Mecanismos de Expulsión de los Parásitos Intestinales

Mecanismos de Mecanismos de Expulsión de los Expulsión de los

Parásitos IntestinalesParásitos Intestinales

Trichinella spiralis-Trichinella spiralis- Ciclo CicloEl huesped ingiere L1 enquistada en los músculos del HI. Las larvas se desarrollan en adultos en el intestino delgado. Los adultos copulan y la hembra penetra la mucosa y pone pre-larvas en los vasos linfáticos. Estas entran en las fibras musculares y las transforman en células nodrizas. La pre-larva necesita 3 semans para transformarse en L1 por tanto el HD es también el HI.

Trichinella spiralisTrichinella spiralis -Intestino -Intestino

Trichinella spiralis-Trichinella spiralis- Músculo Músculo

Nippostrongylus brasiliensis- Nippostrongylus brasiliensis- CicloCiclo Los gusanos adultos viven Los gusanos adultos viven

en el intestino del huésped y en el intestino del huésped y ponen huevos que salen con ponen huevos que salen con las heces. En el exterior, las heces. En el exterior, eclosionan y la larva L1 eclosionan y la larva L1 continúa el desarrollo hasta continúa el desarrollo hasta L3 que es infectante. L3 se L3 que es infectante. L3 se traslada y llega a penetrar la traslada y llega a penetrar la piel del hospedero roedor, piel del hospedero roedor, migrando luego a corazon y migrando luego a corazon y pulmones. Llega al espacio pulmones. Llega al espacio aéreo y es ingerida aéreo y es ingerida alcanzando el tracto GI alcanzando el tracto GI donde se adhieren a la donde se adhieren a la pared del intestinopared del intestino delgado delgado transformándose en transformándose en gusanos adultosgusanos adultos..

. .

Nippostrongylus brasiliensis- Nippostrongylus brasiliensis- AdultoAdulto

Trichuris sp - CicloTrichuris sp - Ciclo

Heligmosomoides polygyrus- Heligmosomoides polygyrus- CicloCiclo Los adultos viven en el Los adultos viven en el

intestino de roedores, intestino de roedores, enrollados en las vellosidades enrollados en las vellosidades intestinales. Las hembras intestinales. Las hembras ponen huevos que salen con ponen huevos que salen con las heces. Estos eclosionan en las heces. Estos eclosionan en pocos días y la L1 muda hasta pocos días y la L1 muda hasta L3 en una semana. Cuando es L3 en una semana. Cuando es ingerida L3 penetra la mucosa ingerida L3 penetra la mucosa intestinal y muda a L4, lo que intestinal y muda a L4, lo que genera inflamación y un genera inflamación y un nódulo en su sitio de nódulo en su sitio de penetración. Se transforma penetración. Se transforma rápidamente en adulto y pasa rápidamente en adulto y pasa nuevamente a la luz nuevamente a la luz intestinal. Los adultos jóvenes intestinal. Los adultos jóvenes migran a su sitio preferido, el migran a su sitio preferido, el intestino delgado cercano al intestino delgado cercano al píloro. Las hembras píloro. Las hembras comienzan la puesta de comienzan la puesta de huevos 2 semanas post huevos 2 semanas post infección y lo pueden hacer infección y lo pueden hacer durante varios meses.durante varios meses.

Heligmosomoides polygyrus- Heligmosomoides polygyrus- CicloCiclo

Diferencias en los modelos estudiadosDiferencias en los modelos estudiadosEspecificidad de huéspedEspecificidad de huésped

– Baja en Baja en Trichinella spiralisTrichinella spiralis– Alta enAlta en Heligmosomoides polygyrus Heligmosomoides polygyrus

Migración intrahospederoMigración intrahospedero– Parte del ciclo invasiva – Parte del ciclo invasiva – N. BrasiliensisN. Brasiliensis– Hábitat sólo intestinal – Hábitat sólo intestinal – T. MurisT. Muris

Relación con la pared intestinalRelación con la pared intestinal- Lumen – Lumen – Ascaris suum, H. PolygyrusAscaris suum, H. Polygyrus- Parietal –Parietal – T.spiralis T.spiralis

LocalizaciónLocalización- Intestino delgado – Intestino delgado – N. Brasiliensis, H. PolygyrusN. Brasiliensis, H. Polygyrus- Intestino grueso – Intestino grueso – T. MurisT. Muris

- Tiempo de infeccionTiempo de infeccion- Infección crónica Infección crónica – T. Spiralis, Ascaris sp.– T. Spiralis, Ascaris sp.- Expulsión agudaExpulsión aguda – N. brasiliensis – N. brasiliensis

La expulsión es dependiente de células La expulsión es dependiente de células T CD4+- EvidenciasT CD4+- Evidencias

Ratones timectomizadosRatones timectomizados Ratones desnudos (nude)Ratones desnudos (nude) Tratamiento con Ciclosporina ATratamiento con Ciclosporina A Experimento de transferencia Experimento de transferencia

adoptivaadoptiva Depleción de células CD4+Depleción de células CD4+

Poblaciones CD4+Poblaciones CD4+

TH1: IFNTH1: IFN, IL-12, IL-2, LT, IgG2a, IL-12, IL-2, LT, IgG2a

TH2: IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13, IgG1, TH2: IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13, IgG1, IgEIgE

Mecanismos de Activación de los Linfocitos Mecanismos de Activación de los Linfocitos T CD4+T CD4+

TH1- IL-12 actúa a través de Stat4.TH1- IL-12 actúa a través de Stat4.

Stat: signal transducers and activators of Stat: signal transducers and activators of transcription.transcription.

TH2- IL-4 e IL-13 actúan por su unión TH2- IL-4 e IL-13 actúan por su unión con IL-4Rcon IL-4Rαα que señaliza a través de que señaliza a través de Stat6.Stat6.

Figure 6-23Figure 6-23

Figure 12-6Figure 12-6

Figure 12-6 part 1 of 3Figure 12-6 part 1 of 3

Figure 12-6 part 2 of 3Figure 12-6 part 2 of 3

Figure 12-6 part 3 of 3Figure 12-6 part 3 of 3

8. Inhibición de las Vías de 8. Inhibición de las Vías de Señalización de la Célula HuéspedSeñalización de la Célula Huésped

Figure 12-2Figure 12-2

Figure 12-7Figure 12-7

Figure 12-13Figure 12-13

La expulsión de los nematodes GI está La expulsión de los nematodes GI está asociada a la respuesta TH2asociada a la respuesta TH2

T. murisT. muris: cepas sensibles generan : cepas sensibles generan respuesta TH1 y las resistentes una TH2respuesta TH1 y las resistentes una TH2

Administración de IFNAdministración de IFN o anti-IL4 en o anti-IL4 en cepas resistentes las vuelve susceptiblescepas resistentes las vuelve susceptibles

Utilización de ratones knock-outUtilización de ratones knock-outpara citoquinas TH2- Resultadospara citoquinas TH2- Resultados

Tanto IL-4 como IL-13 son necesarias Tanto IL-4 como IL-13 son necesarias para la expulsión de para la expulsión de T. murisT. muris

IL-13, pero no IL-4, es necesaria en la IL-13, pero no IL-4, es necesaria en la expulsión de expulsión de N. brasiliensisN. brasiliensis

IL-4, pero no IL-13, es requerida para IL-4, pero no IL-13, es requerida para la eliminación de la eliminación de H. polygyrusH. polygyrus

Utilización de ratones knock-outUtilización de ratones knock-outmúltiple para citoquinas TH2- Resultadosmúltiple para citoquinas TH2- Resultados

IL-4/IL-4/IL-9/IL-13 KO: Retardo en la IL-4/IL-4/IL-9/IL-13 KO: Retardo en la expulsión de expulsión de N. brasiliensisN. brasiliensis en cepas de en cepas de ratones resistentes asociada a citoquinas ratones resistentes asociada a citoquinas TH1.TH1.

IL-5/IL-9/IL-13 KO: IL-4 alcanza para IL-5/IL-9/IL-13 KO: IL-4 alcanza para compensar y producir eosinofilia, hiperplasia compensar y producir eosinofilia, hiperplasia mucosa y mastocitosismucosa y mastocitosis

Falta IL-4/IL-5/IL9 KO para determinar rol de Falta IL-4/IL-5/IL9 KO para determinar rol de la IL-13la IL-13

Ratones KO IL-4RRatones KO IL-4Rαα / Stat6 / Stat6

En En T. spiralisT. spiralis y y N. brasiliensisN. brasiliensis confirma que la expusión depende de confirma que la expusión depende de la acción de IL-4/IL-13 sobre el IL-4Rla acción de IL-4/IL-13 sobre el IL-4Rαα y la activación subsecuente de Stat6.y la activación subsecuente de Stat6.

En Nb los requerimientos de Stat6 en En Nb los requerimientos de Stat6 en la expulsión no dependen de la la expulsión no dependen de la respuesta TH2 ya que hay IgG1, respuesta TH2 ya que hay IgG1, eosinofilia y mastocitosiseosinofilia y mastocitosis

En En T.spiralisT.spiralis es dependiente de Stat6 es dependiente de Stat6

¿¿Porqué las respuestas TH2 son Stat6-Porqué las respuestas TH2 son Stat6-dependientes en dependientes en T.spiralis T.spiralis y Stat6-y Stat6-independientes en independientes en N.brasiliensis?N.brasiliensis?

Dependencia de Stat6Dependencia de Stat6

N. brasiliensisN. brasiliensis genera una respuesta genera una respuesta TH2 pura mientras que TH2 pura mientras que T. spiralisT. spiralis produce una respuesta mixta con IFNproduce una respuesta mixta con IFN

La señalización por medio de Stat6 La señalización por medio de Stat6 pordría requerirse durante la pordría requerirse durante la generación de la respuesta primaria generación de la respuesta primaria TH2 en presencia de IL-12 e IFNTH2 en presencia de IL-12 e IFN

Stat6Stat6N. brasiliensis vs T. spiralisN. brasiliensis vs T. spiralis

A nichos diferentes respuestas diferentesA nichos diferentes respuestas diferentes N. brasiliensisN. brasiliensis y y H. polygyrusH. polygyrus son son

exclusivamente extracelulares y generan exclusivamente extracelulares y generan respuesta TH2 purarespuesta TH2 pura

T. spiralisT. spiralis habita dentro de los habita dentro de los enterocitos y algunas células enterocitos y algunas células caliciformes y genera una respuesta caliciformes y genera una respuesta mixta quizás desencadenando la mixta quizás desencadenando la producción de IFNproducción de IFN

ConclusionesConclusiones La activación de Stat6 por la unión de La activación de Stat6 por la unión de

IL-4 y/o IL-13 a IL-4RIL-4 y/o IL-13 a IL-4Rαα es un es un requerimiento universal para la requerimiento universal para la protección del huésped contra los protección del huésped contra los nematodes GI.nematodes GI.

Los mecanismos efectores inducidos Los mecanismos efectores inducidos por activación de Stat6 que son por activación de Stat6 que son requeridos en los distintos modelos requeridos en los distintos modelos para la protección son diferentes.para la protección son diferentes.

Otras Células IL-4ROtras Células IL-4Rαα Evidencia de que células con origen fuera Evidencia de que células con origen fuera

de la médula Osea (no linfocitos ni de la médula Osea (no linfocitos ni mastocitos) que expresan IL-4Rmastocitos) que expresan IL-4Rαα, son , son necesarias en la expulsión de necesarias en la expulsión de N. N. brasiliensis. brasiliensis.

Se puede concluir que las células T se Se puede concluir que las células T se requieren para generar las citoquinas (IL-4 requieren para generar las citoquinas (IL-4 e IL-13) que actúa sobre células no e IL-13) que actúa sobre células no inmunes que producen la expulsióninmunes que producen la expulsión

Mecanismos EfectoresMecanismos Efectores

MastocitosMastocitos Células caliciformes – mucusCélulas caliciformes – mucus EosinófilosEosinófilos AnticuerposAnticuerpos Efectos fisiológicosEfectos fisiológicos Inflamación intestinalInflamación intestinal

Figure 12-2Figure 12-2

MastocitosMastocitos

MastocitosMastocitos

Mastocitos- Evidencias sobre el rol en la Mastocitos- Evidencias sobre el rol en la expulsión de los nematodes GIexpulsión de los nematodes GI

Participación crucial en Participación crucial en Strongyloides Strongyloides venezuelensisvenezuelensis y y T. spiralisT. spiralis

Poco importantes enPoco importantes en N. brasiliensis y T. N. brasiliensis y T. murismuris

Estudios en ratones W/Wv deficientes en Estudios en ratones W/Wv deficientes en mastocitos o por anti-IL3 o IL-4 que mastocitos o por anti-IL3 o IL-4 que bloquean mastocitosis- fallan de prevenir la bloquean mastocitosis- fallan de prevenir la expulsion de expulsion de N.brasiliensisN.brasiliensis

MastocitosMastocitos

Pueden jugar un papel como la fuente Pueden jugar un papel como la fuente inicial de inducción de una respuesta inicial de inducción de una respuesta TH2TH2

Son una fuente de moléculas Son una fuente de moléculas vasoactivas, proinflamatorias y un vasoactivas, proinflamatorias y un número de citoquinas como IL-4 y TNF número de citoquinas como IL-4 y TNF creando un microambiente inhóspito.creando un microambiente inhóspito.

EosinófilosEosinófilos

Rol discutibleRol discutible Eosinofilia tesidual y periférica es Eosinofilia tesidual y periférica es

característicacaracterística El uso de ratones IL-5 KO o bloqueo de IL-5 El uso de ratones IL-5 KO o bloqueo de IL-5

con Ac no previene la expulsión de los con Ac no previene la expulsión de los helmintos GIhelmintos GI

Los ratones transgénicos IL-5- tienen Los ratones transgénicos IL-5- tienen eosinofiia del 30% no tienen capacidad eosinofiia del 30% no tienen capacidad aumentada de expulsión de aumentada de expulsión de T. spiralisT. spiralis

Células Caliciformes- MucusCélulas Caliciformes- Mucus

Aumento de células caliciformes y cambios Aumento de células caliciformes y cambios cualitativos en el mucus durante la infección cualitativos en el mucus durante la infección de varios parásitos GIde varios parásitos GI

Se ha propuesto que las mucinas pueden Se ha propuesto que las mucinas pueden envolver al parásito y/o interrumpir la envolver al parásito y/o interrumpir la adhesiónadhesión

La hiperplasia de células caliciformes es un La hiperplasia de células caliciformes es un fenómeno CD4+ TH2 IL-4 independientefenómeno CD4+ TH2 IL-4 independiente

Células Caliciformes- Mucus Células Caliciformes- Mucus N. N. brasiliensisbrasiliensis

Los ratones IL-13 KO a diferencia de los IL-Los ratones IL-13 KO a diferencia de los IL-4 KO y los no suprimidos, no pueden 4 KO y los no suprimidos, no pueden eliminar la infección en forma eficiente si eliminar la infección en forma eficiente si bien generan una respuesta TH2.bien generan una respuesta TH2.

Los IL-13 KO no producen hiperplasia de Los IL-13 KO no producen hiperplasia de células caliciformes células caliciformes

Conclusión: IL-13 induce la hiperplasia y el Conclusión: IL-13 induce la hiperplasia y el mucus facilita la expulsión de N.bmucus facilita la expulsión de N.b

AnticuerposAnticuerpos Rol dudosoRol dudoso Alta producción de IgG1 e IgEAlta producción de IgG1 e IgE Gran proporcion de anticuerpos no Gran proporcion de anticuerpos no

específicos en específicos en T. spiralisT. spiralis y y H.polygyrus, H.polygyrus, sería sería consecuencia de fuerte respuesta TH2consecuencia de fuerte respuesta TH2

En contra: Transferencia de CD4+ a los En contra: Transferencia de CD4+ a los ratones SCID (sin T ni B) induce la expulsión ratones SCID (sin T ni B) induce la expulsión de de T. murisT. muris. .

Stat6 KO no pueden expulsar N.b a pesar de Stat6 KO no pueden expulsar N.b a pesar de la gran producción de Anticuerposla gran producción de Anticuerpos

Serían importantes en la respuesta Serían importantes en la respuesta secundariasecundaria

Efectos FisiológicosEfectos Fisiológicos

El efecto de las diversas citoquinas y El efecto de las diversas citoquinas y células efectoras en el intestino lleva a la células efectoras en el intestino lleva a la generación de un microambiente hostil generación de un microambiente hostil con aumento de mucus y actividad con aumento de mucus y actividad contráctil propulsora intestinalcontráctil propulsora intestinal

IL-4 e IL-13 inducen hipercontractilidad de IL-4 e IL-13 inducen hipercontractilidad de las células musculares via Stat6 en las células musculares via Stat6 en ratones infectados por ratones infectados por T. spiralisT. spiralis..

INTESTINAL MUCOSAL RESPONSE INTESTINAL MUCOSAL RESPONSE OF DOGS EXPERIMENTALLY OF DOGS EXPERIMENTALLY INFECTED WITH THE CESTODE INFECTED WITH THE CESTODE ECHINOCOCCUS GRANULOSUS: An ECHINOCOCCUS GRANULOSUS: An animal model, approach to human animal model, approach to human taeniasis. taeniasis.

Uruguaysito Benavides*, Junco Inohara+, Takehito Uruguaysito Benavides*, Junco Inohara+, Takehito

Shozawa+, Zully Altamirano* and Carlos Carmona* #Shozawa+, Zully Altamirano* and Carlos Carmona* #

*Unidad de Biología Parasitaria. Facultad de Ciencias. Instituto *Unidad de Biología Parasitaria. Facultad de Ciencias. Instituto de Higiene, Av. A. Navarro 3051,CP11600. de Higiene, Av. A. Navarro 3051,CP11600. Montevideo, Montevideo, Uruguay.Uruguay.

+ Parasitology Laboratory, Departament of Clinical Pathology, + Parasitology Laboratory, Departament of Clinical Pathology, Veterinary School, Hokkaido University, Sapporo 060, Japan.Veterinary School, Hokkaido University, Sapporo 060, Japan.

Infección de perros con Infección de perros con E. granulosusE. granulosus es es over-dispersed.over-dispersed.

En la infección experimental se infectan En la infección experimental se infectan el 100% de los animales pero el número el 100% de los animales pero el número de parásitos que se encuentran en el de parásitos que se encuentran en el intestino nunca es mayor de un 40%.intestino nunca es mayor de un 40%.

NONO habia datos reportados sobre habia datos reportados sobre inmunidad de mucosas o mecanismos inmunidad de mucosas o mecanismos de expulsión de de expulsión de E. granulosusE. granulosus en en perros.perros.

Preguntas Preguntas interesantes a interesantes a

responder responder experimentalmenteexperimentalmente

??

1) Cuando se expulsan los 1) Cuando se expulsan los parásitos en que momento parásitos en que momento de la infecciónde la infección

1) Cuales son los cambios 1) Cuales son los cambios de la mucosa intestinal de la mucosa intestinal asociados a la expulsión ?asociados a la expulsión ?

Cual es la respuesta de la Cual es la respuesta de la mucosa intestinal asociada mucosa intestinal asociada a la instalación de los a la instalación de los parásitos la permanencia, parásitos la permanencia, o infestación crónica?o infestación crónica?

Que diseño experimental Que diseño experimental realizarían ?realizarían ?

Diseño experimentalDiseño experimental

Infectamos animales con Infectamos animales con protoescolices:protoescolices:

Se necropsiaron a diferentes Se necropsiaron a diferentes tiempos:1,2,3,4,5,6,13,23,33.tiempos:1,2,3,4,5,6,13,23,33.

Un grupo fue usado como Un grupo fue usado como control no infectado.control no infectado.

Se extrajo el intestino delgado.Se extrajo el intestino delgado. Se lo dividió en 3 partes iguales.Se lo dividió en 3 partes iguales. Se sacaron muestras para histología Se sacaron muestras para histología

e histoquímica.e histoquímica. Se extrajo la mucosa intestinal de Se extrajo la mucosa intestinal de

cada una de las partes.cada una de las partes.

Estudios realizados:Estudios realizados:

Cambios morfológicos en la mucosa.Cambios morfológicos en la mucosa.

Conteo de células involucradas en los Conteo de células involucradas en los mecanismos de expulsión hasta ese mecanismos de expulsión hasta ese momento descriptos.momento descriptos.

Tinción con HE para morfología Tinción con HE para morfología general y conteo de IEL y eosinófilos.general y conteo de IEL y eosinófilos.

..

Conteo de criptas Conteo de criptas

Conteo de mitosis a nivel de criptas

Epitelio de la criptaEpitelio de la cripta(multiplicación celular)(multiplicación celular)

Tinción de PAS para células Tinción de PAS para células caliciformes o mucosascaliciformes o mucosas

Jejuno, morfologíca microscopica.( vellocidad)

Parámetros estudiados en cada Parámetros estudiados en cada segmento intestinal:segmento intestinal:

The number of worms.The number of worms. General histological morphologyGeneral histological morphology Submucosal mast cells (SMMC).Submucosal mast cells (SMMC). Mucosal mast cells (MMC).Mucosal mast cells (MMC). Goblet cells.Goblet cells. Intrahepitelial leucocytes (IEL).Intrahepitelial leucocytes (IEL). Eosinophiles number.Eosinophiles number.

ResultadosResultados

Expulsión entre 1-3 dias.Expulsión entre 1-3 dias.

Inmunidad innataInmunidad innata

Respuesta de la mucosa Respuesta de la mucosa intestinal entre 1-3 diasintestinal entre 1-3 dias

Hiperplasia de criptas.Hiperplasia de criptas. Hiperplasia de células epiteliales.Hiperplasia de células epiteliales. Hiperplasia de celulas Hiperplasia de celulas

caliciformes.caliciformes. Hipoplasia de mastocitosHipoplasia de mastocitos NO cambios en el numero de NO cambios en el numero de

eosinofilos y de IEL.eosinofilos y de IEL. Edema e infiltracion Edema e infiltracion

polimorfonuclear.polimorfonuclear.

Parásitos no adheridos a la Parásitos no adheridos a la mucosa.mucosa.

Inflamación catarral aguda.Inflamación catarral aguda.

Probable causa de expulsiónProbable causa de expulsión

5-6-13 dias5-6-13 dias

Apagado de la respuesta Apagado de la respuesta aguda y establecimiento de aguda y establecimiento de una inflamación sub-una inflamación sub-crónica.crónica.

23-3323-33

Inflamación crónica con Inflamación crónica con establecimiento e instalación establecimiento e instalación de los gusanos en las criptas.de los gusanos en las criptas.