a RIα y a RIIβ. Esta
orientación diferencial se debe a la diferencias en el quiebre entre las hélices B
y C del CNB4A y determina zonas de contacto distintas a las observadas en las
subunidades R de mamíferos. Bcy1 presenta características similares a RIα,
como la posición de los residuos ���� ��� y el entrelazado de puentes de
hidrógeno del casete de unión a fosfato del CNB4A (PBC4A); comparte otras
características con las subunidades RII, como la Ser fosforilable en el IS y la
Met y la Asn conservada del PBC4A. En otros aspectos es diferente a estos dos
grupos, como por ejemplo en la orientación relativa de los dominios, las
interacciones de la Tyr conservada del PBC4A, la cola C4terminal, entre otros
[68].
Introducción General 37
La disrupción del gen BCY1 no es letal, pero genera sensibilidad al estrés
térmico y a la deprivación de nitrógeno [66].
����(��*����+ ���
�
La cinética de la interacción R4C en � ���� � difiere de la interacción que
se da entre las subunidades de mamíferos. En mamíferos, la interacción se
encuentra en el rango subnanomolar; en � ���� �, se ha estimado que la
afinidad se encuentra alrededor de 20 nM [67].
Para la holoenzima de mamíferos se ha estimado que el cAMP decrece la
afinidad R4C 1000 veces [27]. En � ���� ���la afinidad aparente entre R4C
disminuye 20 veces por el agregado de cAMP. Las razones para estas
desigualdades pueden radicar en las diferencias en la estructura primaria de
las subunidades regulatorias Bcy1 y RII y en las diferentes modificaciones
postraduccionales que sufren cada una de ellas. Además las subunidades Tpks
de � ���� � difieren de su homóloga en mamíferos en cuanto a la afinidad
por el kemptido y por PKI [61].
����,��$���� +�� .�����������������0������������
�
La localización de Bcy1 es dinámica y dependiente de la disponibilidad de
nutrientes. En células creciendo en glucosa Bcy1 es predominantemente
nuclear, mientras que en ausencia de esta fuente de carbono se encuentra
distribuida tanto en núcleo como en citoplasma. Bcy1 es retenida en el
citoplasma en ausencia de glucosa debido a la fosforilación de dos ����� de
serinas ubicados en el extremo amino terminal de la proteína (primeros 124
aminoácidos). Estos ����� son dos regiones particularmente ricas en serinas.
El ����� I se ubica en el extremo N4terminal, mientras que el ����� II se ubica
entre los residuos de serina 68 y 84. Cuando las serinas del ����� I o del
������ II son mutadas a alaninas no se observan grandes cambios en la
localización de Bcy1. Sin embargo cuando se mutan las serinas de ambos
����� se observa que Bcy1 presenta una marcada localización nuclear
Introducción General 38
cuando las células son crecidas en presencia de glucosa, sugiriendo que la
fosforilación en ambos ����� es importante para una adecuada localización.
En cambio, en fase estacionaria se observó que independientemente de cuál
sea la mutación sobre los �����, la localización de Bcy1 mutante era igual a
la de Bcy1 salvaje, indicando que en fase estacionaria los mecanismos de
localización de Bcy1 no involucran a los ����� I y II [70]. La fosforilación de
los ����� de serinas y la localización de Bcy1 serían dependientes de la
expresión del gen YAK1 [71,72]. Yak1 es una proteína quinasa cuya actividad
es antagónica a la de PKA [73], y su expresión es dependiente de Msn2 y
Msn4, dos factores de transcripción regulados negativamente por PKA [74], lo
cual sugiere que la propia PKA regula su localización. Los mismos autores
identificaron una proteína, Zds1, que hace interacción con el amino terminal de
Bcy1. La fosforilación del ������II de serinas incrementaría la afinidad de Bcy1
por Zds1 la cual puede retener a Bcy1 fosforilada en el citoplasma, por lo que
esta proteína podría funcionar como una AKAP, sin embargo no presenta las
características de éstas (ver más adelante). Dado que para la localización de
Bcy1 se propone que ambos ������ son importantes y sin embargo para la
localización dependiente de Zds1 solo está involucrado el ����� II, se propone
la participación de otra proteína o factor que interactúe con el ����� I.
Durante crecimiento exponencial en glucosa, tanto Bcy1 como Tpk2 localizan
en el núcleo, mientras que Tpk1 y Tpk3 muestran una distribución núcleo4
citoplasmática. En células creciendo en fuente de carbono no fermentable o en
fase estacionaria, las subunidades de PKA se ubican en citoplasma,
encontrándose Tpk2 y Tpk3, pero no Bcy1, asociadas a ����� o 4���
��� �[75]. La localización de Tpk1 (y posiblemente de Tpk2 y Tpk3) depende
de la interacción con Bcy1, es decir depende de los niveles de cAMP. En las
células que se encuentran creciendo en fuente de carbono no fermentable o en
fase estacionaria de crecimiento, Bcy1 se encuentra citoplasmática, donde
puede inhibir a la subunidad catalítica lo cual es un requerimiento necesario
para el metabolismo en fuente de carbono no fermentable [76]. No se conoce si
la exportación nuclear de las subunidades catalíticas involucra un mecanismo
activo.
Introducción General 39
IV. Sustratos de la PKA
�1�%����������2 ��.) ���������0��
�
Las bases moleculares de la especificidad de sustratos de la PKA han sido
originalmente bien definidas mediante el uso de péptidos sustratos derivados
de proteínas sustrato bien caracterizadas y péptidos derivados del PKI. A partir
de la estructura cristalina del complejo PKI4C y mediante el análisis de los
cambios estructurales en la subunidad catalítica, se definieron los
determinantes de unión claves tanto en el PKI como en la subunidad catalítica.
Empleando kemptido (LRRASLG) se ha observado �� � ��� que sustituciones
que alejan o acercan el par de R respecto del sitio fosfoaceptor o la sustitución
de éstos por Lys afectan su calidad como sustrato de la PKA, disminuyendo la
constante de especificidad de la catálisis hasta 700 veces [77]. Estos
resultados indicarían que los sustratos nativos deberían conservar una
secuencia específica "mínima" que asegure propiedades cinéticas óptimas para
su fosforilación.
Sin embargo, se han descripto sustratos fisiológicos de la PKA que presentan
sustituciones en las argininas P42 y P43 por lisinas o variaciones en la posición
relativa de estas respecto al residuo fosfoaceptor. Esto indica que los sustratos
"naturales" de la PKA se desvían de la descripción de especificidad obtenida ��
� ���. Los criterios que se deben cumplir para la definición de un sustrato
fisiológico de las proteínas quinasas ha sido expuesto por Krebs y Beavo
(1979) [78]:
1) Demostración �� � ��� que la proteína puede ser estequiométricamente
fosforilada por una quinasa y desfosforilada por una fosfatasa apropiada.
2) Demostración que las propiedades de la proteína sufre cambios y
correlaciona con el grado de fosforilación.
3) Demostración que la proteína puede ser fosforilada y desfosforilada ��
� �� o en un sistema celular intacto acompañado de cambios
funcionales.
4) Correlación entre los niveles de proteína quinasa y/o fosfatasa y el grado
de fosforilación de la proteína sustrato.
Introducción General 40
Así se elaboró una lista de aproximadamente 100 sustratos fisiológicos de la
PKA [79]. Para esto, basándose en los criterios expuestos anteriormente, se
incluyeron los sustratos en los cuales se ha demostrado la fosforilación �� ��
en respuesta al incremento del cAMP (puntos 3 y 4), más la precisión que
ofrece la identificación del sitio de fosforilación ��� ��. Esto es importante, ya
que no es raro que los sitios ��� ��� e ��� �� difieran. No todos los sustratos
incluidos en la lista pueden cumplir con los cuatro puntos. Varios sustratos que
se han incluido no presentan una consecuencia funcional de su fosforilación.
Algunos de ellos pueden incluir efectos que aun no han sido considerados
como localización subcelular o tasa de degradación en células intactas. Al día
de hoy debería haberse incrementado esta lista debido a los distintos sustratos
que han sido caracterizados, sin embargo la misma no ha sido actualizada.
�1�'��� � ����������2�2�� ��� .��������0��
�
Los sitos de fosforilación obtenidos a partir de la recopilación realizada por
Shabb permiten la evaluación de la secuencia consenso para PKA en un
contexto fisiológico. La observación de la ocurrencia de todas las
permutaciones de estos sitios demuestra que no existe una secuencia
consenso única que prediga satisfactoriamente los sitios de fosforilación. Por lo
que, muchas veces, se requiere de la confirmación experimental de los sitios
de fosforilación de la PKA [79].
Analizando la probabilidad de fosforilación por PKA como el cociente entre los
sitios fosforilados por PKA determinados experimentalmente sobre los sitios
consensos totales (este número indica cuan eficiente es ese sitio como motivo
consenso de PKA) se ha observado que:
1) Existe una fuerte preferencia por Arginina en P42 y/o P43.
2) La secuencia consenso RRXS es la más abundante, representando
ligeramente más del 50% de todos los sitios. El 80% de todos los sitios
RRXS presentes en los sustratos fisiológicos están sujetos a
fosforilación, indicando que este motivo es el sustrato más eficiente.
Introducción General 41
3) Si bien la arginina es el residuo básico preferido en las posiciones P42 y
P43, aproximadamente el 15% contiene al menos un residuo lisina en
estas posiciones. El 47% de todos los sitios RKXS son fosforilados en
sustratos fisiológicos por PKA, mientras que la eficiencia de fosforilación
es menos del 20% para KRXS.
4) El residuo serina es preferido como sitio fosfoaceptor frente a la
treonina, la presencia de Ser ocurre en 135 de 145 secuencias
examinadas.
Examinando las posiciones fuera de P42 y P43, surgen otras características.
Existe una leve preferencia por Arg en las posiciones P44 a P47 y una gran
frecuencia de residuos hidrofóbicos (Phe, Ile, Leu y Val) en la posición P+1.
Existe además un incremento en la frecuencia de residuos pequeños en la
posición P41.
De estas observaciones se desprende que la PKA fosforila eficientemente
sustratos fisiológicos que presenten secuencias consenso RRXS, lo cual es
consistente con numerosos estudios ��� ��� así como el análisis bioquímico y
cristalográfico de las interacciones entre PKI y PKA. Pero como se ha
mencionado anteriormente este motivo representa solo el 50% de todos los
sitios fisiológicos de la PKA. La fosforilación menos frecuente de motivos con
variaciones tanto en la posición como en el tipo de residuo, dificulta la
predicción de sitios de fosforilación sobre la base de la estructura primaria. Es
importante notar que la flexibilidad en la secuencia consenso podría causar que
diferentes sustratos presenten diferentes afinidades por la subunidad catalítica,
constituyéndose en "mejores" y "peores" sustratos.
�1�(�� ���������� ������ �� �� 34� � .�� �� ��� �4�2 � � �� ��� � �� ��
2�2�� ��� .��
�
Se ha analizado la estructura secundaria de fragmentos de péptidos derivados
de 406 sustratos proteicos para proteínas quinasas. Se ha definido utilizando
varios procedimientos de predicción que los residuos Ser y Thr se encuentran
preferentemente dentro de estructuras del tipo �� � (70%), mientras que el 204
Introducción General 42
30% de las secuencias pertenecerían a estructuras del tipo hélice o extendidas
[80].
Realizando predicción de la accesibilidad a la superficie de los residuos Ser y
Thr presentes en los sustratos, se ha observado que alrededor del 65470% de
los residuos fosforilables estarían en la superficie de la proteína. Por otro lado,
si se realiza este análisis sobre todos los residuos Ser y Thr presentes en las
proteínas sustratos se observa que la Ser y Thr tienen la misma probabilidad
de tener ubicaciones externas o internas en la proteína. Estos resultados
indicarían que el residuo a ser fosforilado debe encontrarse en la superficie de
la proteína sustrato, accesible a la proteína quinasa y debe ser parte de una
cadena polipeptídica relativamente flexible para "adaptarse" al sitio activo de la
enzima.
No existe mucha evidencia experimental que describa cuál es el efecto de las
características estructurales del sitio consenso en la fosforilación por la PKA.
La tasa de fosforilación de la piruvato quinasa de hígado de cerdo resultó
menor que para un péptido derivado de ésta [81]. Además se observó
utilizando análogos estructurales del PKI (6422), que la estructura de la porción
central de éste, comprendida por los residuos 12415, tiene gran influencia sobre
su habilidad para unirse a la subunidad catalítica e inhibirla. Específicamente,
la formación de una estructura del tipo lámina β en la región central disminuye
la interacción de PKI a la subunidad catalítica [82].
�1�,���������� +�� .��������0�������������2 ��.) ����
�
El uso de péptidos que compiten la interacción AKAPs4dominio de dimerización
de las subunidades regulatorias de la PKA, ha permitido demostrar el rol de las
proteínas de anclaje de la PKA en las reacciones de fosforilación. Cuando el
péptido Ht31 es introducido en una célula, éste puede bloquear la fosforilación
dependiente de cAMP de un sustrato cuando la AKAP está involucrada en la
co4localización de la PKA y éste [83].
Mediante el uso de este abordaje se definieron varios sustratos cuya
fosforilación depende de su co4localización con PKA. Algunos ejemplos son:
Acuoporina42, receptor β24adrenérgico y canales de calcio sensibles a voltaje.
Introducción General 43
Sin embargo, se han descripto algunos casos en donde la subunidad catalítica
interacciona directamente con el sustrato, como ser la propia subunidad
regulatoria del tipo II.
�1�/���4� 2 � �������������������0��������� ��
Utilizando péptidos derivados del activador transcripcional Adr1, el cual es
necesario para la expresión de la enzima alcohol deshidrogenasa, se ha
caracterizado la especificidad de sustrato de la PKA de � � ��� �� [84].
Empleando péptidos de diferentes largos alrededor de la Ser230, y como
fuente de enzima la isoforma Tpk1 y la subunidad catalítica de la PKA de
corazón porcino, se demostró que ambos tipos de subunidades catalíticas
presentan determinantes aminoacídicos en común, los cuales incluyen los
residuos proximales del lado amino terminal y hasta la posición P+4 del
carboxilo terminal respecto del sitio fosfoaceptor. Sin embargo, la enzima de
mamíferos presenta mayor afinidad por los sustratos que Tpk1 y tiene
preferencia por péptidos más largos respecto de la posición P44.
Estos resultados sugieren que las subunidades catalíticas reconocen
determinantes aminoacídicos similares pero no idénticos.
V. Proteínas de anclaje de la PKA
Es ampliamente aceptado que la localización subcelular de las subunidades R
de mamíferos ocurre a través de la interacción con las AKAPs. Esta familia
formada por cuarenta y tres genes funcionalmente relacionados es definida
sobre la base de su habilidad para interactuar con las subunidades R de la
PKA. Las primeras proteínas de anclaje fueron detectadas como
contaminantes que co4purificaban con las subunidades R en purificaciones por
cAMP4agarosa [85]. Más tarde, el uso de protocolos de ������ que utilizaban
RII como sonda, estrategias de clonado y expresión, y análisis de doble híbrido
en levaduras permitieron identificar más miembros de la familia AKAPs [86488].
Hasta la fecha han sido identificadas alrededor de 50 AKAPs en mamíferos y
Introducción General 44
organismos inferiores [50] (Apéndice A.1). Se definieron AKAPs que hacen
interacción con RI o con RII y AKAPs que hacen interacción tanto con RI como
con RII. Así se clasificaron en 3 clases dependiendo de su especificidad: RI4
específicas, RII–específicas o de especificidad dual. La principal característica
de las AKAPs es la presencia de un dominio de interacción con R, pero
además presentan un dominio de anclaje a localizaciones subcelulares
específicas. Una propiedad de las proteínas AKAPs es su habilidad para
asociar simultáneamente varias proteínas. Este concepto ha sido bien
establecido por numerosos fraccionamientos subcelulares, ��� �� por doble
híbrido en levaduras, y abordajes de espectrometría de masa. El resultado neto
de estas búsquedas ha sido la clara evidencia de que la mayoría, si no todas
las AKAPs, presentan la capacidad de interactuar con diferentes
combinaciones de activadores, efectores, enzimas involucradas en la
transducción y terminación de la señal, y sustratos [1,89]. Esto le permite a los
complejos de señalización formados por las AKAPs efectuar una rápida y
eficiente transmisión de la señal en ambientes locales. Algunas AKAPs se
expresan ubicuamente, mientras que otras presentan una función específica en
tipos celulares especializados. Por ejemplo, en cardiomiocitos, numerosas
AKAPs ocupan localizaciones celulares precisas para coordinar funciones
críticas del corazón, incluyendo el acoplamiento excitación4contracción, la
homeostasis del oxígeno, el gasto de energía, y el control transcripcional.
1�%��������������2��� .��������� .��������0���������0��
�
Aunque los dominios de unión a RII de diferentes AKAPs comparten una baja
identidad de secuencia (<30%) se propone que existe un motivo de estructura
secundaria común a todas las AKAPs. La interacción AKAP4R involucra una
región de α4hélice en la proteína de anclaje (dominio AKB, ' /inase "inding) la
cual se une fuertemente al dominio D/D formado por los primeros cuarenta y
cinco aminoácidos de cada monómero de RII [90]. Los dominios de unión a RII
presentan un patrón de residuos hidrofóbicos e hidrofílicos que tiene una alta
probabilidad de formar una hélice anfipática. Este motivo se encuentra
conservado en todas las AKAPs con especificidad para RII (Tabla 1).
Introducción General 45
Tabla 1. Alineamiento de los dominios de unión a RII de distintas AKAPs. Los
residuos hidrofóbicos conservados se encuentran resaltados en color gris.
Si bien la mayoría de las AKAPs descriptas hasta el momento son específicas
para RII, existen ejemplos de AKAPs con especificidad para RI. La unión entre
las AKAPs y las subunidades RI y RII presentan diferencias. RII se une con
mayor afinidad a las AKAPs y tienen una menor velocidad de disociación que
las subunidades RI. Recientemente se han descripto ejemplos de AKAPs de
tipo dual que también conservan esta característica de unir con mayor afinidad
a RII que a RI [91]. Esta afinidad menor entre RI y las AKAPs se atribuyó,
según ensayos �� � ���, a diferencias estructurales en el dominio D/D N4
terminal de RI que permitirían una disociación más rápida de la hélice
anfipática para RI que para RII; sin embargo, las interacciones dinámicas de
estas proteínas están menos estudiada en sistemas ��� �� [49].
Como se mencionó anteriormente, la superficie de contacto sobre la AKAP es
una α4hélice anfipática. La organización estructural de esta hélice formada por
14418 aminoácidos ubica a los residuos hidrofóbicos sobre la cara interior de la
hélice la cual interactúa directamente con el dominio D/D, y los residuos
Introducción General 46
hidrofílicos sobre la superficie exterior (Figura 11 B y C). Esto genera una
superficie de unión de alta afinidad que encaja dentro del surco hidrofóbico
formado los dominios D/D de las subunidades R. Cualquier mutación que
perturbe la conformación de esta hélice tiene efectos deletéreos sobre el
anclaje de la PKA [83,90].
Figura 11. Estructura del cristal del dímero del dominio D/D de RIIαααα en complejo con el
péptido D%AKAP2. Los dos monómeros de RIIα se muestran en verde y en amarillo. Los
distintos colores en el péptido D4AKAP2 representan la polaridad de los aminoácidos (azul:
hidrofóbicos, rojo: polar). (A) Vista de la parte superior del sitio de interacción con la AKAP. (B)
Vista desde uno de los lados mostrando la interacción de la cara no polar (azul) del péptido con
el surco hidrofóbico del sitio de interacción con las AKAPs [92].
La resolución del cristal de la hélice anfipática de la D4AKAP2 junto con el
dominio D/D de RIIα permitió conocer más en profundidad el mecanismo de
interacción y la especificidad de la unión entre estas proteínas. Un elemento
estable y otro dinámico, que se encuentran en el dominio D/D de la RII, crean
una superficie asimétrica para la hélice de la AKAP. La hélices I y I´
correspondientes a cada monómero de la R, se empaquetan de forma
Introducción General 47
antiparalela para formar el surco hidrofóbico (Figura 12A). Las cadenas
laterales del péptido D4AKAP2 complementan la superficie expuesta por RII
[93]. Se ha identificado por mutagénesis que las Ile5 y Leu21 de RII son
necesarias para la interacción con las AKAPs [94,95] (Figura 12C). Estos
residuos crean un bolsillo hidrofóbico bien definido.
Varios estudios han revelado las bases moleculares de la especificidad de
isoforma y han demostrado que existen diferencias en la distribución de cargas
en la superficie. Mientras que RIIα tiene una superficie de interacción
principalmente hidrofóbica, RIα posee residuos adicionales ácidos y básicos en
el sitio propuesto de interacción [26].
La subunidad RIα contiene un N4terminal más extendido formando una hélice
N1 adicional. Estudios de intercambio hidrógeno/deuterio sugieren que la hélice
N1 está involucrada en la unión entre RI y las AKAPs [25]. A partir de la
estructura cristalina del dominio D/D de RIα con el péptido D4AKAP2 se
confirmó la participación de las hélices N1 en la unión con la AKAP y además se
le asignó un rol a las cisteínas presentes en el extremo aminoterminal de RI,
las cuales aparentemente le confieren una estructura ordenada al extremo N4
terminal (Figura 13) [21].
La comparación de los complejos RIα/D4AKAP2 y RIIα/D4AKAP2 permitió
conocer los determinantes moleculares para la especificidad de las
subunidades R por las AKAPs. Se identificaron cuatro bolsillos hidrofóbicos en
RIα que interactúan con pares de aminoácidos hidrofóbicos de la hélice del
péptido D4AKAP2, mientras que RIIα presenta solo dos bolsillos hidrofóbicos
que interactúan con los residuos hidrofóbicos del péptido D4AKAP2 [21,93].
Se postula que las AKAPs que interactúan con RIα presentarían una secuencia
más larga en su dominio de interacción. Quizás esta sea la razón por la cual
solo unas pocas AKAPs hacen interacción exclusivamente con RIα. Además, la
presencia de los puentes disulfuros en RI le quitan flexibilidad al dímero y
restringen el acceso al sitio de unión de la AKAP [21].
Introducción General 48
Figura 12. Superficies hidrofóbicas complementarias sobre el dominio D/D de RIIαααα y el
péptido D%AKAP2. (A) El péptido D4AKAP2 se removió de la interface y se rotó 180º para
apreciar las superficies de interacción. Las líneas punteadas esquematizan los residuos del
péptido y del dominio D/D que se empaquetan en la interface hidrofóbica. (B) Interacciones
específicas de las cadenas laterales entre los residuos del dominio D/D y el péptido. (C) Los
residuos hidrofóbicos conservados del dominio D/D se encuentran en color rojo. Los residuos
esenciales para la dimerización se indican con un asterisco verde, y los residuos importantes
para la unión a las AKAPs, pero que no afectan la dimerización, se indican con un asterisco
rojo. Adaptado de [93].
Introducción General 49
Figura 13. Interacciones entre el dominio D/D de RIαααα y el péptido D%AKAP2. (A) Esquema
de las interacciones entre las cadenas laterales del péptido D4AKAP2 y los monómeros del
dominio D/D de RIα. La flechas sólidas y punteadas indican las interacciones hidrofóbicas y
polares respectivamente. Los bolsillos hidrofóbicos se encuentran indicados con recuadros
azules. (B) Estructura que muestra la interacción. Los distintos motivos estructurales se
encuentran coloreados como en (A). (C) Dominios estructurales de RIα. Los asteriscos verdes
y rojos indican los residuos críticos para la dimerización y el anclaje a las AKAPs,
respectivamente. Las cisteínas conservadas se resaltan en amarillo.
Introducción General 50
Las AKAPs de especificidad dual, que unen tanto RI como RII, poseen una
secuencia adicional fuera de la hélice anfipática, denominada región específica
para RI (RISR), originalmente identificada en la proteína ezrina [96]. La región
RISR está formada por 30 aminoácidos y contiene dos ����� de residuos
básicos (Figura 14 A). Mediante la metodología de�'�������� �� se determinó
que los residuos básicos en las posiciones 359, 360 y 381 son críticos para la
interacción con RI. A partir del alineamiento de las regiones de unión a RI de
distintas AKAPs duales y utilizando el algoritmo MEME se generó la secuencia
consenso Glu4Ser4Lys4Arg4Arg4Gln4Glu4Glu4Ala4Glu4Gln4Arg4Lys a la cual se la
denominó “péptido RISR”, y se comprobó que este péptido se une a RI. Es
importante notar que este péptido no contiene residuos hidrofóbicos. Por
ensayos de dicroísmo circular se determinó que RISR es capaz de adoptar una
configuración helicoidal. Utilizando mutantes de deleción amino terminales de
RI se demostró que el sitio de interacción con RISR se encuentra hacia el C4
terminal del dominio D/D, entre las hélices I y II (Figura 14 B) [96].
Figura 14. Dominios de unión a RI de las AKAPs duales. (A) Alineamiento de las AKAPs
duales Ezrina, D4AKAP1, Merlin, PAP7 y D4AKAP2. El recuadro verde indica el dominio
conservado de hélice anfipática; el recuadro rojo muestra el dominio de unión a RI. Residuos
conservados: Azul: básicos; Rojo: ácidos; Gris: hidrofóbicos. (B) Se muestra el sitio de unión a
RISR en RIα. Adaptado de [96].
Introducción General 51
Un trabajo posterior describió una nueva proteína AKAP con especificidad dual,
el ��� � ��� .������ '�� � �*�� ��� �� 17A (SFRS17A), el que presenta un
dominio RISR en el cual también los residuos básicos son claves para la
interacción con RI [97].
El rol funcional de las proteínas de anclaje de la PKA es inferido
frecuentemente a través del uso de péptidos inhibidores. Péptidos derivados de
la hélice anfipática de la AKAP4Lbc, también conocida como ����������� ��56
(Ht31), fueron inicialmente caracterizados por su habilidad para romper la
interacción PKA4AKAP [98,99] a través de diferentes abordajes bioquímicos y
fisiológicos. Mediante el análisis de ����� de péptidos en los cuales los
residuos en el sitio de unión a R se reemplazaban por otros de diferentes
características junto con subsecuentes estudios bioinformáticos permitieron el
desarrollo del péptido AKAP4 �� � ���(AKAP4+�), además del péptido permeable
para la membrana celular TAT4AKAP4+�, el cual es selectivo para RII sobre RI
(Figura 15) [100,101]. Estudios complementarios llevaron al desarrollo de dos
péptidos selectivos para RI, el péptido PV438 y el péptido RIAD con mucha más
selectividad para RI que para RII [1024104]. Estudios de estos péptidos a través
de análisis de alta resolución de estructura han mostrado cuáles son los
residuos en la hélice anfipática que hacen contacto con el dímero de R (Figura
15A) [93,104]. Modificaciones de las secuencias de estos péptidos permitieron
generar otros más específicos como el RIAD4RISR [96] y el SuperAKAP4+�
[105], ambos utilizados en ensayos ��� ��.
Introducción General 52
Figura 15. Aspectos estructurales de la interacción de los péptidos derivados de AKAPs
con las subunidades regulatorias de la PKA. (A) Vista detallada de las interacciones entre
AKAP4+� y RII. Los residuos importantes para las interacciones AKAP4RII se encuentran
numerados; los correspondientes sitios de interacción con RII se encuentran resaltados. (B)
Alineamiento de secuencia del dominio de unión a RII de los péptidos de algunas AKAPs [49].�
�
�
�
1�'��� �� ���������������2�� � ���0���
�
Debido a las variadas funciones de PKA, es concordante que las AKAPs estén
presentes en cualquier tejido y tipo celular y que ocupen la mayoría de las
organelas como la membrana plasmática, citoesqueleto, mitocondria, aparato
de Golgi, núcleo o estructuras vesiculares [50] (Apéndice A.1).
No todas las AKAPs se unen al dominio D/D vía una hélice anfipática. Esas
AKAPs no canónicas incluyen a la pericentrina, cuyo dominio de unión a PKA
es largo (100 aminoácidos), no forma una α hélice, y contiene una región rica
en leucinas que hace interacción con RII [106] (Apéndice A.2).
Solo se conocen unas pocas AKAPs no canónicas, probablemente porque en
las búsquedas se utiliza solo el dominio D/D y no la subunidad R entera [107], o
porque se consideran como falsos positivos porque su unión a PKA no
disminuye por la presencia de los péptidos disruptores [108]. Es probable
entonces que un número considerable de AKAPs no canónicas no hayan sido
aun identificadas.
Introducción General 53
En invertebrados se identificaron AKAPs en # ���� y en ) ���������. La
única AKAP conocida en # ���� es la AKAPCE [109,110]. La AKAPCE se une
a la RI humana pero no a la RII. # �����solo expresa una isoforma de la
subunidad regulatoria de PKA, RCE, la cual es homóloga a la RIα humana [109].
En ) �����������se han descripto varias AKAPs que son capaces de unir
tanto R de )����� �� como RII de humanos [111].
En #������������� ������ , un alga unicelular verde con dos flagelos, se ha
descripto que la proteína radial 3 (RSP3) tendría la función de AKAP. El anclaje
de la PKA al flagelo a través de SPR3 resulta necesario para el movimiento
flagelar [112,113].
El conocimiento de AKAPs en invertebrados es muy escaso, pero los ejemplos
encontrados muestran que el mecanismo de interacción, es decir la unión a
PKA, es necesario para que se produzcan determinados procesos.
�
!!5566������11!!������������ ��$$������
Objetivos Generales 55
OBJETIVOS GENERALES
La especificidad de la fosforilación, como hemos descripto en la Introducción,
se encuentra regulada a distintos niveles por dos factores importantes que son
en los cuales focalizamos nuestro estudio: la especificidad del sustrato blanco,
y la localización tanto de la quinasa como del sustrato.
La efectividad de la fosforilación de proteínas por las proteínas quinasas en
general, incluyendo a la PKA, depende de la estructura primaria del sustrato
alrededor del sitio consenso de fosforilación [13,14,114]. Los determinantes de
la especificidad de sustratos para la PKA de mamíferos han sido analizados en
profundidad, mientras que en otros organismos estos determinantes no se
encuentran ampliamente caracterizados. Si bien es aceptado que la secuencia
canónica de fosforilación para PKA es Arg4Arg4X4Ser, péptidos conteniendo
esa secuencia derivados de proteínas que son posibles sustrato no se
fosforilan de igual forma. Por lo tanto, uno de los objetivos de esta tesis fue
analizar los determinantes de la especificidad de sustrato, caracterizando los
residuos alrededor de la secuencia blanco consenso que tienen importancia en
el reconocimiento de una proteína como sustrato en el modelo ������������
��� �.
La PKA de � ��� �� está conformada por dos subunidades regulatorias
(Bcy1) y dos subunidades catalíticas, de las cuales existen tres isoformas
denominadas Tpk1, Tpk2 y Tpk3. Si bien se ha propuesto por años que las tres
isoformas poseen especificidad de sustrato común [57,66], cada Tpk presenta
funciones diferentes y también superpuestas en respuesta a la activación por
cAMP [115,116]. En un análisis global de fosforilación de proteínas en
levaduras se han identificado sustratos únicos para cada Tpk, y solo ocho
sustratos compartidos por las tres isoformas. Estos resultados indicarían que
las tres isoformas presentarían especificidad diferente de sustrato [117]. En
función de estos antecedentes, otro de los objetivos planteados en esta tesis
fue estudiar la selectividad y especificidad de secuencia de fosforilación de las
distintas isoformas de Tpk.
Objetivos Generales 56
Los sustratos participan en el mecanismo de activación de la holoenzima PKA,
pueden desplazar la subunidad R uniéndose a la subunidad C y por lo tanto
facilitar la disociación de la holoenzima, siendo en ese caso la PKA activada a
menores concentraciones de cAMP. Resultados previos de nuestro grupo de
investigación demuestran que en levaduras un sustrato de la PKA, como es la
proteína Piruvato quinasa 1 (Pyk1), es fosforilado menos eficientemente en
comparación con un péptido derivado que contenga el residuo fosforilable
Ser22, a pesar de presentar mayor afinidad [118]. Otro de nuestros objetivos
fue analizar si las proteínas sustrato y sus péptidos derivados, sensibilizan de
manera diferencial a la holoenzima PKA para su activación por cAMP.
Las proteínas de anclaje de PKA (AKAPs) son claves en la regulación
espacio4temporal de la PKA y permiten por lo tanto también regular la
especificidad en la vía de señalización cAMP4PKA. La mayoría de AKAPs
descriptas hasta el momento corresponden a eucariotas superiores tanto para
R tipo I como R tipo II o ambas; se han descripto una AKAP en # ���� y
una proteína que interactúa con la subunidad regulatoria de � ��� �
(Bcy1), Zds1, pero esta última no cumple con las características estructurales
de las AKAPs [119]. Nuestro siguiente objetivo fue identificar y caracterizar
proteínas que interactúen con la subunidad regulatoria de la PKA en levaduras,
determinar el dominio de Bcy1 involucrado en esta interacción y analizar
cuáles son los residuos en la secuencia de las proteínas interactoras
responsables del anclaje de Bcy1.
Determinar los mecanismos involucrados en la regulación espacial y temporal
de PKA, así como también determinar con exactitud la secuencia consenso
reconocida por la quinasa contribuirá a dilucidar los mecanismos que gobiernan
la vía de transducción de señales cAMP4PKA en levaduras.
�
�
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�
�
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--������ ����$$������77��--88��!!��!!����
Materiales y Métodos 58
1. Cepas utilizadas
%�%���4������������
�
Cepa Genotipo
KT 1115
S13-3A (133)
Mata leu2 ura3 his3 pep4�
Matα his3 leu2 ura3 trp1 ade8 tpk2::HIS3 tpk3::TRP1 bcy1::LEU2
Nth1-HA-His* KT1115 + pBG1805-NTH1-HA-His
Pyk1 –HA-His* KT1115 + pBG1805-PYK1-HA-His
Pyk2-HA-His*
JT20454(W)
KT1115 + pBG1805-PYK2-HA-His
MATa his3 leu2 ura3 trp1 tpk1::ade8 tpk2::HIS3 tpk3::TRP1 msn2::LEU2
msn4::TRP1 +pPYK101
033c TAP S288C (ATCC 201388)Mata his3�1 leu2�0 met15�0 ura3�0 BCY1-TAP
S330 W303; MATa tpk2::tpk1::KmR
S331 W303; MATa tpk2::tpk3::KmR
S332 W303; MATa tpk3::tpk1::KmR
S330 BCY1-TAP W303; MATa tpk2::tpk1::KmR BCY1TAP
S331 BCY1-TAP W303; MATa tpk2::tpk3::KmR BCY1TAP
S332 BCY1-TAP
1115-BCY1
1115-����N85BCY1
IRA2-HA
IRA2-TAP
PTP1-TAP
MYO2-HA-His*
HSP60-HA-His*
HSP60 wt
HSP60 ts
W303; MATa tpk2::tpk3::KmR BCY1TAP
KT1115 + YEp51-BCY1
KT1115 + YEp51-�85BCY1
MATa IRA2-3HA-G418 ura3-52 leu2�::hisG
S288C (ATCC 201388)MATa his3�1 leu2�0 met15�0 ura3�0 IRA2-TAP
S288C (ATCC 201388)MATa his3�1 leu2�0 met15�0 ura3�0 PTP1-TAP
KT1115 + pBG1805-MYO2-HA-His
KT1115 + pBG1805-HSP60-HA-His
ura3 leu2 his4 trp1 rme1 HMLa hsp60::TRP1 + pYCPlac60
ura3 leu2 his4 trp1 rme1 HMLa hsp60::TRP1 + pYCPlac MIF4
(*) La cepa KT1115 fue transformada con el plásmido BG1805 que contiene el cDNA de los
siguientes ORFs: YDR001C (Nth1), YAL038W (Pyk1), YOR347C (Pyk2), YOR226W (Myo2) o
YLR259C (Hsp60) bajo el promotor GAL1 (Open Biosystems).
%�%�%���������� .��������4���((%�5�7%����9��(('�5�7%��������((:�
5�7%�����;�4<%�5��%���9��4<'�5��%���9��4<(�5��%���=�
�
El fragmento que comprende la región c4terminal codificante de BCY1
fusionada al epítope TAP (Tandem Affinity Purification) y que incluye el
marcador de selección HIS3, fue amplificado por PCR utilizando como
templado DNA genómico de la cepa BCY14TAP. Los �� ���utilizados fueron:
.������2 5´AGACCATGATTATTTCGGTG3´ y 7��2
5´GTAGTAACAGCAGTAGTAGA3´. Las cepas S330, S331 y S332 fueron
Materiales y Métodos 59
transformadas por el método de acetato de litio con los productos de PCR y se
seleccionaron las células en medio mínimo sin histidina. La expresión de las
proteínas de fusión fue analizada por ����� ���� utilizando anticuerpos anti
TAP o anti Bcy1 (Figura 1).
�
�
Figura 1. Verificación de las construcciones Tpk1%
Bcy1TAP, Tpk2%BcyTAP y Tpk3%BcyTAP. Extractos
proteicos de las cepas transformantes S3304BCY1 TAP
(TPK3), S3314BCY1 TAP (TPK1) y S3324BCY1 TAP (TPK2)
fueron sembrados en un SDS4PAGE 10% y transferidos a
membrana de nitrocelulosa. La presencia de la proteína de
fusión Bcy14TAP (80KDa) fue verificada utilizando anticuerpos
anti TAP y anti Bcy1.
%�%�'���4���� ���4����������������� ��
�
La cepa +7'���' fue gentilmente cedida por el Dr Heitman del Department of
Molecular Genetics and Microbiology, Duke University Medical Center.
Las cepas ���89���������89���fueron gentilmente cedidas por�la Dra Sabine
Rospert del Institute of Biochemistry and Molecular Biology, University of
Freiburg.
%�'���4��������� ��
�
Materiales y Métodos 60
Las bacterias 4 ��� de la cepa BL214CodonPlus (DE3)4RIPL fueron
transformadas con los vectores recombinantes pRSETb 4 �N168BCY1 o
pRSETb 4 �N138BCY1. Esta cepa expresa los tRNAs de codones poco
frecuentes en 4 ��� y la polimerasa T7 bajo un promotor inducible por IPTG.
2. Plásmidos
�
�:�;4�<6�"#;62�La construcción de este plásmido recombinante fue realizada
por la Dra Vanina Zaremberg en el laboratorio de la Dra Moreno [120].
�:�;4�<6��=><"#;62�Se clonaron los fragmentos de ADN que codifican para
el polipéptido Bcy1 864416 en el plásmido YEp51 por amplificación del mismo
por PCR, digestión y ligación. Los �� �� utilizados fueron .������2
5`GTCCATGGGTATGTTCAAATCCCCCTT3`, 7��2
5`GTAAGCTTTTAATGTCTTGTAGGATCAT3`. Los sitios de restricción
utilizados fueron NcoI y HindIII.
�: �7�4��� �� �=68>"#;6� �� �7�4��� �� �=65>"#;62� Se clonaron los
fragmentos de DNA que codifican para los polipéptidos derivados de Bcy1 1394
416 y 1674416 en el plásmido pRSETb (Figura 2) por amplificación de los
mismos por PCR, digestión y ligación. Se utilizaron los sitios de restricción XhoI
y NdeI, lo cual permite eliminar el péptido de seis His de la construcción. Estas
construcciones fueron realizadas en el laboratorio de la Dra Silvia Moreno por
la Dra Jimena Rinaldi.
Materiales y Métodos 61
Figura 2. Mapa del vector pRSETb.
�
�:� �"�6>9<�=��6��'�� �� �"�6>9<��;/6��'�� �� �"�6>9<��;/���'�� ��
�"�6>9<��;-���'�� ����"�6>9<����89��'�� 2�El vector BG1805 (Figura
3) es un vector de 2M para levaduras. Los marcos abiertos de lectura de las
proteínas Nth1, Pyk1,Pyk2, Myo2 y Hsp60 se encuentran clonados río abajo
del promotor GAL1 inducible por galactosa. En el extremo C4terminal se
encuentra una etiqueta de fusión compuesta por: 6XHis, el epítope HA, el sitio
para la proteasa 3C y el dominio ZZ de la Proteína A derivado de
������������������ �
�
�
�
�
�
Materiales y Métodos 62
�
�
�
�
�
Figura 3. Mapa del vector BG1805 (OpenBiosystems).
:� ��;/6962� Este plásmido contiene el gen de la enzima piruvato quinasa 1
(PYK1) bajo el control de su propio promotor. Fue cedido por el Dr Thomas
Nowak del Department of Chemistry and Biochemistry, University of Notre
Dame.
3. Medios de cultivo
(�%��-� �������� ���4������������
�
El medio de levaduras fue preparado como se describe en la bibliografía [121].
Las cepas fueron crecidas en medio rico conteniendo 2% bactopeptona, 1%
extracto de levaduras y 2% galactosa (YPGal), o 2% glucosa (YPD), o 2%
rafinosa (YPR). El medio sintético (SD) contiene 0.67% de base nitrogenada
para levaduras sin aminoácidos, 2% glucosa más los aminoácidos necesarios
para completar los requerimientos auxotróficos y mantener la selección de los
plásmidos. El medio sólido contiene 2% de agar.
�
�
Materiales y Métodos 63
�
�
(�'��-� �������� ���4��������� ��
Los cultivos de bacterias fueron crecidos en medio Luria4Bertani (LB)
conteniendo 1% peptona, 0.5% extracto de levaduras y 0.5% NaCl.
4. Transformación de levaduras
Las células fueron transformadas por el método de acetato de litio [122].
5. Preparación de extractos crudos
Las células de levaduras fueron crecidas hasta una concentración 0.541.0x107
células/ml (fase exponencial de crecimiento) en medio apropiado. Las células
fueron lisadas por ruptura con perlas de vidrio a 4º C en buffer apropiado para
cada ensayo. El debris celular fue decantado por centrifugación por 5 min,
15000 x�� a 4º C; y el sobrenadante fue usado inmediatamente para los
ensayos en extractos crudos o para la subsecuente purificación parcial.
6. Expresión y purificación de proteínas
>�%���34� .����4�� 2 ��� .�������4���&�����<%�* 9���<'�* ������%�
* �
�
Para la expresión de las proteínas de fusión Pyk14His, Pyk24His y Nth14His, 25
ml de medio SD4URA, 2% rafinosa fue crecido toda la noche a 30ºC y luego fue
diluido en 200 ml de medio fresco. El cultivo fue crecido hasta una DO600nm=1.2
y luego se agregó 100ml de 3x YP, 6% galactosa a una concentración final de
1x YP, 2% galactosa. El cultivo se creció toda la noche a 30ºC y las células
fueron cosechadas por centrifugación. Los pellets fueron conservados a 470ºC
hasta el momento de ser utilizados. Para la purificación, las células fueron
Materiales y Métodos 64
resuspendidas en buffer conteniendo 50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, 0.05%
Tween 20, pH 8 y los extractos crudos fueron preparados. Se agregó al
extracto clarificado 50 Ml de resina Ni4NTA (Qiagen) y se incubó la mezcla toda
la noche a 4ºC con agitación. Luego, se lavó la resina con 50 mM NaH2PO4,
300 mM NaCl, 20 mM Imidazole, 0.05% Tween 20, pH 8. Las proteínas fueron
eluídas con buffer de elución conteniendo 50mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250
mM Imidazole, 0.05% Tween 20, pH 8.
>�'���34� .����4�� 2 ��� .�������4���&�����<%�
�
La proteína Pyk1 fue purificada de la cepa JT20454 que contiene el vector
pPYK101 (plásmido que contiene el cDNA de Pyk1 bajo su propio promotor).
La purificación fue realizada utilizando un método previamente descripto en la
literatura [123]. Esta cepa de levaduras sobreexpresa Pyk1 en presencia de 2%
glucosa en el medio de cultivo. La semipurificación incluyó un primer paso de
cromatografía de intercambio aniónico utilizando DEAE4celulosa, luego
cromatografía de intercambio catiónico empleando resina de fosfocelulosa. La
enzima semi4purificada se precipitó con sulfato de amonio 70% y los pellets
fueron conservados a 420ºC. Antes de ser utilizados, los pellets fueron
desalados por cromatografía en gel Sephadex G425.
>�(�� ��� 2 ��� .�� �� ��� 4���&��� 5��%� ����?� �� ������� �� ��� .��
�� ������ ����
�
Para la purificación de Bcy1 y sus mutantes de deleción se partió de células
que sobreexpresan estas proteínas bajo un promotor inducible. Bcy1 y
_N85Bcy1 fueron sobreexpresadas en levaduras y su inducción se realizó en
un medio conteniendo galactosa 2%, mientras que �N138Bcy1 y �N168Bcy1
fueron sobreexpresadas en bacterias y la inducción se realizó por agregado de
IPTG 1mM. Se lisaron las células en buffer de lisis (MES 20 mM pH 6.5, NaCl
100 mM, DTT 2 mM). Los extractos proteicos se precipitaron con 60% de
(NH4)2SO4. Los precipitados se resuspendieron en buffer de lisis y se incubaron
con la resina cAMP4agarosa a 4ºC por 2 h. El lavado se realizó con buffer de
lavado (buffer de lisis + NaCl 0,6 M). Se eluyó con buffer de elución (buffer de
Materiales y Métodos 65
lisis + cAMP 40mM pH 5,5). La purificación fue monitoreada por SDS4PAGE
teñido con #���� ����. La preparación fue cuantificada por Bradford. En la
Figura 4 se muestra un gel representativo de una purificación.
Figura 4. Purificaciones de las proteínas Bcy1 salvaje y
mutantes de deleción por cAMP agarosa. Eluídos de las
distintas purificaciones fueron sembrados en un �)���'�4 12%.
El gel fue teñido con #���� ����.
7. Ensayos de actividad PKA
@�%����4���� .�����+ ���
�
@�%�%����� 2 ��� .������������+ ����0��
�
La holoenzima PKA de levaduras (TPKs4BCY1) fue purificada a partir de la
cepa de levaduras que contiene el ORF de Bcy1 (YJL033W) fusionado al
epítope TAP (OpenBiosystems). Se utilizó el protocolo estándar de purificación
TAP [124] pero empleando solamente un paso de purificación por afinidad a la
resina de IgG Sepharosa 4B (ver Apéndice A.3). La holoenzima inmovilizada
fue utilizada como fuente de PKA para los ensayos de activación. Previo a
realizar los ensayos, las preparaciones de holoenzima fueron probadas para su
Materiales y Métodos 66
actividad quinasa utilizando distintas cantidades de fuente enzimática,
kemptido 300 MM como sustrato, en ausencia y presencia de cAMP.
@�%�'����� 2 ��� .����������� ���������&� �������������
�
Las enzimas TPK1 y TPK2 de levaduras fueron purificadas a partir de las
cepas TAP las cuales expresan una única isoforma de Tpk y el ORF de Bcy1
fusionado al epítope TAP. Las enzimas fueron purificadas utilizando la
metodología estándar TAP, pero realizando un único paso de purificación por
afinidad con la resina IgG Sepharose 4B. Luego de lavados exhaustivos, Tpk1
o Tpk2 fueron eluídas con 50 mM de cAMP. Esta fuente de enzima purificada
fue utilizada inmediatamente para los ensayos de fosforilación. Para los
experimentos en los cuales se utilizó la mezcla de las tres Tpks, la purificación
de las enzimas fue realizada utilizando el mismo protocolo pero la cepa
utilizada en ese caso fue la cepa BCY14TAP salvaje que expresa las tres
isoformas de las subunidades catalíticas. Previo a realizar los ensayos, las
preparaciones de enzima fueron probadas para su actividad quinasa utilizando
distintas cantidades de fuente enzimática y kemptido 300 MM como sustrato.
@�'���A������������� �����+ �A� ���4�������4�� 2 ��� ������4<%���
�4<'�
�
Las unidades enzimáticas para Tpk1 y Tpk2 fueron definidas como los pmoles
de enzima que transfieren 1 pmol de fosfato al sustrato kemptido/min, a 30ºC,
bajo las condiciones estándar del ensayo. La cantidad de cada enzima fue
estimada por comparación con curva de BSA en �)���'�4 y tinción por plata.
Luego de la purificación se verificó la identidad de cada enzima por
espectrometría de masa. Para ello, las bandas de proteínas del gel fueron
cortadas y sometidas a digestión tríptica. Cada digestión fue analizada
utilizando un espectrómetro MALDI4TOF4TOF, Ultraflex II (Bruker)
(CEQUIBIEM, FCEN). En la Figura 5 se muestra un gel representativo teñido
con plata.
El ������� �� �������� ����� de Tpk1 y Tpk2 fue calculado utilizando la
concentración de proteína estimada por SDS4PAGE y la actividad catalítica a
Materiales y Métodos 67
concentración saturante de kemptido (sustrato) de la misma muestra de
purificación.
Figura 5. Purificaciones TAP de las
subunidades catalíticas Tpk1 y Tpk2.
Una alícuota de la preparación
enzimática de Tpk1 o Tpk2 fue
sembrada en un �)���'�4 10% y
teñida con plata para la identificación
de las bandas por espectrometría de
masa.
@�(������������� � �����0�� ��� ����
�
La actividad PKA se determinó ensayando su actividad fosfotransferasa
utilizando como sustratos kemptido o los péptidos S22, Nth141, Nth142, Pyk1,
Pyk2, Ira24S1018 o Ira24S1725. El ensayo se inició mezclando diferentes
cantidades de subunidad catalítica (Tpk1 o Tpk2 solubles; o mezclas de Tpks)
con los sustratos correspondientes (proteína o péptidos), a las concentraciones
indicadas en cada experiment,o en buffer Tris4HCl 15 mM pH 7.5, EGTA 0.1
Materiales y Métodos 68
mM, EDTA 0.1 mM, 24mercaptoetanol 10 mM, MgCl2 15 mM, [γ432P]ATP (1000
dpm/pmol). Un ensayo estándar, por definición de unidad, contiene una
concentración saturante de kemptido de 300 MM. La mezcla de reacción fue
incubada durante 10 min a 30ºC. En las reacciones en las cuales se utilizaron
péptidos como sustrato, una alícuota de la reacción fue procesada de acuerdo
al método de fosfocelulosa (P81; Whatman) [125]. Cuando las proteínas
purificadas fueron utilizadas como sustrato, alícuotas de la mezcla de reacción
fueron analizadas a través de �)���'�4. La incorporación de fosfato al
sustrato fue determinada por análisis digital de imagen y posterior
cuantificación por densitometría, la cual se expresó como unidades arbitrarias.
Alternativamente, la cantidad de fosfato incorporado al sustrato se determinó
por contador de centelleo a partir de las bandas de proteínas fosforiladas
extraídas del gel �)���'�4. Los ensayos de actividad PKA mantuvieron una
relación lineal con el tiempo y con la concentración de enzima. La actividad
PKA se expresó como pmol de fosfato incorporado al sustrato/min a 30ºC.
@�,������������� ��� .�����0�� ��� ����
�
Para los ensayos de activación de PKA, holoenzima purificada e inmovilizada
fue utilizada para determinar la actividad quinasa a distintas concentraciones
de cAMP. El ensayo se realizó como se indica en el ítem 7.3. Se calculó el
valor de A0.5 para el cAMP utilizando diferentes sustratos. Dos pruebas de
análisis estadístico se aplicaron para validar las curvas obtenidas. El �� de
normalidad de D´Agostino y Pearson, el cual indicó que las curvas no muestran
una desviación significativa del modelo. También se aplicó el programa ALLFIT,
el cual es utilizado para el análisis estadístico de familias de curvas de dosis4
respuesta sigmoideas y utiliza las ecuaciones logísticas de cuatro parámetros.
Todas las curvas presentaron una buena significancia estadística con un
p>0.05, indicando la calidad del ajuste de las mismas. La prueba F fue no
significativa entre los dos grupos de proteínas (Nth1 y Ser22 por un lado y
Pyk1, Pyk2 y kemptido por el otro) indicando con los datos comparten los dos
parámetros: IC50 y pendiente. Sin embargo, la diferencia fue significativa
cuando el análisis se realizó intergrupos.
Materiales y Métodos 69
8. ����� de péptidos
B�%�� ����������������4C4� ���4����������� �)��2&��
�
Los ����� de péptidos unidos a celulosa fueron preparados de manera
automática de acuerdo a los protocolos estándar de síntesis SPOT utilizando
un sintetizador SPOT (Abimed Analysentechnik Lagenfeld, Alemania) del
laboratorio de la Dra Susan Taylor del Departamento de Química y Bioquímica
de la Universidad de California en San Diego. Las membranas fueron
embebidas en etanol y luego se incubaron con buffer de fosforilación (Tris4Hcl
50 mM pH 7.4, 24mercaptoetanol 10 mM, EDTA 0.1 mM, EGTA 0.1 mM, NaCl
100 mM, MgCl2 15 mM) conteniendo BSA 0.2 mg/ml durante toda la noche a
temperatura ambiente. Posteriormente las membranas fueron incubadas a
30ºC durante 45 min con buffer de fosforilación conteniendo BSA 1 mg/ml,
NaCl 100 mM y ATP 100 MM. La reacción de fosforilación fue realizada en
buffer de fosforilación conteniendo BSA 0.2 mg/ml, ATP 100 MM, [γ432P]ATP
200 MCi y 150 pmol de subunidad Tpks durante 1 hora a 30ºC. Las membranas
fueron lavadas 10x15 min con NaCl 1M, 3x5 min con H2O, 3x15 min con H3PO4
5%, 3x5 min con H2O y 3x2 min con etanol. Las membranas fueron secadas y
sometidas a análisis de imagen digital (Bio4Imaging Analyzer as41800II e Image
Gauge 3.12, FUJIFILM).
B�'�� ����������������4C4� ���4��� ����������
�
Las membranas fueron embebidas en etanol y sonicadas por 20 minutos.
Luego fueron lavadas con buffer TBS pH 7.5, 3 veces durante 10 min. Las
membranas fueron bloqueadas durante toda la noche a 4ºC con solución de
bloqueo (BSA 5%, Tween 20 0.1% en buffer TBS, pH 7.5). Luego se agregó
Bcy1, �N85Bcy1, �N138Bcy1 o �N168Bcy1 purificadas en una concentración
final de 20 Mg/ml en solución de bloqueo. Se incubó 2 horas a temperatura
ambiente y posteriormente se realizaron 3 lavados con buffer TBS4T (TBS pH
7.5, Tween 20 0.1%).
Materiales y Métodos 70
El revelado del ����� se realizó con anticuerpo anti4subunidad regulatoria de
���������& �que cruza y reconoce específicamente a la subunidad regulatoria
de levaduras (Ver Capítulo II). El primer anticuerpo se incubó en una dilución
de 1:5000 durante 1.5 h a temperatura ambiente. Luego de los lavados con
buffer TBS4T, las membranas fueron incubadas con anticuerpo anti4conejo
1:5000 acoplado a peroxidasa por 1 h a temperatura ambiente. Después de la
incubación, las membranas fueron lavadas tres veces con buffer TBS4T y tres
veces con buffer TBS. Las membranas fueron incubadas con el reactivo
quimioluminiscente Luminol y las bandas inmunoreactivas fueron visualizadas y
analizadas por imagen digital (Bio4Imaging Analyzer Bas41800II and Image
Gauge 3.12, FUJIFILM).
Para el ensayo de competencia con el péptido Ht31, se agregó péptido Ht31 o
péptido �������en una concentración final de 100 MM en el mismo momento
en el cual se realizó la incubación con Bcy1 purificada.
9. Purificación e identificación de proteínas por espectrometría de masa
D�%����� 2 ��� ���
�
D�%�%����� 2 ��� ��������
�
100 ml de medio mínimo sin histidina fueron inoculados con las cepas BCY14
TAP o TPK14TAP e incubados a 30ºC toda la noche. Se realizó una dilución de
estos precultivos en 1 litro de medio YPD fresco y se incubaron toda la noche a
30ºC. El protocolo estándar de purificación TAP [124] fue empleado para
obtener los complejos proteicos. En el caso de la purificación de la cepa TPK14
TAP se realizaron lavados con NaCl 150 mM y cAMP 50 mM, y esta fracción
fue utilizada para la posterior identificación de proteínas por espectrometría de
masa. En la Figura 6 se esquematiza el protocolo de purificación utilizado para
cada una de las cepas.
Materiales y Métodos 71
Figura 6. Purificación TAP. Esquematización de los pasos utilizados para la
purificación de BCY14TAP y TPK14TAP y sus proteínas interactoras para posterior
identificación por espectrometría de masa.
D�%�'����� 2 ��� �����-���)������
�
��� ����&�� ?�� �� "#;6: 50 ml de medio mínimo sin leucina fueron
inoculados con la cepa 11154BCY1 e incubados toda la noche a 30ºC. Se
realizó una dilución del cultivo en 500 ml de medio YPGal fresco y se incubó
ON a 30ºC para permitir la sobreexpresión de BCY1.
���#@�������� ���������������� ����: 50 ml de medio YPD o YPGli fueron
inoculados con la cepa 1115 e incubados toda la noche a 30ºC. Se realizó una
dilución del cultivo en 500 ml de medio fresco (YPD o YPGli) y se incubó ON a
30ºC.
Extracto de la cepaTPK1%TAP Extracto de la cepa BCY1%TAP
Contaminantes
IgG beads
Epítope TAPProteínas asociadas
Clivaje por TEV proteasa
Calmodulina beads (Ca )2+
Elución en condiciones nativas (EGTA)
BCY
BCY
BCY
BCY
TPK
TPK
TPK
TPK
IgG beads
Lavados con NaCl y 0.5 M cAMP
BCY
BCY
BCY
BCY
TPK1
TPK 2/3
TPK1
TPK1
Calmodulina beads (Ca )2+
Materiales y Métodos 72
���#@�������$����� ���� �2�50 ml de medio YPD fueron inoculados con la
cepa 1115 e incubados toda la noche a 30ºC. Se realizó una dilución del cultivo
en 500 ml de medio fresco y se incubó 7 días a 30ºC.
En todos los casos las células fueron cosechadas por centrifugación y el pellet
fue resuspendido en buffer de lisis (NaH2PO44H2O 10 mM, Na2HPO4 15 mM,
NP440 0.1%, NaCl 0.5 mM, EDTA 2 mM, pH 7.2) e inhibidores de proteasas y
los extractos crudos fueron preparados. La mitad del clarificado fue sembrado
en 50 Ml de resina cAMP agarosa, mientras que la otra mitad fue sembrada en
50 Ml de resina en presencia de 50 mM de cAMP (control de inespecífico). Se
incubó toda la noche a 4 ºC con agitación suave. Las resinas incubadas con los
extractos fueron centrifugadas a 100 x g 10 min. Se realizaron 10 lavados de 1
ml cada uno con buffer de lisis sin NaCl. Se agregó a la resina lavada 50 Ml de
buffer de siembra 4X. En la Figura 7 se esquematizan los pasos de la
purificación.
Extracto cepa 1115 BCY1
BCY
TPK
CAMP%agarosa+CAMP %CAMP
ContaminantesBCY
Figura 7. Purificación por cAMP agarosa. Esquematización de
los pasos utilizados para la purificación de Bcy1 y sus proteínas
interactoras.
Materiales y Métodos 73
D�'������ 2 ��� .����4���&���4���4�������&��������
�
Las purificaciones BCY14TAP, TPK14TAP y BCY1 fueron sembradas en un
�)�� �'�4 10%. El gel fue teñido #���� � ��� coloidal, desteñido, y las
bandas fueron cortadas del gel. En el caso de la purificación por cAMP agarosa
las bandas seleccionadas fueron aquellas que disminuían o no se encontraban
en el control con cAMP 50 mM. Las bandas seleccionadas fueron cortadas del
gel y sometidas a digestión tríptica. Cada digestión fue analizada utilizando un
espectrómetro MALDI4TOF4TOF, Ultraflex II (Bruker) (CEQUIBIEM, FCEN,
UBA). En el Capítulo II y en el Apéndice A.3 se encuentran las imágenes
correspondientes a los �)���'�4 teñidos con #���� � ��� coloidal y la
lista de proteínas identificadas por los distintos métodos de purificación,
respectivamente.
��
�
10. Ultracentrifugación en gradiente de sacarosa
Los gradientes de sacarosa se utilizaron con fines analíticos para estimar el
coeficiente de sedimentación la subunidad R salvaje y de la mutante
�N85BCY1. En todos los casos el gradiente fue lineal de sacarosa 5420% (p/v)
en buffer de lisis, con un volumen final de 4,2 ml. El volumen de la muestra que
se cargó sobre el gradiente fue de 504150 al y la masa de proteína total fue de
entre 50 y 100 ag. Con el fin de calibrar el gradiente para estimar los
coeficientes de sedimentación, se incluyó la proteína estándar (3,5S)
peroxidasa (SIGMA). La centrifugación se realizó en una ultracentrífuga
Beckmann SW50 a 35.000 r.p.m. por 15 horas a 4ºC en rotor SW55Ti. Se
colectaron 30 fracciones de 200 al cada una desde el fondo del tubo.
4����������& ����
Se agregaron al gradiente 10 ag de peroxidasa (SIGMA). Se mezclaron 500 al
de solución A (0,5% (v/v) H2O2 en10 mM Tris4HCl pH 7.0), 10 al de solución B
(punta de espátula de ortodianisidina en 1 ml de metanol) y 10 al de cada
fracción del gradiente. En pocos minutos se desarrolla un color naranja en
aquellas fracciones en las cuales está presente la enzima. La fracción con
Materiales y Métodos 74
mayor actividad peroxidasa corresponde a aquella donde se observe coloración
más intensa.
4�������� ��������#�
Esta proteína es de color rojo. Se agregan al gradiente 25 ag de citocromo C.
Se determina la fracción con mayor cantidad citocromo C, sembrando unos 20
al en una membrana de nitrocelulosa y observando a ojo la intensidad del color
de la muestra en la membrana.
11. Pull down ��� ����
500 ml de medio rico (YPD o YPGal) fueron inoculados con las cepas IRA24
TAP, PTP14TAP, MYO24HA o HSP604HA. Los cultivos fueron crecidos a 30 ºC
toda la noche, excepto para el caso de la cepa IRA24TAP, el cual fue crecida
hasta una DO600nm de 0.8. Los extractos crudos de las diferentes cepas fueron
realizados como se describe en 5; las células fueron lisadas en buffer
conteniendo Tris4HCl 50mM pH 7, EDTA 5mM, EGTA 3mM, 24mercapto4etanol
10mM, β4glicerolfosfato 5mM, NaCl 100 mM, NP440 0.1%, excepto para IRA24
TAP en donde se utilizó el mismo buffer pero conteniendo CHAPS 0.3% en
reemplazo de NP440 y SDS.
250 ml de medio YPGal fueron inoculados con la cepa 11154BCY1, el cultivo se
creció toda la noche a 30ºC. Las células fueron cosechadas y el pellet fue
resuspendido en buffer de lisis (MES 20 mM pH 6.5, NaCl 100 mM, DTT 2 mM,
coctel de inhibidores de proteasas) y se preparó el extracto crudo como se
detalló anteriormente. El clarificado fue sembrado en 50 Ml de resina cAMP4
agarosa y fue incubado 2 h a 4ºC. La resina se lavó con buffer de lavado A
(buffer de lisis + 700 mM NaCl). Se agregó extracto crudo de las cepas IRA24
TAP, PTP14TAP, MYO24HA o HSP604HA. Se incubó 2 h a 4ºC y se realizaron
lavados con buffer de lavado B (Tris4HCl 50mM pH 7, EDTA 5mM, EGTA 3mM,
24mercapto4etanol 10mM, β4glicerolfosfato 5mM, NaCl 150 mM, NP440 0.2%,
SDS 0.3%). Se agregó a la resina 50 Ml de buffer de siembra 4x y se hirvieron
las muestras. El control se realizó sembrando la misma masa de extracto
proteico en 50 Ml de cAMP4agarosa en presencia de cAMP 40 mM y se
Materiales y Métodos 75
realizaron los mismos procedimientos descriptos para el ensayo de ���������
Las muestras fueron sembradas en �)���'�4 10% (para visualizar Bcy1,
Ptp14TAP, y Hsp604HA) y en �)���'�4 6% (para visualizar Ira24TAP y Myo24
HA). Los geles se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y las proteínas
fueron visualizadas por ��������� �
12. Inmunoprecipitación ��� ���
�
100 ml de medio YPD fueron inoculados con la cepa IRA24HA y el cultivo fue
crecido a 30ºC hasta alcanzar una DO600nm de 0.8. El extracto crudo fue
preparado como se detalla en el punto 5 utilizando buffer de lisis conteniendo
NaH2PO44H2O 10 mM, Na2HPO4 15 mM, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, CHAPS
0.3% e inhibidores de proteasas. Al extracto clarificado se le agregó anticuerpo
anti4HA y se incubó 1 h a 4ºC. Luego, 15 Ml de proteína A/G agarosa se agregó
a la mezcla y se incubó 4 h a 4ºC. La resina fue lavada con buffer IPP150 (Tris4
HCl 25 mM pH 8, NaCl 150 mM, NP440 0.1%) y con buffer TBS. Como control
se incubó el extracto clarificado con anticuerpo inespecífico. Se agregó a la
resina 50 Ml de buffer de siembra 4x y las muestras fueron sembradas en �)��
�'�4� 10% (para visualizar Bcy1) y en �)���'�4 6% (para visualizar Ira24
HA). Los geles se transfirieron a membrana de nitrocelulosa y las proteínas
fueron visualizadas por ���������.
13. Fraccionamiento subcelular
500 ml de medio YPD fueron inoculados con la cepa IRA24HA y el cultivo fue
crecido a 30ºC hasta alcanzar una DO600nm de 0.8. Las células fueron
cosechadas por centrifugación y el pellet fue resuspendido en buffer de lisis
conteniendo Tris4HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, CHAPS 0.3%
e inhibidores de proteasas. Las células fueron lisadas por ruptura mecánica
utilizando perlas de vidrio y vortex. El lisado fue centrifugado a 300xg 10 min a
4ºC generándose las fracciones de pellet (P300) y sobrenadante (S300). El
S300 fue centrifugado a 100,000xg 60 min a 4ºC, obteniéndose el pellet
Materiales y Métodos 76
(P100,000) y el sobrenadante (S100,000) correspondiente. El S100,000 fue
concentrado por precipitación con ácido tricloroacético 25%; este precipitado, el
P300, y el P100,00 fueron resuspendidos en 150 Ml urea 8M y SDS 5% y
fueron calentados a 65ºC por 10 min. En el P300 se espera que esté
enriquecido en proteínas integrales de membrana, el P100,000 en proteínas
asociadas a membranas, y el S100,000 en proteínas citosólicas.
14. Preparación de fracción mitocondrial cruda
500 ml de medio YPGal fueron inoculados con un precultivo de la cepa HSP604
HA4His y se incubó el cultivo a 30ºC hasta alcanzar una DO600nm 0.7. Los
cultivos fueron sometidos o no a estrés térmico incubándolos a 37ºC o 30ºC por
2 horas respectivamente. EL cultivo se centrifugó a 3000 xg 5 min para
cosechar las células y el pellet celular se lavó con H2O destilada. Las células se
resuspendieron en 2ml/g en buffer DTT (Tris4HCl 100 mM pH 9.4, DTT 10 mM)
y se incubaron a 30ºC 20 min con agitación suave. Se realizó un lavado con
buffer zymolyasa (sorbitol 1.2 M, fosfato de potasio 20 mM pH 7.4). Se
incubaron las células a 30ºC durante 45 min con 5 mg/g de zymolyasa 20T en
7 ml/g de buffer zymolyasa. Posteriormente se realizó un lavado con buffer de
homogenización (sorbitol 0.6 M, Tris4HCl 10 mM pH7.4, EDTA 1 mM, PMSF
1mM, BSA 0.2%) y luego se homogeneizó por 15 golpes en pistón en 6,5 ml/g
de buffer de homogeneización. El homogenato se diluyó con 1 volumen de
buffer de homogeneización y se centrifugó a 1500 xg 5 min a 4ºC obteniéndose
el S y P 1500. El S1500 se centrifugó a 3000 xg 5min a 4ºC y se obtuvieron el
S y P3000. El S3000 se centrifugó a 12000 xg 15 min a 4ºC. El pellet obtenido
que contiene la fracción mitocondrial cruda (Mit (pellet)) se lavó con buffer SEM
(sacarosa 250 mM, EDTA 1mM, Mops 10 mM pH 7.2) y se resuspendió en el
mismo buffer. Las fracciones correspondientes al homogenato, S1500, S3000 y
Mit(sbn) se precipitaron con ácido tricloroacético 25%; estos pellet y los P1500,
y P3000 fueron resuspendidos en urea 8M y SDS 5% y fueron calentados a
65ºC 10 min.
Materiales y Métodos 77
15. Ensayo de estrés térmico
250 ml de medio mínimo sin leucina fueron inoculados con la cepa HSP60 wt o
HSP60 ts e incubados a 24ºC con agitación toda la noche. A la mañana
siguiente el cultivo fue transferido a un baño a 37ºC para provocar el shock
térmico y se recolectaron alícuotas de 50 ml a los siguientes tiempos: 0, 15, 30
y 60 minutos. Las células se cosecharon por centrifugación y se realizaron los
extractos crudos como se describió anteriormente.
Para la determinación de la activad quinasa, se tomaron 2,5, 5 y 10 Mg de
extracto crudo y se utilizó kemptido como sustrato (300 MM). Los ensayos se
realizaron en ausencia o presencia de cAMP y se procedió como se indica en
el punto 7.3.
16�� Determinación de concentración de proteínas
La concentración de proteínas fue determinada utilizando el método de
Bradford con BSA como proteína estándar.
17� SDS%PAGE
Muestras de preparaciones proteicas fueron separadas por �)���'�4 10%T o
6%T [126].
18��E���������
Muestras de preparaciones proteicas (indicado en cada figura) fueron
separadas por �)���'�4, transferidas a membranas de nitrocelulosa usando
Tris 25 mM, Glicina 192 mM, metanol 20% (v/v), durante 90 min a 90 volts. Las
membranas fueron bloqueadas con 5% de leche descremada, 0.05% de Tween
20 en buffer TBS, incubada con los siguientes anticuerpos: anti4BCY1 (Santa
Cruz Biotechnology) 1/200; anti4TPK1 (Santa Cruz Biotechnology) 1/200; anti4
Materiales y Métodos 78
Pyk1 (Santa Cruz Biotechnology) 1/500; anti Pma1/2 (Santa Cruz
Biotechnology) 1/1000; anti4HA (Santa Cruz Biotechnology) 1/1000; anti4TAP
(Open Biosystems) 1/1000. Las membranas fueron lavadas e incubadas con un
anticuerpo anti4cabra, anti4conejo o anti ratón conjugado con peroxidasa (Santa
Cruz Biotechnology) por 1 h a temperatura ambiente. Después de la
incubación, las membranas fueron lavadas dos veces con solución de bloqueo
y dos veces con 0.05% de Tween 20 en TBS. Las membranas fueron
incubadas con el reactivo quimioluminiscente Luminol y las bandas
inmunoreactivas fueron visualizadas y analizadas por imagen digital (Bio4
Imaging Analyzer Bas41800II and Image Gauge 3.12 FUJIFLM).
19. Tinción con ����� �5���coloidal
Luego de realizar el �)���'�4, se procedió a la tinción del gel con azul de
#���� � coloidal. En primer lugar, se realizan tres incubaciones de 30
minutos con Solución I (Etanol 30%, ácido fosfórico 2%) en agitación
moderada. Posteriormente, se realizan 3 lavados de 20 minutos con Solución II
(ácido fosfórico 2%), y luego se incuba por 30 minutos en Solución III (Etanol
18%, ácido fosfórico 2%, Sulfato de amonio 15 %). Finalmente, se agregan a
25 ml de la solución III, 1 ml de Coomassie G250 2%. Se deja 24 horas en
agitación moderada. Por último, se realizan una serie de lavados con agua
milliQ, con el objeto de eliminar el fondo�de colorante en el gel.
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CCAAPPÍÍTTUULLOO II SSuussttrraattooss ddee llaa PPrrootteeíínnaa qquuiinnaassaa AA ddee ������������������������������ ����yy ssuu ppaarrttiicciippaacciióónn eenn llaa aaccttiivvaacciióónn ddee llaa hhoollooeennzziimmaa �
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Capítulo I 80
I.1% INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Las proteínas quinasas son responsables de la regulación de una amplia
variedad de procesos fisiológicos a través de la fosforilación de sus proteínas
blanco. La fosforilación de las proteínas sustrato por PKA es crítica para la
regulación de diversos procesos celulares como ser metabolismo, expresión
génica, flujo iónico y muerte celular [1]. Para asegurar la fidelidad de la
respuesta, la PKA debe ser específica y actuar solamente sobre un grupo
definido de blancos celulares.
La especificidad de la fosforilación se encuentra determinada por al menos dos
factores importantes: la especificidad del péptido, y la localización del sustrato y
la quinasa. La efectividad de la fosforilación por las proteínas quinasas en
general, incluyendo a la PKA, dependería de la estructura primaria del sustrato
alrededor del sitio consenso de fosforilación. Para definir las secuencias
consenso de fosforilación de la PKA de mamíferos se han utilizado péptidos
sintéticos que permitieron definir como sitios de fosforilación canónicos para
esta enzima a las secuencias Arg4Arg4X4Ser/Thr, Arg/Lys4X4X4Ser/Thr, y
Arg/Lys4X4Ser/Thr [13,14,114,127,128]. Sin embrago, análisis estadísticos
realizados en base a proteínas fosforiladas por PKA, han demostrado que
muchos de los sitios de fosforilación presentes en las proteínas sustrato no
corresponden exactamente a la secuencia consenso definida [80]. Estudios
enfocados en caracterizar cuáles son los determinantes involucrados en el
reconocimiento del sitio de fosforilación, han permitido definir características del
sitio blanco de fosforilación. La secuencia Arg4Arg4X4Ser (RRXS) resultó la
secuencia consenso más representada, correspondiendo aproximadamente a
la mitad de todos los sitios descriptos. Se define dentro de la secuencia
consenso como posición P0 a la serina fosforilable. Aunque las argininas
parecen ser los residuos básicos preferidos en las posiciones P42 y P43, uno de
cada seis sitios contiene al menos una lisina en alguna de estas posiciones. La
serina en P0 es mejor aceptor de fosfato que la treonina [129]. Se demostró
también que existe una leve preferencia por el residuo arginina en las
posiciones P44 a P47, y una alta frecuencia de ocurrencia de residuos
hidrofóbicos como fenilalanina, isoleucina, leucina o valina en la posición P+1
[79]. Finalmente en posición P41 es más probable la presencia de residuos
Capítulo I 81
pequeños, como glicina o prolina. Mientras que los determinantes de
especificidad de sustratos para PKA en mamíferos han sido analizados en
profundidad, no ocurre lo mismo para las quinasas A de otros organismos. A
partir de la secuencia de fosforilación del activador transcripcional ADR1 de�� �
��� �, se estableció la importancia de los residuos presentes en el extremo
amino terminal y C4terminal hasta la posición +4 del sitio fosfoaceptor. Los
residuos presentes en esas dos regiones son compartidos con los sustratos de
la PKA de mamíferos [64].
La PKA de � � ��� � está formada por una isoforma de la subunidad
regulatoria Bcy1 y tres isoformas de la subunidad catalítica, Tpk1, Tpk2 y Tpk3.
En este modelo se han descripto completamente unos pocos sustratos para
esta quinasa. Si bien mediante abordajes proteómicos el número de posibles
sustratos ha aumentado considerablemente, no se han confirmado las
proteínas candidatas como sustrato de PKA ni se han identificado sus
secuencias blanco de fosforilación [117,130,131].
Las tres subunidades catalíticas de levaduras tendrían funciones celulares
distintivas y también superpuestas entre ellas. Análisis proteómicos clasificaron
sustratos específicos de cada quinasa, siendo unos pocos de estos
reconocidos por las tres o por dos de las isoformas. Estos resultados sugieren
que cada isoforma de la quinasa tendría una especificidad única de sustrato
[131].
Resultados previos de nuestro laboratorio demuestran que la Piruvato quinasa
1 (Pyk1) es sustrato de la PKA de � ���� �. Se determinó que la proteína
entera, a pesar de presentar mayor afinidad, es menos eficiente como sustrato,
en comparación con un péptido derivado que contiene el residuo blanco
fosforilable Ser22 [118]. Estos resultados indican que la habilidad de la quinasa
para fosforilar una proteína en un sitio específico está influenciada por el
contexto estructural del sustrato.
Como hemos mencionado en la Introducción General, actualmente se postula
que el cAMP no logra la disociación completa de la holoenzima PKA y que los
sustratos intervienen en la activación de la enzima [45,1324134].
El entendimiento del rol biológico de la PKA de � ��� �� requiere la
caracterización completa de la enzima y de sus blancos celulares para poder
Capítulo I 82
avanzar en la descripción y definición de la especificidad de la transducción de
la señal cAMP4PKA.
El objetivo específico de esta parte de la tesis fue evaluar las características de
las secuencias que rodean los sitios de fosforilación en los sustratos de PKA de
levaduras, analizar la selectividad y actividad catalítica de dos de las isoformas
de Tpk, y finalmente evaluar la participación de los sustratos en la activación de
la holoenzima de ��������������� �
Capítulo I 83
I.2% RESULTADOS Y DISCUSIÓN
I.2.1. Los péptidos derivados de las proteínas Nth1, Pyk1 y Pyk2 son
fosforilados por Tpk1 y Tpk2
En base a los resultados de un análisis global de fosforilación de proteínas de
levaduras �� � ��� que demostró que las tres isoformas de Tpk presentan
selectividad diferencial por los sustratos [117], se decidió evaluar cuáles son las
diferencias en las secuencias blanco de los sustratos que determinan la
especificidad de cada isoforma. Para esto ensayamos el comportamiento
cinético de péptidos derivados de tres proteínas: Pyk1 (piruvato quinasa 1),
Pyk2 (piruvato quinasa 2) y Nth1 (trehalasa neutra 1) identificadas como
sustratos fisiológicos de la PKA de levaduras [118,1354137]. Tanto Nth1 como
Pyk1 han sido descriptas como sustratos selectivos de Tpk1 en el análisis
global de fosforilación de proteínas de levaduras.
Como primer paso, corroboramos que estas tres proteínas son fosofriladas ��
� ��� utilizando como fuente enzimática Tpks purificadas (las tres isoformas) y
como sustrato las proteínas recombinantes Nth14His, Pyk14His y Pyk24His.
Para poder utilizar como fuente enzimática las subunidades catalíticas de
levaduras purificadas, se puso a punto un método de purificación que es una
adaptación de la metodología de purificación TAP (������'$$ � ������ $ ��� ��,
ver Apéndice A.3.), partiendo de una cepa que expresa la subunidad
regulatoria como proteína de fusión al epítope TAP (Bcy14TAP) (Ver Materiales
y Métodos).
Como se puede ver en la Figura I.1 las proteínas Pyk1, Pyk2 y Nth1 fueron
fosforiladas por preparación de Tpks. El aumento en el grado de fosforilación
fue correlativo con la cantidad de sustrato.
Capítulo I 84
Figura I.1. Fosforilación de las proteínas Pyk1, Pyk2 y Nth1 por la PKA de levaduras.
Diferentes cantidades de las proteínas recombinantes Pyk14His, Pyk24His y Nth14His fueron
incubadas con preparación de Tpks purificada en presencia de [γ32P] ATP. Las calles 4, 5 y 9
corresponden a las cantidades indicadas de proteína incubadas en ausencia de enzima. Las
muestras fosforiladas fueron analizadas por SDS4PAGE e imagen digital.
A continuación, se diseñaron péptidos para la caracterización de los
determinantes del sitio de fosforilación. Para realizar el diseño de los péptidos
derivados de las proteínas Pyk1, Pyk2 y Nth1, hemos seleccionado las
secuencias aminoacídicas comprendidas entre las posiciones P46 y P+4 que
rodean al sitio de fosforilación P0, ya que se ha descripto que estos residuos
influyen sobre la interacción directa con el sitio catalítico de la quinasa
[129,138].
Para el diseño de los péptidos se tuvo en cuenta que:
• Las proteínas Pyk1 y Pyk2 presentan un único motivo RRXS en su
secuencia primaria.
• Nuestro grupo de trabajo ha demostrado previamente que Pyk1 es
sustrato de Tpk1 y que el residuo Ser22 es el principal sitio de
fosforilación para PKA [118].
• La secuencia que rodea al residuo Ser22 en Pyk1 se encuentra
conservada en la isoforma de levaduras Pyk2 en el residuo Ser24,
aunque difiere en los residuos amino terminales del RRXS.
• La proteína Pyk2 es fosforilada ��� ��� por Tpk1 con una constante de
especificidad mayor que la que presenta Pyk1 [135].
• La secuencia aminoacídica de Nth1 muestra tres sitios de fosforilación
potenciales: Ser20, Ser21 y Ser83, los cuales se encuentran incluidos en
un motivo consenso de fosforilación para PKA [137].
Capítulo I 85
• Resultados genéticos han correlacionado la fosforilación de estas tres
serinas con la activación de la trehalasa por la PKA [137].
• Un análisis global del fosfoproteoma �� � �� de levaduras detectó
péptidos conteniendo la serina fosforilable en estas tres posiciones para
Nth1 [131].
En la Tabla I.1 se encuentran las secuencias de los péptidos utilizados para los
ensayos cinéticos que se describen a continuación.
Tabla I.1. Péptidos derivados de las proteínas sustrato. Secuencia de los
péptidos derivados de cada proteína: Pyk1 y Ser22 de piruvato quinasa 1;
Pyk2 de piruvato quinasa 2; y Nth41/Nth142 de la trehalasa neutra. En negrita
se indica la secuencia consenso RRXS que incluye la serina fosforilable; los
superíndices indican la posición del correspondiente residuo en la secuencia
primaria completa de la proteína.
Las isoformas Tpk1 y Tpk2 o la mezcla de Tpks purificadas se obtuvieron a
partir de extractos proteicos de las cepas TPK14BCY1TAP, TPK24BCY1TAP o
BCY14TAP, respectivamente. Las cepas TPK14BCY1TAP y TPK24BCY1TAP
expresan solo la subunidad Tpk1 o Tpk2 respectivamente, ya que presentan
delecionados los genes que codifican para las otras dos isoformas. Las
unidades enzimáticas utilizadas en cada ensayo se calcularon según lo
descripto en Materiales y Métodos. La purificación de la isoforma Tpk3 a partir
de la cepa TPK34BCY1TAP (que solo expresa la isoforma Tpk3) no resultó
exitosa, a pesar de utilizar grandes volúmenes de cultivo para su purificación y
Péptido Secuencia
Pyk1 SDLRRTS24IIGTI
Ser22 LRRTS22IIGTI
Pyk2 QQLRRTS24IIGTI
Nth141 GRQRRLS20SLSEF
Nth142 QQTRRGS83EDDTY
Kemptido LRRASLG
Capítulo I 86
de medir actividad quinasa en la fracción teóricamente purificada con diferentes
sustratos y distintas concentraciones de sustrato y/o ATP. Consideramos que la
dificultad en la purificación de Tpk3 se debe a que es la isoforma que presenta
menores niveles de expresión (ver más adelante en este mismo ítem y
sección).
Para evaluar los parámetros cinéticos de cada isoforma se ensayó la enzima
purificada con diferentes concentraciones de péptidos sustrato en presencia de
[γ432P] ATP y se determinaron los valores de /���/��� y /���que se encuentran
resumidos en la Tabla I.2. En la Figuras I.2 se muestran los gráficos
representativos correspondientes a un ensayo en el cual se utilizó como fuente
enzimática Tpk1 o Tpk2 purificada.
Tabla I.2. Parámetros cinéticos. Preparaciones purificadas de Tpk1 y fueron
utilizados para determinar los valores de /���/��� y /� para los distintos péptidos
sustratos.
Péptido 0��
�(PM)
0�����
(min%1)�
04��
(min%1.PM%1)
Tpk1 Tpk2 Tpk1 Tpk2 Tpk1 Tpk2
Nth141 95 ±±±± 5 111 ±±±± 8 479 ±±±± 10 439 ±±±± 12 5.0 3.9
Ser22 35 ±±±± 1 41 ±±±± 1 119 ±±±± 7 128 ±±±± 8 3.4 3
Kemptido 148 ±±±± 5 151 ±±±± 6 99 ±±±± 4 101 ±±±± 5 0.7 0.6
Pyk2 61 ±±±± 1 59 ±±±± 1 24 ±±±± 1 18 ±±±± 0.6 0.4 0.36
Pyk1 52 ±±±± 1 49 ±±±± 1 9 ±±±± 0.1 12 ±±±± 0.4 0.17 0.24
Nth142 >>>>300 >>>>300 nd nd % %
Capítulo I 87
Figura I.2. Cinética de fosofrilación ��� ��� de Tpk1 y Tpk2 purificadas. Ensayos cinéticos
representativos utilizando como fuente de enzima Tpk1 o Tpk2 purificadas y los distintos
péptidos sustrato.
Los valores de /� y /��� para Tpk1 y Tpk2 resultaron similares entre sí para
cada uno de los péptidos ensayados, indicando que no existen diferencias en
lo que respecta a la selectividad de sustrato de estas dos isoformas. El
������� ����������������(número de eventos catalíticos por unidad de tiempo
y por unidad de enzima) de Tpk1 y Tpk2 fue calculado utilizando la
concentración de proteína estimada por SDS4PAGE y la actividad catalítica a
concentración saturante de kemptido (sustrato) (ver detalles en Materiales y
Métodos). El valor obtenido fue de 3 seg41 para Tpk1 y Tpk2. Este valor es
aproximadamente 10 veces menor que el ������� � ������������� reportado
para la subunidad C de mamíferos, el cual se encuentra en el rango de 20
seg41 [139]. Resultados previos de nuestro laboratorio demostraron que tanto el
kemptido como péptidos derivados de la región IS de la subunidad regulatoria
de � ���� � y de����������& �presentan valores de /� mayores para las
quinasas de hongos y levaduras que para la subunidad catalítica de
Capítulo I 88
mamíferos, indicando que el ������� de las subunidades catalíticas de � �
���& �y � ��� � es menor que el de la C de mamíferos [140].
A pesar de que todos los sustratos incluían la secuencia consenso RRXS, la
/� para cada uno de ellos fue muy diferente. Las diferencias en la /�
resultan en diferencias tanto de /� como de /���. El péptido Nth142 no resultó
fosforilado a pesar de realizar los ensayos utilizando concentraciones de
sustrato mayores a 300 MM. El mejor sustrato fue el péptido Nth141, mientras
que el peor fue Pyk1. La diferencia entre ambos se debe principalmente a sus
valores de�/���. Mientras que las /��� entre ambos difieren entre 40 y 50 veces,
el valor de las /� difieren en 2 veces. La afinidad aparente de Pyk1 es mayor
que la de Nth141, pero su eficiencia de catálisis resultó mucho menor que la de
Nth141. Los péptidos Pyk1 y Pyk2 presentan un comportamiento diferente
como sustratos a pesar de que solo difieren en dos aminoácidos en las
posiciones P45 y P46. Si bien sus valores de /� no difieren demasiado, sí existe
una diferencia notable en los valores de /���, resultando la�/� para Pyk1 dos
veces menor que la de Pyk2. El péptido Ser22, el cual presenta dos
aminoácidos menos en el extremo amino terminal con respecto al péptido
Pyk1, resultó mejor sustrato que este último. En este caso, las diferencias están
dadas por los valores de las /� para cada péptido: el péptido Ser22 posee un
valor 10 veces mayor que Pyk1 para este parámetro. El kemptido, utilizado
como prototipo de péptido sustrato para PKA, presentó un rendimiento
intermedio, debido a su elevado valor de�/�
Estos resultados fueron inesperados, dado que ambas proteínas, Nth1 y Pyk1,
han sido descriptas como sustratos específicos de la isoforma Tpk1 [117].
Aunque la fosforilación de un péptido derivado de la secuencia de una proteína
no necesariamente implica que la proteína completa pueda ser fosforilada,
consideramos estos resultados como un primer indicio de que estas proteínas
podrían ser fosforiladas tanto por Tpk1 como por Tpk2.
Con el objetivo de analizar si las proteínas Nth1 y Pyk1 son también sustratos
de las isoformas Tpk1 y Tpk2 tal como sucede con los péptidos derivados de
ellas, se ensayó la fosforilación de ambas proteínas enteras con preparaciones
purificadas de cada isoforma. En la Figura I.3 puede observarse la fosforilación
de distintas concentraciones de Pyk1 y Nth1 cuando se utilizó iguales
cantidades de Tpk1 y Tpk2. Las pendientes de estas curvas, las cuales
Capítulo I 89
representan una aproximación de la /� para cada proteína, son muy similares
para ambos tipos de Tpk, indicando que ambas proteínas sustrato son
reconocidas de manera similar por cada una de las isoformas. Las pendientes
obtenidas para Nth1 resultaron mayores que las correspondientes a Pyk1,
indicando que la proteína Nth1 es mejor sustrato. Estos resultados concuerdan
con los obtenidos para los correspondientes péptidos derivados de las
proteínas.
Capítulo I 90
Figura I.3. Fosforilación de las proteínas Pyk1 y Nth1 con Tpk1 y Tpk2. Diferentes
cantidades de cada proteína fueron sometidas a fosforilación utilizando como fuente enzimática
Tpk1 o Tpk2 purificadas. Las muestras fosforiladas fueron analizadas por �)���'�4 y análisis
de imagen. La incorporación de fosfato en el sustrato fue determinada por análisis de imagen
digital y posterior cuantificación por densitometría expresada en unidades arbitrarias (UA). Los
gráficos mostrados corresponden al promedio de dos replicas y la imagen a un experimento
representativo.
Teniendo en cuenta nuestros resultados infructuosos para purificar Tpk3 y
considerando antecedentes reportados por Mazón����� [141] que demostraron
que una cepa que sólo contiene el gen TPK3 no presenta actividad de
fosforilación detectable, y que en esa misma cepa no se detecta mRNA para
esta isoforma, consideramos que los resultados indican que Tpk3 es la
isoforma que presenta los menores niveles de expresión. Para reforzar este
Capítulo I 91
concepto se analizó por espectrometría de masa una preparación de las
isoformas de Tpks obtenida de una cepa de levaduras salvaje utilizando el
mismo protocolo de purificación de los ensayos anteriores, y no se detectaron
péptidos derivados de Tpk3. Por lo tanto, predijimos y luego confirmamos que
una mezcla de Tpks exhibiría los mismos parámetros cinéticos que una mezcla
que contenga solamente las isoformas Tpk1 o Tpk2. Las curvas de cinética
típicas se muestran en la Figura I.4 y los datos se encuentran resumidos en la
Tabla I.3. Estos resultados pueden ser interpretados como un indicio de que los
niveles de Tpk3 son muy bajos y que por lo tanto no contribuyen
significativamente al total de la actividad PKA; o si contribuyen, presenta los
mismos parámetros cinéticos que las otras dos isoformas. Los resultados
obtenidos con la mezcla de Tpks valida la utilización de esta mezcla como
fuente enzimática para los experimentos posteriores.
Capítulo I 92
Figura I.4. Cinética de fosofrilación �� � ��� de Tpks purificadas. Ensayos cinéticos
representativos utilizando como fuente de enzima mezcla de Tpks purificadas y los distintos
péptidos sustrato.
Capítulo I 93
Péptido 0� (PM) 0��� (min%1)
Nth141 127 ±±±± 12 425 ±±±± 10
Ser22 57 ±±±± 4 150 ±±±± 8
Kemptido 138 ±±±± 9 88 ±±±± 5
Pyk2 64 ±±±± 6 27 ±±±± 2
Pyk1 58 ±±±± 4 15 ±±±± 0.5
Nth142 >>>>300 nd
Tabla I.3. Parámetros cinéticos.
Preparaciones purificadas de mezcla de
Tpks fueron utilizadas para determinar los
valores de /�� Y� /��� para los distintos
péptidos sustratos.
Se han propuesto y demostrado diferentes roles fisiológicos para las isoformas
Tpk1, Tpk2 y Tpk3 de la PKA de levaduras [57,142]. Las cepas que carecen de
las tres isoformas no son viables; sin embargo aquellas que contienen alguna
de las tres Tpks son capaces de propagarse, indicando que cada una es
genéticamente redundante para el crecimiento celular, aunque presenten
algunas funciones específicas [57]. En un análisis global �� � ��� de
fosforilación de proteínas de levaduras se observó una diferencia entre los
sustratos fosforilados por Tpk1, Tpk2 y Tpk3 [117]. En ese trabajo los autores
indican que Tpk1, Tpk2 y Tpk3 reconocieron 256, 29 y 70 sustratos,
respectivamente. Sin embargo, solo 8 sustratos fueron reconocidos por las tres
isoformas y 39 por dos de las tres. La mayoría de las proteínas ensayadas
(87.7%) son reconocidas por solo una de las isoformas, concluyendo que cada
quinasa tiene una especificidad de sustrato única dependiendo de la estructura
primaria de la proteína que rodea al sitio de fosforilación. Desde que han sido
publicados, estos resultados han sido considerados como la base para indicar
que existe selectividad diferencial hacia el sustrato entre las tres Tpks. Sin
embargo nuestros resultados contradicen esta conclusión, al menos en lo que
concierne a las proteínas Nth1 y Pyk1, las cuales fueron descriptas como
sustratos de Tpk1 en ese trabajo.
Capítulo I 94
En esta parte de la tesis se estudió el comportamiento cinético de Tpk1 y Tpk2
hacia los sustratos fisiológicos Pyk1, Pyk2 y Nth1, tanto a nivel peptídico como
proteico. Para nuestra sorpresa, las isoformas no mostraron ninguna diferencia
en los parámetros cinéticos medidos, usando péptidos o proteínas como
sustratos. La /� para cada sustrato fue la misma tanto para Tpk1 como para
Tpk2. Es importante destacar que el valor de /��� estimado tanto para Tpk1
como para Tpk2, utilizando kémptido como sustrato fue de 10 veces menor
que el valor para la C de mamíferos [139], indicando que la enzima de
levaduras tiene una velocidad de fosfotransferencia mucho más baja.
Todos los péptidos utilizados presentan la secuencia RRXS para fosforilación
por PKA, sin embargo sus /� fueron diferentes. La diferencia en estos
valores se debe principalmente a las diferencias en las /��� para cada péptido
sustrato, es decir que la velocidad de la transferencia del fosfato es distinta
para cada uno de ellos. Es interesante destacar que el péptido Nth142 no fue
fosforilado por la PKA. La naturaleza química de los residuos que rodean al
sitio de fosforilación debe ser importante para la estabilización del complejo
enzima4sustrato durante la fosfotransferencia. Por supuesto que no
descartamos que en el contexto natural de la secuencia aminoacídica haya
otros determinantes que participen en la reacción.
I.2.2. Residuos determinantes para el reconocimiento del sustrato por Tpk
Con el objetivo de evaluar cuáles son los determinantes involucrados en el
reconocimiento de un péptido por la PKA de levaduras utilizamos la
metodología de ����� de péptidos y como fuente enzimática la purificación de
Tpks. El primer paso fue determinar la razón por la cual el péptido Nth142 no
resultó fosforilado por Tpk a pesar de que presenta el motivo consenso RRXS.
La primera observación es que la secuencia de este péptido carece de un
residuo hidrofóbico voluminoso en P+1 y presenta en esta posición un residuo
ácido (Asp), así como también en las posiciones P+2 y P+3 (Glu). En la
estructura cristalina de la subunidad C de mamíferos con el PKI (péptido
inhibidor) se visualiza que en la región hacia el C4terminal del sustrato el
residuo en posición +1 se dispone en la proximidad de un bolsillo hidrofóbico
Capítulo I 95
formado por las cadenas laterales de la Leu198, Pro202 y Leu205 (Figura 3
Introducción General). Como consecuencia, un residuo hidrofóbico grande en
P+1 favorece la interacción con el bolsillo hidrofóbico [13,143,144]. Los
residuos indicados que forman el bolsillo hidrofóbico en la C de mamíferos se
encuentran conservados en todas las subunidades catalíticas de PKA desde
levaduras hasta humanos (Figura 4 Introducción). Además, los residuos de las
secuencias vecinas también están conservados, y estos residuos hacen
interacción con los sustratos de la PKA de mamíferos. Por lo tanto suponemos
que también deben cumplir la misma función en las PKA de otras taxas. La
Figura I.5A muestra que al reemplazar los residuos ácidos de las posiciones
P+1, P+2 o P+3 por alanina se generaron péptidos que fueron fosforilados
eficientemente (Nth142a y Nth142b). Estos resultados sugieren que la presencia
de un residuo ácido en una zona del péptido que debe interactuar con el bolsillo
hidrofóbico de la subunidad catalítica genera un importante impedimento
estérico.
El péptido Pyk1, que se fosforila eficientemente, presenta en posición P+1 y
P+2 residuos hidrofóbicos. Con el objetivo de evaluar la hipótesis que supone
que los residuos ácidos en las posiciones hacia el C terminal del P0 afectan el
reconocimiento del péptido por la subunidad catalítica, reemplazamos los
residuos en P+1, P+2 y P+3 del péptido Pyk1a por residuos ácidos (Pyk1b,
Pyk1c, Pyk1d). Puede observarse en la Figura I.6A que si bien un contexto de
residuos ácidos en esta región es desfavorable para la fosforilación, la inclusión
de un residuo de estas características en P+1 resulta clave para evitar el
reconocimiento del sustrato. El péptido Pyk1b, con tres residuos ácidos en
estas posiciones, resultó tan mal sustrato como el péptido Nth142. Los mismos
resultados fueron observados cuando la secuencia del péptido Nth141, el mejor
péptido sustrato de los analizados, fue mutado introduciendo residuos ácidos en
P+1, P+2 y P+3 (Nth141a, Nth141b, Nth141c). En la Figura I.5B se muestra que
un residuo ácido en P+1 o P+2 posee consecuencias inhibitorias más fuertes
que en P+3. Por lo tanto podemos concluir que la presencia de un residuo ácido
hacia el extremo C terminal de P0 es deletéreo para la fosforilación del
sustrato.
Las mutaciones por dos Ala en las posiciones P+1 y P+2 en el péptido Nth141
(Nth141g) no produce ningún efecto sobre la fosforilación. Esta observacion
Capítulo I 96
indica que la presencia de un residuo hidrofóbico voluminoso en P+1 no es tan
crítica para la PKA de levaduras, ya que la presencia de una alanina permite
que el péptido se comporte como un buen sustrato. Por otro lado a partir de
estos resultados también podemos concluir que la Ser fosforilable es aquella en
P0, ya que al reemplazar la Ser en P+1 por Ala los niveles de la fosforilación del
péptido Nth141g alcanzan los mismos valores que el péptido original.
Nuestro análisis indica que la Ser83 de Nth1 (posición P0 del péptido Nth142)
no es un buen sitio de fosforilación para la PKA de levaduras, sin embargo en el
estudio �� � ��� que analiza el fosfoproteoma de levaduras se identificó un
fosfopéptido que contiene la Ser83 de Nth1 [131]. Si bien esto parece
contradictorio, ese estudio no brinda información respecto a la quinasa
responsable de la fosforilación de los péptidos identificados. Como hemos
mencionado anteriormente, si bien no necesariamente deben cumplirse los
mismos requerimientos entre péptidos y proteínas enteras, antecedentes de
nuestro grupo y de otros grupos indican que la fosforilación ��� ��� de péptidos
derivados de las proteínas Pyk1 o colina quinasa correlaciona con el sitio
fosforilado ��� �� por la PKA [118,145].
La presencia de residuos cargados positivamente en las posiciones P42 y P43
hacia el extremo N terminal del sitio de fosforilación, han sido los determinantes
principales establecidos para la especificidad de PKA, siendo la arginina el
residuo preferido en estas posiciones [13]. Trabajos recientes basados en
métodos de predicción de sitios de fosforilación para PKA [143,146] confirmaron
y generalizaron esta afirmación estableciendo que los requerimientos de
residuos cargados positivos no solo son mayores para las posiciones P42 y P43
sino que pueden ser encontrados inclusive 6 a 8 residuos antes de la serina
fosforilable. La PKA de levaduras ha demostrado tener los mismos
requerimientos en relación a la presencia de residuos básicos en las
posiciones P42 y P43, siendo la arginina mejor que la lisina en P42 [64]. Otro
residuo clave es la serina en P0; el reemplazo de serina por threonina resulta
perjudicial para un sustrato de PKA de levaduras [64]. Nuestros resultados
confirman que estos requerimientos son también válidos. Cuando la serina en
P0 fue reemplazada por threonina en el péptido Pyk1, y cuando la secuencia
Arg4Arg en P42 y P43 fue reemplazada por Lys4Lys, Arg4Lys y Lys4Arg en el
péptido Nth141, se obtuvieron niveles muy bajos de fosforilación (Figura I.7).
Capítulo I 97
También hemos analizado la importancia de los residuos ubicados más allá de
P42 y P43 hacia el amino terminal de la posición P0. El péptido Nth142 presenta
residuos neutros (Gln) en las posiciones P45 y P46. De acuerdo con lo que se
ha observado para los sustratos de la PKA de mamíferos, la adición de una
arginina extra en estas posiciones (Nth142d, Nth142e, Nth142g) convierte al
péptido Nth142a en un mejor sustrato (Figura I.5A). Esto se confirma cuando la
arginina natural en P45 del péptido Nth141 fue reemplazada por un residuo
ácido (Nth141e o Nth141f) ya que los péptidos mostraron menor fosforilación
(Figura I.5B). Como se observa en la Figura I.6A, el péptido Pyk2 es mejor
sustrato que Pyk1 y Pyk1a, ya que no presenta en la posición P45 un residuo
ácido. El mismo razonamiento puede ser aplicado para el péptido Ser22, el cual
es un péptido más corto y una versión mejorada del péptido Pyk1 ya que no
posee el residuo P45 en su secuencia; consideramos que su mayor fosforilación
podría deberse a la falta de este residuo ácido que forma parte de su
secuencia natural (Figura I.6B). Por lo tanto, podemos concluir que la presencia
de residuos ácidos hacia el C terminal de P0 genera una secuencia con un
entorno poco favorable para la fosforilación, y que la inclusión de estos residuos
hacia el extremo N4terminal de la posición P0, también impide que el péptido
sea reconocido como sustrato. Por el contrario, la presencia de residuos
positivos hacia el extremo amino terminal, más allá de las posiciones P+2 y
P+3, favorece la fosforilación.
Capítulo I 98
Figura 5. Residuos determinantes para el reconocimiento de Nth1%1 y Nth1%2 por Tpk.
Los péptidos derivados de Nth141 y Nth142 sintetizados sobre membrana fueron incubados
con preparación purificada de Tpks como fuente enzimática, y sometidos a fosforilación como
se describe en la sección Materiales y Métodos. La incorporación de fosfato en los péptidos
expresada en unidades arbitrarias (UA), fue determinada por análisis de imagen digital y
posterior cuantificación densitométrica. Las imágenes de los ������ corresponden a un
experimento representativo. Las barras de lo gráficos de cuantificación corresponden a la
media de tres réplicas y están expresadas en forma relativa a la intensidad del ���
correspondiente a Nth141. Las imágenes de los ��� mostrados en A y B corresponden a
una misma membrana revelada por fosforilación pero los ��� fueron ensamblados para
facilitar la comparación.
Capítulo I 99
Figura I.6. Residuos determinantes para el reconocimiento de Pyk1 y Pyk2 por
Tpk. Los péptidos derivados de las proteínas Pyk1 y Pyk2 sintetizados sobre membrana
fueron incubados con preparación purificada de Tpks como fuente enzimática, y
sometidos a fosforilación como se describe en la sección Materiales y Métodos. La
incorporación de fosfato en los péptidos expresada en unidades arbitrarias (UA), fue
determinada por análisis de imagen digital y posterior cuantificación densitométrica. Las
imágenes de los ������corresponden a un experimento representativo. Las barras de lo
gráficos de cuantificación corresponden a la media de tres réplicas y están expresadas
en forma relativa a la intensidad del ��� correspondiente a Ser22. Las imágenes de los
��� mostrados en A y B corresponden a una misma membrana revelada por
fosforilación pero los ��� fueron ensamblados para facilitar la comparación.
Capítulo I 100
Figura I.7. Residuos determinantes para el reconocimiento de Pyk1 y
Nth1 por Tpk. Los péptidos derivados de las proteínas Pyk1 y Nth1
sintetizados sobre membrana fueron incubados con preparación purificada
de Tpks como fuente enzimática, y sometidos a fosforilación como se
describe en la sección Materiales y Métodos. La incorporación de fosfato en
los péptidos expresada en unidades arbitrarias (UA), fue determinada por
análisis de imagen digital y posterior cuantificación densitométrica. Las
imágenes de los ������corresponden a un experimento representativo. Las
barras de lo gráficos de cuantificación corresponden a la media de tres
réplicas y están expresadas en forma relativa a la intensidad del ���
correspondiente a Nth141. Las imágenes de los ��� corresponden a una
misma membrana revelada por fosforilación y los ��� fueron ensamblados
para facilitar la comparación.
Capítulo I 101
Hasta el momento, para los sustratos de la C de mamíferos no se ha
establecido una secuencia consenso exacta para el extremo C terminal de la
Ser/Thr fosforilable, con excepción de la posición P+1 en la cual es favorable un
residuo hidrofóbico voluminoso, y que en P+2 y P+3 hay una leve preferencia
por residuos pequeños y flexibles [146]. Con respecto a la posición P+4, no se
tenía información ya que esta posición estaba perdida en las estructuras
cristalinas resueltas de la subunidad C de mamíferos unida a PKI. En las
estructuras más recientes de holoenzimas de PKA cristalizadas conformadas
por un complejo entre la Cα de mamíferos y mutantes de deleción en el amino
terminal de las subunidades RI [22] y RII [23], puede observarse claramente
definida la interacción entre el sitio inhibitorio (IS) (incluyendo la posición P+4)
de la subunidad R con la superficie de la subunidad catalítica. Un alineamiento
de las subunidades R de mamíferos y hongos muestra que la secuencia IS se
encuentra extremadamente conservada (Figura I.8). Las subunidades R de
mamíferos presentan la secuencia RRA(S/A)V(C/S)AE, el residuo en la posición
P0 varía dependiendo si es RI, la cual posee la secuencia IS de pseudosustrato
con alanina en P0; o RII que posee una serina autofosforilable en esa posición.
La posición P+2 también varía dependiendo de la isoforma. En hongos, la
secuencia IS predominante es RRTSVS(G/A)E y particularmente en�
� ��� � la secuencia IS de Bcy1 es RRTSVSGE (Tesis Jimena Rinaldi).
Como puede observarse en el alineamiento de la Figura I.8, el residuo ácido en
P+4 se encuentra absolutamente conservado. En la estructura cristalina
formada por la subunidad C y la RI, el aminoácido que hace interacción con la
posición P+4 de la RI corresponde a una lisina (Lys83) en la subunidad C. Esta
lisina se encuentra en una región de la secuencia altamente conservada en
todas las C, inclusive en Tpk1, Tpk2 y Tpk3 (posiciones 127, 110 y 128
respectivamente). La IS de las subunidades R es uno de los puntos de
contacto de la R con la C que contribuye a la alta afinidad de interacción R4C en
la holoenzima. Es válido entonces asumir que los sustratos proteicos comparten
con la subunidad R los determinantes para la interacción con C en la zona
cercana que rodea al aminoácido fosforilable. Un residuo ácido en P+4, por lo
tanto, puede considerarse como favorable ya que está presente en todas las
subunidades R de hongos. El sustrato Nth141, el mejor de los péptidos
sustratos analizado en este trabajo, presenta un glutámico en P+4.
Capítulo I 102
Figura I.8. Alineamiento jerárquico de la región IS de las subunidades R de hongos y
mamíferos (Adaptado Tesis Jimena Rinaldi). Los residuos conservados se encuentran
coloreados. Se indican las posiciones P0 (flecha negra) y P+4 (flecha roja).
I.2.3. Participación de los péptidos sustratos en la activación de la
holoenzima
Por muchos años fue aceptado el concepto que establece que el cAMP activa a
la holoenzima PKA mediante la disociación de las subunidades R y C,
provocando la liberación de las subunidades catalíticas para fosforilar sus
correspondientes sustratos. Sin embargo, recientemente ha sido demostrado
que la adición de un exceso molar de cAMP causa la disociación parcial de la
holoenzima PKA tipo Iα, y sólo luego de la adición de un péptido sustrato junto
con el cAMP se logra la disociación total de la holoenzima. Los autores también
demuestran que el péptido sustrato juega un rol diferencial en la activación de
la holoenzima de tipo I versus la tipo II, ya que el sustrato puede aumentar la
disociación de la PKA tipo I a concentraciones de cAMP bajas y
fisiológicamente relevantes, pero no ejerce el mismo efecto sobre la interacción
de las subunidades de la quinasa tipo II [133,147]. Estas diferencias de
comportamiento frente al sustrato y al cAMP podrían explicar ciertas diferencias
Capítulo I 103
importantes entre las isoformas de PKA, como por ejemplo la localización
subcelular y los requerimientos de Mg2+ y ATP (ver Introducción General)
[45,133]. Nuestro grupo de trabajo ha demostrado que los sustratos peptídicos
están involucrados en la activación de la PKA en el hongo ���������& [134].
En base a estos antecedentes, nuestro siguiente objetivo fue evaluar si la
activación de la PKA de � � ��� �� por cAMP también se encuentra
influenciada por la presencia de sustratos peptídicos. Para esto, los péptidos
Pyk1, Pyk2, Nth141, Ser22 y Kemptido se utilizaron para medir la actividad
dependiente de cAMP de la holoenzima, en presencia de concentraciones
saturantes de cada uno de ellos, con el fin de evaluar si los péptidos pueden
sensibilizar a la PKA frente al cAMP de manera diferente dependiendo de su
secuencia. Para realizar estos experimentos utilizamos holoenzima de
levaduras purificada e inmovilizada, formada por Bcy1 y las tres isoformas de
Tpk. Esta fuente enzimática fue la mejor obtenida, en términos de grado de
purificación y cantidad de enzima. Para la realización de estos experimentos se
necesitó contar con una buena cantidad de enzima ya que previamente a cada
ensayo se requirió del análisis de la calidad enzimática. Para cada preparación
enzimática se realizaban curvas para determinar la dependencia de cAMP, la
/�, del kemptido y se determinaba la cantidad de enzima a utilizar para que
respondiera de forma proporcional a la concentración.� En la Figura I.9 se
observan las curvas de activación para los diferentes péptidos sustratos y en la
tabla insertada en la figura se resumen los valores de A0.5 para el cAMP en
cada situación.
Capítulo I 104
Figura I.9. Los sustratos peptídicos aumentan la activación por cAMP de la PKA de
levaduras. La holoenzima purificada (Tpks4Bcy1) fue incubada con concentraciones
crecientes de cAMP y con los sustratos peptídicos en concentraciones saturantes (3 veces el
valor de /�:. La curva de activación de PKA para cada sustrato se encuentra representada
relativa a la actividad de PKA con ese sustrato a 100 MM cAMP. Los datos de los gráficos y
los valores de A0.5 para cada péptido que se encuentran en la tabla corresponden a la media
± SD de n=4. El análisis estadístico de las curvas sigmoideas dosis respuesta fue realizado
utilizando el programa ALLFIT y el test de normalidad D`Agostino y Person. Todas las curvas
son significativas con un p>0.05.
Las curvas pueden ser comparadas entre sí dado que todos los péptidos fueron
utilizados a una concentración de 3 veces su /�, y para una mejor
interpretación las curvas fueron normalizadas relativas a su valor máximo
respectivo.
La primera observación es que la A0.5 para el cAMP varía en un rango que va
de 0.014 a 0.136 MM, casi un orden de diferencia. Si bien los valores de A0.5
difieren para cada uno de los péptidos, algunos valores se encuentran
aproximados entre ellos haciendo difícil establecer diferencias. Sin embargo, sí
se ve claramente que los péptidos pueden ser divididos en dos grupos de
acuerdo a la concentración de cAMP necesaria para alcanzar la mitad del valor
máximo de su fosforilación. Uno de los grupos se encuentra conformado por los
péptidos Ser22 y Nth141 con una A0.5 para el cAMP que varía en el rango de
0.01 a 0.03 MM; el otro grupo incluye a los péptidos Pyk1, Pyk2 y kemptido con
valores de A0.5 que se encuentran en el rango de 0.0840.14 MM.
Capítulo I 105
La curva de activación obtenida con el péptido Pyk1, si bien se separa un poco
de las curvas correspondientes a kemptido y Pyk2, presenta un valor de A0.5
similar a los obtenidos para estos dos péptidos. Por lo tanto consideramos
apropiado que estos tres péptidos conformen un solo grupo.
Las curvas de activación correspondientes a los péptidos Nth141 y Ser22 están
desplazadas hacia la izquierda, generando valores de A0.5 claramente
diferentes a los de las otras curvas.
A partir de estos resultados podemos concluir que los sustratos peptídicos
sensibilizan diferencialmente a la PKA para la activación por cAMP ya que se
requieren distintas concentraciones de nucleótido cíclico para lograr el 50% de
su fosforilación. Podemos inferir también que los mejores sustratos (aquellos
cuya /� es más alta) son aquellos que promueven la activación de PKA a
concentraciones más bajas de cAMP, y que por lo tanto presentan un efecto de
sensibilización mayor sobre la holoenzima. Todo esto indica que un péptido
sensibiliza a la holoenzima a la activación por cAMP de manera diferente según
su secuencia peptídica.
I.2.4. Las proteínas sustrato sensibilizan a la PKA hacia la activación por
cAMP
Los resultados obtenidos hasta el momento permiten puntualizar la
participación del sustrato peptídico en la activación de la holoenzima. Trabajos
previos de nuestro laboratorio han demostrado que la proteína Pyk1 es un
sustrato fisiológico de la PKA de � ���� � y que la fosforilación en el sitio
blanco Ser22 modula su actividad enzimática [118]. Consideramos entonces
que la proteína Pyk1 es un buen modelo de sustrato fisiológico para analizar
cómo es su participación en la sensibilización de la holoenzima de levaduras en
presencia de cAMP. Por lo tanto ensayamos la dependencia al cAMP de PKA
en presencia de dos concentraciones de proteína Pyk1 (Pyk1p) y distintas
concentraciones de cAMP. En paralelo, y para poder comparar y validar los
resultados, se realizaron ensayos utilizando el péptido sustrato Pyk1 con la
misma preparación de enzima. Las curvas de activación se ensayaron a dos
concentraciones diferentes de proteína. Al utilizar dos concentraciones distintas
Capítulo I 106
de sustrato proteico se esperaba poder visualizar un cambio en los valores de
A0.5 para el cAMP con cada una de ellas. Cuanto mayor es la concentración de
sustrato, menor debería ser la concentración de cAMP necesaria para lograr la
activación de la holoenzima. Esto es válido tanto para la proteína entera como
para el sustrato peptídico. El péptido Pyk1 se utilizó a concentraciones iguales
a los valores de /� y tres veces esa concentración. Las concentraciones de
Pyk1p fueron elegidas en función de la concentración máxima de proteína que
podía usarse por mezcla de reacción, ya que metodológicamente no era posible
utilizar concentraciones mayores. Por lo tanto, el punto de menor concentración
quedó determinado en función del punto mayor de concentración, y estas
concentraciones fueron 0.3 y 1.5&/�. En cuanto a las concentraciones de
péptido, no pudieron ser exactamente las mismas que la de la proteína ya que
el punto de menor concentración debía ser bastante mayor que 0.3&/�, dado
que a esas concentraciones el grado de fosforilación del péptido es dificultoso
de cuantificar por la poca incorporación de [γ32P] ATP. ��
En la Figura I.10 se muestra que la A0.5 para el cAMP en presencia de la
proteína Pyk1 cambia de acuerdo a la concentración de sustrato utilizada en el
ensayo: 0.10 MM para una concentración de Pyk1p igual a 1.5&/� y 0.24 MM
para una concentración de Pyk1p de 0.3 /�, mientras que en una reacción de
fosforilación en la cual el péptido Pyk1 fue utilizado a 1&/� y 3&/�, los valores
de A0.5 para el cAMP fueron de 0.43 y 0.1 MM respectivamente. Estos
resultados muestran que tanto la proteína como los sustratos peptídicos
sensibilizan a la PKA para la activación con cAMP y sugieren que la proteína es
un mejor activador, dado que para alcanzar una A0.5 de 0.1 MM se necesitó una
concentración de proteína igual a 1,5&/�, mientras que para alcanzar el
mismo valor de A0.5 utilizando el péptido sustrato fue necesario una
concentración dos veces más alta de este último.
Capítulo I 107
Figura I.10. Comparación entre proteína y péptido en el aumento de la activación por
cAMP de la PKA de levaduras. La fosforilación de la proteína Pyk1 (Pyk1p) por la holoenzima
de levaduras purificada (Tpks4Bcy1) fue determinada luego de incubar 10 min a 30ºC con 100
MM [γ32P] ATP. Las concentraciones de proteína ensayadas fueron de 1.5 x /� (13,5 MM) o 0.3
x /�� (2,7 MM). La fosforilación de Pyk1p fue visualizada por SDS4PAGE y análisis digital de
imagen. La cantidad de fosfato incorporado al sustrato fue determinada a partir de la banda
correspondiente a Pyk1p cortada del gel de poliacrilamida y cuantificando la radioactividad
incorporada por contador de centelleo. La misma preparación de enzima fue ensayada en
presencia de dos concentraciones de sustrato peptídico Pyk1: 1 x /� (50 MM) y 3 x /� (150
MM). Pyk1 proteina /�= 9 MM y Pyk1 péptido /�= 50 MM. Los valores de A0.5 que se muestran
en la tabla corresponden a la media +SD de n=3. El análisis estadístico de las curvas
sigmoideas dosis4respuesta fue realizado utilizando el programa ALLFIT y el test de normalidad
D`Agostino y Pearson. Todas las curvas son significativas con un p>0.05.
Capítulo I 108
Capítulo I 109
I.3% Conclusiones
La fosforilación de proteínas juega un rol fundamental en la ejecución y
regulación de muchas funciones celulares. Para lograr un entendimiento
completo sobre la regulación de los eventos de fosforilación, es imprescindible
dilucidar cómo estas enzimas reconocen los diferentes sustratos proteicos.
Las proteínas quinasas reconocen la secuencia que rodea al grupo
fosfoaceptor, mientras que las regiones más distantes que se encuentran en la
estructura proteica juegan un rol menos importante en la especificidad por el
sustrato.
Varios abordajes experimentales y aproximaciones computacionales han sido
utilizados para la búsqueda de sustratos y para la predicción de sitios
específicos de fosforilación para los sistemas de mamíferos [143,148] como así
también para levaduras [64,117,130,146], tanto para quinasas en general
[14,80,117,143] como para la PKA en particular [64,130,146,148]. Si bien estos
abordajes brindan mucha información acerca de cómo son las características
de los sitios consensos reconocidos por las proteínas quinasas, no siempre
estos sitios resultan ser blancos de la enzima. Nuestros resultados contribuyen
a la dinámica de la fosforilación en � � ��� ��� demostrando que la
naturaleza química de los residuos que rodean al sitio consenso es de suma
importancia para el reconocimiento por la quinasa.
A partir de nuestros resultados surge una nueva característica para la
predicción de sitios de fosforilación para la PKA de levaduras: un residuo ácido
en la posición P+4, tal como ocurre en la IS de la subunidad R, es beneficioso
para el reconocimiento del sustrato.
Mientras se estaba realizando la preparación del manuscrito correspondiente a
esta parte de la Tesis, se publicó un trabajo en el cual�utilizando un abordaje de
��� �� de péptidos se determinaron los motivos blanco de fosforilación
reconocidos por 61 de las 122 quinasas de�� ���� ��[149]. Sus resultados
indican que Tpk1, Tpk2 y Tpk3 presentan solo tres determinantes claros para la
identificación de la secuencia de fosforilación: Ser en P0, y Arg en P42 y P43.
Los resultados presentados en esta parte de la Tesis concuerdan con esos
resultados y avanzan un poco más en discriminar los residuos que favorecen o
Capítulo I 110
perjudican el reconocimiento del sustrato más allá de las posiciones P0, P42 y
P43.
Nuestros resultados no solamente indican que la selectividad de secuencia es
la misma tanto para Tpk1 como para Tpk2, sino que además la actividad
catalítica para ambas isoformas es idéntica.
Si bien nuestros resultados contribuyen a caracterizar la secuencia consenso
reconocida por la PKA de levaduras, debemos tener en cuenta que en el
reconocimiento del sustrato intervienen otros puntos de contacto alejados del
sitio fosfoaceptor. También es importante destacar que más allá de que la
secuencia consenso presente los determinantes adecuados para ser
reconocida por la quinasa, la accesibilidad del sitio fosfoaceptor en la estructura
de la proteína y la localización subcelular del sustrato son de suma importancia
para que ocurra la fosforilación.
La ubicación celular de la PKA y la existencia de microdominios de cAMP
proveen especificidad espacial y temporal sobre los efectos biológicos
controlados por el camino de cAMP4PKA. Se ha demostrado que las isoformas
de Tpk pueden presentar localización diferente en distintas condiciones
nutricionales de estrés [75]. Por lo tanto, aunque las isoformas Tpk1 y Tpk2
presenten la misma especificidad de sustrato ��� ��� no necesariamente van a
fosforilar los mismos sustratos �� � ��. Existen antecedentes de este tipo de
comportamiento para Tpk1 y Tpk2. Por ejemplo, se ha demostrado que ambas
isoformas de la PKA juegan roles diferentes durante la diferenciación
pseudohifal: Tpk2 activa la diferenciación pseudohifal mientras que Tpk1 y Tpk3
inhiben el crecimiento filamentoso [150,151]. Se ha demostrado que Tpk2 es la
quinasa responsable de la fosforilación de los factores transcripcionales Flo8 y
Sfl1, los cuales están involucrados en la diferenciación pseudohifal. Sin
embargo, estos reguladores transcripcionales pueden ser fosforilados �� � ���
tanto por Tpk1 como por Tpk2. Los autores proponen que la diferencia en la
localización intracelular del sustrato y la quinasa probablemente contribuya a la
función activadora de Tpk2 en la diferenciación pseudohifal comparada con el
rol inhibitorio de Tpk1 [59].
Hemos demostrado que tanto los péptidos como las proteínas sustrato
sensibilizan a la PKA para la activación con cAMP. Los ensayos realizados con
la proteína Pyk1 dan relevancia fisiológica a los resultados ya que las
Capítulo I 111
concentraciones a las cuales puede aumentar la disociación de la holoenzima
de levaduras (2.7 o 3.5 MM) están en el mismo orden que la concentración
fisiológica de la piruvato quinasa en la célula. Además estas concentraciones
de Pyk1 logran sensibilizar a la holoenzima en un rango de concentraciones
fisiológicas de cAMP (0.03 a 0.13 MM). De todas formas, es importante
destacar que si bien estamos hablando de concentraciones tanto de sustrato
como de cAMP del orden fisiológico, el interior celular se encuentra
compartimentalizado. Las concentraciones de cAMP, sustrato y PKA en cada
compartimento deben ser únicas y necesarias para lograr que la activación de
PKA sea un proceso regulable y específico. Se ha medido la actividad PKA ��
�� en células permeadas, preservando su localización intracelular, y se ha
comparado ese valor con la actividad PKA total medida en extractos crudos ��
� ���. Se pudo establecer que el valor que se puede medir �� �� es solo el 14
2% del valor de actividad total de quinasa presente en la célula [152]. Estos
datos sugieren que existe un alto efecto inhibitorio ejercido por la subunidad R
en el interior celular, y que la PKA no se encuentra libremente accesible a los
sustratos peptídicos utilizados en los ensayos de fosforilación �� ��.
Evidentemente, la concentración local del cAMP generado de manera
endógena así como la concentración de sustrato endógeno son los factores
claves involucrados en el mecanismo de activación de la holoenzima PKA. La
disponibilidad del sustrato, tanto como la sensibilización por el mismo sobre la
PKA, podrían ser considerados como un mecanismo de regulación fina sobre la
activación de la holoenzima.
Como se puntualizó anteriormente existe una correlación entre el
comportamiento de los péptidos como sensibilizadores de la activación por
cAMP y su /� para la subunidad C aislada. Esto sugiere que la
sensibilización ocurre por competencia entre el sustrato y la región IS de la
subunidad regulatoria. Sin embargo, resultados de nuestro laboratorio como de
otros grupos de investigación demuestran que existen interacciones a través de
diferentes dominios presentes en la subunidad C como en la subunidad R que
participan en la activación de PKA, además del IS [140,153].
La participación del sustrato en la activación de la holoenzima podría
establecer otro punto de regulación en la especificidad de la señal, haciendo
más sensible la respuesta celular frente al incremento de los niveles
Capítulo I 112
endógenos de cAMP. Es decir, que pequeños cambios en la concentración
intracelular de este segundo mensajero, podrían generar respuestas rápidas y
específicas.
En conclusión, la especificidad en el reconocimiento del sustrato por una
quinasa depende de una interrelación dinámica entre varios factores: la
secuencia de aminoácidos que rodean al residuo fosforilado, la localización del
sustrato y la quinasa y sus niveles de expresión, y la presencia o ausencia de
proteínas de anclaje que limitan las interacciones quinasa4sustrato. En
particular, la especificidad de sustrato de las isoformas Tpk1, Tpk2 y Tpk3 en
levaduras no parece depender de los determinantes de secuencia alrededor del
sitio de fosforilación ni en la diferencia en el /��� para cada isoforma. Por lo
tanto, se podría pensar que la especificidad de sustrato para cada una de estas
isoformas se encuentra mayormente determinada por su localización
subcelular, la cual puede variar dependiendo de las condiciones del medio.
�
CCAAPPÍÍTTUULLOO IIII IIddeennttiiffiiccaacciióónn yy ccaarraacctteerriizzaacciióónn ddee pprrootteeíínnaass qquuee iinntteerraaccttúúaann ccoonn llaa ssuubbuunniiddaadd rreegguullaattoorriiaa ddee llaa PPKKAA ddee ������������������������������ �� �
Capítulo II 114
II.1% INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Las proteínas de anclaje sirven como plataformas para la integración y
transmisión de múltiples señales. A través del anclaje de una enzima de
señalización a una localización subcelular específica, estas proteínas aseguran
que luego de la activación la enzima se encuentre cerca de sus blancos más
relevantes. Por lo tanto las proteínas de anclaje contribuyen a la resolución
espaciotemporal de la señalización intracelular y son el medio clave por el cual
un camino de señalización común puede servir para diferentes funciones [2].
Las proteínas de anclaje de la proteína quinasa A ('�� ��������� ������� ��
o� AKAPs) anclan a la PKA de mamíferos en localizaciones subcelulares
específicas [1,50]. Dado que la PKA es el primer efector del segundo
mensajero cAMP, las AKAPs juegan un rol importante en el direccionamiento y
regulación de los eventos de fosforilación mediados por la PKA. Las AKAPs
permiten formar complejos multi4proteicos que integran la señal del cAMP con
otros caminos y eventos de señalización [2].
Las AKAPs contienen una α4hélice anfipática de 14418 residuos a través de los
cuales se unen al dominio de dimerización amino terminal de las subunidades
regulatorias de la PKA [90,154,155]. La estructura en solución resuelta por
NMR del complejo AKAP4PKA reveló que la cara hidrofóbica de la hélice
anfipática de la AKAP se ubica en el paquete formado por las cuatro hélices de
los dímeros de subunidades R, de este modo permite una extensa interacción
hidrofóbica entre ambas proteínas [20]. El análisis de las hélices anfipáticas de
las AKAPs demostró que el lado hidrofóbico está conformado por residuos
hidrofóbicos pequeños y ramificados, como valina e isoleucina, que interactúan
con el dímero de RII. Si bien se considera que todas las interacciones AKAP4
PKA comparten estas características, existen unas pocas proteínas que anclan
a la PKA por medios alternativos. Por ejemplo, la cola citoplasmática de la α444
integrina, a la cual no se le predice una estructura de hélice anfipática, se une a
la subunidad regulatoria de tipo I sólo cuando ésta se encuentra formando
parte de la holoenzima. Esta interacción involucraría un dominio distinto al
dominio amino terminal de la subunidad regulatoria [156]. Por otro lado, la
proteína pericentrina que ancla a la PKA en el centrosoma se une a la quinasa
Capítulo II 115
a través de un dominio de 100 aminoácidos rico en leucinas el cual interactúa
con dominio amino terminal de RII [106].
Otro tipo de interacción entre la subunidad regulatoria de la PKA y proteínas
que no presenta la características de una proteína de anclaje es la interacción
que ocurre entre RI y la quinasa ribosomal S6 1 (RSK1). RSK1 es una
serina/treonina quinasa que comparte varios sustratos con la PKA. Se ha
demostrado que la forma inactiva (defosforilada) de RSK1 interactúa con la
subunidad RI, mientras que la forma activa (fosforilada) interactúa
preferentemente con la subunidad catalítica de la PKA [157]. El dominio
quinasa amino terminal (NTK) de RSK1 es necesario para la interacción con la
subunidad RI de PKA. Este dominio NTK compite con la subunidad catalítica de
la PKA por la unión a la región pseudosustrato presente sobre la RI [158]. La
unión de RSK1 en su forma activa a la subunidad catalítica incrementa la
interacción entre las subunidades catalíticas y regulatorias disminuyendo la
activación de la holoenzima por el cAMP. De manera contraria, la asociación
entre RSK1 en su forma inactiva con RI disminuye la interacción R4C,
facilitando la activación de la PKA [157].
Muchas de las proteínas que participan en los caminos de transducción de la
señal existen en diferentes conformaciones que corresponden a los estados
activos e inactivos de las mismas. La especificidad y la eficiencia de la
transducción de la señal depende tanto de la localización subcelular de las
moléculas como así también de la interacción proteína4proteína. Las
chaperonas moleculares pueden interactuar específicamente con proteínas en
distintas conformaciones y de este modo pueden interferir en la señalización
intracelular. Las chaperonas moleculares pueden actuar tanto en la maduración
como en la regulación de la transición entre el estado activo e inactivo de
distintas moléculas, como por ejemplo las proteínas quinasas [159].
Las chaperonas Hsp90, Hsp70, Hsp40, Cdc37 y Hop son las 5 proteínas
mínimas y suficientes para plegar proteínas quinasas ��� ���. El ciclo comienza
con el pegado de un polipéptido recientemente sintetizado o mal plegado a
Hsp70 y a Hsp40 [160]. El complejo ternario es estabilizado por la hidrólisis de
ATP por Hsp70, la cual es catalizada por Hsp40. Cdc37 también puede unirse
débilmente a las proteínas mal plegadas en este momento del ciclo. Este
Capítulo II 116
complejo temprano de 1� ������A9���B9�interactúa con Hsp90 a través de
la proteína Hop. En levaduras, el homólogo de Hop, Sti1, es necesario para
promover la unión estable no sólo de la quinasa sino también de Cdc37 a
Hsp90 [161].
Cdc37 y Hsp90 se unen directamente al dominio catalítico de las quinasas
[1624165]. Utilizando mutantes de deleción de quinasas se demostró que
ambas chaperonas se unen al lóbulo menor N4 terminal, aunque Hsp90
también interactúa con ciertas zonas del lóbulo C4terminal [163]. La unión de
Cdc37 a lóbulo N4terminal de las quinasas refleja una inestabilidad intrínseca
en esta parte del dominio catalítico. Se propone que la estabilidad del lóbulo N4
terminal es crucial para determinar si la quinasa debe interactuar con las
chaperonas de manera transciente durante el inicio del plegamiento o debe
hacerlo permanentemente [166]. Las quinasas que necesitan estar unidas a
chaperonas persistentemente pueden dividirse en dos grupos: el primer grupo
incluye a las quinasas que son inestables en su forma inactiva. Un ejemplo es
la quinasa Cdk4, la cual se une a Cdc37 en su conformación inactiva antes de
unirse a la ciclina D [167]. En el caso de Cdk2, la unión a la ciclina incrementa
el empaquetamiento de las interacciones del lóbulo N4terminal, por lo tanto
aumenta su estabilidad [168]. Es posible que Hsp90 y Cdc37 promuevan la
estabilización de la quinasa hasta que la ciclina se una a las Cdks y las activen.
El segundo grupo corresponde a las quinasas que requieren de las chaperonas
para el plegado de las cadenas nacientes y también durante el estado maduro.
A partir de abordajes de genética de levaduras se identificaron componentes
del sistema de chaperonas involucradas en el plegamiento de quinasas
[161,1694171] y se demostró que Cdc37 tiene un rol general en la biogénesis
del “quinoma” además de proteger a las cadenas nacientes de la degradación
durante o inmediatamente después de su traducción [172]. Mandal �� ��
proponen que Cdc37 funciona en distintos pasos de la biogénesis de las
quinasas, y estos pasos involucran proteger a las cadenas nacientes de una
rápida degradación y plegarlas adecuadamente junto con Hsp90 [172]. Los
dominios a los cuales se unen las chaperonas incluyen regiones que se
encuentran involucradas en la dinámica de la quinasa durante la activación y el
ciclo catalítico [8]. De hecho, la forma activa de la quinasa Akt co4
inmunoprecipita con Cdc37, sugiriendo que esta chaperona tiene otras
Capítulo II 117
funciones más allá de su participación en el plegado y en la estabilización
[173].
Además de prevenir la agregación, las chaperonas intervienen en el proceso de
degradación vía proteosoma de proteínas mal plegadas. Por ejemplo, la
inhibición de Hsp90 lleva a la ubiquitinación y agregación de muchas proteínas
quinasas y diversos receptores nucleares [174]. Distintos estudios genéticos y
bioquímicos han demostrado que Hsp70 es importante para la degradación de
proteínas citosólicas mal plegadas [1754177]. Hsp40 coopera con Hsp70 en
este proceso [178].
En levaduras la proteína Ydj1, una chaperona Hsp40 de tipo I, fue identificada
como una chaperona que protege una cohorte de quinasas similar a la que
protege Cdc37. Se propone que Ydj1 protege las cadenas nacientes durante o
inmediatamente después de la síntesis, en contraposición con lo que ya está
descripto en la literatura. Además se demostró que en células ��36� la
maduración de varias quinasas, así como también su actividad, se ve
disminuida con respecto a las células salvajes para Ydj1. Se demostró que
Ydj1 protege y controla el grado de maduración de Tpk2, y se observó que en
cepas ��36� los niveles proteicos y de actividad de esta quinasa disminuyen un
40% respecto a las células salvajes [179].
Ren �����han identificado mutaciones dentro del dominio de unión a proteínas
quinasas de Cdc37 que disminuyen el defecto en el crecimiento de una cepa
de � ���� � que contiene una mutación sensible a la temperatura en el gen
�����(Ts). Estas mutaciones sobre Cdc37 elevan la actividad PKA en esta cepa
termosensible [180].
En levaduras, la entrada principal hacia la mitocondria de las proteínas
codificadas por el genoma nuclear es la ���������� �� ������C��� �� ���
�������� &����� � ������� ��� o complejo TOM. Se demostró que la
fosforilación de este complejo por la quinasa CK2 promueve la biogénesis del
mismo, mientras que la fosforilación por PKA del receptor Tom70 inhibe la
importación de preproteínas mitocondriales [181]. Este receptor está
involucrado en la importación de distintos transportadores de metabolitos
mitocondriales.mLas preproteínas que son reconocidas por Tom70 se
encuentran formando un complejo con la chaperona Hsp70, la cual se une
específicamente a Tom70 [182]. Cuando las células se encuentran creciendo
Capítulo II 118
en presencia de glucosa, generan ATP a partir de la fermentación, y por lo
tanto, los requerimientos de la fosforilación oxidativa disminuyen, así como
también disminuye la importación mitocondrial. Por lo tanto en estas
condiciones PKA fosforila a Tom70 en la Ser174, y esta fosforilación impide la
interacción con la chaperona Hsp70 [181]. De esta manera la fosforilación de
Tom70 por PKA representa un mecanismo de regulación el cual puede actuar
rápidamente para ajustar la tasa de importación mitocondrial dependiendo de
las demandas metabólicas de la célula.
Los miembros de la familia Hsp60 se distinguen por sus características
estructurales: forman un homo4oligómero de 14 subunidades con 7 de ellas
dispuestas en forma de anillo [183,184]. Este sistema de doble anillo forma una
extensa cavidad interna que es capaz de acomodar proteínas de un peso
molecular mayor a 50 kDa. Las proteínas que ingresan en esta cavidad son
protegidas de las interacciones con otros componentes que las rodean. Los
sustratos predilectos por Hsp60 son intermediaros de plegado que no han
adquirido aun su estructura nativa. Los sustratos proteicos se unen a los
residuos de los aminoácidos hidrofóbicos que se encuentran expuestos sobre
la pared interna de la cavidad. La unión del ATP induce un cambio
conformacional importante en las subunidades lo cual genera que se abra la
cavidad y se reduzca la hidrofobicidad de su superficie interna. Entonces, las
proteínas son liberadas del complejo Hsp60 y pueden desarrollar nuevas
rondas de plegado.
Las células de levaduras que presentan delecionado el gen HSP60 son
inviables debido a los defectos severos en el plegado de las proteínas
mitocondriales. Las mutantes condicionales acumulan proteínas mal plegadas
en la matriz.
En levaduras aun no se han descripto proteínas de anclaje de la PKA. Hasta el
momento, el único antecedente es un trabajo en el cual se demuestra que la
proteína Zds1 regula la localización de Bcy1 dependiendo de la disponibilidad
de glucosa en el medio. También se demostró que la fosforilación de un �����
de serinas presente en el extremo amino terminal de Bcy1 favorece la
Capítulo II 119
interacción con Zds1 [72]. Sin embargo, el dominio de interacción de Zds1 no
ha sido definido ni caracterizado.
El objetivo específico de este capítulo es la identificación de proteínas que
interactúen con Bcy1 y determinar cuáles son los dominios y determinantes
claves involucrados en esta interacción. También nos propusimos evaluar la
relevancia fisiológica de la interacción de algunas de las proteínas identificadas
con la PKA de ��������������� � �
�
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�
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Capítulo II 120
II.2% RESULTADOS Y DISCUSIÓN
II.2.1. Identificación de proteínas que hacen interacción con Bcy1
Para la identificación de proteínas que interactúan con Bcy1 se emplearon
abordajes de proteómica y bioinformática. Para el abordaje proteómico se
realizaron tres estrategias de purificación. En primera instancia se realizaron
purificaciones a partir de la cepa BCY14TAP y TPK14TAP y se analizaron las
proteínas asociadas a la subunidad regulatoria. En el caso de la purificación
BCY14TAP también co4purifican las subunidades catalíticas y proteínas
asociadas. La purificación de la proteína Tpk14TAP se realizó a partir de una
cepa que solo expresa la isoforma Tpk1 ya que los otros dos genes se
encuentran delecionados. En este caso se analizaron las proteínas que eluían
con NaCl y cAMP, que al disociar la holoenzima liberan en el eluído la
subunidad regulatoria más las proteínas que forman complejos con la misma.
La segunda estrategia consistió en la purificación de Bcy1 y las proteínas
asociadas utilizando cromatografía de afinidad por cAMP4agarosa a partir de
una cepa (11154BCY1) que sobreexpresa Bcy1 bajo un promotor inducible por
galactosa (ver detalles en la Sección Materiales y Métodos). Como control, un
extracto proteico de esta cepa fue pre incubado con 50 mM de cAMP y luego
fue sembrado en la resina. En estas condiciones se espera que todas las
moléculas de Bcy1 se encuentren cargadas con cAMP y por lo tanto no puedan
unirse a la resina. Por lo tanto las proteínas que se unen en estas condiciones
son consideradas como unión inespecífica. Luego de la electroforesis y la
tinción con� #���� coloidal, se seleccionaron las bandas proteicas que
estaban presentes en la muestra y ausentes en el control. Las distintas
proteínas que co4purificaron con Bcy1 fueron identificadas por espectrometría
de masa. Del análisis de los espectros obtenidos surgieron como posibles
candidatos las proteínas Eno2 (cobertura 12%), Hsp60 (cobertura 14%), Cop1
(cobertura 15%), Myo2 (cobertura 7%) entre otras (Tabla II.1, Tabla II.2 y
Apéndice A.3).
La proteína Hsp60 es una chaperona esencial de mitocondria que promueve el
plegamiento de muchas proteínas importadas hacia la matriz mitocondrial.
También participa en el direccionamiento de varias proteínas hacia el espacio
Capítulo II 121
intermembrana de la mitocondria [1854187]. Sin embargo también se ha
reportado la presencia de Hsp60 en citoplasma [1884192]. Mediante el empleo
de abordajes de identificación de complejos proteicos por espectrometría de
masa, se describió que Hsp60 forma parte de complejos multiproteicos con
Tpk1, Tpk2 y Bcy1 [193]. En un estudio de análisis del fosfoproteoma de
levaduras se describió a Hsp60 como sustrato de Tpk1 [117].
En lo que respecta a la proteína Myo2, miosina V de levaduras involucrada en
el transporte basado en actina de diferentes cargos [194], se ha demostrado
que es fosforilada en forma dependiente de la vía cAMP4PKA en su dominio de
unión al cargo y que esa fosforilación regula su actividad ��� �� [195].
La proteína Cop1 es la subunidad alfa del complejo COPI de coatomeros, los
cuales rodean las vesículas de transporte derivadas del retículo
endoplasmático en el camino de secreción temprano [196]. Hasta el momento
no se han reportado datos que relacionen la proteína Cop1 con la vía de
señalización de la PKA.
La enolasa II (Eno2) es una fosfopiruvato hidratasa que cataliza la conversión
del 24fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato durante la glicólisis y la reacción inversa
durante la gluconeogénesis; su expresión es inducida en respuesta a glucosa
[197,198]. Se ha encontrado a la proteína Eno2 formando parte de complejos
proteicos con Tpk2 y Hsp60 [193]. Si bien la enolasa es una proteína presente
en alta concentración en la célula y podría suponerse que es un contaminante,
y no una proteína que se une específicamente a la subunidad regulatoria, ya
que en muchos abordajes proteómicos aparece como tal, no la descartamos
como posible interactora de Bcy1 ya que se reportó que interactúa con Tpk2.
La proteína Eno2 no presenta sitios consenso para la fosforilación por PKA.
En paralelo se realizó un búsqueda bioinformática en colaboración con el Dr.
William McLaughlin (Dept. of Chemistry and Biochemistry, UCSD). A partir del
alineamiento de las secuencias de 22 AKAPs humanas se generó una
secuencia consenso de interacción con RIIα. Dicha secuencia fue utilizada para
realizar un análisis �� � �� de los marcos abiertos de lectura disponibles en la
base de datos del genoma de levaduras (����������� Genome Database,
SGD). Los posibles falsos positivos se filtraron en base a los siguientes
criterios:
Capítulo II 122
• Baja probabilidad de que la secuencia adopte una conformación de alfa4
hélice [199].
• Que la secuencia derive de una región con baja conservación evolutiva
[200].
Así se identificaron dominios pertenecientes a algunas proteínas candidatas,
entre las cuales se encontraban con alto ����� aunque con probabilidad no
muy buena, algunas de las proteínas que también habían surgido del abordaje
proteómico; y con alto score y alta probabilidad dos nuevas proteínas, Ptp1 e
Ira2. La proteína Ptp1 es una fosfatasa específica para fosfotirosina que
defosforila una amplia variedad de sustratos �� � ��; presenta localización
citoplasmática y mitocondrial [201,202].
Las proteínas Ira1 e Ira2 pertenecen a la familia de las proteínas activadoras
de GTPasas (GAPs) [2034206]. Se ha demostrado que la proteína Ira1
interactúa con Cyr1, la adenilato ciclasa de levaduras, y podría promover su
localización en membrana [207]. Las proteínas Ira1/2 son proteínas grandes
(∼350 KDa) que se encuentran conservadas desde levaduras hasta humanos
[208,209]. Si bien no han sido descriptas como sustratos de PKA en levaduras,
sus secuencias aminoacídicas presentan dos sitios consenso de fosforilación
para PKA.
En la Tabla II.1 se resumen las proteínas que fueron identificadas por los
distintos abordajes y con las cuales avanzamos en nuestros estudios.
Capítulo II 123
Tabla II.1. Identificación de proteínas que interactúan con Bcy1. Se resumen
algunas de las proteínas identificadas por los distintos abordajes experimentales.
Dado que está descripto que Bcy1 cambia la localización con las condiciones
nutricionales del medio, nos resultó interesante evaluar si las proteínas que
interactúan con Bcy1 varían dependiendo de las condiciones nutricionales del
medio. Además, dado que la mayor cantidad de proteínas candidatas surgieron
del abordaje de purificación por sobreexpresión de Bcy1 y purificación por
cAMP agarosa, evaluamos la bondad de la purificación a partir de una cepa
que no sobreexpresa Bcy1. En este caso se mejora la especificidad
preincubando el extracto con cAMP y ATP. Para esto la cepa 1115 de
levaduras fue crecida en distintas condiciones: glucosa o glicerol como fuente
de carbono en fase exponencial y glucosa como fuente de carbono hasta fase
estacionaria. Las proteínas que purifican junto con Bcy1 se obtuvieron por
cAMP4agarosa (Figura II.1) y se identificaron por MALDI4TOF4TOF. En la Tabla
II.2, se resumen las proteínas identificadas para cada condición con sus
respectivos 4������������. Se puede observar que Bcy1 fue identificada en
las 4 condiciones ensayadas, con alto ����� �� 4����� Se encontraron
proteínas que co4purifican con Bcy1 sólo en una de las condiciones ensayadas,
y también algunas que se encuentran en más de una condición.
La proteína glucógeno fosforilasa, Gph1, fue identificada en células creciendo
en glucosa, glicerol y en fase estacionaria. Esta proteína interviene en la
degradación del glucógeno y su expresión aumenta en fase logarítmica tardía.
Su actividad está regulada a través de la fosforilación dependiente de la vía del
cAMP, y presenta sitios de fosforilación para PKA [2104212]. Sólo dos proteínas
Proteína identificada Método de identificación
4���� ��� $ ��� ?����/6��'��
��� $ ��� ?���'����������
��89� ��� $ ��� ?���'����������
Cop1 ��� $ ��� ?���'���������
����� ��� $ ��� ?���'����������
+���� '�D� � �� � ���
���6� '�D� � �� � ���
Capítulo II 124
se encontraron tanto en glucosa como en glicerol: el factor de elongación 2,
Eft2 [213], y la subunidad α de la fosfofructoquinasa 1 (Pfk1), enzima
involucrada en la glicólisis indispensable para el crecimiento anaeróbico [214].
Las proteínas Glc3 y Hsc82 se encontraron tanto en las purificaciones de
células crecidas en glicerol como en fase estacionaria. La proteína Glc3 es una
enzima encargada de la ramificación del glucógeno [215]. La proteína Hsc82 es
una chaperona citoplasmática perteneciente a la familia de las chaperonas
Hsp90 [216,217] y es fosforilada por PKA. De las 15 proteínas identificadas a
partir de la sobreexpresión de Bcy1, 9 de ellas se encontraron también en
condiciones de no sobreexpresión, entre ellas las proteínas Hsp60, Ssa1
(Hsp70) y Hsc82. Es interesante notar que las proteínas Hsp60, Hsp70 y Hsc82
se encontraron en condiciones en las cuales las células se encuentran
creciendo en presencia de una fuente de carbono no fermentable y con una
alta actividad mitocondrial.
Cada purificación se realizó repetidas veces y las proteínas más relevantes
(mejor ���� y 4�����) fueron identificadas en cada una de estas
purificaciones. Sin embargo, en cada purificación encontrábamos nuevas
proteínas que co4purificaban con Bcy1. Además dependiendo si se tratara de
Bcy1 endógena, sobreexpresada o etiquetada con el epítope TAP, los
resultados variaron considerablemente. Tal como explican Uetz & Goll se
pueden recuperar distintos complejos aún cuando una purificación se realiza
repetidas veces utilizando siempre la misma proteína etiquetada. Si bien el
ensayo de ��������� es bastante reproducible también presenta un significativo
margen de error. Se debe considerar también que muchas proteínas forman
parte de diferentes complejos: la proteína “carnada” podría interactuar con
distintos complejos independientes que aparentan ser uno solo. Además,
dependiendo de las condiciones nutricionales del medio los niveles de
proteínas, la expresión de los genes y la traducción de los mensajeros pueden
ser diferentes [218]. Todo esto hace que resulte difícil identificar las mismas
proteínas formando parte de un complejo en cada purificación.
Capítulo II 125
Figura II.1. Purificaciones cAMP agarosa. Extractos proteicos de las cepas 11154BCY1
(sobreexpresión), 1115 en YPD, YPGli o fase estacionaria fueron incubados en presencia o
ausencia de cAMP y sembrados en resina cAMP4agarosa. Las purificaciones se sembraron en
un �)���'�4 y el gel fue teñido con #���� � "�� coloidal. (*) banda identificada como
Bcy1.
Capítulo II 126
Tabla II.2 Proteínas identificadas por MALDI TOF TOF. Glucosa: incluye las purificaciones
realizadas por cAMP agarosa a partir de la cepa 1115 y las purificaciones realizadas por la
metodología TAP utilizando la cepa BCY14TAP
Proteína Glucosa ��1�����������
Glicerol ��1�����������
Fase estacionaria ��1�����������
Sobre%expresión
��1�����������
Rpo21
8.3E404 175
Ura2 2.6E408 120 Rpb2 4.2E414 168 Spt5 5.3E407 107 Gph1 2.1E407 111 0.0045 80 4.6E405 89
Hsp104 0.00048 77 Eft2 8.3E411 145 1.6E409 134 0.009 66 Pfk1 0.085 55 2.5E406 102
Vma2 0.00021 81 Pyk1 0.0043 68 6.6E405 82
Pdc1/2 0.016 62 0.00056 73 Bcy1 3.3E407 109 0.01 65 4E409 130 5.4E406 93 Asc1 5.3E406 97 Rpl20 0.0025 70
Glc3
0.00013 85 1.6E410 144
Fas2 6.3E410 138 Pyc2 0.0048 69 0.0007 77 Ala1 0.0063 68 Kgd1 0.02 63 Aco1 4E412 160 Hsc82 8E421 247 4E408 120 0.0033 71 7.4E406 92
YEL011w 2E406 103 Ssa1 3.2E406 101 2.2E406 88 Icl1 0.025 62
Hsp60 5.6E406 98 0.0074 62 Ald6 0.022 62 Ald4 8E415 187 Idp2 8E408 117 0.0001 86 Pgk1 0.0037 70 5E409 129 Oye2 0.0032 71 Ilv5 1E408 126
Fba1 0.029 61 Pet9 0.0008 77
Rps1a 0.00018 84 Rps4b 0.08 57
Gdb1
4E408 120
Cpa2 0.018 63 Tdh3 0.009 66 5.4E412 153 Fks1 0.001 76 Gal7 0.0067 68 Cop1 0.00011 88 Myo2 0.1 40 Ynk1 2.1E408 117
Hsp70 7.9E406 93 Eno2 9.8E46 96
Capítulo II 127
II.2.2. El extremo amino terminal de Bcy1 se une �� � ��� a péptidos
derivados de las proteínas interactoras
Del análisis de predicción se delimitaron las posibles secuencias interactoras
con Bcy1 de las proteínas identificadas. En base a estos resultados, se elaboró
un ����� de péptidos con los posibles dominios de unión a Bcy1 para cada una
de las proteínas identificadas. Las secuencias de los péptidos incluidos en el
����� se encuentran resumidas en la Tabla II.3. También se utilizaron como
control las secuencias de interacción de AKAPs de mamíferos: AKAP7
(específica para RII) [219] y AKAP2 (AKAP dual) [220], y el péptido Ht31[90],
utilizado para romper la interacción RII4AKAPs tanto ��� ��� como ��� ��.
Proteína Secuencia péptido �����
+���� 2507TVLPTTEVANNIIQKILAKIRSFLP2531
4���� 222AEEALDLIVDAIKAAGHGDKVKIGL246
����� 943LENKVIELTQNASKVKENKEMTERI968
#��6� 618LIKDSNLVGQNIISYLQKSGYPEIA642
��89� 137LRRGSQVAVEKVIEFLSANKKEITT161
���6� 285SDRATEEYTRDLIEQIVLQLRSQRM309
'���A� 270DDAELVALSKRLVENAVLKAVQQYL294
��56� 1246DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY1269
'����� 633ELAWKIAKMIVSDVMQQAHHDQPLEKSTKL662
Tabla II.3. Predicción de secuencias que interactúan con Bcy1. Secuencias
peptídicas derivadas de las proteínas que hacen interacción con Bcy1 identificadas
por los distintos abordajes. Los superíndices indican las posiciones del primer y
último residuo en la secuencia primaria de la proteína. También se incluyeron en el
diseño del array los péptidos correspondientes a la α hélice anfipática de las
proteínas Akap7, Akap2 y Ht31 de mamíferos.
Los primeros análisis estructurales por NMR demostraron que la interacción
entre la subunidad regulatoria y las AKAPs ocurre a través del surco
hidrofóbico formado por los dominios de dimerización y anclaje (D/D) amino
terminales de los dímeros de RII [20,155]. El dominio D/D está formado por
cuatro hélices antiparalelas que conforman la superficie de anclaje para la
Capítulo II 128
hélice anfipática de la AKAP [20,26,155]. Se ha demostrado que los primeros
124 residuos del extremo amino terminal de Bcy1 son necesarios para la
correcta localización subcelular de la proteína [70]. Si bien la secuencia del
extremo amino terminal de Bcy1 difiere con respecto al dominio D/D de las
subunidades regulatorias de mamíferos, los residuos hidrofóbicos definidos
como críticos para la dimerización se encuentran conservados en la subunidad
regulatoria de levaduras, y también se predice un motivo de hélice4����4hélice
característico de la estructura D/D.
En mamíferos, la hélice I se extiende hasta el residuo 39 para RIα y hasta el
residuo 25 para RIIα; y la hélice II se extiende hasta el residuo 62, en el caso
de la RIα, y hasta el residuo 45 en el caso de la RIIα. Los residuos
involucrados en la interacción con las AKAPs se ubican sobre la secuencia de
la Hélice I [94,221]. Además RI presenta una región helicoidal adicional,
denominada N1 que se propone que hace interacción con las AKAPs [25]. De la
predicción de estructura secundaria del extremo N4terminal de Bcy1 surge la
posibilidad de dos hélices: la hélice I que se extiende hasta el residuo 21 y la
hélice II que se extiende hasta el residuo 50 (Tesis Jimena Rinaldi). Sin
embargo, la deleción de los primeros 49 aminoácidos de Bcy1 es suficiente
para impedir su correcta localización, como así también la deleción de los
primeros 124 aminoácidos [70].
Resultados de nuestro laboratorio sugieren que Bcy1 es capaz de formar
dímeros (Tesis Jimena Rinaldi, Nicolás Bardeci comunicación personal). Para
analizar la importancia del extremo amino terminal de Bcy1 en el anclaje a
proteínas, se construyeron mutantes con distintas deleciones amino terminales
(Figura II.2).
Capítulo II 129
Figura II.2. Esquema de las subunidades regulatorias salvaje
y mutantes amino terminales. En el esquema se muestra la
estructura modular de Bcy1 y de las distintas mutantes. En azul
se muestra el Dominio D/D (dominio de dimerización y anclaje);
en rojo el IS (sitio inhibitorio); en rosa y violeta los sitios A y B
del dominio de unión a cAMP.
La primera construcción realizada fue la mutante �N85Bcy1. Esta construcción
se transformó en una cepa de levaduras ����6. La sobreexpresión de esta
proteína en esta cepa fue infructuosa ya que las células no podían crecer.
Estimamos que la sobreexpresión de una proteína que carece del N4terminal, y
que probablemente tiene alterada su localización, resultó tóxica para la célula.
Sin embargo, la proteína �N85Bcy1 sí pudo sobreexpresarse en una cepa
salvaje y purificarse. En las purificaciones no detectamos la presencia de la
proteína Bcy1 endógena. Las proteínas �N138Bcy1 y �N168Bcy1 se
expresaron en 4 � ��� . Estas proteínas se utilizaron para revelar el �����
mostrado en la Figura II.3 (ver Figura 4 en sección Materiales y Métodos).
El revelado del ����� se realizó con las proteínas Bcy1 salvaje y cada una de
las mutantes y utilizando anticuerpos anti subunidad R. Como puede
observarse en la Figura II.3, Bcy1 interactúa con los péptidos derivados de las
Capítulo II 130
proteínas Ira2, Myo2, Hsp60 y Ptp1 (fila superior del �����). No detectamos
interacción entre Bcy1 y los péptidos de Eno2 o Cop1ni tampoco con los
péptidos derivados de la AKAP7, Ht31 y AKAP2 derivados de proteínas de
mamíferos. Estos resultados dieron los primeros indicios que los residuos
involucrados en la interacción entre Bcy1 y estos péptidos serían diferentes de
los determinantes que participan en la interacción R4AKAP en mamíferos.
El revelado del ����� se realizó con un anticuerpo anti4subunidad regulatoria R
de ������ ���& preparado en nuestro laboratorio (anti4R Mr). Se utilizó este
anticuerpo dado que resultó mucho más sensible que el anticuerpo anti4Bcy1
C4terminal comercial. Como control se corroboró que la disminución
(�N85Bcy1) o falta (�N138Bcy1 y �N168Bcy1) de la señal en el revelado de los
����� se debe verdaderamente a la ausencia de Bcy1 y no a la disminución
del reconocimiento de los anticuerpos hacia las proteínas mutantes. Para esto
se realizó un ����� ����� con las proteínas purificadas y se reveló con el
anticuerpo anti4R Mr. En la Figura II.4 se puede observar que el anticuerpo anti4
R Mr reconoce con la misma eficiencia la proteína salvaje y las mutantes.
En la Figura II.3 también se observa que la mutante �N85Bcy1 pierde mucha
capacidad de unión por los péptidos del ����� con respecto a la proteína
salvaje. Para el resto de las mutantes de deleción no detectamos unión a los
péptidos. A partir de estos resultados surge que la región amino terminal de
Bcy1 es clave para permitir la interacción con los péptidos.
Para verificar que las señales en el ����� no se deben a falsos positivos dados
por la interacción entre los anticuerpos y los ����de péptidos, se realizó un
control incubando el ����� con los anticuerpos primarios y secundarios en
ausencia de proteína. Pudimos verificar que en estas condiciones no se
observa señal en el �����, y por lo tanto confirmamos que los anticuerpos
revelan específicamente la interacción entre los péptidos del ����� y las
proteínas Bcy1 salvaje o mutante. Este control se realizó para todos los ������
que se muestran a continuación.
Capítulo II 131
Figura II.3. La unión de Bcy1 a las proteínas con las cuales interactúa es a
través de su extremo amino terminal. Los péptidos derivados de las distintas
proteínas fueron sintetizadas sobre el fase sólida junto a los péptidos derivados de
la AKAP7, Ht31 y AKAP2 de mamíferos como controles. Cada ����� fue incubado
con Bcy1 o sus mutantes de deleción amino terminales purificadas para permitir la
interacción. El revelado se realizó con el anticuerpo anti4subunidad regulatoria Mr.
La intensidad de los ��� fue analizada por imagen digital. Las imágenes de los
������corresponden a un experimento representativo.
Figura II.4. El anticuerpo anti subunidad Regulatoria de -��������3 reconoce Bcy1
y sus mutantes de deleción. Bcy1 y las mutantes �N85Bcy1, �N138Bcy1 y �N168Bcy1
purificadas fueron analizadas por �)���'�4 12% ��������� y reveladas con anticuerpo
primario anti Bcy1 C terminal (A) o anti R ���������& (B).
Capítulo II 132
La falta del extremo N4terminal seguramente está impidiendo la dimerización de
Bcy1. En la Tesis de Jimena Rinaldi se demostró que Bcy1 es capaz de formar
dímeros y que la región N4terminal es importante para dicha función.
Verificamos entonces si la proteína �N85Bcy1 pura forma o no dímeros. Para
esto se compararon los coeficientes de sedimentación de las proteínas mutante
y salvaje purificadas por gradiente de sacarosa. El S de la proteína �N85Bcy1
(S<2,8) es mucho menor que el de la proteína salvaje (S>4,8), indicando que la
proteína mutante podría ser monomérica y no dimérica (Figura II.5). Estos
resultados coinciden con los presentados en la Tesis de Jimena Rinaldi, en la
que utilizó extractos de cepas que sobreexpresaban Bcy1 y �N85Bcy1.
Análisis de las proteínas salvaje y mutante �N85 por ��������� de geles no
desnaturalizantes indicaron también que la proteína mutante no forma dímeros
(resultados no mostrados).
Figura II.5. Gradiente de sacarosa de las proteínas Bcy1 y ����N85Bcy1 purificadas. La
presencia de Bcy1 () o �N85Bcy1 () en cada fracción fue determinada por ����� �����
utilizando el anticuerpo anti4Bcy1 C4terminal. Las bandas fueron analizadas por imagen digital y
cuantificadas (UA). Se usaron como marcadores los estándares Peroxidasa (Px) y Citocromo C
(Cyt C).
Capítulo II 133
En base a estos resultados concluimos que la región N terminal presente en los
primeros 85 aminoácidos es clave para la dimerización de Bcy1 y que esta
dimerización es importante para la interacción con otras proteínas.
Para verificar que el extremo amino terminal de Bcy1 está involucrado en la
interacción con las proteínas identificadas realizamos purificaciones por cAMP
agarosa a partir de la cepa 11154�N85BCY1. Las proteínas co4purificadas
fueron analizadas por �)�� �'�4. Si bien en la resina de cAMP agarosa se
unen muchas proteínas, se definieron como específicas para la interacción con
Bcy1 a aquellas que disminuyen considerablemente o desaparecen por la
preincubación por cAMP. En la Figura II.6 podemos observar que al patrón de
bandas de la purificación con la proteína mutante �N85Bcy1 no varía por
preincubar el extracto con cAMP, indicando que las proteínas identificadas en
la purificación con Bcy1 salvaje requieren del amino terminal de la subunidad
regulatoria para su interacción. En la purificación realizada a partir de la
proteína Bcy1 salvaje, se observan diferencias en el patrón de bandas en
ausencia y en presencia de cAMP como en los geles anteriores. De esta
manera confirmamos que el extremo amino terminal de Bcy1 está involucrado
en la interacción.
Figura II.6. Purificación cAMP agarosa de la proteína mutante ����N85Bcy1. Extractos
proteicos de las cepas 11154BCY1 y 11154�N85BCY1 fueron incubados con 50 Ml de resina
cAMP agarosa en presencia o ausencia de 50 mM de cAMP. Luego de la incubación y lavados
exhaustivos se agregó buffer de siembra 4x. Los extractos fueron sembrados en un �)���'�E
12% y el gel fue teñido con�#���� ����.
Capítulo II 134
Dado que el péptido correspondiente a la proteína Hsp60 presenta una
secuencia consenso de fosforilación para PKA surgió como posibilidad que la
interacción con los péptidos no fuera directa, sino a través de las Tpks que
pudieran estar presentes como contaminantes en la purificación. Esto no sería
esperable ya que la subunidad Bcy1 queda retenida en la columna a través de
la unión al cAMP y en estas condiciones la subunidad catalítica se debería
disociar de la regulatoria. Y si de todas formas hubiera Tpks en la purificación
(las cuales no se observaron en los geles teñidos con ����� ni por ����
����), la pequeña proporción de holoenzima que pudiera estar presente debería
disociarse en presencia de cAMP y sustrato durante el revelado del �����. Los
otros péptidos analizados no presentan sitios consenso de la fosforilación para
PKA. De todas formas, las preparaciones purificadas de Bcy1 fueron
analizadas por MALDI4TOF y no se detectaron péptidos correspondientes a
alguna de las Tpks en estas preparaciones. Otro punto a destacar es que la
proteína �N85Bcy1 no debería haber perdido la afinidad de interacción con
Tpk ya que la región amino terminal no está involucrada en la interacción entre
éstas dos subunidades, y sin embargo no reconoce los péptidos en el ����� �
Recientemente ha sido publicado un trabajo en dónde evalúan las interacción
de distintas quinasas con 4200 ORF de � ��� ��utilizando la metodología
de ������ [222] En este trabajo encuentran solo unas pocas proteínas que se
unen directamente a Tpk1 (3 proteínas), Tpk2 (7 proteínas) y Tpk3 (6
proteínas), y la mayoría de ellas no están descriptas como sustratos o no
presentan un sitio consenso de fosforilación para PKA y ninguna de ellas
coincide con las evaluadas en nuestros �����. Estos resultados son llamativos
y demuestran que es muy difícil poder apreciar la interacción entre las
subunidades catalíticas de la PKA y sus proteínas sustrato a través de estos
abordajes experimentales. En función de todo lo expuesto consideramos que la
interacción observada en nuestros ����� es exclusivamente consecuencia de
una interacción directa con Bcy1.
Para confirmar que las proteínas identificadas, cuyos péptidos fueron
evaluados para su interacción con Bcy1 en el ������� interactúan con Bcy1 se
realizaron ensayos de interacción ��� �� e ��� ���. Los ensayos realizados� ��
� ���� corresponden a ensayos de ����� ����, en los cuales se ofreció a una
resina de cAMP agarosa con Bcy1 inmovilizada un extracto proteico de cepas
Capítulo II 135
que expresan las distintas proteínas recombinantes Ira24TAP, Ptp14TAP, Myo24
HA, Hsp604HA y Eno24TAP. La interacción específica se evaluó ofreciendo
extracto proteico de las cepas que expresan cada proteína etiquetada a la
resina cAMP agarosa libre de Bcy1 y en presencia de cAMP 50mM. Como se
observa la Figura II.7A, B, C y D las proteínas Ira2, Ptp1, Myo2 y Hsp60
interactúan con Bcy1 ��� ���. Sin embargo no detectamos interacción para la
proteína Eno2 (Figura II.7E), y por esta razón no la consideramos como posible
proteína interactora de Bcy1.
El péptido derivado de la proteína Ptp1 interactuó con baja afinidad con Bcy1
en los �����, sin embargo la proteína recombinante sí pudo unirse a Bcy1
directa o indirectamente �� � ���� (Figura II.7B). Es posible que le interacción
entre Ptp1 y Bcy1 involucre residuos extras ubicados en otro dominio de la
proteína, o que se requiera la presencia de otra proteína para que ocurra la
interacción más fuerte.
En base a estos resultados podemos concluir que las proteínas Ira2, Myo2,
Hsp60 y Ptp1 interactúan con Bcy1 �� � ���, confirmando los resultados
obtenidos en el �����.
Capítulo II 136
Figura II.7. Las proteínas Ira2, Ptp1, Myo2 y Hsp60 recombinantes se unen a Bcy1 ��
� ���� Extractos proteicos de la cepa 11154BCY1 fueron incubados con 50 Ml de resina cAMP
agarosa por 2 horas a 4ºC. Luego de exhaustivos lavados se le ofreció a la resina con Bcy1
inmovilizada extracto proteico de las cepas IRA24TAP (A), PTP14TAP (B), HSP604HA (C),
MYO24HA (D) o ENO24TAP (E) y se incubó 2 horas a 4ºC. Luego de realizar los lavados
correspondientes, se le agregó a la resina 50 Ml de buffer de siembra 4X y se analizó la
muestra por �)���'�4�y ��������� �El revelado se realizó utilizando anticuerpo anti4TAP (A
y B) o anti4HA (C y D) para detectar las proteínas recombinantes, mientras que para detectar
Bcy1 se utilizó el anticuerpo anti4Bcy1 C4terminal. Los controles fueron realizados incubando
extracto proteico de las cepas que expresan las proteínas con resina cAMP agarosa libre de
Bcy1 y en presencia de cAMP 50mM para descartar falsos positivos. Los inputs corresponden a
un 0.5% del extracto utilizado para el ensayo.
II.2.3. Los determinantes involucrados en la interacción con Bcy1 difieren
de los presentes en las AKAPs de mamíferos
Hace algunos años se ha descripto a través de estudios bioquímicos que el
dominio de anclaje a PKA de las AKAPs se encuentra sobre una hélice
anfipática de 14418 residuos [90]. Estudios estructurales [105,223] muestran
que la cara hidrofóbica de la hélice de las AKAPs se ancla al surco hidrofóbico
formado por los dominios D/D del dímero de subunidades RII. Aunque la
presencia de residuos hidrofóbicos sobre la cara de la hélice que interactúa con
R se encuentran conservados entre las distintas AKAPs, la identidad de esos
residuos no se encuentra totalmente conservada. Esto podría explicar las
Capítulo II 137
diferencias observadas entre las AKAPs en lo que respecta a su afinidad por
RII [224].
En mamíferos, la mayoría de las AKAPs descriptas hasta el momento se unen
a la PKA tipo II, sin embargo también se han descripto varias AKAPs que se
unen de manera específica a RI y también se han encontrado AKAPs con
función dual, es decir que se unen tanto a RI como a RII [220,2254228]. Análisis
de RMN y estructuras cirstalográficas han demostrado que el dominio D/D de
RII presenta una estructura con forma de X formada por 4 hélices, la cual
provee la superficie para el anclaje con las AKAPs [229]. Sin embargo, el
homodímero de RI es mucho más compacto y presenta una estructura del tipo
Y [230]. Estas diferencias estructurales en los dominios amino terminales,
podrían explicar la especificidad en la interacción de las AKAPs con las
subunidades RI y RII.
Como se mencionó en la Introducción General, además de las AKAPs con
dominios de unión conservados, existen AKAPs no canónicas que no
presentan la hélice anfipática conservada [106,156].
Como una primera aproximación para evaluar si los residuos involucrados en la
interacción entre los péptidos analizados y Bcy1 correlacionan con los
determinantes observados en mamíferos, realizamos un ensayo de
competencia entre Bcy1 purificada y el péptido Ht31, disruptor de la unión
AKAPs4R. En la Figura II.8 se observa que el péptido competidor Ht31 no fue
capaz de lograr el desplazamiento de Bcy1. Estos resultados sugieren que la
interacción entre los péptidos y Bcy1 no ocurriría a través de los mismos
determinantes presentes en mamíferos.
Capítulo II 138
Figura II.8. Ensayo de competencia entre Bcy1 y el péptido Ht31. El ����� fue
incubado con Bcy1 purificada más el péptido Ht31 o el péptido control (������).
El revelado se realizó con el anticuerpo anti4subunidad regulatoria Mr. La
intensidad de los ��� fue analizada por imagen digital.
Para analizar cuáles son los determinantes para la interacción Bcy14proteínas y
�N85Bcy14proteínas, elegimos trabajar con el dominio de interacción de Ira2.
Diseñamos un ������de péptidos�en el cual cada uno de los aminoácidos de la
secuencia de Ira2 fue sustituído por:
• Residuo hidrofóbico pequeño (alanina o glicina)
• Residuo pequeño con carga negativa (aspártico)
• Residuo hidrofílico (serina)
• Residuo pequeño con carga positiva (lisina)
En la Figura II.9 se observa que el reemplazo de residuos hidrofóbicos
voluminosos (leucina e isoleucina), por un aminoácido hidrofóbico pequeño
como la alanina aumenta la interacción del péptido con Bcy1. En este caso, la
interacción se ve favorecida por un cambio en el tamaño del aminoácido y no
por variar la naturaleza química del mismo. Cuando los residuos fueron
reemplazados por glicina, se observó que el reemplazo por este residuo en
posiciones hacia el C4terminal del péptido favoreció la unión de Bcy1. La
mayoría de los residuos presentes en esa zona del péptido también son
hidrofóbicos. La ausencia de residuos hidrofóbicos favorece la interacción con
Bcy1, en contraposición a lo que ocurre en la interacción entre AKAPs4RII de
mamíferos, donde estos residuos en determinadas posiciones resultan claves
para la unión. Cuando los residuos de la secuencia de Ira2 fueron
reemplazados por glutámico (residuo con carga negativa) en muchas de las
Capítulo II 139
posiciones, hubo una notable disminución en la interacción con Bcy1. El
resultado más llamativo se observó cuando los aminoácidos básicos de Ira2
fueron reemplazados por cualquiera de los otros residuos. La ausencia de los
residuos básicos disminuye de manera notable la interacción con Bcy1 (Figura
II.9A). Finalmente vemos que el reemplazo de residuos hidrofóbicos por lisinas
mejora la interacción.
Para el caso de la interacción �N85Bcy14péptidos la interacción disminuye
notablemente con respecto a la interacción con Bcy1 salvaje (Figura II.9B
Consideramos entonces como negativa la interacción de �N85Bcy con el
péptido Ira2. Pudimos observar que, semejante a lo que ocurre para la
interacción con Bcy1 entera, la presencia de ciertos residuos hidrofóbicos o con
carga negativa presentes en la secuencia de Ira2 resultan perjudiciales para la
interacción. Además la presencia de cargas positivas en ciertas posiciones
favorece la interacción con �N85Bcy1 (Figura II.9B). Estos resultados sugieren
que �N85Bcy1 interactúa con los péptidos de manera diferente que Bcy1, y
que tal vez se generen otros puntos de contacto debido a la ausencia del
dominio amino terminal y la falta de dimerización.
Capítulo II 140
Figura II.9. Determinantes involucrados en la interacción con Bcy1 y
����N85Bcy1. Se diseñó un ����� de péptidos a partir de la secuencia derivada de la
proteína Ira2 en donde cada residuo fue reemplazado por alanina, glicina,
aspártico, lisina o serina. Los ����� fueron incubados con Bcy1 (A) o �N85Bcy1
(B) purificadas para permitir la interacción. El revelado se realizó con el anticuerpo
anti4Bcy1 C4terminal La intensidad de los ��� fue analizada por imagen digital.
La secuencia del péptido utilizada para el ���� �� de alanina se muestra en la fila
“A” de las Figuras A y B, mientras que en la fila “G” se muestra la secuencia
utilizada en el ���� �� con glicina, Fila “D” con aspártico, fila “K” con lisina y fila
“S” con serina. La flecha indica la posición de los ��� correspondientes a la
secuencia salvaje del péptido; los puntos indican las secuencias salvajes en el
���� �� de alanina. Las imágenes de los ��� corresponden a una misma
membrana revelada por ��������� y los ��� fueron ensamblados para facilitar
la comparación.
Para verificar los resultados obtenidos que sugieren una fuerte participación de
los residuos básicos en la interacción Bcy14proteínas, como así también el
Capítulo II 141
efecto negativo que presentan los aminoácidos hidrofóbicos o ácidos sobre
esta interacción, realizamos un ����� con '��� ����� �� sobre las secuencias
correspondientes a las proteínas Myo2, Hsp60 y Ptp1 y analizamos la
interacción con Bcy1 (Tabla II.4 y Figura II.10). El revelado de los mismos
demostró similitudes con los resultados vistos anteriormente. El péptido Ptp1
presenta tres residuos negativos concentrados en su extremo amino terminal,
lo cual podría explicar la interacción débil con Bcy1 (Figura II.3). Con el péptido
Hsp60 también confirmamos que el reemplazo de algunos de los residuos
hidrofóbicos favorece de manera sustancial la interacción, mientras que la
ausencia de los residuos básicos va en detrimento de la misma.
El '������� �� del péptido de la AKAP7 de mamíferos (específica para RII),
demuestra que el reemplazo de aminoácidos hidrofóbicos (leucina y valina) o
ácidos (glutámico) por alanina incrementa la interacción, pasando de una no
interacción a una interacción débil (Figura II.10D). El reemplazo de estos
residuos hidrofóbicos presenta un efecto opuesto a lo que ocurre en la
interacción entre AKAP7 y RII, en dónde la presencia de estos determinantes
es crítica para la interacción.
Péptido Secuencia
����� L E N K V I E L T Q N A S K V K E N K E M T E R I
��89� L R R G S Q V A V E K V I E F L S A N K K E I T T
���6� S D R A T E E Y T R D L I E Q I V L Q L R S Q R M
'/'�A� D D A E L V R L S K R L V E N A V L K A V Q Q Y L
Tabla II.4. Secuencias derivadas de las proteínas que hacen interacciones con Bcy1 y dominio
de interacción de la AKAP7 de mamíferos utilizadas para los ����� de la Figura II.10.
Capítulo II 142
Figura II.10. �������� �) de los sitios de interacción de Myo2, Hsp60, Ptp1 y AKAP7. Se
diseñó un ����� de péptidos a partir de las secuencias derivadas de las proteínas Myo2 (A),
Hsp60 (B), Ptp1 (C) y AKAP7 (D), en donde cada residuo fue reemplazado por alanina. Los
����� fueron incubados con Bcy1 purificada para permitir la interacción. El revelado se realizó
con el anticuerpo anti4Bcy1 C4terminal La intensidad de los ��� fue analizada por imagen
digital. La secuencia del péptido utilizada para el ���� �� se muestra en la parte superior de
cada Figura. La flecha indica la posición de los ��� correspondientes a la secuencia salvaje
Las imágenes de los ��� corresponden a una misma membrana revelada por ��������� y
los ��� fueron ensamblados para facilitar la comparación. Las imágenes de los ������
corresponden a un experimento representativo.
Si analizamos la proporción de residuos de acuerdo a su naturaleza química en
cada una de las secuencias salvajes utilizadas en los diferentes �����,
podemos observar que existe una correlación entre el grado de interacción con
Bcy1 y el porcentaje de residuos básicos y ácidos presentes en las mismas.
Los datos de la Tabla II.5 muestran claramente que las secuencias
correspondientes a Ira2 y Hsp60 presentan un mayor porcentaje de residuos
con cargas positivas respecto a las negativas y estas proteínas presentaron
una mayor interacción con Bcy1, tanto en los ����� de péptidos como en los
Capítulo II 143
ensayos de ���������� ��� ���. En el caso de Eno2, Ptp1, AKAP7 y AKAP2 el
porcentaje de residuos básicos es menor respecto al de los ácidos, que
correlaciona con la falta de interacción con Bcy1.
Tabla II.5. Distribución de residuos hidrofóbicos, básicos y ácidos. Para calcular
los porcentajes de cada tipo de aminoácido se utilizaron las secuencias que se
encuentran en la Tabla II.2. EF:2� �������� �������� ��� �� ��� � � �� ! ����
7 ���� G�=)2�������� ����
En base a estos resultados pensamos que los residuos básicos son críticos
para la interacción y que los residuos hidrofóbicos no estarían involucrados,
más aún, resultan perjudiciales para la interacción con Bcy1. Estas
características hacen diferentes a los péptidos que interactúan con Bcy1 de los
péptidos que hacen interacción con RI o RII.
Como describimos en la Introducción General, las AKAPs de especificidad dual
presentan un segundo dominio de unión a RI denominado RISR, que si bien
presenta una estructura de α hélice no tiene la misma simetría que los
dominios de unión a RII. Se ha propuesto que el dominio RISR une a RI por un
mecanismo diferente, ya que su unión a RI ocurre en una zona que se
encuentra fuera del área de unión de las α hélices y no presenta simetría
interna. Por lo tanto se piensa que RISR podría hacer contacto con solo uno de
los protómeros del dímero de R. Además, en el dominio RISR los residuos
básicos son claves para la interacción, ya que la mutación de estos residuos
anula la unión a la subunidad R. Por todo esto se propone que RISR es una
región de unión adicional en las AKAPs de especificidad dual.
� -��'� ��4%� ���'� *4>:� ���'� �0��@� �0��'�
H�� ���$?� ��� 20 28 44 36 57 50 34
H��D ��� 20 16 12 20 4 12 7
H�D� ��� 16 20 4 12 28 16 19
+������ ?�������������� + + + + 4 ND + (*)
+������ ?���������� ++ + ++ +++ 4 4 4
Capítulo II 144
Las predicciones de estructuras secundarias para los péptidos ensayados de
Ira2 y Hsp60 predicen una alfa hélice. Para analizar la disposición de los
residuos básicos en las secuencias de los péptidos utilizados en los �����, se
modelaron las hélices de los putativos dominios de interacción de las proteínas
Ira2, Hsp60, Myo2 y Ptp1 utilizando el programa PyMOL [231]. Los residuos
básicos presentes en Ira2 se encuentran más concentrados en una zona
delimitada hacia el extremo C4 terminal del péptido, y el residuo ácido se ubica
fuera de esta zona (Figura II.11A). Hsp60 presenta una distribución de los
aminoácidos cargados positivos a lo largo de todo el péptido aunque una
densidad de carga positiva queda dispuesta sobre el N4terminal del péptido
(Figura II.11 B y C). Myo2 presenta una distribución más pareja a lo largo del
péptido aunque los residuos básicos quedan más expuestos sobre una de las
caras del péptido. La distribución espacial de los residuos básicos podrían
explicar las diferencias en la interacción. En el caso del péptido Ptp1 (Figura
II.11D), que es el que peor interacciona con Bcy1, presenta una distribución de
residuos básicos y ácidos menos delimitada y podrían ser la causa de la débil
interacción observada con Bcy1 en los �����.
Capítulo II 145
Figura II.11. Visualización de los péptidos Ira2, Hsp60, Myo2 y Ptp1.
Las estructuras están coloreadas de acuerdo a la naturaleza química de
los aminoácidos: �,��2��D ��G���3�2�D� ��.
Griffioen �� ���demostraron que la localización de Bcy1 es dependiente de la
fuente de carbono. Los autores comprobaron que en ausencia de glucosa Bcy1
se fosforila en dos ����� de serinas (����� I y II) que abarcan los primeros
124 aminoácidos de la molécula. La fosforilación de Bcy1 en estos �����
depende de la proteína Yak1, la cual podría activar otras quinasas o inhibir
ciertas fosfatasas de manera de regular el estado de fosforilación de Bcy1.
Dado que las secuencias aminoacídicas de los ����� I y II son notablemente
Capítulo II 146
diferentes, los autores sugieren que cada ����� podría ser fosforilado por
quinasas distintas. Por último los autores demuestran que la proteína Zds1
afecta la localización de Bcy1: el reclutamiento de Bcy1 en el citoplasma
mediado por Zds1 es controlado por la fosforilación del ����� II. [72] La
presencia de grupos fosfato en el extremo amino terminal de Bcy1 como
consecuencia de la fosforilación podrían permitir la interacción con los residuos
positivos expuestos en los dominios de interacción de Ira2, Hsp60 y Myo2.
II.2.4. Bcy1 e Ira2 están presentes en las mismas fracciones subcelulares
e interactúan� ��� ���
�
������������ ��� �� presenta dos tipos de receptores acoplados a
proteína G (GPCRs) para el sensado de feromonas y nutrientes. EL GPCR
involucrado en el sensado de nutrientes es el Gpr1, el cual activa la subunidad
Gα de Gpa2 en respuesta a glucosa y a azúcares estructuralmente
relacionados [2324235]. La proteína Gpa2 activada estimula la producción de
cAMP por la adenilato ciclasa y dispara la vía de señalización de la PKA
[236,237]. Gpa2 se asocia con dos proteínas kelch, Gpb1 y Gpb2, las cuales
son funcionalmente redundantes, y presentan siete motivos de repeticiones
kelch cada una [238].
� ���� � expresa dos proteínas Ras: Ras1 y Ras2 [239]. Ras1 y Ras2 son
funcionalmente redundantes para el crecimiento celular, pero Ras2 juega el rol
predominante en la vía de señalización por cAMP en respuesta al estímulo de
glucosa. La actividad Ras es controlada positivamente por los factores
intercambiadores de GTP Cdc25 y Sdc25 (GEFs), y negativamente por las
proteínas activadoras de GTPasas (GAPs) Ira1 e Ira2 [2034206]. Se ha
demostrado que cuando la PKA es activada frente al estímulo de glucosa,
provoca una relocalización de Ras2 desde la cara interna de la membrana
plasmática hacia el citoplasma, participando de esta manera en el $�����
negativo de la vía cAMP4PKA [240]. Ha sido demostrado que Ira1 interactúa
con la adenilato ciclasa de levaduras y que podría promover su localización en
la membrana [207]. Las proteínas RasGAP Ira1/2 son proteínas grandes (350
kDa) que se encuentran conservadas de levaduras a humanos [208,209]. A
Capítulo II 147
pesar de que los genes IRA1 e IRA2 fueron clonados hace más de una década,
aun no se sabe con certeza cómo es controlada la actividad RasGAP de estas
proteínas. Recientemente se ha demostrado que Ira1/2 serían blancos de las
proteínas kelch Gpb1/2. Gpb1/2 se une al dominio conservado C4terminal y
estabilizaría a Ira1/2 [241]. Esta estabilización induciría la actividad GTPasa de
Ras, colaborando con el apagado de la señal de la vía cAMP4PKA.
Basándonos en estos antecedentes y en los resultados obtenidos previamente,
como primer paso en el estudio de la relevancia fisiológica de la interacción
Bcy14Ira2, resultó interesante estudiar la co4localización de estas proteínas.
Para ello se realizó un fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial
de un extracto crudo de la cepa que expresa IRA24HA. Como marcador de
fraccionamiento se utilizó la proteína integral de membrana Pma1 [242], de
manera de poder diferenciar las proteínas integrales de membranas de
aquellas asociadas a membrana plasmática, como Ira2. Como puede
observarse en la Figura II.12, si bien Bcy1 es considerada una proteína con
distribución núcleo4citoplasmática, se observa la presencia de la misma en las
fracciones correspondientes a proteínas asociadas a membrana (S100,000) y
en la de proteínas integrales de membrana (P100,000). Ira2 se encuentra en la
fracción correspondiente a la de proteínas asociadas a membrana plasmática
(S100,000), en la cual también está Bcy1. "���� �� �� han reportado la
presencia de actividad PKA cAMP dependiente en preparaciones de membrana
de células de levaduras así como también la presencia de Bcy1 en esta
fracción [243].
Capítulo II 148
Figura II.12. Determinación de la localización subcelular de Ira2 y Bcy1 mediante
centrifugación diferencial. La cepa IRA24HA fue crecida en YPD hasta una DO600nm=0.8. Los
extractos proteicos se sometieron a una centrifugación diferencial para obtener las distintas
fracciones subcelulares, tal como se detalla en la Sección Materiales y Métodos. Las muestras
fueron analizadas por �)���'�4 y ��������� y reveladas utilizando anticuerpos anti4HA,
anti4Pma1 o anti4Bcy1 c4terminal según corresponda. �599����5992 sobrenadante y pellet del
599&�� respectivamente; �699�99� �� �699�9992� sobrenadante y pellet del 699�999&�,
respectivamente.
Los resultados obtenidos en los ����� de péptidos sugieren que existe una
interacción directa entre Bcy1 e Ira2. Por otra parte, utilizando la metodología
de ����� ���� encontramos que ambas proteínas interactúan directa o
indirectamente ��� ��� y además, están presentes en la misma fracción celular.
Teniendo en cuenta estos resultados y los antecedentes que se encuentran en
la literatura que indican que Ira2 promueve la localización en membrana de la
adenilato ciclasa de levaduras, y que Bcy1 se encuentra asociada a la fracción
subcelular correspondiente a membrana plasmática, nos permite pensar que
Bcy1 podría encontrarse formando parte de un complejo que incluya a estas
dos proteínas que participan en la vía de la señalización del cAMP. Por lo tanto,
nuestro próximo objetivo fue evaluar la posible interacción �� � �� de Bcy1 e
Ira2. Para ello se prepararon extractos crudos de la cepa IRA24HA y se
inmunoprecipitó la proteína Ira24HA junto con las proteínas que interactúan con
ésta utilizando anticuerpo anti HA y proteína A/G agarosa. El inmunoprecipitado
fue analizado por ��������� revelado con anticuerpo anti Bcy1 y anti HA. En
la Figura II.13 puede observarse la presencia de Bcy1 en el inmunoprecipitado
de la proteína Ira24HA, por lo que podemos concluir que Ira2 y Bcy1 interactúan
directa o indirectamente ��� ��. En el IP Bcy1 es detectada como dos bandas
Capítulo II 149
(Figura II.13) que consideramos que debe corresponder a Bcy1 proteolizada.
Hemos observado que en ensayos en los cuales se requiere largos períodos de
incubación las muestras se enriquecen en esta forma proteolizada de Bcy1.
Figura II.13. Ira2 se une a Bcy1 ��� ����La cepa IRA24HA fue crecida en YPD
hasta una DO600nm=0.8. Los extractos proteicos fueron incubados con 10Ml de
anticuerpo anti4HA por 1 hora a 4ºC, y posteriormente se agregó Proteína A/G. El
inmunoprecipitado fue lavado exhaustivamente y se le agregó buffer de siembra
4x. Las muestras fueron analizadas por �)���'�4 y ��������� y el revelado se
realizó utilizando anticuerpo anti4HA o anti4Bcy1 C4terminal según corresponda. +�2�
inmunoprecipitado; �������: extracto incubado con anticuerpo inespecífico.
Como se ha mencionado anteriormente, la presencia de Bcy1 en membrana
plasmática ha sido reportada previamente [243]. Los autores de este trabajo
encontraron que fracciones de membrana plasmática provenientes de células
creciendo con glucosa como fuente de carbono presentaban niveles crecientes
de actividad PKA cAMP4dependiente durante el crecimiento celular. Por lo tanto
la presencia de PKA en membrana aseguraría la pronta respuesta frente al
estímulo de glucosa, aun en presencia de bajos niveles de cAMP. El
interrogante que surge de estas evidencias es cómo se encuentra anclada la
quinasa en la membrana plasmática. La proteína Bcy1 que se encuentra en
membrana no presenta ninguna modificación post4traduccional que le permita
anclarse directamente a la membrana celular. No presenta ningún residuo de
glicina amino terminal típico para la miristilación, ni tampoco presenta una
secuencia de reconocimiento para acetiltransferasas en el carboxi4terminal,
como ocurre en las proteínas palmitoiladas [243]. La interacción de Bcy1 con
Ira2 podría explicar la presencia de la PKA en membrana plasmática, apoyando
la hipótesis de la existencia de proteínas de anclaje en levaduras.
Capítulo II 150
Otra pregunta que nos plateamos al analizar estos resultados fue si las
subunidades catalíticas también co4inmunoprecipitan con Ira2, sin embargo no
pudimos demostrar por ����� ���� la presencia de Tpk1 en el
inmunoprecipitado. Hasta el momento, según lo reportado por Harashima et al
[241], se ha descripto la interacción de Ira2 con Gpb1/2 (proteínas Kelch), pero
no con otro componente de las cascada cAMP4PKA. Y según lo reportado por
Peeters et al [244] las proteínas Gpb1/2 se asocian con Gpa2 y con las
subunidades catalíticas de PKA. Según nuestros resultados Ira2 puede hacer
interacción con Bcy1 pero no detectamos la presencia de Tpks.
II.2.5. Péptidos derivados de la proteína Ira2 son fosforilados por Tpks
Se ha demostrado que la neurofibromina (NF1), homóloga de Ira1/2 en
humanos, se encuentra constitutivamente fosforilada y que esta fosforilación
ocurre en un dominio rico en cisteínas/serinas (CSRD) y en el dominio C
terminal (CTD) de la proteína [245]. El dominio CTD presenta sitios específicos
para la fosforilación por PKA. La proteína =��� =�4dimetilarginina
dimetilaminohidrolasa (DDAH) se une a los dominios CSRD y CTD de la
neurofibromina y esta interacción promueve la fosforilación por PKA [245].
Además, la fosforilación del dominio CSRD por PKA promueve la asociación de
NF1 con la proteína 144343, la cual pertenece a una familia de proteínas que se
unen a una gran variedad de proteínas fosforiladas en serina, participando en un
amplio espectro de procesos biológicos. La unión de 144343 regula
negativamente la actividad NF14GAP. Estos resultados sugieren que 144343
regula las funciones bioquímicas y biológicas de la neurofibromina gracias a la
fosforilación mediada por PKA de NF1 [246].
Diversos trabajos indican que la proteína Ira2 de levaduras presenta diferentes
serinas y treoninas fosforiladas, sin embargo en estos trabajos no se determinó
cuál o cuáles son las quinasas responsables de fosforilar estos sitios [2474249].
Por otro lado, en levaduras existen dos genes que codifican para las proteínas
144343: BMH1 y BMH2. Está descripto que Bmh1 presenta interacción genética
con Ira2 [250].
Capítulo II 151
En base a estos antecedentes resultó interesante determinar la presencia de
sitios de fosforilación para PKA en la proteína Ira2. En primer lugar, utilizando el
programa Scansite [251] realizamos un análisis �� � �� de la secuencia
aminoacídica de la proteína con el objetivo de encontrar sitios putativos para la
fosforilación por PKA. A partir de este análisis surgieron dos posibles sitios
como candidatos: ser1018 y ser1745. Ambos sitios se encuentran río arriba de
la secuencia que hemos identificado que interactúa con Bcy1. En trabajos
proteómicos previos se ha encontrado que la ser1018 se encuentra fosforilada
��� �� [2474249]. Para determinar si estos sitios son fosforilados por la PKA de
levaduras �� � ���, diseñamos los péptidos que se muestran en la Tabla II.6 y
estudiamos su fosforilación utilizando como fuente enzimática mezcla de Tpks
purificadas. En la Figura II.14 se puede observar que ambos péptidos resultaron
fosforilados por la PKA de levaduras �� � ���. El péptido Ira24ser1745 se
comportó como un buen sustrato de las Tpks con una /�=100 MM y una /��� =
614 min41. La /��resultó por lo tanto de 6.14 min41.MM41. Estos valores indican
que este péptido se fosforiló eficientemente con un comportamiento similar a
Nth141 (descripto en el capítulo I).
El péptido Ira24ser1018, sin embargo, resultó muy poco fosforilado por las Tpks
(/� = 545 MM; /��� = 311 min41). En función de los resultados presentados en el
Capítulo I, consideramos que el péptido Ira24ser1018 se fosforila
ineficientemente por la presencia de los residuos ácidos presentes en P+1 y
P+2.
Tabla II.6. Péptidos derivados de la proteína Ira2 y sus parámetros cinéticos. En negrita se
indica la secuencia consenso RRXS que incluye la serina fosforilable; los superíndices indican la
posición del correspondiente residuo en la secuencia primaria completa de la proteína.
�C4� ��� ����� �� 0�� 0���� 04�
Ira24ser1018 IRTRRYS1018DESLG 545 MM 311 min41 0.57 min41.MM41
Ira24ser1745 DILRRNS1745CATRS 100 MM 614 min41 6.14 min41.MM41
Capítulo II 152
0 250 500 7500.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25Nth141Ira24ser1018Ira24ser1745
sustrato (����M)
pm
ol/
min
Figura II.14. Fosforilación �� � ��� con Tpks purificadas de péptidos derivados de la
proteína Ira2. Ensayo cinético representativo utilizando como fuente de enzima mezcla de Tpks
purificadas y los péptidos derivados de la proteína Ira2. Como control se utilizó el péptido Nth14
1 utilizado en el Capítulo I.
Sabiendo que al menos uno de los péptidos derivados de Ira2 es fosforilado
eficientemente ��� ���, nuestro próximo objetivo fue ensayar la fosforilación de
la proteína ��� ���. Tanto por la metodología TAP (cepa IRA24TAP) como por
inmunoprecipitación con anticuerpo anti4HA (cepa IRA24HA), la cantidad de
proteína purificada no resultó suficiente para los ensayos de fosforilación.
Además, la proteína inmunoprecipitada resultaba proteolizada durante el
ensayo de fosforilación.
��������� han propuesto que la regulación de las proteínas Ira1/2 es llevada a
cabo por la unión de la proteína Gpb1/Krh2. Esta regulación negativa sucede a
nivel de la degradación de las proteínas ya que la unión de Gpb1/Krh2 al
dominio carboxilo terminal de Ira1/2 promueve la proteólisis ubiquitina
dependiente [252]. Sin embargo, trabajos previos se contradicen con estos
resultados ya que proponen que la unión de las proteínas Gpb1/Krh2 y
Gpb2/Krh1 a Ira1/2 estabilizan la proteína [241]. Se ha demostrado también que
la proteína Gpb2/Krh1 interactúa ��� ��� con las tres isoformas de las Tpks y con
holoenzima reconstituida ��� ��� [244]. Los mismos autores han demostrado que
la unión de Gpb2/Krh1 a las Tpks promueve la formación de la holoenzima, y
por lo tanto se sugiere que las proteínas Gpb1/2 podrían actuar como
Capítulo II 153
reguladores negativos de la PKA [244]. Recientemente Budhwar et al
encontraron que en ausencia de glucosa Gpb1/2 estabilizan los niveles
proteicos de Bcy1 y promueven su fosforilación en el ����� II de serinas por
una quinasa aun no conocida [253,254]. Esta estabilización y fosforilación de la
subunidad regulatoria favorecería la unión de Bcy1 con las subunidades
catalíticas contribuyendo al apagado de la señal. Los autores proponen que la
regulación de los niveles de Bcy1 así como la fosforilación en el ����� II no
sería un efecto directo de las proteínas Gpb1/2 sobre la subunidad R sino que
estas proteínas estarían actuando directamente sobre las Tpks, ya sea
modificando su actividad o afectando su localización subcelular [254]. Todos
estos resultados sugieren que las proteínas Gpb1/2 actuarían como reguladores
negativos de la vía cAMP4PKA: por un lado actuando directamente sobre la PKA
promoviendo la formación de la holoenzima y por el otro estabilizando a las
proteínas Ira1/2 para que puedan ejercer su actividad GAP sobre las proteínas
Ras inactivándolas para frenar la actividad de la adenilato ciclasa.
Si bien un aumento en la estabilidad de Ira1/2 afecta de manera directa su
actividad GAP, sería importante determinar cuáles son los mecanismos
moleculares que conllevan a la regulación de dicha actividad cuando los niveles
de la proteína se encuentran estables. Basándonos en los resultados reportados
para NF1 y a los resultados de fosforilación ��� ��� de los péptidos derivados de
Ira2, proponemos que la fosforilación por PKA de la ser 1745 y, en mucha
menor medida la de la ser1018 podría presentar un rol regulatorio para la
actividad Ira24GAP. Esta fosforilación podría activar la actividad GAP de la
proteína Ira2 o favorecer la interacción de Ira2 tanto con Ras como con Gpb1/2
y así contribuir al apagado de la señal (ver detalles más adelante en Figura
II.17).
Nuestro próximo paso será determinar si la proteína Ira2 es fosforilada ��� ��
por PKA, y si esta fosforilación es importante para la regulación de su actividad
GAP y/o el reclutamiento de otros factores involucrados en la transducción de la
señal.
Capítulo II 154
II.2.6. Localización subcelular de Hsp60 y PKA
En mamíferos, PKA juega un rol crítico en la fisiología mitocondrial, además a
partir de mitocondrias purificadas, se han aislado tanto la subunidad catalítica
como las subunidades RI y RII [255]. Esto sugiere que la PKA activada en esta
organela puede fosforilar eficientemente diversos sustratos y modula su
función. La señalización vía cAMP hacia la mitocondria depende de que ocurra
la correcta localización de PKA en la membrana externa mitocondrial, y esta
localización se da a través de la interacción de la holoenzima con la AKAP121,
la cual la ancla a la mitocondria [256].
Las condiciones del cultivo afectan considerablemente la actividad mitocondrial
en levaduras. Las funciones mitocondriales se encuentran reprimidas y el
contenido de ADNmt se haya reducido cuando las células crecen en presencia
de glucosa [257]. Por el contrario, el crecimiento en una fuente de carbono no
fermentable estimula la respiración e incrementa en contenido de ADNmt.
Mucha de esta regulación es llevada a cabo por la estimulación de la vía
cAMP/PKA sobre la transcripción de genes nucleares, y posiblemente,
mitocondriales. La transcripción de genes mitocondriales requiere de la
fosforilación de diversos sustratos mitocondriales de PKA [258].
Las chaperonas de la familia Hsp60 son los componentes más importantes del
sistema de plegado de proteínas en la matriz mitocondrial [259]. La importancia
de estas chaperonas en la biogénesis mitocondrial fue identificada a partir del
análisis de mutantes termosensibles de ��������������� ��[186] �
Estos antecedentes sumados al hecho de que Hsp60 es sustrato de PKA,
sugieren que un pool de PKA podría ser dirigido hacia o dentro de la
mitocondria. La presencia de PKA mitocondrial en levaduras ha sido propuesta
por Rahman� �� ��� [258,260,261], basándose en la medición de actividad
quinasa en fracciones mitocondriales purificadas. Sin embargo hasta el
momento no hay evidencias que demuestren la presencia física de las
subunidades regulatoria y catalíticas en dicha organela.
En mamíferos, por otro lado, se ha demostrado que Hsp60 estaría involucrada
en diversas funciones celulares en las cuales la mitocondria no se encuentra
implicada. Por ejemplo, Hsp60 participa en los sistemas de transporte de
aminoácidos [262,263], transducción de señales [264], presentación antigénica
Capítulo II 155
[265] entre otros. También se la ha encontrado en la superficie de ciertas
células tumorales [188,266] y células estresadas [267]. Estos roles diversos
son inconsistentes con una localización exclusivamente mitocondrial de Hsp60.
También se ha demostrado que una cepa de levaduras que presenta una
proteína Hsp60 termosensible (��89��) puede ser complementada con la
proteína SCS1 de localización citoplasmática revirtiéndose el fenotipo [268].
Basándonos en estos antecedentes y en nuestros resultados en los cuales
demostramos que Hsp60 y Bcy1 se encontrarían formando parte de un
complejo proteico ��� �� (ver sección II.2.1), y que Bcy1 y Hsp60 interactúan
�� � ���, decidimos evaluar la co4localización de Hsp60, Bcy1 y Tpk1 en
condiciones normales y en estrés térmico. Para ello, a partir de una cepa que
sobreexpresa la proteína recombinante Hsp604HA4His realizamos
preparaciones de fracción mitocondrial cruda por centrifugación diferencial de
un cultivo sometido a estrés térmico (2 horas, 37ºC) y de un cultivo en
condiciones normales de crecimiento. Mediante ����� ���� se determinó la
presencia de Bcy1, Tpk1 y Hsp604HA4His en las distintas fracciones
correspondientes a los diferentes pasos de centrifugación. Como control se
determinó la presencia de Pyk1 como marcador de proteínas citoplasmáticas y
de Pma1como marcador de proteínas integrales de membrana. En la Figura
II.14 se observa que Hsp60 se halla tanto en las fracciones citoplasmáticas
como en la fracción mitocondrial cruda (Mit (sbn) y Mit (pellet)) en condiciones
normales de crecimiento y a 37ºC. En levaduras se ha descripto que la
chaperona Hsp60 tiene una localización exclusivamente mitocondrial [269]. La
proteína es codificada por un gen nuclear [185] para luego ser traducida en el
citosol como un precursor el cual posteriormente es translocado a la
mitocondria y procesado proteolíticamente [270]. La presencia de Hsp604HA4
His en el citoplasma puede deberse a la acumulación de la proteína
sobreexpresada que no pudo ser translocada hacia la mitocondria. Sin
embargo, tomando como referencia los datos presentes en la literatura que
hemos mencionado anteriormente, en los cuales se ha demostrado que esta
chaperona está involucrada en numerosos procesos celulares extra
mitocondriales, no podemos descartar la posibilidad de la existencia de un�����
citoplasmático de Hsp60. También podemos observar que cuando las células
Capítulo II 156
se someten a estrés térmico aumentan los niveles de Hsp604HA4His en la
fracción mitocondrial cruda (Mit (pellet)).
En la Figura II.15 observamos que Bcy1 se encuentra tanto en las fracciones
citoplasmáticas como en la fracción mitocondrial y además los niveles de Bcy1
en la fracción mitocondrial aumentan frente al estrés térmico. Para Tpk1 se
observa que solo después de someter a las células al estrés térmico se
observa presencia de Tpk1 en la fracción mitocondrial cruda. Resultados
preliminares de nuestro laboratorio obtenidos por microscopía de fluorescencia
utilizando una cepa que expresa Tpk14GFP y sometiendo a las células a estrés
térmico de 37ºC durante distintos tiempos (5, 10 y 15 minutos), sugieren que
Tpk1 se localiza en la mitocondria después del estrés térmico.
Figura II.15. Localización subcelular de Hsp60%HA%His, Bcy1 y Tpk1 mediante
centrifugación diferencial. La cepa Hsp604HA4His fue crecida en YP Galactosa 2% a 30ºC
hasta alcanzar una DO600nm. Luego las células fueron incubadas durante 2 horas a 30ºC o a
37ºC (estrés térmico). Los extractos proteicos se sometieron a una centrifugación diferencial
para obtener las distintas fracciones subcelulares, tal como se detalla en la Sección Materiales
y Métodos. Las muestras fueron sembradas en �)���'�4 y el revelado se realizó utilizando
anticuerpo anti4HA, anti4Pma1, anti.Pyk1, anti4Bcy1 c4terminal o anti4Tpk1 según corresponda.
Como control de carga se muestra una sección de las membranas post4transferencia teñidas
con Rojo Punceau. �6<992 sobrenadante 6<99&�; �5999����59992�sobrenadante y pellet del
5�999&�, respectivamente; � � E��:���� ��E����:2 sobrenadante y pellet (fracción mitocondrial
cruda) del 65�999&�.
Capítulo II 157
Si bien hasta el momento no se había descripto aun la presencia física de PKA
dentro de la mitocondria, diversos trabajos demuestran la participación de la
enzima en diferentes procesos biológicos que ocurren en esta organela. En
mamíferos, se han descripto diferentes AKAPs mitocondriales, pero estas
AKAPs anclan a la PKA en la membrana exterior mitocondrial [88,271,272].
Los resultados obtenidos a partir del fraccionamiento subcelular no nos
proveen la información necesaria para asegurar la presencia de Bcy1 y Tpk1
dentro de la mitocondria, ya que las preparaciones utilizadas corresponden a
fracciones mitocondriales crudas. Para la PKA tipo I y II de mamíferos, se
demostró que se encuentran localizadas en la membrana externa mitocondrial.
Como se mencionó en la introducción de este capítulo, en levaduras se ha
demostrado que la PKA fosforila a la proteína Tom70, que forma parte del
complejo de importación TOM. Tom70 se encuentra anclada en la membrana
externa mitocondrial y está involucrada en la importación de ciertos
precursores mitocondriales. El sitio de fosforilación para la quinasa se
encuentra expuesto hacia el citoplasma y la fosforilación de Tom70 impide la
interacción con la chaperona Hsp70 encargada de transportar ciertos
precursores hacia la mitocondria [181]. Estos resultados apoyan la idea de que
en levaduras las PKA podría encontrarse localizada cerca de la membrana
externa mitocondrial.
Existen además resultados publicados en la literatura que demuestran la
interacción de Hsp60 y la proteína fosfofructoquinasa 1 (Pfk1) (proteína
citoplasmática) de levaduras [273] [193], lo cual indica que es posible la
interacción de Hsp60 con proteínas citoplasmáticas. Una propuesta sería que
Hsp60 se una a Bcy14Tpk en citoplasma y las transportara hacia la membrana
mitocondrial y este proceso podría ser regulado por estrés térmico.
�
�
II.2.7. Relevancia fisiológica de la interacción Bcy1%Hsp60
Tomando en cuenta estos antecedentes y nuestros resultados que sugieren
una interacción �� � ��� (proteómica y co4localización) e �� � ��� (����� de
péptidos y ensayos de ���������) entre PKA y Hsp60, nos planteamos como
próximo objetivo determinar si la actividad de la PKA de levaduras y los niveles
Capítulo II 158
de la proteína Tpk1 se encuentran regulados por esta chaperona. Para abordar
este objetivo utilizamos la cepa HSP60ts, la cual cuando crece a la temperatura
no permisiva (37ºC) presenta una proteína no funcional. Las cepas HSP60ts y
HSP60wt se crecieron toda la noche a 30ºC en el medio adecuado. Luego se
sometieron los cultivos a la temperatura no permisiva (37ºC) durante distintos
períodos de tiempo. Para cada tiempo se ensayó la actividad quinasa
dependiente de cAMP en el extracto crudo utilizando kemptido como sustrato y
se determinaron los niveles endógenos de Tpk1 mediante ���������. Como
control se determinaron los niveles proteicos de Pyk1.
En la Figura II.16 se observa que la actividad quinasa dependiente de cAMP
para la cepa salvaje disminuye levemente cuando las células se encuentran
37ºC. Griffioen ���� han demostrado que, cuando las células de levaduras que
están creciendo en un medio con glucosa como fuente de carbono son
sometidas a un estrés térmico, hay un redistribución de Bcy1 desde el núcleo
hacia el citoplasma y una consecuente hiperfosforilación de los ����� de
serinas I y II presentes en el extremo amino terminal de la proteína [119]. Se
observó que esta redistribución e hiperfosforilación de Bcy1 no afecta la
actividad quinasa de la holoenzima. Hasta el momento, estos son los únicos
datos presentes en la literatura que describen el comportamiento de PKA frente
a este tipo de estrés. Nuestros resultados concuerdan con estas observaciones
ya que los niveles de actividad quinasa registrados mostraron poca variación a
lo largo del experimento.
En cambio, para la cepa HSP60ts la disminución en la actividad quinasa es
mucho más marcada que en la cepa salvaje. En este caso, hay un descenso
notable de la actividad a medida que aumenta el tiempo de estrés térmico,
llegando a niveles de actividad quinasa que descendieron hasta un 70% con
respecto al tiempo inicial.
Los niveles de Tpk1 acompañan la cinética observada para la actividad
quinasa: en la cepa salvaje los niveles de Tpk1 se mantiene constantes
respecto al tiempo cero, y en la cepa mutante los niveles de Tpk1 descienden a
lo largo del tiempo. Como control, evaluamos los niveles de la proteína Pyk1 y
pudimos observar que los mismos se mantienen constantes tanto en el caso de
la cepa HSP60wt como en la cepa HSP60ts. Estos resultados sugieren que la
Capítulo II 159
unión de Hsp60 a Tpk1 podría favorecer el mantenimiento de la estructura de la
quinasa y asegurar de esta forma su actividad catalítica.
Capítulo II 160
Figura II.16. Niveles proteicos de Tpk1 y actividad quinasa en ausencia de Hsp60. Las
cepas HSP60wt y HSP60ts se crecieron toda la noche en medio mínimo a 30ºC. Las células
fueron sometidas a la temperatura no permisiva (37ºC) por distintos períodos de tiempo. De
cada tiempo se preparó un extracto crudo el cual fue ensayado para la determinación de
actividad quinasa dependiente de cAMP utilizando kemptido como sustrato (C). Cada fracción
fue analizada por �)���'�4 �'�4 y ����� ���� y el revelado se realizó utilizando
anticuerpo anti4Pyk1 (A) o anti4Tpk1 (B) según corresponda. La cuantificación de Pyk1 y Tpk1
se realizó por análisis digital de imagen y cuantificado por densitometría. La intensidad de las
bandas detectadas por %�������� se relativizó a la cantidad proteína sembrada. Los gráficos
corresponden a un experimento representativo.
Capítulo II 161
Como hemos demostrado en la Figura II.16, la actividad quinasa dependiente
de cAMP disminuye en aquellas células que presentan la proteína Hsp60 no
funcional (es decir, en la cepa HSP60ts incubada a 37º). Como hemos
mencionado anteriormente en este mismo apartado, se ha descripto tanto en
mamíferos como en levaduras, una relación funcional entre distintas
chaperonas y quinasas. Específicamente, se ha demostrado que el par Hsp40
(Ydj1)4Hsp70 protege los polipéptidos nacientes de Tpk2 evitando así su
degradación, y además controla la velocidad de maduración de esta isoforma
[179].
Nuestros resultados sugieren una posible relación funcional entre Tpk1 y
Hsp60. En ausencia de esta chaperona los niveles proteicos de la isoforma
Tpk1, así como también la actividad quinasa dependiente de cAMP, se ven
afectados negativamente. El abordaje experimental utilizado no nos permite
concluir si el descenso en la actividad quinasa es sólo a causa de la pérdida de
actividad de la isoforma Tpk1. No descartamos la posibilidad de que las
isoformas Tpk2 y Tpk3 también sean blancos de Hsp60. Tampoco podemos
concluir respecto a si la protección de Hsp60 sobre Tpk1 es a nivel de la
proteína que está siendo sintetizada o sobre la proteína preexistente.
Teniendo en cuenta estos últimos resultados obtenidos planteamos que en el
citoplasma y/o en las cercanías de la mitocondria existiría el complejo Hsp604
PKA, formado por la interacción entre la chaperona y Bcy1. Por lo tanto Hsp60
podría tener dos funciones: darle estabilidad a la quinasa en las fracciones
citoplasmáticas y por otro lado localizaría a la quinasa en la membrana externa
mitocondrial para permitir la regulación del transporte de proteínas
mitocondriales frente a un estímulo de glucosa o frente a un estrés térmico (ver
Conclusiones en esta sección).
II.2.8. Red de interacción de Bcy1
A partir de nuestros resultados obtenidos por proteómica, bioinformática y
ensayos bioquímicos, y tomando los datos de interacción que se encuentran en
la base de datos BioGRID, construimos una red de interacción de Bcy1 que se
muestra en la Figura II.17. Esta red de interacción se construyó utilizando sólo
Capítulo II 162
las interacciones físicas descriptas en la literatura, las cuales incluyen captura
de afinidad4MS, captura de afinidad4���� y doble híbrido. No se tuvieron en
cuenta las interacciones genéticas ni los efectos bioquímicos de una proteína
sobre otra.
Esta red nos permite observar que las proteínas identificadas como interactoras
de Bcy1 también interactúan entre ellas, lo cual genera redes más complejas
que agrupan proteínas con una función biológica similar y proteínas que
participan en una misma vía de tansducción de señal (Tabla II.7). Como
ejemplos puntualizamos que Bcy1 se encuentra formando parte del complejo
compuesto por Gpa24Gpb14Cyr14Ira24Ras1/2, que son proteínas involucrados
en la transmisión de la señal del estímulo de glucosa, o con proteínas
involucradas en el metabolismo de la glucosa, como Pfk1 y Gph1. También
encontramos a la subunidad regulatoria participando del complejo formado por
las chaperonas Ssa1, Hsp82, Hsc82 e Ydj1, lo cual refuerza la idea de la
interacción entre la PKA y las chaperonas moleculares. Finalmente se puede
observar que Bcy1 también interactúa de manera directa con distintas
proteínas mitocondriales como Ilv5 y Kgd1.
Esta red de interacción demuestra que PKA interactúa con diferentes proteínas
involucradas en diversos procesos biológicos. Esto sugiere la necesidad de un
mecanismo que sitúe a la holoenzima cerca de los diferentes sustratos para
responder rápidamente a las señales extracelulares. La interacción de Bcy1
con las proteínas de anclaje, que al mismo tiempo pueden participar en la
transducción de la señal, sería una manera efectiva de asegurar una correcta
transmisión de la señal.
Capítulo II 163
GO Proceso biológico Proteína 7����� ?������ ���������C��7�� Ira2
Gpb1 Bcy1
7���������@� Ira2 Hsc82 Rim15 Ssa1
0C����I�� ,�� ?���� ��������7�� Ras1/2 Bmh1 Tpk1/2/3 Cyr1
������ ���������?���� Bmh1 Gph1 Gdb1
.����� ?������������ Bmh1 Asc1 Gpa2
#�� � ��������� $��� Bmh1 Gpb1 Gpa2
�C�� ����� ��D� ��� Bmh1 Cpa2 Ura2 Aco1 Ilv5 Pdc1
.�$�� ��� ?��������C��� Yak1 Tpk1/2/3 Rim15
0C����I�� ,�� ?������������� Gpb1 Asc1
������� ?�� Rpl1 Eft2
" �C�� ���������*������� ?����=')���
Ald6 Ald4
��������@� *����?� � Pgk1 Fba1 Tdh3 Pfk1 (glucólisis)
7����� ?������������� �� ?�� Spt5 Rpo21
������ ?������������ �������� ��� Aco1 Ilv5 Abf2
# ��������#'� Aco1 Kgd1
������ ������� ������� Ald4 Pdc1
Capítulo II 164
�!�������� ��.) ��� ����&�������� ����������C����
��>����>����6���89�;�36�
) ��� ���� ������� ������� �� ��6�;�36�
7����� ?���������I��������� �����.�6�
���������� ������ �����#��6�
�I�� ,�� ?���C������C����� �����#��6�
)$�$�� ��� ?��������C��� ���6�
" �C�� ���D� �������� .���
Tabla II.7. Procesos biológicos en los cuales se encuentran involucradas las proteínas
que forman el interactoma. GO: Gene Ontology. Los datos se obtuvieron de la base de datos
BioGRID.
Figura II.17. Interactoma de Bcy1. Las proteínas identificadas por nosotros como intercatoras
de Bcy1 se muestran en color rojo. La interacción de estas proteínas con Bcy1 se representó
con una línea sólida, mientras que la interacción entre estas proteínas con otros componentes
de la red se encuentra representada con una línea punteada. Estas últimas interacciones
surgieron luego del análisis de las interacciones descriptas en la base de datos del genoma de
levaduras (SGD). La interacción entre las Tpks con Bcy1 se muestra con una línea sólida
celeste. Aquellas proteínas que forman parte de la red pero que no han sido identificadas por
nosotros se encuentran coloreadas y con bordes punteados. La distancia proteína4proteína es
arbitraria y no se corresponde con el grado de interacción.
Capítulo II 165
Capítulo II 166
II.3% Conclusiones
Los sistemas para la comunicación celular transmiten la información a través
de modificaciones post traduccionales rigurosamente controladas. La
fosforilación de proteínas es una de las modificaciones post traduccionales más
comunes y se encuentra regulada por las acciones opuestas de diferentes
proteínas quinasas y fosfatasas específicas. Estas proteínas tienen un rol
central en los caminos de transducción de señales y difieren en la especificidad
de sustrato, actuando sobre residuos de serina, treonina o tirosina. Debido a
que la fosforilación de proteínas afecta varios procesos celulares, su regulación
debe ser específica y debe actuar sobre un grupo definido de blancos celulares
para asegurar la fidelidad de la señal. La especificidad se logra por el
ensamblaje de distintos complejos enzimáticos en localizaciones subcelulares
definidas a través de las proteínas de anclaje y andamiaje. Esta organización
permite la regulación espaciotemporal de la señalización celular y constituye el
concepto por el cual un camino de señalización común puede derivar en
diferentes funciones.
En el caso particular de la vía de señalización del cAMP, el control temporal
depende, entre otras cosas, de la asociación a proteínas de anclaje que
aseguran la especificidad de la transducción de la señal ubicando a la
holoenzima cerca de sus efectores y sustratos. En mamíferos, las proteínas de
anclaje de la PKA proveen los medios para llevar a cabo el control espacial de
la señal y facilitar el control temporal posicionando adecuadamente a la PKA en
las cercanías de los microdominios de cAMP.
Los mecanismos de localización de la PKA de � ���� � no se encuentran
aun totalmente dilucidados. Como mencionamos anteriormente, la fuente de
carbono afecta la distribución celular de las subunidades catalíticas y
regulatorias de la PKA de levaduras [72]. Hasta el momento, Zds1 es la única
proteína descripta que afecta la localización de Bcy1 cuando las células están
creciendo en ausencia de glucosa.
Todas las AKAPs de mamíferos presentan una α4hélice anfipática de 14418
residuos. Los residuos hidrofóbicos presentes en esta estructura son claves
para la interacción con el dímero de RI o RII. Sin embargo, las proteínas de
anclaje duales presentan un segundo sitio de unión. Dicho sitio está compuesto
Capítulo II 167
por una región de la proteína que presenta una estructura de α hélice, y
residuos con carga positiva que participan en la interacción. En el caso de las
proteínas analizadas en esta sección que interactúan con Bcy1, si bien se
predice una α4hélice anfipática, la presencia de residuos hidrofóbicos resultó
desfavorable para la interacción con Bcy1, mientras que los residuos con carga
positiva resultaron claves. A partir de los resultados obtenidos en los ������
surge como conclusión que el dominio aminoterminal de Bcy1 participa en la
interacción con las secuencias derivadas de las proteínas candidatas que unen
Bcy1, ya sea porque la falta de dicho dominio previene la dimerización y se
pierde la interacción o por la falta de residuos necesarios para la interacción.
Un análisis bioinformático realizado por nuestro laboratorio indica que la
superficie de contacto de Bcy1 con el dominio AKB sería más polar que la que
se encuentra en la R de superiores [274]. Por lo tanto, sería razonable pensar
que la interacción entre Bcy1 y las posibles AKAPs de levaduras no tenga una
naturaleza hidrofóbica, sino más bien polar. En estos momentos se están
realizando en el laboratorio estudios bioinformáticos para modelar la posible
interacción péptidos interactor4Bcy1.
En esta parte de la tesis hemos demostrado que péptidos derivados de
distintas proteínas identificadas por proteómica y bioinformática, interactúan
con Bcy1. Estas interacciones fueron corroboradas por ensayos de ���������� ��
� ���. Basándonos en los antecedentes que se encuentran en la literatura, nos
resultó interesante profundizar en la interacción entre Bcy14Ira2 y Bcy14Hsp60.
Para estos dos pares de interactores encontramos que:
• Bcy1 co4fracciona e interactúa ��� �� con Ira2.
• Péptidos derivados de Ira2 que presentan sitios consenso para PKA son
fosforilados ��� ��� por mezcla de Tpks.
• Hsp60 y Bcy1 se encuentran co4localizando en la fracción
correspondiente al citosol y en la fracción mitocondrial y los niveles de
Bcy1 aumentan en esta última fracción luego de someter a las células a
un estrés térmico. Tpk1 se detecta en la fracción mitocondrial cruda
luego del estrés térmico.
Capítulo II 168
• La ausencia de Hsp60 provoca una disminución en los niveles proteicos
de Tpk1 y en la actividad quinasa dependiente de cAMP.
Estos resultados reflejan una posible relación funcional entre la PKA y las
proteínas Hsp60 e Ira2.
Si bien ninguna de estas proteínas presenta las características clásicas
presentes en las AKAPs de mamíferos, se ha demostrado claramente la
interacción con Bcy1. Para esta interacción son de gran importancia los
residuos básicos presentes en los péptidos derivados de estas proteínas, y
además se demostró que el extremo amino terminal de Bcy1 participa en esta
interacción y en la dimerización. Las características de este dominio de
interacción son similares al dominio RISR presente en las AKAPs de
especificidad dual, las cuales presentan este dominio además de la α hélice
anfipática característica de las AKAPs de mamíferos. El dominio RISR actuaría
en forma sinérgica a la α hélice anfipática para incrementar el anclaje de la
PKA tipo I.
La proteína Bcy1 podría hacer interacción con dos dominios de las proteínas de
anclaje, y tal vez nosotros hemos detectado y caracterizado uno de estos
dominios.
La presencia de otro dominio con las características del dominio canónico de
las AKAPs parece difícil de identificar, ya que a pesar de haber realizado
análisis bioinformáticos con secuencias consenso de AKAPs no hemos podido
identificar estos motivos en las proteínas estudiadas.
En el caso de la interacción Ira24Bcy1, la ubicación de PKA cerca del lugar
donde se recibe el estímulo, asegura en primera instancia la pronta activación
de la holoenzima. Tomando en cuenta los antecedentes reportados en la
bibliografía y los resultados expuestos en esta sección podríamos plantear que
en una situación sin glucosa en el medio, Gpb1/2 se encuentra unida a PKA a
través de su interacción con las Tpks y favoreciendo la formación de la
holoenzima [244] (Figura II.18 (1)). Esta interacción evita que las Tpks ejerzan
su acción inhibitoria sobre una quinasa aun no conocida que puede fosforilar a
Bcy1 en el ����� II de serinas, impidiendo de esta manera la disociación de la
holoenzima [253,254]. Se ha propuesto que esta fosforilación sobre Bcy1 le
confiere estabilidad a la pro
inhibir a las Tpks [253]. Ad
favorecería la interacción
residuos básicos presentes
ausencia de glucosa los niv
glucosa se une al receptor
GTP en Gpa2 y en la prote
Gpa24GTP y Ras4GTP es
ciclasa. El cAMP generado
PKA, provocando la disocia
de glucosa las proteínas G
aun desconocido), pierden
inhibir a la quinasa respon
disminución de los niveles d
a Ira2 y la estabilizan, aum
subunidades catalíticas act
presentes en Ira2 (Figura II
unión con Ras y/o con Gpb
Ras4GAP de Ira2 para ate
modo, se daría una regulac
por un lado a la inactivación
vía Ras) y por el otro lado a
de Gpb1/2 sobre las Tpks
consecuente apagado de la
II.18.
Figura II.17. Modelo propues
Harashima, T. et al 2006).
(2): Budhwar et al (2010 & 2011)
dad a la proteína, de forma tal que se encuentra disp
. Además, la fosforilación de la subunidad
interacción de la PKA con la proteína Ira2 a tra
s presentes en el dominio de unión (nuestros resu
cosa los niveles de la proteína Ira2 son bajos [241]
al receptor Gpr1 (Figura II.18 (2)) ocurre el interca
en la proteína Ras, en este último caso por acción
GTP estimulan la producción de cAMP por l
P generado puede unirse a las subunidades regula
o la disociación y la activación de la holoenzima. E
proteínas Gpb1/2 se encuentran inhibidas (por un
o), pierden la interacción con las Tpks y éstas pu
asa responsable de la fosforilación de Bcy1, favo
los niveles de Bcy1 [253]. En estas condiciones, Gpb
bilizan, aumentando los niveles proteicos de la pr
talíticas activadas podrían fosforilar las serinas 10
a2 (Figura II.18 (3)). La fosforilación de Ira2 podría e
y/o con Gpb1/2, como así también podría estimular
a2 para atenuar la actividad de la adenilato ciclas
na regulación a través de un $����� negativo, q
inactivación directa de la adenilato ciclasa (a través
el otro lado a la inactivación sobre la PKA (a través d
re las Tpks y sobre el estado de fosforilación de Bc
agado de la señal. Todo lo planteado se resume e
lo propuesto para la interacción entre Ira2 y Bcy1 (
: fosfatos; círculos rojos: cAMP; (1): Peeters et a
2011) [253,254]. Ver detalles en el texto.
Capítulo II 169
cuentra disponible para
subunidad regulatoria
Ira2 a través de los
uestros resultados). En
[241]. Cuando la
re el intercambio GDP4
o por acción de Cdc25.
cAMP por la adenilato
ades regulatorias de la
loenzima. En presencia
as (por un mecanismo
y éstas pueden ahora
Bcy1, favoreciendo la
iciones, Gpb1/2 se une
os de la proteína. Las
s serinas 1018 y 1745
ra2 podría estabilizar la
a estimular la actividad
nilato ciclasa. De este
negativo, que llevaría
sa (a través de la señal
A (a través de la acción
lación de Bcy1), con el
se resume en la Figura
y Bcy1 (Adaptado de
Peeters et al (2006) [244];
Capítulo II 170
Capítulo II 171
Se ha demostrado que las chaperonas están íntimamente relacionadas con el
plegado y la estabilización de distintas proteínas quinasas, estabilizando la
proteína madura o su precursor. La interacción entre Bcy1 y Hsp60, ya sea en
el citoplasma como en la mitocondria, podría tener como finalidad mantener
próximas las subunidades catalíticas con las chaperonas. De esta manera, se
mantendría la funcionalidad de la quinasa asegurando una respuesta rápida y
eficiente de la PKA frente al estímulo.
Se ha demostrado que la PKA regula negativamente el sistema de importación
mitocondrial a través de la fosforilación del receptor Tom70. Esto indica que la
PKA está involucrada en la regulación de las proteínas mitocondriales y que es
necesaria la localización de la holoenzima cerca de la mitocondria.
En base a los resultados obtenidos y a los antecedentes antes mencionados
proponemos que una de las consecuencias de la interacción Hsp604Bcy1 sería
acercar a PKA a la mitocondria. Cuando las células se encuentran en presencia
de glucosa el ATP se genera por la fermentación de este azúcar. En estas
condiciones la importación de preproteínas mitocondriales así como la actividad
mitocondrial debe disminuir. Este control ocurre a nivel de la fosforilación del
receptor Tom70 por PKA: la PKA que se encuentra localizada cerca de la
membrana mitocondrial gracias a su interacción con Hsp60 se activa como
consecuencia del estímulo de glucosa, las Tpks fosforilan la Ser174 de Tom70
y esta fosforilación impide que Hsp70 interactúe con Tom70 y se inhibe de esta
manera la importación de las preproteínas mitocondriales (Figura II.18) [181].
Otra situación en la cual la importación de preproteínas hacia las distintas
organelas se ve impedida es cuando las células se enfrentan a un estrés
térmico, esto previene la agregación de proteínas mal plegadas en los distintos
compartimentos subcelulares. Se demostró que en estas condiciones las
preproteínas que se encuentran interactuando con las chaperonas no son
liberadas y quedan unidas a éstas hasta que las condiciones vuelven a ser las
adecuadas [275]. Particularmente para Hsp70, se ha demostrado que en esta
situación la chaperona puede actuar como una “sostenedora”, previniendo la
liberación de los sustratos unidos bajo condiciones que favorecerían su
agregación. Nuestros resultados indican que frente a un estrés térmico Hsp60,
Bcy1 y Tpk1 aumentan su localización en la fracción mitocondrial. Proponemos
que durante el estrés térmico, Hsp60 dirige a la PKA hacia la membrana
Capítulo II 172
mitocondrial y allí, una vez activada podría fosforilar a Tom70 para inhibir la
importación de precursores mal plegados hacia la mitocondria y, por otro lado,
evitar su agregación.
También hemos demostrado que en ausencia de Hsp60, tanto los niveles de
Tpk1 como la actividad PKA disminuyen. Esto sugiere que otra posible función
de la interacción Hsp604Bcy1 es la de acercar a la chaperona a las Tpks para
colaborar con el plegado de las mismas y con la mantención de su estabilidad
inmediatamente después de sus síntesis y previo a la unión con la subunidad
regulatoria.
Figura II.18. Posible rol para la interacción entre Hsp60 y Bcy1 (Adaptado de Rao, S ����,
2011). �-�2� membrana externa mitocondrial; �-�2� translocasa de la membrana externa
mitocondrial; círculos rojos: cAMP.
Resulta interesante que tanto en el estímulo por glucosa como en el estrés
térmico, los ����� de serina I y II de Bcy1 resultan hiperfosforilados. Esta
distribución de cargas negativas sobre el extremo amino terminal de la
subunidad regulatoria permitiría la interacción con los residuos básicos en los
péptidos sobre estas proteínas que demostramos interactúan con Bcy1.
��������������������������������������
�
��!!����$$""����!!���������������� ��$$������
Conclusiones Generales 174
Para comprender en profundidad cómo es regulado el mecanismo de
activación de la PKA, es necesario conocer en detalle los factores involucrados
en el reconocimiento de la enzima por el sustrato, así como también aquellos
que facilitan la rápida y eficiente transmisión de la señal a través de la
localización de la holoenzima en lugares estratégicos en el interior celular. En
esta Tesis hemos avanzado en la caracterización del sitio de reconocimiento de
la PKA así como también en las proteínas que hacen interacción con la
holoenzima a través de la subunidad regulatoria acercándola a sus proteínas
sustrato.
En el Capítulo I de esta Tesis planteamos como principal objetivo determinar
las características de la estructura primaria que rodea al sitio de fosforilación
de la PKA de � � ��� � para comprender más en detalle cuáles son los
determinantes que hacen que un péptido o proteína sea mejor sustrato que
otro. Hemos confirmado resultados que han sido previamente sugeridos en la
literatura, como que la Arg en posición P42 y P43 son determinantes
importantes del sitio de fosforilación y que cargas positivas extras en la región
que flanquea al extremo N4terminal de P0 son beneficiosas para el
reconocimiento del sustrato. Además hemos demostrado que la presencia de
un sitio Arg4Arg4X4Ser no es suficiente para que el sustrato sea reconocido
como tal por la enzima, ya que un sitio con esa secuencia pero con residuos
ácidos en posición P+1 no es reconocido como buen sustrato. El mejor sustrato
posee un residuo ácido en la posición P+4, tal como ocurre en el IS de las
subunidades R de hongos. Estas características deberían ser incluidas en los
programas de predicción de sitios de fosforilación para PKA de levaduras.
Hasta el momento, para las tres isoformas de la subunidad catalítica de la PKA
de � ���� � se han demostrado roles fisiológicos diferentes y redundantes.
Además, el trabajo publicado donde se realizó un análisis global de los sitios de
fosforilación en levaduras indica que cada Tpk reconoce una gran cantidad de
sustratos únicos.
Nuestros resultados provenientes del análisis de las proteínas Nth1, Pyk1 y
Pyk2, descriptas como sustratos únicos para Tpk1, indican que el
comportamiento cinético de Tpk1 y Tpk2 hacia estos sustratos fisiológicos es el
mismo para ambas isoformas. Este comportamiento cinético se observó tanto
Conclusiones Generales 175
para las proteínas enteras como para sus péptidos derivados que poseen el
sitio de fosforilación. También hemos demostrado que la actividad catalítica
entre ambas isoformas es idéntica.
Según se puntualizó en la Introducción, el anclaje de la PKA y la existencia de
microdominios de cAMP proveen un mecanismo para controlar la especificidad
temporal y espacial de la vía cAMP4PKA.
Si bien Tpk1 y Tpk2 muestran la misma selectividad de sitios �� � ���, no
necesariamente pueden fosforilar el mismo sustrato ��� ��. Las diferencias en
la localización de la quinasa y el sustrato deben contribuir al reconocimiento de
este último por una de las isoformas, lo que permitiría explicar por qué cada
variante de las Tpks tiene una función fisiológica única.
Finalmente también demostramos la participación del sustrato, tanto como
péptido como proteína completa, en la sensibilización de la PKA por cAMP. Si
bien este concepto había sido probado para la holoenzima de mamíferos,
hemos avanzado en este punto demostrando que existe una correlación entre
el comportamiento de los péptidos como sensibilizadores de la activación por
cAMP de la PKA y su comportamiento como sustrato. Los mejores sustratos
actuaron también como mejores sensibilizadores. Esto sugiere que la
sensibilización ocurre a nivel de la competición entre el sustrato y la región IS
de la subunidad regulatoria. Utilizando la proteína Pyk1 pudimos observar que
las proteínas completas resultan mejores activadores que el péptido derivado
conteniendo la secuencia de fosforilación, sugiriendo la participación de otros
puntos de contacto entre R y C.
Mediciones de actividad PKA �� �� en células permeadas de levaduras,
indican que de la actividad total de PKA presente en la célula sólo se puede
determinar el 1% o 2% de la misma, indicando que existe un efecto inhibitorio
de la actividad PKA dentro de la célula dado por la misma subunidad
regulatoria [152]. Esto sugiere que la PKA no está libremente accesible al
péptido empleado en el ensayo �� ��. La concentración local del sustrato y del
cAMP son claves para el mecanismo de activación de la holoenzima. La
disponibilidad del sustrato y cómo el mismo sensibiliza a la holoenzima frente al
cAMP pueden ser considerados como un mecanismo fino de regulación en la
activación de la PKA.
Conclusiones Generales 176
Tratando de avanzar en el entendimiento de la especificidad de la respuesta, el
objetivo planteado en el Capítulo II fue la búsqueda, identificación y
caracterización de posibles proteínas de anclaje para la PKA de levaduras.
Hemos identificado diferentes proteínas que se unen a la subunidad regulatoria
de levaduras, las cuales presentan distintas y variadas funciones y
localizaciones subcelulares.
En mamíferos se han descripto y caracterizado numerosas proteínas de
anclaje, las cuales interactúan con las subunidades R a través de un motivo
conservado formado por una α hélice anfipática presente en las AKAPs. La
cara hidrofóbica de esta hélice contacta con el surco hidrofóbico formado por
los dímeros de R. Sin embargo, nuestros resultados demuestran que en
������������ ��� � la interacción entre las proteínas de anclaje con
Bcy1 presenta características diferentes respecto a lo que ocurre en
mamíferos. Demostramos que la presencia de residuos con carga positiva son
claves para la unión con Bcy1. Estas características son semejantes a las
demostradas para la interacción de R con las AKAPs duales de mamíferos, en
las cuales además de la α hélice anfipática existe otro punto de contacto sobre
la AKAP que es el dominio RISR, el cual presenta como determinantes claves
para la interacción residuos con carga positiva. El dominio que hemos
identificado como interactor con Bcy1 podría ser un segundo sitio de
interacción tal como ocurre con las AKAPs duales, o puede ser el único
dominio involucrado en esta interacción. Esta última posibilidad podría explicar
la dificultad en encontrar proteínas de anclaje en levaduras, ya que se ha
apuntado en general a la búsqueda de dominios con α hélices anfipáticas. Si
bien en los dominios de interacción definidos en el Capítulo II se pueden
predecir α hélices, los residuos hidrofóbicos no son importantes en la
interacción.
La interacción con las proteínas identificadas ocurre a través del extremo N4
terminal de R. Este extremo amino terminal es necesario para que la subunidad
regulatoria forme dímeros. Con los experimentos realizados en esta Tesis no
podemos concluir si la falta de dimerización es responsable de impedir la
interacción con las proteínas o si la interacción no ocurre por falta de los
residuos involucrados en la unión con las proteínas blanco.
Conclusiones Generales 177
En el extremo N4terminal de Bcy1 se han descripto dos regiones ricas en
serinas que varían su fosforilación según las condiciones nutricionales del
medio y el estrés. Proponemos que la presencia de grupos fosfato de las
serinas fosforiladas pueden ser los puntos de interacción con las cargas
positivas definidas como claves sobre las proteínas interactoras. El cambio en
el patrón de fosforilación podría tener como finalidad modular la interacción de
Bcy1 con estas proteínas.
Para avanzar en la caracterización de las proteínas interactoras se analizaron
distintos aspectos de la interacción entre Bcy14Ira2 y Bcy14Hsp60.
En el caso de la interacción Bcy14Ira2 determinamos que ambas proteínas co
localizan ��� �� y que péptidos derivados de Ira2 son fosforilados por las Tpks
��� ���. Ira2 es una proteína que se encuentra involucrada en el apagado de la
señal de la vía del cAMP, a través de su actividad GAP sobre Ras. La
fosforilación de Ira2 por PKA podría colaborar con la regulación de la actividad
GAP de Ira2. En este caso, el mismo sustrato podría estar localizando y quizás
participando en la activación de la PKA para que ocurra una rápida y eficiente
transducción de la señal.
Como se ha mencionado en el Capítulo II, las chaperonas presentan otras
funciones además de ayudar al plegado de las proteínas. La unión de estas
moléculas a las proteínas quinasas mantiene la estabilidad de las mismas y
colabora con su maduración. Hemos demostrado que en ausencia de Hsp60
los niveles proteicos y la actividad quinasa de Tpk1 disminuyen
considerablemente. Esto sugiere que una de las posibles consecuencias de la
interacción Bcy14Hsp60 podría ser acercar a la chaperona a las Tpks para
mantener la estabilidad de la actividad quinasa.
Por otro lado observamos que la localización de Bcy1, Tpk1 y Hsp60 varían
durante el estrés térmico, ya que existe una re localización hacia la mitocondria
de estas tres proteínas. Cuando existe un estrés térmico la importación de
proteínas mitocondriales se detiene. Otra función de Hsp60 sería la de llevar a
la PKA hacia la membrana externa mitocondrial para regular mediante la
fosforilación de Tom70 la importación de proteínas hacia la mitocondria. Está
demostrado que durante el estrés térmico está disminuido el transporte
mitocondrial como consecuencia de que Hsp70 es incapaz de replegar
Conclusiones Generales 178
correctamente sus sustratos, y trabajaría como un reservorio de proteínas mal
plegadas para evitar su agregación.
Durante el estrés térmico aumenta la actividad PKA, y como demostramos,
ocurre una mayor localización de PKA en la fracción mitocondrial, lo cual podría
conducir a un aumento de la fosforilación de Tom70, y consecuentemente a
una reducción del transporte de proteínas mitocondriales, como ha sido
demostrado en condiciones de baja disponibilidad de glucosa.
Por lo tanto Hsp60 podría cumplir dos funciones: acercar a la PKA a la
mitocondria para que regule los sustratos involucrados en la importación
mitocondrial y, al mismo tiempo, ayudar a mantener la estabilidad de la
quinasa.
Si bien es necesario realizar más abordajes para determinar fehacientemente
que estas proteínas son homólogas en su función a las AKAPs de mamíferos,
los resultados obtenidos son muy prometedores al respecto. Resulta importante
remarcar que hasta el momento no hay proteínas de anclaje descriptas en
levaduras, a excepción de Zds1, y que este trabajo abre la posibilidad de un
estudio más profundo sobre este tema.
Los resultados obtenidos en esta Tesis demuestran que en ������������
��� � tanto la localización de PKA como el reconocimiento de los sustratos
depende fuertemente de la secuencia primaria de las proteínas de anclaje y de
los sustratos, respectivamente.
Debido a que las células de levaduras deben responder de manera rápida a los
cambios generados en el ambiente, es de suma importancia que todos los
componentes moleculares involucrados en la respuesta al estímulo se
encuentren compartimentalizados. El hecho de que un sustrato pueda activar y
localizar a la enzima que modifica su actividad es una manera de asegurar que
la señal se trasmita de forma rápida, específica y selectiva.
�
���� ������������11����
Perspectivas 180
A partir de los resultados obtenidos en esta Tesis quedan planteados distintos
interrogantes. Proponemos las siguientes tareas para poder profundizar en el
entendimiento de la regulación espacio4temporal de la vía cAMP4PKA de
levaduras:
4 Identificar nuevas proteínas de anclaje en levaduras. El tener un mayor
número de proteínas identificadas permitirá evaluar un consenso en el dominio
de unión a Bcy1.
4 En función de la definición de la secuencia consenso de interacción, diseñar
un péptido disruptor de la interacción Bcy14AKAPs en levaduras y evaluar su
efecto �� � ��, analizando localización de Bcy1 (Bcy14GFP), y el efecto sobre
los niveles de activación de la enzima.
4 Análisis ��� �� del dominio interactor de las AKAPs: se podrá comenzar con
Ira2, construyendo una cepa mutante con la deleción a nivel genómico en el
dominio de interacción, y analizar alteraciones en la localización y función en
respuesta a glucosa.
4 Estudios de co4localización, entre Bcy1,y proteínas AKAPs por
inmunofluorescencia , para lo cual deberán construirse cepas Bcy14GFP y
AKAP4RFP a nivel genómico.
4 Analizar si las proteínas identificadas como interactoras de Bcy1 son también
sustratos fisiológicos de la PKA de � ���� � ��� ��� e ��� ��, y entre ellas
estudiar si Ira2 es fosofrilada por PKA ��� ���y analizar cuál es el estímulo y la
consecuencia de esta modificación.
4 Análisis de la función de Hsp60 en la estabilización de la actividad PKA,
determinando si la misma es co4traduccional.
Perspectivas 181
4 Evaluar si el grado de fosforilación de Bcy1 es importante para la unión a
estas proteínas de anclaje. Se ha descripto en superiores que la fosforilación
en el sitio de autofosforilacion regula la interacción con las proteínas AKAPs
�
�
����88������������
Apéndice 183
A.1. Tabla de AKAPs canónicas [92]
Apéndice 184
Apéndice 185
Apéndice 186
Apéndice 187
Apéndice 188
Apéndice 189
Apéndice 190
Apéndice 191
Apéndice 192
Apéndice 193
Apéndice 194
Apéndice 195
Apéndice 196
Apéndice 197
Apéndice 198
Apéndice 199
Apéndice 200
Apéndice 201
A.2. Tabla de AKAPs no canónicas [92]
Apéndice 202
A.3. Protocolo modificado de la purificación TAP para la obtención de fuente enzimática
Esquema de purificación de las subunidades catalíticas de levadura por la metodología
TAP. Extractos proteicos de la cepa BCY14TAP, TPK14BCY1TAP o TPK24BCY1TAP fueron
incubados con resina IgG4Sepharosa. Luego del agregado de cAMP se logró disociar la
holoenzima y obtener purificadas las subunidades catalíticas de levaduras. Ver detalles en
Materiales y Métodos.
Apéndice 203
A.4. Identificación de proteínas por espectrometría de masa
' B 6 ���� $ ��� ?���'����������J�������
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' B � ���� $ ��� ?���'����������J��� �����
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Proteína e%value Score Matches Cobertura
Rpo21
8.3E404 175 25 18
Ura2 2.6E408 120 25 16 Rpb2 4.2E414 168 27 27 Spt5 5.3E407 107 15 15 Gph1 2.1E407 145 20 29
Hsp104 0.00048 111 15 26 Eft2 8.3E411 55 12 20 Pfk1 0.085 81 10 20
Vma2 0.00021 81 10 23 Pyk1 0.0043 68 8 23
Pdc1/2 0.016 62 8 18 Bcy1 3.3E407 109 11 31 Asc1 5.3E406 97 8 38 Rpl20 0.0025 70 5 32
Proteína e%value score matches %cobertura LIFT score expect
Gph1 0.0045 80 15 20 116 1.E407 Eft2 1.6E409 134 15 26 182 2.5E414 Pfk1 2.5E406 102 18 22 113 2E407 Bcy1 0.01 53 6 32 nd nd
Glc3
0.00013 85 8 16 12 0.29
Fas2 6.3E410 139 24 13 nd nd Pyc2 0.0048 69 13 26 26 0.017 Ala1 0.0063 68 13 19 86 9.8E405 Kgd1 0.02 63 14 17 nd nd Aco1 4E412 160 15 23 250 4E421 Hsc82 4E408 120 14 26 151 3.2E411 Ssa1 3.2E406 101 13 25 191 3.2E415 Icl1 0.025 62 8 16 nd nd
Hsp60 5.6E406 98 13 27 185 1.3E415 Ald6 0.022 62 8 21 150 4E411 Ald4 8E415 187 16 26 nd nd Idp2 8E408 117 12 20 nd nd Pgk1 5E409 129 12 23 nd nd Oye2 0.0032 71 8 23 nd nd Ilv5 1E408 126 11 39 nd nd
Fba1 0.029 61 5 13 nd nd Pet9 0.0008 77 8 25 nd nd
Rps1a 0.00018 84 7 43 nd nd Rps4b 0.08 57 6 23 nd nd
Apéndice 204
' B 5 ���� $ ��� ?���'������������$����� ���� ��
�
' B B ���� $ ��� ?���'����������J����&�� ?��
�
' B < ���� $ ��� ?���'���������
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Proteína E%Value score matches %cobertura LIFT score expect
Gph1 4.6E405 89 11 14 11 0.64 Bcy1 4E409 130 12 35 nd nd
Glc3
1.6E410 144 17 26 27 0.17
Hsc82 0.0033 71 7 31 37 0.0063
Gdb1
4E408 120 19 14 nd nd
Cpa2 0.018 63 17 8 nd nd Tdh3 0.009 66 6 18 99 2.1E409
Proteína E%Value score matches %cobertura Eft2 0.009 66 20 17
Pdc1/2 0.00056 73 8 25 Bcy1 5.4E406 110 13 26 Pyc2 0.0007 77 13 8
Hsc82 7.4E406 92 16 24 Ssa1 2.2E406 90 15 23
Hsp60 0.0074 62 6 14 Fks1 0.001 76 21 20 Gal7 0.0067 68 9 17 Cop1 0.00011 88 11 15 Myo2 0.1 40 8 7 Pgk1 0.0001 96 11 21
Proteína E%Value score matches %cobertura Hsc82 8E421 277 30 32 Pgk1 0.00037 70 12 19 Eno2 9.8E406 96 27 27
�
55��55$$��!!�� ��FFGG�����
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Bibliografía 206
[1] Tasken, K. and Aandahl, E.M. (2004). Localized effects of cAMP mediated by distinct routes of protein kinase A. Physiol Rev 84, 137467.
[2] Beene, D.L. and Scott, J.D. (2007). A4kinase anchoring proteins take shape. Curr Opin Cell Biol 19, 19248.
[3] Taylor, S.S., Kim, C., Cheng, C.Y., Brown, S.H., Wu, J. and Kannan, N. (2008). Signaling through cAMP and cAMP4dependent protein kinase: diverse strategies for drug design. Biochim Biophys Acta 1784, 16426.
[4] Pearce, L.R., Komander, D. and Alessi, D.R. (2010). The nuts and bolts of AGC protein kinases. Nat Rev Mol Cell Biol 11, 9422.
[5] Beebe, S.J., Oyen, O., Sandberg, M., Froysa, A., Hansson, V. and Jahnsen, T. (1990). Molecular cloning of a tissue4specific protein kinase (C gamma) from human testis44representing a third isoform for the catalytic subunit of cAMP4dependent protein kinase. Mol Endocrinol 4, 465475.
[6] Hanks, S.K. and Hunter, T. (1995). Protein kinases 6. The eukaryotic protein kinase superfamily: kinase (catalytic) domain structure and classification. FASEB J 9, 576496.
[7] Johnson, D.A., Akamine, P., Radzio4Andzelm, E., Madhusudan, M. and Taylor, S.S. (2001). Dynamics of cAMP4dependent protein kinase. Chem Rev 101, 2243470.
[8] Huse, M. and Kuriyan, J. (2002). The conformational plasticity of protein kinases. Cell 109, 275482.
[9] Taylor, S.S., Yang, J., Wu, J., Haste, N.M., Radzio4Andzelm, E. and Anand, G. (2004). PKA: a portrait of protein kinase dynamics. Biochim Biophys Acta 1697, 259469.
[10] Knighton, D.R., Zheng, J.H., Ten Eyck, L.F., Xuong, N.H., Taylor, S.S. and Sowadski, J.M. (1991). Structure of a peptide inhibitor bound to the catalytic subunit of cyclic adenosine monophosphate4dependent protein kinase. Science 253, 414420.
[11] Bossemeyer, D., Engh, R.A., Kinzel, V., Ponstingl, H. and Huber, R. (1993). Phosphotransferase and substrate binding mechanism of the cAMP4dependent protein kinase catalytic subunit from porcine heart as deduced from the 2.0 A structure of the complex with Mn2+ adenylyl imidodiphosphate and inhibitor peptide PKI(5424). EMBO J 12, 849459.
[12] Zheng, J., Knighton, D.R., ten Eyck, L.F., Karlsson, R., Xuong, N., Taylor, S.S. and Sowadski, J.M. (1993). Crystal structure of the catalytic subunit of cAMP4dependent protein kinase complexed with MgATP and peptide inhibitor. Biochemistry 32, 2154461.
[13] Kemp, B.E., Graves, D.J., Benjamini, E. and Krebs, E.G. (1977). Role of multiple basic residues in determining the substrate specificity of cyclic AMP4dependent protein kinase. J Biol Chem 252, 4888494.
[14] Zatterqvist, O., Ragnarsson, U., and Engsrom, L. (1990). CRC Press, Boca Raton, 1714210.
[15] Bramson, H.N., Kaiser, E.T. and Mildvan, A.S. (1984). Mechanistic studies of cAMP4dependent protein kinase action. CRC Crit Rev Biochem 15, 934124.
[16] Cheng, H.C., Kemp, B.E., Pearson, R.B., Smith, A.J., Misconi, L., Van Patten, S.M. and Walsh, D.A. (1986). A potent synthetic peptide inhibitor of the cAMP4dependent protein kinase. J Biol Chem 261, 989492.
Bibliografía 207
[17] Glass, D.B., Lundquist, L.J., Katz, B.M. and Walsh, D.A. (1989). Protein kinase inhibitor4(6422)4amide peptide analogs with standard and nonstandard amino acid substitutions for phenylalanine 10. Inhibition of cAMP4dependent protein kinase. J Biol Chem 264, 14579484.
[18] Knighton, D.R., Zheng, J.H., Ten Eyck, L.F., Ashford, V.A., Xuong, N.H., Taylor, S.S. and Sowadski, J.M. (1991). Crystal structure of the catalytic subunit of cyclic adenosine monophosphate4dependent protein kinase. Science 253, 407414.
[19] Banky, P., Newlon, M.G., Roy, M., Garrod, S., Taylor, S.S. and Jennings, P.A. (2000). Isoform4specific differences between the type Ialpha and IIalpha cyclic AMP4dependent protein kinase anchoring domains revealed by solution NMR. J Biol Chem 275, 35146452.
[20] Newlon, M.G., Roy, M., Morikis, D., Hausken, Z.E., Coghlan, V., Scott, J.D. and Jennings, P.A. (1999). The molecular basis for protein kinase A anchoring revealed by solution NMR. Nat Struct Biol 6, 22247.
[21] Sarma, G.N., Kinderman, F.S., Kim, C., von Daake, S., Chen, L., Wang, B.C. and Taylor, S.S. (2010). Structure of D4AKAP2:PKA RI complex: insights into AKAP specificity and selectivity. Structure 18, 155466.
[22] Kim, C., Cheng, C.Y., Saldanha, S.A. and Taylor, S.S. (2007). PKA4I holoenzyme structure reveals a mechanism for cAMP4dependent activation. Cell 130, 1032443.
[23] Wu, J., Brown, S.H., von Daake, S. and Taylor, S.S. (2007). PKA type IIalpha holoenzyme reveals a combinatorial strategy for isoform diversity. Science 318, 27449.
[24] Li, F., Gangal, M., Jones, J.M., Deich, J., Lovett, K.E., Taylor, S.S. and Johnson, D.A. (2000). Consequences of cAMP and catalytic4subunit binding on the flexibility of the A4kinase regulatory subunit. Biochemistry 39, 15626432.
[25] Burns4Hamuro, L.L. et al. (2005). Distinct interaction modes of an AKAP bound to two regulatory subunit isoforms of protein kinase A revealed by amide hydrogen/deuterium exchange. Protein Sci 14, 2982492.
[26] Banky, P., Roy, M., Newlon, M.G., Morikis, D., Haste, N.M., Taylor, S.S. and Jennings, P.A. (2003). Related protein4protein interaction modules present drastically different surface topographies despite a conserved helical platform. J Mol Biol 330, 1117429.
[27] Kopperud, R., Christensen, A.E., Kjarland, E., Viste, K., Kleivdal, H. and Doskeland, S.O. (2002). Formation of inactive cAMP4saturated holoenzyme of cAMP4dependent protein kinase under physiological conditions. J Biol Chem 277, 1344348.
[28] Cadd, G.G., Uhler, M.D. and McKnight, G.S. (1990). Holoenzymes of cAMP4dependent protein kinase containing the neural form of type I regulatory subunit have an increased sensitivity to cyclic nucleotides. J Biol Chem 265, 1950246.
[29] Dostmann, W.R. and Taylor, S.S. (1991). Identifying the molecular switches that determine whether (Rp)4cAMPS functions as an antagonist or an agonist in the activation of cAMP4dependent protein kinase I. Biochemistry 30, 871046.
[30] Gamm, D.M., Baude, E.J. and Uhler, M.D. (1996). The major catalytic subunit isoforms of cAMP4dependent protein kinase have distinct biochemical properties in vitro and in vivo. J Biol Chem 271, 15736442.
Bibliografía 208
[31] Lee, D.C., Carmichael, D.F., Krebs, E.G. and McKnight, G.S. (1983). Isolation of a cDNA clone for the type I regulatory subunit of bovine cAMP4dependent protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A 80, 3608412.
[32] Scott, J.D., Glaccum, M.B., Zoller, M.J., Uhler, M.D., Helfman, D.M., McKnight, G.S. and Krebs, E.G. (1987). The molecular cloning of a type II regulatory subunit of the cAMP4dependent protein kinase from rat skeletal muscle and mouse brain. Proc Natl Acad Sci U S A 84, 519246.
[33] Jahnsen, T. et al. (1986). Molecular cloning, cDNA structure, and regulation of the regulatory subunit of type II cAMP4dependent protein kinase from rat ovarian granulosa cells. J Biol Chem 261, 12352461.
[34] Clegg, C.H., Cadd, G.G. and McKnight, G.S. (1988). Genetic characterization of a brain4specific form of the type I regulatory subunit of cAMP4dependent protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A 85, 370347.
[35] Cadd, G. and McKnight, G.S. (1989). Distinct patterns of cAMP4dependent protein kinase gene expression in mouse brain. Neuron 3, 7149.
[36] Skalhegg, B.S. and Tasken, K. (2000). Specificity in the cAMP/PKA signaling pathway. Differential expression,regulation, and subcellular localization of subunits of PKA. Front Biosci 5, D678493.
[37] Anand, G.S., Hotchko, M., Brown, S.H., Ten Eyck, L.F., Komives, E.A. and Taylor, S.S. (2007). R4subunit isoform specificity in protein kinase A: distinct features of protein interfaces in PKA types I and II by amide H/2H exchange mass spectrometry. J Mol Biol 374, 487499.
[38] Herberg, F.W. and Taylor, S.S. (1993). Physiological inhibitors of the catalytic subunit of cAMP4dependent protein kinase: effect of MgATP on protein4protein interactions. Biochemistry 32, 14015422.
[39] Kim, C., Xuong, N.H. and Taylor, S.S. (2005). Crystal structure of a complex between the catalytic and regulatory (RIalpha) subunits of PKA. Science 307, 69046.
[40] Corbin, J.D., Brostrom, C.O., Alexander, R.L. and Krebs, E.G. (1972). Adenosine 3',5'4monophosphate4dependent protein kinase from adipose tissue. J Biol Chem 247, 3736443.
[41] Rubin, C.S., Erlichman, J. and Rosen, O.M. (1972). Molecular forms and subunit composition of a cyclic adenosine 3',5'4monophosphate4dependent protein kinase purified from bovine heart muscle. J Biol Chem 247, 36444.
[42] Beavo, J.A., Bechtel, P.J. and Krebs, E.G. (1974). Preparation of homogeneous cyclic AMP4dependent protein kinase(s) and its subunits from rabbit skeletal muscle. Methods Enzymol 38, 2994308.
[43] Reimann, E.M., Walsh, D.A. and Krebs, E.G. (1971). Purification and properties of rabbit skeletal muscle adenosine 3',5'4monophosphate4dependent protein kinases. J Biol Chem 246, 1986495.
[44] Tao, M., Salas, M.L. and Lipmann, F. (1970). Mechanism of activation by adenosine 3':5'4cyclic monophosphate of a protein phosphokinase from rabbit reticulocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 67, 408414.
[45] Vigil, D., Blumenthal, D.K., Brown, S., Taylor, S.S. and Trewhella, J. (2004). Differential effects of substrate on type I and type II PKA holoenzyme dissociation. Biochemistry 43, 5629436.
Bibliografía 209
[46] Pidoux, G. and Tasken, K. (2010). Specificity and spatial dynamics of protein kinase A signaling organized by A4kinase4anchoring proteins. J Mol Endocrinol 44, 271484.
[47] Barradeau, S., Imaizumi4Scherrer, T., Weiss, M.C. and Faust, D.M. (2002). Intracellular targeting of the type4I alpha regulatory subunit of cAMP4dependent protein kinase. Trends Cardiovasc Med 12, 235441.
[48] Scott, J.D., Stofko, R.E., McDonald, J.R., Comer, J.D., Vitalis, E.A. and Mangili, J.A. (1990). Type II regulatory subunit dimerization determines the subcellular localization of the cAMP4dependent protein kinase. J Biol Chem 265, 2156146.
[49] Welch, E.J., Jones, B.W. and Scott, J.D. (2010). Networking with AKAPs: context4dependent regulation of anchored enzymes. Mol Interv 10, 86497.
[50] Wong, W. and Scott, J.D. (2004). AKAP signalling complexes: focal points in space and time. Nat Rev Mol Cell Biol 5, 959470.
[51] Mayr, B. and Montminy, M. (2001). Transcriptional regulation by the phosphorylation4dependent factor CREB. Nat Rev Mol Cell Biol 2, 5994609.
[52] Hagiwara, M., Brindle, P., Harootunian, A., Armstrong, R., Rivier, J., Vale, W., Tsien, R. and Montminy, M.R. (1993). Coupling of hormonal stimulation and transcription via the cyclic AMP4responsive factor CREB is rate limited by nuclear entry of protein kinase A. Mol Cell Biol 13, 485249.
[53] Scott, J.D., Fischer, E.H., Demaille, J.G. and Krebs, E.G. (1985). Identification of an inhibitory region of the heat4stable protein inhibitor of the cAMP4dependent protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A 82, 4379483.
[54] Dalton, G.D. and Dewey, W.L. (2006). Protein kinase inhibitor peptide (PKI): a family of endogenous neuropeptides that modulate neuronal cAMP4dependent protein kinase function. Neuropeptides 40, 23434.
[55] Wen, W., Harootunian, A.T., Adams, S.R., Feramisco, J., Tsien, R.Y., Meinkoth, J.L. and Taylor, S.S. (1994). Heat4stable inhibitors of cAMP4dependent protein kinase carry a nuclear export signal. J Biol Chem 269, 32214420.
[56] Sastri, M., Barraclough, D.M., Carmichael, P.T. and Taylor, S.S. (2005). A4kinase4interacting protein localizes protein kinase A in the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 349454.
[57] Toda, T., Cameron, S., Sass, P., Zoller, M. and Wigler, M. (1987). Three different genes in S. cerevisiae encode the catalytic subunits of the cAMP4dependent protein kinase. Cell 50, 277487.
[58] Mazon, M.J., Behrens, M.M., Morgado, E. and Portillo, F. (1993). Low activity of the yeast cAMP4dependent protein kinase catalytic subunit Tpk3 is due to the poor expression of the TPK3 gene. Eur J Biochem 213, 50146.
[59] Pan, X. and Heitman, J. (2002). Protein kinase A operates a molecular switch that governs yeast pseudohyphal differentiation. Mol Cell Biol 22, 3981493.
[60] Carmel, G. and Kuret, J. (1992). A solid4phase screen for protein kinase substrate selectivity. Anal Biochem 203, 274480.
Bibliografía 210
[61] Zoller, M.J., Kuret, J., Cameron, S., Levin, L. and Johnson, K.E. (1988). Purification and characterization of C1, the catalytic subunit of Saccharomyces cerevisiae cAMP4dependent protein kinase encoded by TPK1. J Biol Chem 263, 914248.
[62] Glass, D.B., Feller, M.J., Levin, L.R. and Walsh, D.A. (1992). Structural basis for the low affinities of yeast cAMP4dependent and mammalian cGMP4dependent protein kinases for protein kinase inhibitor peptides. Biochemistry 31, 1728434.
[63] Zoller, M.J., Yonemoto, W., Taylor, S.S. and Johnson, K.E. (1991). Mammalian cAMP4dependent protein kinase functionally replaces its homolog in yeast. Gene 99, 17149.
[64] Denis, C.L., Kemp, B.E. and Zoller, M.J. (1991). Substrate specificities for yeast and mammalian cAMP4dependent protein kinases are similar but not identical. J Biol Chem 266, 1793245.
[65] Mashhoon, N., Carmel, G., Pflugrath, J.W. and Kuret, J. (2001). Structure of the unliganded cAMP4dependent protein kinase catalytic subunit from Saccharomyces cerevisiae. Arch Biochem Biophys 387, 1149.
[66] Toda, T. et al. (1987). Cloning and characterization of BCY1, a locus encoding a regulatory subunit of the cyclic AMP4dependent protein kinase in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 7, 137147.
[67] Kuret, J., Johnson, K.E., Nicolette, C. and Zoller, M.J. (1988). Mutagenesis of the regulatory subunit of yeast cAMP4dependent protein kinase. Isolation of site4directed mutants with altered binding affinity for catalytic subunit. J Biol Chem 263, 9149454.
[68] Rinaldi, J., Wu, J., Yang, J., Ralston, C.Y., Sankaran, B., Moreno, S. and Taylor, S.S. (2010). Structure of yeast regulatory subunit: a glimpse into the evolution of PKA signaling. Structure 18, 1471482.
[69] Diller, T.C., Madhusudan, Xuong, N.H. and Taylor, S.S. (2001). Molecular basis for regulatory subunit diversity in cAMP4dependent protein kinase: crystal structure of the type II beta regulatory subunit. Structure 9, 73482.
[70] Griffioen, G., Anghileri, P., Imre, E., Baroni, M.D. and Ruis, H. (2000). Nutritional control of nucleocytoplasmic localization of cAMP4dependent protein kinase catalytic and regulatory subunits in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 275, 1449456.
[71] Werner4Washburne, M., Brown, D. and Braun, E. (1991). Bcy1, the regulatory subunit of cAMP4dependent protein kinase in yeast, is differentially modified in response to the physiological status of the cell. J Biol Chem 266, 1970449.
[72] Griffioen, G., Branduardi, P., Ballarini, A., Anghileri, P., Norbeck, J., Baroni, M.D. and Ruis, H. (2001). Nucleocytoplasmic distribution of budding yeast protein kinase A regulatory subunit Bcy1 requires Zds1 and is regulated by Yak14dependent phosphorylation of its targeting domain. Mol Cell Biol 21, 511423.
[73] Garrett, S. and Broach, J. (1989). Loss of Ras activity in Saccharomyces cerevisiae is suppressed by disruptions of a new kinase gene, YAKI, whose product may act downstream of the cAMP4dependent protein kinase. Genes Dev 3, 1336448.
Bibliografía 211
[74] Smith, A., Ward, M.P. and Garrett, S. (1998). Yeast PKA represses Msn2p/Msn4p4dependent gene expression to regulate growth, stress response and glycogen accumulation. EMBO J 17, 3556464.
[75] Tudisca, V., Recouvreux, V., Moreno, S., Boy4Marcotte, E., Jacquet, M. and Portela, P. (2010). Differential localization to cytoplasm, nucleus or P4bodies of yeast PKA subunits under different growth conditions. Eur J Cell Biol 89, 339448.
[76] Griffioen, G. and Thevelein, J.M. (2002). Molecular mechanisms controlling the localisation of protein kinase A. Curr Genet 41, 1994207.
[77] Walsh, D.A. and Van Patten, S.M. (1994). Multiple pathway signal transduction by the cAMP4dependent protein kinase. FASEB J 8, 1227436.
[78] Krebs, E.G. and Beavo, J.A. (1979). Phosphorylation4dephosphorylation of enzymes. Annu Rev Biochem 48, 923459.
[79] Shabb, J.B. (2001). Physiological substrates of cAMP4dependent protein kinase. Chem Rev 101, 23814411.
[80] Kreegipuu, A., Blom, N., Brunak, S. and Jarv, J. (1998). Statistical analysis of protein kinase specificity determinants. FEBS Lett 430, 45450.
[81] Humble, E., Berglund, L., Titanji, V., Ljungstrom, O., Edlund, B., Zetterqvist, O. and Engstrom, L. (1975). Non4dependence on native structure of pig liver pyruvate kinase when used as a substrate for cyclic 3',5'4AMP4stimulated protein kinase. Biochem Biophys Res Commun 66, 614421.
[82] Glass, D.B., Trewhella, J., Mitchell, R.D. and Walsh, D.A. (1995). Conformationally constrained analogs of protein kinase inhibitor (6422)amide: effect of turn structures in the center of the peptide on inhibition of cAMP4dependent protein kinase. Protein Sci 4, 405415.
[83] Carr, D.W., Stofko4Hahn, R.E., Fraser, I.D., Cone, R.D. and Scott, J.D. (1992). Localization of the cAMP4dependent protein kinase to the postsynaptic densities by A4kinase anchoring proteins. Characterization of AKAP 79. J Biol Chem 267, 16816423.
[84] Cherry, J.R. and Denis, C.L. (1989). Overexpression of the yeast transcriptional activator ADR1 induces mutation of the mitochondrial genome. Curr Genet 15, 31147.
[85] Theurkauf, W.E. and Vallee, R.B. (1982). Molecular characterization of the cAMP4dependent protein kinase bound to microtubule4associated protein 2. J Biol Chem 257, 3284490.
[86] Carr, D.W. and Scott, J.D. (1992). Blotting and band4shifting: techniques for studying protein4protein interactions. Trends Biochem Sci 17, 24649.
[87] Lohmann, S.M., DeCamilli, P., Einig, I. and Walter, U. (1984). High4affinity binding of the regulatory subunit (RII) of cAMP4dependent protein kinase to microtubule4associated and other cellular proteins. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 672347.
[88] Huang, L.J., Durick, K., Weiner, J.A., Chun, J. and Taylor, S.S. (1997). Identification of a novel protein kinase A anchoring protein that binds both type I and type II regulatory subunits. J Biol Chem 272, 8057464.
[89] Scott, J.D. and Pawson, T. (2009). Cell signaling in space and time: where proteins come together and when they're apart. Science 326, 122044.
Bibliografía 212
[90] Carr, D.W., Stofko4Hahn, R.E., Fraser, I.D., Bishop, S.M., Acott, T.S., Brennan, R.G. and Scott, J.D. (1991). Interaction of the regulatory subunit (RII) of cAMP4dependent protein kinase with RII4anchoring proteins occurs through an amphipathic helix binding motif. J Biol Chem 266, 14188492.
[91] Herberg, F.W., Maleszka, A., Eide, T., Vossebein, L. and Tasken, K. (2000). Analysis of A4kinase anchoring protein (AKAP) interaction with protein kinase A (PKA) regulatory subunits: PKA isoform specificity in AKAP binding. J Mol Biol 298, 329439.
[92] Skroblin, P., Grossmann, S., Schafer, G., Rosenthal, W. and Klussmann, E. (2010). Mechanisms of protein kinase A anchoring. Int Rev Cell Mol Biol 283, 2354330.
[93] Kinderman, F.S. et al. (2006). A dynamic mechanism for AKAP binding to RII isoforms of cAMP4dependent protein kinase. Mol Cell 24, 3974408.
[94] Hausken, Z.E., Coghlan, V.M., Hastings, C.A., Reimann, E.M. and Scott, J.D. (1994). Type II regulatory subunit (RII) of the cAMP4dependent protein kinase interaction with A4kinase anchor proteins requires isoleucines 3 and 5. J Biol Chem 269, 24245451.
[95] Li, Y. and Rubin, C.S. (1995). Mutagenesis of the regulatory subunit (RII beta) of cAMP4dependent protein kinase II beta reveals hydrophobic amino acids that are essential for RII beta dimerization and/or anchoring RII beta to the cytoskeleton. J Biol Chem 270, 1935444.
[96] Jarnaess, E., Ruppelt, A., Stokka, A.J., Lygren, B., Scott, J.D. and Tasken, K. (2008). Dual specificity A4kinase anchoring proteins (AKAPs) contain an additional binding region that enhances targeting of protein kinase A type I. J Biol Chem 283, 33708418.
[97] Jarnaess, E., Stokka, A.J., Kvissel, A.K., Skalhegg, B.S., Torgersen, K.M., Scott, J.D., Carlson, C.R. and Tasken, K. (2009). Splicing factor arginine/serine4rich 17A (SFRS17A) is an A4kinase anchoring protein that targets protein kinase A to splicing factor compartments. J Biol Chem 284, 35154464.
[98] Carr, D.W., Hausken, Z.E., Fraser, I.D., Stofko4Hahn, R.E. and Scott, J.D. (1992). Association of the type II cAMP4dependent protein kinase with a human thyroid RII4anchoring protein. Cloning and characterization of the RII4binding domain. J Biol Chem 267, 13376482.
[99] Rosenmund, C., Carr, D.W., Bergeson, S.E., Nilaver, G., Scott, J.D. and Westbrook, G.L. (1994). Anchoring of protein kinase A is required for modulation of AMPA/kainate receptors on hippocampal neurons. Nature 368, 85346.
[100] Alto, N.M., Soderling, S.H., Hoshi, N., Langeberg, L.K., Fayos, R., Jennings, P.A. and Scott, J.D. (2003). Bioinformatic design of A4kinase anchoring protein4in silico: a potent and selective peptide antagonist of type II protein kinase A anchoring. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 4445450.
[101] Faruque, O.M., Le4Nguyen, D., Lajoix, A.D., Vives, E., Petit, P., Bataille, D. and Hani el, H. (2009). Cell4permeable peptide4based disruption of endogenous PKA4AKAP complexes: a tool for studying the molecular roles of AKAP4mediated PKA subcellular anchoring. Am J Physiol Cell Physiol 296, C306416.
Bibliografía 213
[102] Burns4Hamuro, L.L. et al. (2003). Designing isoform4specific peptide disruptors of protein kinase A localization. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 407247.
[103] Carlson, C.R., Lygren, B., Berge, T., Hoshi, N., Wong, W., Tasken, K. and Scott, J.D. (2006). Delineation of type I protein kinase A4selective signaling events using an RI anchoring disruptor. J Biol Chem 281, 21535445.
[104] Stokka, A.J., Gesellchen, F., Carlson, C.R., Scott, J.D., Herberg, F.W. and Tasken, K. (2006). Characterization of A4kinase4anchoring disruptors using a solution4based assay. Biochem J 400, 49349.
[105] Gold, M.G., Lygren, B., Dokurno, P., Hoshi, N., McConnachie, G. Tasken, K., Carlson, C.R., Scott, J.D., Barford, D. (2006). Moll Cell 24, 3834395.
[106] Diviani, D., Langeberg, L.K., Doxsey, S.J., and Scott, J.D. (2000). Pericentrin anchors protein kinase A at the centrosome through a newly identified RII4binding domain. Curr Biol 10, 4174420.
[107] Goehring, A.S., Pedroja, B.S., Hinke, S.A., Langeberg, L.K. and Scott, J.D. (2007). MyRIP anchors protein kinase A to the exocyst complex. J Biol Chem 282, 33155467.
[108] Hundsrucker, C. et al. (2010 ). Glycogen synthase kinase 3beta interaction protein functions as an A4kinase
anchoring protein. J Biol Chem 285, 5507421. [109] Angelo, R. and Rubin, C.S. (1998). Molecular characterization of an
anchor protein (AKAPCE) that binds the RI subunit (RCE) of type I protein kinase A from Caenorhabditis elegans. J Biol Chem 273, 14633443.
[110] Angelo, R.G. and Rubin, C.S. (2000). Characterization of structural features that mediate the tethering of Caenorhabditis elegans protein kinase A to a novel A kinase anchor protein. Insights into the anchoring of PKAI isoforms. J Biol Chem 275, 4351462.
[111] Han, J.D., Baker, N.E. and Rubin, C.S. (1997). Molecular characterization of a novel A kinase anchor protein from Drosophila melanogaster. J Biol Chem 272, 2661149.
[112] Gaillard, A.R., Diener, D.R., Rosenbaum, J.L. and Sale, W.S. (2001). Flagellar radial spoke protein 3 is an A4kinase anchoring protein (AKAP). J Cell Biol 153, 44348.
[113] Gaillard, A.R., Fox, L.A., Rhea, J.M., Craige, B. and Sale, W.S. (2006). Disruption of the A4kinase anchoring domain in flagellar radial spoke protein 3 results in unregulated axonemal cAMP4dependent protein kinase activity and abnormal flagellar motility. Mol Biol Cell 17, 2626435.
[114] Kennelly, P.J. and Krebs, E.G. (1991). Consensus sequences as substrate specificity determinants for protein kinases and protein phosphatases. J Biol Chem 266, 1555548.
[115] Chevtzoff, C., Vallortigara, J., Averet, N., Rigoulet, M. and Devin, A. (2005). The yeast cAMP protein kinase Tpk3p is involved in the regulation of mitochondrial enzymatic content during growth. Biochim Biophys Acta 1706, 117425.
[116] Robertson, L.S. and Fink, G.R. (1998). The three yeast A kinases have specific signaling functions in pseudohyphal growth. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 1378347.
Bibliografía 214
[117] Ptacek, J. et al. (2005). Global analysis of protein phosphorylation in yeast. Nature 438, 679484.
[118] Portela, P., Moreno, S. and Rossi, S. (2006). Characterization of yeast pyruvate kinase 1 as a protein kinase A substrate, and specificity of the phosphorylation site sequence in the whole protein. Biochem J 396, 117426.
[119] Griffioen, G., Swinnen, S. and Thevelein, J.M. (2003). Feedback inhibition on cell wall integrity signaling by Zds1 involves Gsk3 phosphorylation of a cAMP4dependent protein kinase regulatory subunit. J Biol Chem 278, 23460471.
[120] Portela, P., Zaremberg, V. and Moreno, S. (2001). Evaluation of in vivo activation of protein kinase A under non4dissociable conditions through the overexpression of wild4type and mutant regulatory subunits in Saccharomyces cerevisiae. Microbiology 147, 1149459.
[121] Sherman, F., Fink, G., and hicks, J.B. . (1981). Methods in yeast genetics. Cols Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
[122] Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. (1983). J Bacteriol 153, 1634168.
[123] Mesecar, A.D., and Nowak, T. . (1997). Biochemestry 36, 10. [124] Puig, O., Caspary, F., Rigaut, G., Rutz, B., Bouveret, E., Bragado4
Nilsson, E., Wilm, M., and Sepharin, B. (2001). Methods 24, 21. [125] Roskoski, R. (1983). Methods Enzymology 99, 346. [126] Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the
assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 68045. [127] Pearson, R.B. and Kemp, B.E. (1991). Protein kinase phosphorylation
site sequences and consensus specificity motifs: tabulations. Methods Enzymol 200, 62481.
[128] Kreegipuu, A., Blom, N. and Brunak, S. (1999). PhosphoBase, a database of phosphorylation sites: release 2.0. Nucleic Acids Res 27, 23749.
[129] Shaw, J.B. (2001). Chem Rev 101 [130] Budovskaya, Y.V., Stephan, J.S., Deminoff, S.J. and Herman, P.K.
(2005). An evolutionary proteomics approach identifies substrates of the cAMP4dependent protein kinase. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 1393348.
[131] Gnad, F., de Godoy, L.M., Cox, J., Neuhauser, N., Ren, S., Olsen, J.V. and Mann, M. (2009). High4accuracy identification and bioinformatic analysis of in vivo protein phosphorylation sites in yeast. Proteomics 9, 4642452.
[132] Yang, S., Fletcher, W.H. and Johnson, D.A. (1995). Regulation of cAMP4dependent protein kinase: enzyme activation without dissociation. Biochemistry 34, 6267471.
[133] Viste, K., Kopperud, R.K., Christensen, A.E. and Doskeland, S.O. (2005). Substrate enhances the sensitivity of type I protein kinase a to cAMP. J Biol Chem 280, 13279484.
[134] Zaremberg, V., Donella4Deana, A. and Moreno, S. (2000). Mechanism of activation of cAMP4dependent protein kinase: in Mucor rouxii the apparent specific activity of the cAMP4activated holoenzyme is different than that of its free catalytic subunit. Arch Biochem Biophys 381, 74482.
Bibliografía 215
[135] Portela, P., Howell, S., Moreno, S. and Rossi, S. (2002). In vivo and in vitro phosphorylation of two isoforms of yeast pyruvate kinase by protein kinase A. J Biol Chem 277, 30477487.
[136] Uno, I., Matsumoto, K., Adachi, K. and Ishikawa, T. (1983). Genetic and biochemical evidence that trehalase is a substrate of cAMP4dependent protein kinase in yeast. J Biol Chem 258, 10867472.
[137] Wera, S., De Schrijver, E., Geyskens, I., Nwaka, S. and Thevelein, J.M. (1999). Opposite roles of trehalase activity in heat4shock recovery and heat4shock survival in Saccharomyces cerevisiae. Biochem J 343 Pt 3, 62146.
[138] Walsh, D.A., Glass, D.B. and Mitchell, R.D. (1992). Substrate diversity of the cAMP4dependent protein kinase: regulation based upon multiple binding interactions. Curr Opin Cell Biol 4, 241451.
[139] Lieser, S.A., Aubol, B.E., Wong, L., Jennings, P.A. and Adams, J.A. (2005). Coupling phosphoryl transfer and substrate interactions in protein kinases. Biochim Biophys Acta 1754, 19149.
[140] Rinaldi, J., Ocampo, J., Rossi, S. and Moreno, S. (2008). A novel activating effect of the regulatory subunit of protein kinase A on catalytic subunit activity. Arch Biochem Biophys 480, 954103.
[141] Mazón, M.J., Behrens, M.M., Morgado, E., and Portillo, F. (1993). Eur J Biochem 213, 5014506.
[142] Palomino, A., Herrero, P. and Moreno, F. (2006). Tpk3 and Snf1 protein kinases regulate Rgt1 association with Saccharomyces cerevisiae HXK2 promoter. Nucleic Acids Res 34, 1427438.
[143] Songyang, Z., Blechner, S., Hoaglnad, N., Hoekstra, M.F., Piwnica4Worms, H., and Cantley, l.C. (1994). Curr Biol 4, 9734979.
[144] Moore, M.J., Kanter, J.R., Jones, K.C. and Taylor, S.S. (2002). Phosphorylation of the catalytic subunit of protein kinase A. Autophosphorylation versus phosphorylation by phosphoinositide4dependent kinase41. J Biol Chem 277, 47878484.
[145] Choi, M.G., Kurnov, V., Kersting, M.C., Sreenivas, A. and Carman, G.M. (2005). Phosphorylation of the yeast choline kinase by protein kinase C. Identification of Ser25 and Ser30 as major sites of phosphorylation. J Biol Chem 280, 26105412.
[146] Neurberger, G., Schneider, G., and eisenhaber, F. (2007). Biology direct 2, doi:10.1186/1745461504241.
[147] Yang, S.Y., He, X.Y. and Schulz, H. (1995). Glutamate 139 of the large alpha4subunit is the catalytic base in the dehydration of both D4 and L434hydroxyacyl4coenzyme A but not in the isomerization of delta 3, delta 24enoyl4coenzyme A catalyzed by the multienzyme complex of fatty acid oxidation from Escherichia coli. Biochemistry 34, 644147.
[148] Loog, M., Oskolkov, N., O'Farrell, F., Ek, P. and Jarv, J. (2005). Comparison of cAMP4dependent protein kinase substrate specificity in reaction with proteins and synthetic peptides. Biochim Biophys Acta 1747, 26146.
[149] Mok, J. et al. Deciphering protein kinase specificity through large4scale analysis of yeast phosphorylation site motifs. Sci Signal 3, ra12.
[150] Pan, X. and Heitman, J. (1999). Cyclic AMP4dependent protein kinase regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 19, 4874487.
Bibliografía 216
[151] Pan, X., Harashima, T. and Heitman, J. (2000). Signal transduction cascades regulating pseudohyphal differentiation of Saccharomyces cerevisiae. Curr Opin Microbiol 3, 567472.
[152] Portela, P. and Moreno, S. (2006). Glucose4dependent activation of protein kinase A activity in Saccharomyces cerevisiae and phosphorylation of its TPK1 catalytic subunit. Cell Signal 18, 1072486.
[153] Deminoff, S.J., Ramachandran, V. and Herman, P.K. (2009). Distal recognition sites in substrates are required for efficient phosphorylation by the cAMP4dependent protein kinase. Genetics 182, 529439.
[154] Newlon, M.G., Roy, M., Hausken, Z.E., Scott, J.D. and Jennings, P.A. (1997). The A4kinase anchoring domain of type IIalpha cAMP4dependent protein kinase is highly helical. J Biol Chem 272, 23637444.
[155] Newlon, M.G., Roy, M., Morikis, D., Carr, D.W., Westphal, R., Scott, J.D. and Jennings, P.A. (2001). A novel mechanism of PKA anchoring revealed by solution structures of anchoring complexes. EMBO J 20, 1651462.
[156] Lim, C.J., Han, J., Yousefi, N., Ma, Y., Amieux, P.S., McKnight, G.S., Taylor, S.S., and Ginsberg, M.H. (2007). Alpha4 integrins are type I cAMP4dependent protein kinase4anchoring proteins. Nat Cell Biol 9, 4154421.
[157] Chaturvedi, D., Poppleton, H.M., Stringfield, T., Barbier, A. and Patel, T.B. (2006). Subcellular localization and biological actions of activated RSK1 are determined by its interactions with subunits of cyclic AMP4dependent protein kinase. Mol Cell Biol 26, 45864600.
[158] Gao, X. and Patel, T.B. (2009). Regulation of protein kinase A activity by p90 ribosomal S6 kinase 1. J Biol Chem 284, 3307048.
[159] Gaestel, M. (2006). Molecular chaperones in signal transduction. Handb Exp Pharmacol, 934109.
[160] Arlander, S.J., Felts, S.J., Wagner, J.M., Stensgard, B., Toft, D.O. and Karnitz, L.M. (2006). Chaperoning checkpoint kinase 1 (Chk1), an Hsp90 client, with purified chaperones. J Biol Chem 281, 2989498.
[161] Lee, P., Shabbir, A., Cardozo, C. and Caplan, A.J. (2004). Sti1 and Cdc37 can stabilize Hsp90 in chaperone complexes with a protein kinase. Mol Biol Cell 15, 1785492.
[162] Zhao, Q., Boschelli, F., Caplan, A.J. and Arndt, K.T. (2004). Identification of a conserved sequence motif that promotes Cdc37 and cyclin D1 binding to Cdk4. J Biol Chem 279, 1256044.
[163] Prince, T. and Matts, R.L. (2004). Definition of protein kinase sequence motifs that trigger high affinity binding of Hsp90 and Cdc37. J Biol Chem 279, 39975481.
[164] Prince, T., Sun, L. and Matts, R.L. (2005). Cdk2: a genuine protein kinase client of Hsp90 and Cdc37. Biochemistry 44, 15287495.
[165] Terasawa, K., Yoshimatsu, K., Iemura, S., Natsume, T., Tanaka, K. and Minami, Y. (2006). Cdc37 interacts with the glycine4rich loop of Hsp90 client kinases. Mol Cell Biol 26, 3378489.
[166] Caplan, A.J., Mandal, A.K. and Theodoraki, M.A. (2007). Molecular chaperones and protein kinase quality control. Trends Cell Biol 17, 87492.
Bibliografía 217
[167] Stepanova, L., Leng, X., Parker, S.B. and Harper, J.W. (1996). Mammalian p50Cdc37 is a protein kinase4targeting subunit of Hsp90 that binds and stabilizes Cdk4. Genes Dev 10, 14914502.
[168] Jeffrey, P.D., Russo, A.A., Polyak, K., Gibbs, E., Hurwitz, J., Massague, J. and Pavletich, N.P. (1995). Mechanism of CDK activation revealed by the structure of a cyclinA4CDK2 complex. Nature 376, 313420.
[169] Dey, B., Caplan, A.J. and Boschelli, F. (1996). The Ydj1 molecular chaperone facilitates formation of active p60v4src in yeast. Mol Biol Cell 7, 914100.
[170] Kimura, Y., Yahara, I. and Lindquist, S. (1995). Role of the protein chaperone YDJ1 in establishing Hsp904mediated signal transduction pathways. Science 268, 136245.
[171] Lee, P., Rao, J., Fliss, A., Yang, E., Garrett, S. and Caplan, A.J. (2002). The Cdc37 protein kinase4binding domain is sufficient for protein kinase activity and cell viability. J Cell Biol 159, 105149.
[172] Mandal, A.K. et al. (2007). Cdc37 has distinct roles in protein kinase quality control that protect nascent chains from degradation and promote posttranslational maturation. J Cell Biol 176, 319428.
[173] Basso, A.D., Solit, D.B., Chiosis, G., Giri, B., Tsichlis, P. and Rosen, N. (2002). Akt forms an intracellular complex with heat shock protein 90 (Hsp90) and Cdc37 and is destabilized by inhibitors of Hsp90 function. J Biol Chem 277, 39858466.
[174] Whitesell, L. and Lindquist, S.L. (2005). HSP90 and the chaperoning of cancer. Nat Rev Cancer 5, 761472.
[175] Bercovich, B., Stancovski, I., Mayer, A., Blumenfeld, N., Laszlo, A., Schwartz, A.L. and Ciechanover, A. (1997). Ubiquitin4dependent degradation of certain protein substrates in vitro requires the molecular chaperone Hsc70. J Biol Chem 272, 9002410.
[176] McClellan, A.J., Scott, M.D. and Frydman, J. (2005). Folding and quality control of the VHL tumor suppressor proceed through distinct chaperone pathways. Cell 121, 739448.
[177] Park, S.H., Bolender, N., Eisele, F., Kostova, Z., Takeuchi, J., Coffino, P. and Wolf, D.H. (2007). The cytoplasmic Hsp70 chaperone machinery subjects misfolded and endoplasmic reticulum import4incompetent proteins to degradation via the ubiquitin4proteasome system. Mol Biol Cell 18, 153465.
[178] Younger, J.M., Ren, H.Y., Chen, L., Fan, C.Y., Fields, A., Patterson, C. and Cyr, D.M. (2004). A foldable CFTR{Delta}F508 biogenic intermediate accumulates upon inhibition of the Hsc704CHIP E3 ubiquitin ligase. J Cell Biol 167, 1075485.
[179] Mandal, A.K., Nillegoda, N.B., Chen, J.A. and Caplan, A.J. (2008). Ydj1 protects nascent protein kinases from degradation and controls the rate of their maturation. Mol Cell Biol 28, 4434444.
[180] Ren, M., Santhanam, A., Lee, P., Caplan, A. and Garrett, S. (2007). Alteration of the protein kinase binding domain enhances function of the Saccharomyces cerevisiae molecular chaperone Cdc37. Eukaryot Cell 6, 1363472.
[181] Schmidt, O. et al. (2011). Regulation of mitochondrial protein import by cytosolic kinases. Cell 144, 227439.
Bibliografía 218
[182] Young, J.C., Hoogenraad, N.J. and Hartl, F.U. (2003). Molecular chaperones Hsp90 and Hsp70 deliver preproteins to the mitochondrial import receptor Tom70. Cell 112, 41450.
[183] Sigler, P.B., Xu, Z., Rye, H.S., Burston, S.G., Fenton, W.A. and Horwich, A.L. (1998). Structure and function in GroEL4mediated protein folding. Annu Rev Biochem 67, 5814608.
[184] Xu, Z., Horwich, A.L. and Sigler, P.B. (1997). The crystal structure of the asymmetric GroEL4GroES4(ADP)7 chaperonin complex. Nature 388, 741450.
[185] Reading, D.S., Hallberg, R.L. and Myers, A.M. (1989). Characterization of the yeast HSP60 gene coding for a mitochondrial assembly factor. Nature 337, 65549.
[186] Cheng, M.Y. et al. (1989). Mitochondrial heat4shock protein hsp60 is essential for assembly of proteins imported into yeast mitochondria. Nature 337, 62045.
[187] Hallberg, E.M., Shu, Y. and Hallberg, R.L. (1993). Loss of mitochondrial hsp60 function: nonequivalent effects on matrix4targeted and intermembrane4targeted proteins. Mol Cell Biol 13, 305047.
[188] Khan, I.U., Wallin, R., Gupta, R.S. and Kammer, G.M. (1998). Protein kinase A4catalyzed phosphorylation of heat shock protein 60 chaperone regulates its attachment to histone 2B in the T lymphocyte plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 10425430.
[189] Soltys, B.J. and Gupta, R.S. (1997). Cell surface localization of the 60 kDa heat shock chaperonin protein (hsp60) in mammalian cells. Cell Biol Int 21, 315420.
[190] Soltys, B.J. and Gupta, R.S. (1996). Immunoelectron microscopic localization of the 604kDa heat shock chaperonin protein (Hsp60) in mammalian cells. Exp Cell Res 222, 16427.
[191] Brudzynski, K., Martinez, V. and Gupta, R.S. (1992). Immunocytochemical localization of heat4shock protein 604related protein in beta4cell secretory granules and its altered distribution in non4obese diabetic mice. Diabetologia 35, 316424.
[192] Velez4Granell, C.S., Arias, A.E., Torres4Ruiz, J.A. and Bendayan, M. (1994). Molecular chaperones in pancreatic tissue: the presence of cpn10, cpn60 and hsp70 in distinct compartments along the secretory pathway of the acinar cells. J Cell Sci 107 ( Pt 3), 539449.
[193] Ho, Y. et al. (2002). Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry. Nature 415, 18043.
[194] Pruyne, D., Legesse4Miller, A., Gao, L., Dong, Y. and Bretscher, A. (2004). Mechanisms of polarized growth and organelle segregation in yeast. Annu Rev Cell Dev Biol 20, 559491.
[195] Legesse4Miller, A., Zhang, S., Santiago4Tirado, F.H., Van Pelt, C.K. and Bretscher, A. (2006). Regulated phosphorylation of budding yeast's essential myosin V heavy chain, Myo2p. Mol Biol Cell 17, 1812421.
[196] Gerich, B., Orci, L., Tschochner, H., Lottspeich, F., Ravazzola, M., Amherdt, M., Wieland, F. and Harter, C. (1995). Non4clathrin4coat protein alpha is a conserved subunit of coatomer and in Saccharomyces cerevisiae is essential for growth. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 3229433.
Bibliografía 219
[197] McAlister, L. and Holland, M.J. (1982). Targeted deletion of a yeast enolase structural gene. Identification and isolation of yeast enolase isozymes. J Biol Chem 257, 718148.
[198] Entian, K.D., Meurer, B., Kohler, H., Mann, K.H. and Mecke, D. (1987). Studies on the regulation of enolases and compartmentation of cytosolic enzymes in Saccharomyces cerevisiae. Biochim Biophys Acta 923, 214421.
[199] Won, K.J., Hamelryck, T., Prugel4Bennett, A. and Krogh, A. (2007). An evolutionary method for learning HMM structure: prediction of protein secondary structure. BMC Bioinformatics 8, 357.
[200] McLaughlin, W.A., Hou, T. and Wang, W. (2006). Prediction of binding sites of peptide recognition domains: an application on Grb2 and SAP SH2 domains. J Mol Biol 357, 1322434.
[201] Wilson, L.K., Benton, B.M., Zhou, S., Thorner, J. and Martin, G.S. (1995). The yeast immunophilin Fpr3 is a physiological substrate of the tyrosine4specific phosphoprotein phosphatase Ptp1. J Biol Chem 270, 25185493.
[202] Guan, K.L., Deschenes, R.J., Qiu, H. and Dixon, J.E. (1991). Cloning and expression of a yeast protein tyrosine phosphatase. J Biol Chem 266, 12964470.
[203] Crechet, J.B., Poullet, P., Mistou, M.Y., Parmeggiani, A., Camonis, and J., B.4M., E., Damak, F., and Jacquet, M. (1990). Science 248, 8664868.
[204] Munder, T., and Furst, P. (1992). Mol Cell Biol 12, 209142099. [205] Tanaka, K., Nakafuku,M., Satoh, T., Marshall, M.S.,Gibbs, J.B.,
Matsumoto, and K., K., Y., and Toh4e, A. (1990). S. cerevisiae genes IRA1 and IRA2 encode proteins that may be functionally equivalent to mammalian ras GTPase activating protein. Cell 60, 8034807.
[206] Tanaka, K., Lin, B.K., Wood, D.R., and Tamanoi, F. (1991). IRA2, an upstream negative regulator of RAS in yeast, is a RAS GTPase4activating protein. Proc Natl Acad Sci U S A 88, 4684472.
[207] Mitts, M.R., Bradshaw4Rouse, J., and Heideman, W. (1991). Mol Cell Biol 11, 459144598.
[208] Tanaka, K., Matsumoto, K., and Toh4e, A. (1989). Dual regulation of the expression of the polyubiquitin gene by cyclic AMP and heat shock in yeast. Mol Cell Biol 9, 7574768.
[209] Tanaka, K., Nakafuku, M., Tamanoi, F., Kaziro, Y., Matsumoto, K., and and Toh4e, A. (1990b). IRA2, a second gene of Saccharomyces cerevisiae that encodes a protein with a domain homologous to mammalian ras GTPase4activating protein. Mol Cell Biol 10, 430344313.
[210] Hwang, P.K., Tugendreich, S. and Fletterick, R.J. (1989). Molecular analysis of GPH1, the gene encoding glycogen phosphorylase in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 9, 1659466.
[211] Sunnarborg, S.W., Miller, S.P., Unnikrishnan, I. and LaPorte, D.C. (2001). Expression of the yeast glycogen phosphorylase gene is regulated by stress4response elements and by the HOG MAP kinase pathway. Yeast 18, 1505414.
[212] Perez4Torrado, R., Gimeno4Alcaniz, J.V. and Matallana, E. (2002). Wine yeast strains engineered for glycogen overproduction display enhanced viability under glucose deprivation conditions. Appl Environ Microbiol 68, 3339444.
Bibliografía 220
[213] Perentesis, J.P., Phan, L.D., Gleason, W.B., LaPorte, D.C., Livingston, D.M. and Bodley, J.W. (1992). Saccharomyces cerevisiae elongation factor 2. Genetic cloning, characterization of expression, and G4domain modeling. J Biol Chem 267, 119047.
[214] Arvanitidis, A. and Heinisch, J.J. (1994). Studies on the function of yeast phosphofructokinase subunits by in vitro mutagenesis. J Biol Chem 269, 891148.
[215] Thon, V.J., Vigneron4Lesens, C., Marianne4Pepin, T., Montreuil, J., Decq, A., Rachez, C., Ball, S.G. and Cannon, J.F. (1992). Coordinate regulation of glycogen metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Induction of glycogen branching enzyme. J Biol Chem 267, 1522448.
[216] Gross, D.S., Adams, C.C., English, K.E., Collins, K.W. and Lee, S. (1990). Promoter function and in situ protein/DNA interactions upstream of the yeast HSP90 heat shock genes. Antonie Van Leeuwenhoek 58, 175486.
[217] Borkovich, K.A., Farrelly, F.W., Finkelstein, D.B., Taulien, J. and Lindquist, S. (1989). hsp82 is an essential protein that is required in higher concentrations for growth of cells at higher temperatures. Mol Cell Biol 9, 3919430.
[218] Goll, J. and Uetz, P. (2006). The elusive yeast interactome. Genome Biol 7, 223.
[219] Klussmann, E., Rosenthal, W. . (2006). AKAP7. AfCS4Nature Molecules Pages, doi:10.1038/mp.A000246.
[220] Huang, L.J., Durick, K., Weiner, J.A., Chun, J. and Taylor, S.S. (1997). D4AKAP2, a novel protein kinase A anchoring protein with a putative RGS domain. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 1118449.
[221] Banky, P., Huang, L.J. and Taylor, S.S. (1998). Dimerization/docking domain of the type Ialpha regulatory subunit of cAMP4dependent protein kinase. Requirements for dimerization and docking are distinct but overlapping. J Biol Chem 273, 35048455.
[222] Fasolo, J. et al. Diverse protein kinase interactions identified by protein microarrays reveal novel connections between cellular processes. Genes Dev 25, 767478.
[223] Kinderman, F.S., Kim, C., von Daake, S., Ma, Y.L., Pham, B.Q., Spraggon, G., Xuong, N.H., Jennings, P.A., Taylor, S.S. (2006). Mol Cell 24, 3974408.
[224] Herberg, F.W., Maleszka, A., Eide, T., Vossebein, L., Tasken, K. (2000). J Mol Biol 298, 3294339.
[225] Wang, L., Sunahara, R.K., Krumins, A., Perkins, G., Crochiere, M.L., Mackey, M., Bell, S., Ellisman, M.H., and Taylor, S.S. (2001). Proc Natl Acad Sci U S A 98, 322043225.
[226] Carrera, A., Gerton, G.L., and Moss, S.B. (1994). Dev Biol 165, 2724284. [227] Miki, E., and Eddy, E.M. (1998). J Biol Chem 273, 34384434390. [228] Li, H.W., Adamik, R., Pacheco4Rodriguez, G., Moss, J., and Vaughan, M.
(2003). Protein kinase A4anchoring (AKAP) domains in brefeldin A4inhibited guanine nucleotide4exchange protein 2 (BIG2). Proc Natl Acad Sci U S A 100, 162741632.
Bibliografía 221
[229] Heller, W.T., Vigil, D., Brown, S., Blumenthal, D.K., Taylor, S.S. and Trewhella, J. (2004). C subunits binding to the protein kinase A RI alpha dimer induce a large conformational change. J Biol Chem 279, 19084490.
[230] Vigil, D., Blumenthal, D.K., Heller, W.T., Brown, S., Canaves, J.M., Taylor, S.S. and Trewhella, J. (2004). Conformational differences among solution structures of the type Ialpha, IIalpha and IIbeta protein kinase A regulatory subunit homodimers: role of the linker regions. J Mol Biol 337, 1183494.
[231] The PyMOL Molecular Graphics System, Version 1.2r3pre, Schrôdinger, LLCed.^eds)
[232] Lemaire, K., Van de Velde, S., Van Dijck, P. and Thevelein, J.M. (2004). Glucose and sucrose act as agonist and mannose as antagonist ligands of the G protein4coupled receptor Gpr1 in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell 16, 29349.
[233] Lorenz, M.C., Pan, X., Harashima, T., Cardenas, M.E., Xue, Y., Hirsch, J.P. and Heitman, J. (2000). The G protein4coupled receptor gpr1 is a nutrient sensor that regulates pseudohyphal differentiation in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 154, 609422.
[234] Xue, Y., Batlle, M. and Hirsch, J.P. (1998). GPR1 encodes a putative G protein4coupled receptor that associates with the Gpa2p Galpha subunit and functions in a Ras4independent pathway. EMBO J 17, 199642007.
[235] Yun, C.W., Tamaki, H., Nakayama, R., Yamamoto, K. and Kumagai, H. (1998). Gpr1p, a putative G4protein coupled receptor, regulates glucose4dependent cellular cAMP level in yeast Saccharomyces cerevisiae. Biochem Biophys Res Commun 252, 29433.
[236] Colombo, S., Ma, P.S., Cauwenberg, L., Winderickx, J., Crauwels,, M., T., A., Nauwelaers, D., de Winde, J.H., Gorwa, M.F., and Colavizza, D., and Thevelein, J.M. (1998). EMBO J 17, 332643341.
[237] Lorenz, M.C. and Heitman, J. (1997). Yeast pseudohyphal growth is regulated by GPA2, a G protein alpha homolog. EMBO J 16, 7008418.
[238] Harashima, T., and Heitman, J. (2004). Nutrient control of dimorphic growth in ��������������� �. Topics in Current Genetics 7, 1314169
[239] Powers, S., Kataoka, T., Fasano, O., Goldfarb, M., Strathern, J., and
Broach, J., and Wigler, M. (1984). Genes in S. cerevisiae Encoding Proteins with Domains Homologous to the Mammalian ras Proteins. Cell 36, 6074612.
[240] Dong, J. and Bai, X. (2011). The membrane localization of Ras2p and the association between Cdc25p and Ras24GTP are regulated by protein kinase A (PKA) in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett 585, 1127434.
[241] Harashima T., A.S. and Yates III, J.R., and Heitman J. (2006). The Kelch Proteins Gpb1 and Gpb2 Inhibit Ras
Activity via Association with the Yeast RasGAP Neurofibromin Homologs Ira1 and Ira2. Mol Cell 22, 8194830. [242] Serrano, R., Kielland4Brandt, M.C. and Fink, G.R. (1986). Yeast plasma
membrane ATPase is essential for growth and has homology with (Na+ + K+), K+4 and Ca2+4ATPases. Nature 319, 689493.
Bibliografía 222
[243] Behrens, M.M. and Mazon, M.J. (1988). Yeast cAMP4dependent protein kinase can be associated to the plasma membrane. Biochem Biophys Res Commun 151, 56147.
[244] Peeters, T., Louwet, W., Gelade, R., Nauwelaers, D., Thevelein, J.M. and Versele, M. (2006). Kelch4repeat proteins interacting with the Galpha protein Gpa2 bypass adenylate cyclase for direct regulation of protein kinase A in yeast. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 1303449.
[245] Tokuo, H., Yunoue, S., Feng, L., Kimoto, M., Tsuji, H., Ono, T., Saya, H. and Araki, N. (2001). Phosphorylation of neurofibromin by cAMP4dependent protein kinase is regulated via a cellular association of N(G),N(G)4dimethylarginine dimethylaminohydrolase. FEBS Lett 494, 48453.
[246] Feng, L. et al. (2004). PKA phosphorylation and 144343 interaction regulate the function of neurofibromatosis type I tumor suppressor, neurofibromin. FEBS Lett 557, 275482.
[247] Albuquerque, C.P., Smolka, M.B., Payne, S.H., Bafna, V., Eng, J. and Zhou, H. (2008). A multidimensional chromatography technology for in4depth phosphoproteome analysis. Mol Cell Proteomics 7, 1389496.
[248] Smolka, M.B., Albuquerque, C.P., Chen, S.H. and Zhou, H. (2007). Proteome4wide identification of in vivo targets of DNA damage checkpoint kinases. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 1036449.
[249] Chi, A. et al. (2007). Analysis of phosphorylation sites on proteins from Saccharomyces cerevisiae by electron transfer dissociation (ETD) mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 219348.
[250] Collins, S.R. et al. (2007). Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map. Nature 446, 806410.
[251] Obenauer, J.C., Cantley, L.C. and Yaffe, M.B. (2003). Scansite 2.0: Proteome4wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Res 31, 3635441.
[252] Phan, V.T., Ding, V.W., Li, F., Chalkley, R.J., Burlingame, A. and McCormick, F. The RasGAP proteins Ira2 and neurofibromin are negatively regulated by Gpb1 in yeast and ETEA in humans. Mol Cell Biol 30, 2264479.
[253] Budhwar, R., Lu, A. and Hirsch, J.P. (2010). Nutrient control of yeast PKA activity involves opposing effects on phosphorylation of the Bcy1 regulatory subunit. Mol Biol Cell 21, 3749458.
[254] Budhwar, R., Fang, G. and Hirsch, J.P. (2011). Kelch repeat proteins control yeast PKA activity in response to nutrient availability. Cell Cycle 10, 767470.
[255] Papa, S., Sardanelli, A.M., Scacco, S. and Technikova4Dobrova, Z. (1999). cAMP4dependent protein kinase and phosphoproteins in mammalian mitochondria. An extension of the cAMP4mediated intracellular signal transduction. FEBS Lett 444, 24549.
[256] Harada, H., Becknell, B., Wilm, M., Mann, M., Huang, L.J., Taylor, S.S., Scott, J.D. and Korsmeyer, S.J. (1999). Phosphorylation and inactivation of BAD by mitochondria4anchored protein kinase A. Mol Cell 3, 413422.
[257] Cho, J.H., Lee, Y.K. and Chae, C.B. (2001). The modulation of the biological activities of mitochondrial histone Abf2p by yeast PKA and its
Bibliografía 223
possible role in the regulation of mitochondrial DNA content during glucose repression. Biochim Biophys Acta 1522, 175486.
[258] Rahman, M.U. and Hudson, A.P. (1995). Substrates for yeast mitochondrial cAMP4dependent protein kinase activity. Biochem Biophys Res Commun 214, 188494.
[259] Martin, J. (1997). Molecular chaperones and mitochondrial protein folding. J Bioenerg Biomembr 29, 35443.
[260] Rahman, M.U. and Hudson, A.P. (1995). Nature and transcriptional role of catalytic subunits of yeast mitochondrial cAMP4dependent protein kinase. Biochem Biophys Res Commun 206, 756463.
[261] Rahman, M.U., Kleyman, T.R., McEntee, C.M. and Hudson, A.P. (1994). Regulation of mitochondrial cAMP4dependent protein kinase activity in yeast. Biochem Mol Biol Int 34, 745453.
[262] Jones, M., Gupta, R.S. and Englesberg, E. (1994). Enhancement in amount of P1 (hsp60) in mutants of Chinese hamster ovary (CHO4K1) cells exhibiting increases in the A system of amino acid transport. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 858462.
[263] Woodlock, T.J., Chen, X., Young, D.A., Bethlendy, G., Lichtman, M.A. and Segel, G.B. (1997). Association of HSP604like proteins with the L4system amino acid transporter. Arch Biochem Biophys 338, 5046.
[264] Ikawa, S. and Weinberg, R.A. (1992). An interaction between p21ras and heat shock protein hsp60, a chaperonin. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 201246.
[265] Wells, A.D., Rai, S.K., Salvato, M.S., Band, H. and Malkovsky, M. (1997). Restoration of MHC class I surface expression and endogenous antigen presentation by a molecular chaperone. Scand J Immunol 45, 605412.
[266] Kaur, I., Voss, S.D., Gupta, R.S., Schell, K., Fisch, P. and Sondel, P.M. (1993). Human peripheral gamma delta T cells recognize hsp60 molecules on Daudi Burkitt's lymphoma cells. J Immunol 150, 2046455.
[267] Xu, Q., Schett, G., Seitz, C.S., Hu, Y., Gupta, R.S. and Wick, G. (1994). Surface staining and cytotoxic activity of heat4shock protein 60 antibody in stressed aortic endothelial cells. Circ Res 75, 1078485.
[268] Shu, Y. and Hallberg, R.L. (1995). SCS1, a multicopy suppressor of hsp604ts mutant alleles, does not encode a mitochondrially targeted protein. Mol Cell Biol 15, 5618426.
[269] Huh, W.K., Falvo, J.V., Gerke, L.C., Carroll, A.S., Howson, R.W., Weissman, J.S. and O'Shea, E.K. (2003). Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature 425, 686491.
[270] Cheng, M.Y., Hartl, F.U. and Horwich, A.L. (1990). The mitochondrial chaperonin hsp60 is required for its own assembly. Nature 348, 45548.
[271] Lin, R.Y., Moss, S.B. and Rubin, C.S. (1995). Characterization of S4AKAP84, a novel developmentally regulated A kinase anchor protein of male germ cells. J Biol Chem 270, 27804411.
[272] Chen, Q., Lin, R.Y. and Rubin, C.S. (1997). Organelle4specific targeting of protein kinase AII (PKAII). Molecular and in situ characterization of murine A kinase anchor proteins that recruit regulatory subunits of PKAII to the cytoplasmic surface of mitochondria. J Biol Chem 272, 15247457.
[273] Schwock, J., Kirchberger, J., Edelmann, A., Kriegel, T.M. and Kopperschlager, G. (2004). Interaction of 64phosphofructokinase with cytosolic proteins of Saccharomyces cerevisiae. Yeast 21, 483494.
Bibliografía 224
[274] Rinaldi, J.D.S.M.d.C. (2009). Tesis Doctoral [275] Moro, F. and Muga, A. (2006). Thermal adaptation of the yeast
mitochondrial Hsp70 system is regulated by the reversible unfolding of its nucleotide exchange factor. J Mol Biol 358, 1367477.
�
Bibliografía 225
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